ES2284769T3 - Enzimas termoestables modificadas reversiblemente para la sintesis y la amplificacion de dna in vitro. - Google Patents
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Abstract
La composición que comprende una primera enzima modificada termoestable que muestra actividad exonucleasa 3¿, que prácticamente no muestra actividad DNA-polimerasa y una segunda enzima modificada termoestable que muestra actividad DNA-polimerasa, considerando que la fidelidad del proceso de amplificación se mejora con el uso de la composición en un proceso de amplificación, en comparación con el uso de la segunda enzima solamente y, considerando que dichas primera y segunda enzimas termoestables modificadas se modifican reversiblemente mediante un reactivo inhibidor que provoca prácticamente una inactivación completa de la actividad enzimática, en la que la incubación de dichas primera y segunda enzimas termoestables modificadas en un tampón acuoso a pH alcalino a una temperatura inferior a 25 ºC durante 20 minutos resulta en un aumento no significativo de la actividad de dichas primera y segunda enzimas modificadas termoestables, en la que la incubación a temperatura superior a 50 ºC en untampón acuoso a pH alcalino provoca al menos un aumento del doble en la actividad enzimática en menos de 20 minutos, lo que permite la formación de productos de extensión del cebador.
Description
Enzimas termoestables modificadas
reversiblemente para la síntesis y la amplificación de DNA in
vitro.
Esta invención está relacionada con el campo de
la química de los ácidos nucleicos. Específicamente con los métodos
de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos. La invención
facilita la amplificación de ácidos nucleicos en condiciones de
alta fidelidad y puede utilizarse con diversos fines en la
industria, la medicina y la ciencia forense.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
un método in vitro bien conocido que se utiliza para la
amplificación de secuencias de ácidos nucleicos (patentes
estadounidenses US 4 683 202, US 4 684 195, US 4 965 188). La
reacción utiliza dos cebadores oligonucleótidos específicos de
secuencia que hibridan con la cadena opuesta de la secuencia de
ácido nucleico diana desnaturalizada. Una enzima
DNA-polimerasa termoestable cataliza la elongación
de los cebadores incorporando desoxinucleótidos monofosfato en la
nueva cadena.
La especificidad de la amplificación depende de
la hibridación del cebador. Con las elevadas temperatura que se
utilizan en una PCR típica, el cebador hibrida solamente con la
secuencia diana. Los cebadores pueden unirse inespecíficamente a
otras secuencias de ácidos nucleicos e iniciar la síntesis de
productos de extensión inespecíficos en condiciones menos
restrictivas. La amplificación de productos inespecíficos en la PCR
puede competir con la amplificación del DNA diana y puede disminuir
significativamente la eficiencia de la amplificación de la secuencia
diana.
En el pasado se desarrollaron varios métodos
para reducir la formación de productos inespecíficos en la PCR. En
uno de los métodos, al que se hace referencia como protocolo de
"arranque en caliente", al menos se sustrae un reactivo
crítico de la mezcla de reacción hasta que la temperatura se eleva
suficientemente para proporcionar la especificidad de hibridación
necesaria. De este modo, la mezcla de reacción impide la reacción
de extensión del cebador hasta añadir el componente que faltaba.
Los métodos de arranque en caliente pueden
llevarse a cabo manualmente tras una fase de incubación a alta
temperatura abriendo el tubo de reacción y añadiendo el reactivo que
falta. Sin embargo los métodos de arranque en caliente manuales
aumentan el riesgo de contaminación y son muy laboriosos. Otra
posibilidad es utilizar materiales termolábiles como la cera para
separar los componentes de la reacción (patente estadounidense US 5
411 876). Una prerreacción de incubación a alta temperatura funde
los materiales termolábiles, permitiendo así que los reactivos se
mezclen. Otro método describe el empleo de anticuerpos con el fin de
inhibir la actividad de la DNA-polimerasa (patente
estadounidense US 5 338 671). Los anticuerpos se incuban con la
polimerasa antes de la preparación de la mezcla de reacción para
permitir la formación del complejo anticuerpo-DNA
polimerasa. La inhibición producida por el anticuerpo se elimina
mediante la desnaturalización de este en la fase de preincubación a
alta temperatura. Además, la formación de producto de extensión
también puede ser inhibida por la adición de reactivos como los
aptámeros oligonucleótidos de cadena corta que se unen a la
DNA-polimerasa de manera termorreversible
inhibiendo así la actividad de la polimerasa (Lin y Jayasena [1997]
J. Mol. Biol. 271: 100-111). Sin embargo, la
producción de anticuerpos y aptámeros es costosa y su aplicación en
una reacción en cadena de la polimerasa puede requerir rediseñar la
reacción de amplificación.
La amplificación inespecífica puede reducirse
utilizando una DNA-polimerasa termoestable
inactivada reversiblemente que puede ser reactivada por incubación
en la mezcla de reacción de la amplificación a temperatura elevada.
La amplificación inespecífica se reduce debido a que la polimerasa
se encuentra inactivada hasta que la temperatura de la mezcla se
eleva a una temperatura en la cual se asegura una hibridación
específica del cebador (patentes estadounidenses US 5 773 258 y US
5 677 152).
La PCR se realiza rutinariamente usando la
DNA-polimerasa termoestable extraída de Thermus
aquaticus (DNA-polimerasa Taq) que
muestra una actividad polimerasa 5'-3' y una función
exonucleasa dependiente de polimerasa 5'-3'. Sin
embargo no posee una actividad exonucleasa 3'-5'
(Lawyer et al.(1989) J. Biol. Chem.
264:6427-6437). La actividad exonucleasa
3'-5' de la DNA-polimerasa se
denomina actividad "proofreading" (actividad correctora). Esta
actividad correctora extrae bases desapareadas del extremo 3' de la
doble cadena formada por el cebador y el molde. Puede ser ventajoso
ya que proporciona un aumento de la fidelidad de la replicación
durante la amplificación. Dado que la DNA-polimerasa
Taq es deficiente en la actividad exonucleasa
3'-5', no extrae bases desapareadas de los extremos
del cebador. Sin embargo es capaz de elongar estos cebadores con
bases desapareadas dando lugar así a la incorporación de bases
erróneas durante la amplificación. Numerosas
DNA-polimerasas termoestables de tipo B muestran
actividad exonucleasa 3'-5' y se utilizan en la PCR
para la amplificación de DNA de alta fidelidad. Por ejemplo, las
DNA-polimerasas derivadas de Pyrococcus
furiosus (DNA-polimerasa Pfu, WO
92/09689), Pyrococcus woesei (DNA-polimerasa
Pwo disponible en Roche Applied Science) y Thermococcus
gorgonarius (DNA-polimerasa Tgo, WO 981
590) son muy conocidas en la técnica.
Las DNA-polimerasas
termoestables con actividad correctora se utilizan también en las
PCR en forma de mezclas de DNA-polimerasas con al
menos una polimerasa que muestre tal actividad correctora (patente
estadounidense US 5 436 149). Recientemente, se demostró que una
exonucleasa 3'-5' termoestable actuaba como una
enzima correctora de bases apareadas erróneamente si se utilizaba
en la PCR mezclada con una DNA-polimerasa.
Una serie repetitiva de ciclos que incluyen la
desnaturalización del molde, la hibridación del cebador y la
extensión de los cebadores hibridados mediante la polimerasa dan
lugar a la acumulación exponencial de un fragmento específico de
DNA. Los productos de extensión sintetizados por el cebador en un
determinado ciclo pueden servir como molde en el siguiente ciclo,
así el número de copias de DNA diana se dobla en cada ciclo
aproximadamente. De este modo, incluso las cantidades más pequeñas
de DNA contaminante de amplificaciones por PCR previas pueden ser
amplificadas dando lugar a resultados falsos positivos
(contaminación por arrastre). Por lo tanto, se han desarrollado
métodos para impedir tal contaminación. En las amplificaciones de la
PCR es posible sustituir dUTP por dTTP para producir DNA que
contenga uracilo (U-DNA). Los ácidos nucleicos
contaminantes son degradados y no intervienen en la reacción de
amplificación al tratar las mezclas de reacción subsiguientes de la
PCR con uracil-DNA glucosilasa (UNG). Las dUTP
pueden incorporarse fácilmente gracias a la
DNA-polimerasa termoestable de tipo Pol I, pero no
por las polimerasas de tipo B (Slupphaug et al. [1993] Anal.
Biochem. 211:164-169). Por lo tanto, las
DNA-polimerasas de tipo B no pueden ser utilizadas
en amplificaciones por PCR si se requieren una alta fidelidad y una
descontaminación con UNG.
En la invención aquí descrita se desarrolló una
mezcla de enzimas termoestables capaz de proporcionar una PCR de
arranque en caliente con alta fidelidad de replicación. La invención
proporciona métodos y reactivos para la amplificación de ácidos
nucleicos utilizando una reacción de amplificación basada en los
cebadores como se especifica en las reivindicaciones. Estos métodos
y reactivos generan una amplificación de ácidos nucleicos de alta
fidelidad de replicación y reducen las amplificaciones
inespecíficas. Aún más, la invención hace posible la aplicación del
método de descontaminación con la UNG.
Es objeto de la presente invención una
composición que comprende una primera enzima modificada termoestable
que muestra actividad exonucleasa 3', pero que prácticamente no
muestra una actividad DNA-polimerasa y una segunda
enzima modificada termoestable con actividad
DNA-polimerasa, de modo que la fidelidad del proceso
de amplificación se mejora por el uso de la composición en un
proceso de amplificación, en comparación con el uso de la segunda
enzima solamente en un proceso de amplificación, y de modo que la
primera y segunda enzima termoestables modificadas son
reversiblemente modificadas por un agente inhibidor que provoca
prácticamente la completa inactivación de la actividad enzimática,
en la que la incubación de dichas primera y segunda enzimas
termoestables modificadas en un tampón acuoso a pH alcalino y a una
temperatura inferior a 25ºC durante 20 min provoca un aumento no
significativo de la actividad de dichas primera y segunda enzimas
modificadas termoestables, o bien la incubación a temperatura
superior a 50ºC en un tampón acuoso a pH alcalino da lugar a un
aumento de al menos el doble en la actividad enzimática en menos de
20 minutos, lo cual permite la formación de los productos de
extensión del cebador.
De acuerdo a la presente invención es preferible
que la primera enzima muestre actividad exonucleasa 3', pero que
prácticamente no muestre actividad DNA-polimerasa y
que la segunda enzima muestre actividad
DNA-polimerasa, pero que prácticamente no muestre
actividad exonucleasa 3'. En los ejemplos descritos más abajo la
invención se lleva a la práctica con la
DNA-polimerasa perteneciente a Thermus
aquaticus (DNA-polimerasa Taq) como
dicha segunda enzima termoestable y la exonucleasa III perteneciente
a Archaeoglobus fulgidus (Afu Exo III) como dicha
primera enzima termoestable. Gracias a la tecnología de vanguardia
se sabe que las enzimas adecuadas pueden obtenerse de otras
fuentes, tales como las eubacterias termófilas o las
arqueobacterias.
Algunos ejemplos son: especies de los géneros
Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus y
Thermosiphon. Son especies representativas de las cuales se
obtienen DNA-polimerasas termoestables útiles para
amplificaciones por PCR las siguientes: Thermus aquaticus,
Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum,
Pyrodictium abyssi y Thermosiphon africanus. Las
DNA-polimerasas termoestables se describen en las
patentes US 4 889 818, US 5 352 600, US 5 079 352, PCT/US90/07639,
PCT/US91/05753, PCT/US91/0703, PCT/US91/07076; la patente
estadounidense pendiente de aprobación con núm. de serie 08/062 368;
WO 92/09689; y US 5 210 036. Las DNA-polimerasas
termoestables se encuentran disponibles en el mercado
comercializadas por Perkin Elmer Norwalk, Conn. Los métodos de la
presente invención no están limitados al uso de las enzimas citadas
en los ejemplos.
En una de las realizaciones preferidas de la
presente invención la primera enzima es una exonucleasa que muestra
actividad exonucleasa 3' y la segunda enzima es una polimerasa Pol I
que prácticamente no muestra actividad exonucleasa 3'. El empleo de
la exonucleasa como primera enzima hace posible la sustitución de
dUTP por dTTP que produce DNA que contiene uracilo
(U-DNA) en reacciones de síntesis de ácidos
nucleicos como las reacciones de amplificación, como por ejemplo en
la PCR. Con un tratamiento previo a la amplificación de las
subsiguientes mezclas de reacción para PCR con
uracil-DNA glucosilasa (UNG) se degradan los ácidos
nucleicos contaminantes y no intervienen en la amplificación. Por
lo tanto, dado que en la novedosa composición la primera enzima es
una exonucleasa que muestra actividad exonucleasa 3'y la segunda
enzima es una polimerasa tipo Pol I que prácticamente no muestra
actividad exonucleasa 3', dicha novedosa composición es la preferida
debido a la posibilidad de prevenir la contaminación por
arrastre.
Las actividades de las enzimas se bloquean
reversiblemente mediante una reacción entre las enzimas y un
reactivo inhibidor que da lugar a la pérdida de todas, o casi
todas, las actividades enzimáticas. El reactivo inhibidor se elige
de tal manera que la inhibición sea reversible a temperaturas
elevadas. En una realización el reactivo inhibidor puede ser un
anticuerpo capaz de inhibir una de dichas enzimas termoestables.
Opcionalmente, en vez de utilizar un anticuerpo, la enzima puede
ser inhibida por otro agente inhibidor que da lugar a una
modificación química reversible de una de dichas enzimas
termoestables. Como se ha descrito en la presente invención, la
inactivación reversible de enzimas termoestables puede llevarse a
cabo por modificación química de los residuos de lisina. Esta
modificación química de la lisina puede obtenerse con anhídridos de
ácido (EP 0 962 526). Sin embargo, las modificaciones químicas de
otros residuos de aminoácido pueden dar lugar a una proteína
modificada con las características adecuadas. Se han descrito una
serie de compuestos en la bibliografía que reaccionan con grupos
amino de manera reversible. Por ejemplo, se han modificado
reversiblemente grupos amino por trifluoroacetilación (véase
Goldberger y Anfinsen, 1962 Biochemistry 1:410), amidinación (véase
Hunter y Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc. 84:3491), malailación
(véase Butler et al., 1967, Biochem. J. 103:78),
acetoacetilación (véase Marzotto et al., 1967, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 26:517; y Marzotto et al., 1968,
Biochim. Biophys. Acta 154:450), tetrafluorosuccinilación (véase
Brannitzer et. al., 1968,
Hoppe-Seylers's. Z. Physiol. Chem. 349:265) y
citraconilación (véase Dixon y Perham, 1968, Biochem. J.
109:312-314; y Habeeb y Atassi, 1970, Biochemistry 9
(25):4939-4944.
Los reactivos químicos de elección para la
modificación química de los grupos épsilon-amino de
los residuos de lisina son los anhídridos de ácidos
dicarboxílicos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención
se prefiere la composición que se obtiene cuando dichas primera y
segunda enzimas modificadas termoestables sean producidas por la
reacción de una mezcla de o bien dicha primera, o bien dicha segunda
enzima termoestable modificada con un reactivo modificador, en la
que dicha reacción se produce a pH alcalino a una temperatura
inferior a 25ºC aproximadamente, en la que dicho reactivo es el
anhídrido dicarboxílico con la siguiente fórmula general:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{1} y R_{2} son átomos
de hidrógeno o radicales orgánicos, que pueden estar unidos, o bien
presentar la fórmula
general:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{1} y R_{2} son
radicales orgánicos que pueden estar unidos y los enlaces de
hidrógeno son cis; y en la que dicha reacción da lugar básicamente
a una inactivación completa de la actividad
enzimática.
El radical orgánico puede hallarse directamente
unido al anillo por un enlace carbono-carbono o a
través de un enlace carbono-heteroátomo, como
carbono-oxígeno, carbono-nitrógeno o
carbono-azufre. Los radicales orgánicos pueden
estar también unidos entre ellos para formar una estructura en
anillo como por ejemplo el anhídrido
3,4,5,6-tetrahidroftálico.
Son ejemplos de los reactivos de elección los
siguientes compuestos: anhídrido maleico, anhídridos maleicos
sustituidos tales como anhídrido citracónico, anhídrido
cis-aconítico, y anhídrido
2,3-dimetilmaleico; anhídrido
exo-cis-3,6-endoxo-.\Delta.^{4}-tetrahidroftálico;
y anhídrido 3,4,5,6-tetrahidroftálico. Los reactivos
se encuentran comercializados por Aldrich Chemical Co. (Milwaukee,
Wis.), Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), o Spectrum Chemical
Mfg. Corp (Gardena, Calif) por ejemplo. Las modificaciones de las
DNA-polimerasas termoestables utilizando reactivos
de anhídrido maleico sustituido, anhídrido citracónico y anhídrido
cis-aconítico se hallan descritos en los
Ejemplos.
La estabilidad relativa de los grupos amino
acilados utilizando los reactivos citados anteriormente disminuye
en el siguiente orden: anhídrido maleico; anhídrido
exo-cis-3,6-endoxo-.\Delta.^{4}-tetrahidroftálico;
anhídrido citracónico; anhídrido
3,4,5,6-tetrahidroftálico; y anhídrido
2,3-dimetilmaleico (véase Palacian et al.,
supra).
Los métodos de la presente invención no se
limitan a los compuestos modificadores de los ejemplos o a la
modificación de la proteína por modificación química de los
residuos de lisina. Cualquiera de los compuestos descritos en la
bibliografía que reaccione con proteínas para producir la pérdida
reversible de toda, o casi toda, la actividad enzimática, con los
que la modificación se revierte por incubación a temperatura elevada
en el tampón de reacción de la amplificación, son adecuados para la
preparación de una enzima inactivada reversiblemente. A medida que
se encuentren disponibles nuevos compuestos que modifiquen
reversiblemente proteínas, también serán adecuados para su uso en
los presentes métodos. De este modo, los compuestos para la
preparación de enzimas termoestables modificadas de la presente
invención incluyen compuestos que poseen las siguientes
propiedades:
(1)la reacción con la enzima termoestable
que cataliza la extensión del cebador da lugar a una inactivación
significante de la enzima.
(2)la incubación de la enzima modificada
resultante en un tampón acuoso a pH 8-9
aproximadamente, a temperatura ambiente o ligeramente inferior a
esta (25ºC) da lugar a un aumento no significativo de la actividad
enzimática en menos de 20 minutos aproximadamente; y
(3)la incubación de la enzima modificada
termoestable resultante en el tampón de la reacción de amplificación
formulado con un pH aproximado de 8-9 a temperatura
ambiente, da lugar al menos a un aumento del doble de la actividad
enzimática en menos de 20 minutos aproximadamente a una temperatura
elevada superior a 50ºC.
De acuerdo a la presente invención, se prefiere
especialmente el uso de anhídrido citracónico o anhídrido
cis-aconítico como reactivo modificador, siendo el
de elección el anhídrido cis-aconítico.
Las composiciones que se prefieren son aquellas
que comprenden dichas primera y segunda enzimas termoestables
modificadas que son reversiblemente modificadas con una modificación
química, considerando que la incubación de dichas primera y segunda
enzimas termoestables modificadas en un tampón acuoso a pH alcalino
a temperatura inferior a 70ºC durante 10 minutos da lugar a un
aumento no significativo de la actividad de dichas primera y
segunda enzimas modificadas termoestables, en las que una incubación
a temperaturas superiores a 70ºC en un tampón acuoso a pH alcalino
da lugar al menos a un aumento del doble en la actividad enzimática
en menos de 10 minutos que permite la formación del producto de
extensión del cebador. Más abajo se describen las modificaciones
adecuadas que conducen a tales composiciones preferidas.
Los términos "ácido nucleico" y
"oligonucleótido" hacen referencia a los cebadores, sondas y
fragmentos oligómeros a detectar y se utilizarán de forma genérica
para referirse a los polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2-D-desoxirribosa, los
polirribonucleótidos (que contengan D-ribosa) y a
cualquier otro tipo de polinucleótidos que sean un
N-glucósido de una base purina o pirimidina, o base
purina o pirimidina modificada. No existe una distinción de
longitud entre los términos "ácido nucleico" y
"oligonucleótido" y estos términos serán utilizados
indistintamente. Estos términos hacen referencia a la estructura
primaria de la molécula solamente. De este modo, estos términos
incluyen el DNA monocatenario y bicatenario, así como RNA
monocatenario y bicatenario. Los oligonucleótidos pueden prepararse
mediante cualquier método adecuado. Se puede encontrar una revisión
de los métodos de síntesis en Goodchild, 1990, Bioconjugate
Chemistry 1(3):165-187.
El término "hibridación" se refiere a la
formación de una estructura bicatenaria formada por dos ácidos
nucleicos monocatenarios debido al apareamiento de bases
complementarias. La hibridación puede producirse entre cadenas de
ácidos nucleicos complementarias en su totalidad o entre cadenas de
ácidos nucleicos "sustancialmente complementarias" que
contienen regiones desapareadas mínimas. Las condiciones bajo las
cuales sólo se hibridarán las cadenas de ácidos nucleicos
totalmente complementarias se denominan "condiciones restrictivas
de hibridación" o "condiciones de hibridación específicas de
secuencia". Las cadenas dobles estables de secuencias
sustancialmente complementarias pueden obtenerse en condiciones de
hibridación menos restrictivas. Los expertos en el campo de los
ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad
considerando variables como por ejemplo, la longitud y la
concentración de bases de los oligonucleótidos, la fuerza iónica,
la incidencia de apareamiento erróneo de bases, siguiendo las
orientaciones que proporcionan las tecnologías de
vanguardia(véase, p. ej., Sambrook et al, 1989,
supra).
supra).
Generalmente, las condiciones restrictivas de
hibridación se escogen 5ºC por debajo del punto de fusión (Pf) para
la secuencia específica con una fuerza iónica y un pH definidos. El
Pf es la temperatura (bajo unas condiciones definidas de fuerza
iónica y pH) a la cual el 50% de los pares de bases están
disociados. En condiciones de hibridación menos restrictivas se
permite la formación de secuencias con apareamientos de bases
erróneos. El grado de apareamientos erróneos que se forman puede
controlarse mediante ajustes adecuados de las condiciones de
hibridación.
El término "cebador" hace referencia a un
oligonucleótido, ya sea natural o sintético, capaz de actuar como
punto de iniciación de la síntesis de DNA en condiciones en las que
la síntesis del producto de extensión del cebador complementario a
una cadena de ácido nucleico se induce, por ejemplo, en presencia de
cuatro nucleósidos trifosfato y un reactivo de polimerización (por
ejemplo, DNA-polimerasa o transcriptasa inversa)
con un tampón y una temperatura adecuados. Los análogos de
oligonucleótidos tal como los "ácidos nucleicos peptídicos",
pueden actuar como cebadores y quedan incluidos dentro del término
"cebador" tal como se utiliza aquí. Preferiblemente, un
cebador es un oligodesoxirribonucleótido monocatenario. La longitud
apropiada del cebador depende del uso que se pretende hacer del
cebador, pero oscila normalmente entre 6 y 50 nucleótidos. Las
moléculas de cebadores de pequeña longitud precisan temperaturas más
bajas para formar suficientes híbridos estables con el molde. No es
necesario que el cebador refleje la secuencia exacta del ácido
nucleico molde, pero debe ser suficientemente complementario para
que hibride con el molde.
El término "extensión del cebador" como es
utilizado aquí hace referencia a la síntesis de DNA procedente de
la polimerización de nucleósidos trifosfato individuales usando un
cebador como punto de iniciación y también a la unión de
nucleótidos adicionales al cebador para alargar el cebador. Como se
utiliza aquí, el término "extensión del cebador" pretende
englobar la ligación de dos oligonucleótidos para formar un
producto de más longitud que pueda servir como diana para los
futuros ciclos de la amplificación. Como se utiliza aquí, el
término "cebador" pretende englobar los oligonucleótidos
utilizados en los procesos de amplificación mediante ligación que
se extienden por la ligación de un segundo oligonucleótido que
hibrida en una posición adyacente.
Los cebadores pueden incorporar características
adicionales que permitan la detección o inmovilización del cebador,
pero sin alterar las propiedades básicas del cebador como la de
actuar como punto de iniciación de la síntesis de DNA. Por ejemplo,
los cebadores pueden contener una secuencia adicional de ácido
nucleico en el extremo 5'que no hibrida con el ácido nucleico
diana, pero facilita la clonación del producto amplificado. La
región del cebador que es suficientemente complementaria al molde
para hibridarse se la denomina aquí como región de hibridación.
Los términos "región diana" y "ácido
nucleico diana" hacen referencia a una región o subsecuencia de
un ácido nucleico que se amplifica. Al sitio de hibridación del
cebador se le hace referencia como la región diana de la
hibridación del cebador.
Como se usa aquí un cebador oligonucleótido es
"específico" para una secuencia diana si el número de
apareamientos erróneos presentes entre el oligonucleótido y la
secuencia diana es inferior al número de apareamientos erróneos
presentes entre los oligonucleótidos y las secuencias que no son
diana que puedan estar presentes en la muestra. Las condiciones de
hibridación pueden ser escogidas para formar cadenas dobles estables
sólo si el número de apareamientos erróneos presentes no es mayor
que el número de apareamientos erróneos presentes entre el
oligonucleótido y la secuencia diana. En tales condiciones los
oligonucleótidos pueden formar una cadena doble estable sólo con la
secuencia diana. De este modo, el uso de cebadores específicos de
la diana en condiciones de amplificación restrictivas adecuadas
permite la amplificación específica de aquellas secuencias diana
que contienen los sitios de unión diana del cebador. El empleo de
condiciones de amplificación específicas de secuencia hace posible
la amplificación específica de aquellas secuencias diana que
contienen exactamente los sitios de unión complementarios al
cebador.
El término "amplificación inespecífica"
hace referencia a la amplificación de secuencias de ácido nucleico
distintas a la secuencia diana que resulta de la hibridación de los
cebadores con otras secuencias distintas a la secuencia diana y que
sirven así como sustrato para la extensión del cebador. Se hace
referencia a la hibridación de un cebador con una secuencia que no
es la diana como "hibridación inespecífica" y puede tener
lugar en condiciones de baja temperatura, restricción reducida y en
la prerreacción.
El término "enzima termoestable" hace
referencia a una enzima que es relativamente estable al calor. Las
enzimas termoestables pueden soportar las altas temperaturas de
incubación utilizadas para extraer los grupos modificadores,
generalmente superiores a 50ºC, sin sufrir una pérdida de actividad
irreversible. Las enzimas termoestables modificadas utilizadas en
los métodos de la presente invención incluyen
DNA-polimerasas termoestables y exonucleasas
termoestables.
El término "DNA-polimerasa
termoestable" hace referencia a una enzima que es relativamente
estable al calor y cataliza la polimerización de nucleósidos
trifosfato para formar los productos de extensión del cebador que
son complementarios a una de las cadenas de ácidos nucleicos de la
secuencia diana. Las enzimas inician la síntesis en el extremo
3'del cebador y avanzan en dirección al extremo 5' del molde hasta
que la síntesis finaliza. Las DNA-polimerasas
termoestables purificadas se hallan descritas en las patentes US 4
889 818, US 5 352 600, US 5 079 352, PCT/US90/07639, PCT/US91/05753,
PCT/US91/0703, PCT/US91/07076, patente estadounidense pendiente de
aprobación con núm. de serie 08/062368, WO 92/09689, y US 5 210
036.
El término "exonucleasa
3'-5'termoestable" hace referencia a una enzima
que es relativamente estable al calor y actúa como una enzima
correctora de apareamientos erróneos si se utiliza en la PCR en una
mezcla con la DNA-polimerasa. La exonucleasa
3'-5' termoestable extrae ácidos nucleicos apareados
erróneamente del extremo 3' de la cadena de ácido nucleico
creciente durante la amplificación. Tal exonucleasa
3'-5' termoestable se halla descrita p. ej.
en WO 01/23583.
Una enzima "derivada" de un organismo hace
referencia aquí a una enzima que es purificada de este organismo o
una versión recombinante de una enzima que se purifica del organismo
e incluye enzimas en las que la secuencia de aminoácidos ha sido
modificada mediante técnicas de biología molecular.
Se prefiere que la proporción entre dicha
primera enzima y dicha segunda enzima de la novedosa composición
oscile en un intervalo de 1:10 a 1:75.
Para enzimas derivadas de otras fuentes y para
otros métodos de modificación química pueden aplicarse diferentes
proporciones de enzimas.
La modificación química de dichas enzimas puede
llevarse a cabo en tampones y en condiciones alcalinas a temperatura
aproximadamente inferior a 25ºC. Los componentes del tampón que
pueden ser utilizados incluyen el Tris-HCl a un pH
de 7,5 a 9,5 aproximadamente. Pueden incluirse también componentes
adicionales como el KCl, preferiblemente alrededor de 100 mM a 1 M,
o detergentes, preferiblemente Tween 20 del 0,1 al 2%,
aproximadamente.
Las modificaciones químicas de dichas primera y
segunda enzimas pueden obtenerse mediante incubación de dichas
enzimas a concentraciones de 0,1 a 10 mg/ml, preferiblemente de 0,5
a 5 mg/ml con el reactivo modificador. El reactivo modificador
puede utilizarse con una relación molar
(proteína-modificador-reactivo) de
1:10 a 1:200, preferiblemente de 1:10 a 1:100. Sin embargo, pueden
aplicarse concentraciones y condiciones diferentes para diferentes
proteínas y reactivos modificadores.
Tras la modificación química la solución
proteica puede separarse por diálisis frente al tampón de
almacenamiento. Los tampones de almacenamiento pueden contener
Tris-HCl a un pH de alrededor de 7,5 a 10,
preferiblemente de 8,5 a 9,5 y a una concentración de 10 a 500 mM,
preferiblemente alrededor de 20 a 50 mM. Adicionalmente, los
tampones de almacenamiento pueden contener sales, preferiblemente
KCl a una concentración de 10 a 500 mM y otros aditivos como los
detergentes, preferiblemente Tween 20, reactivos protectores de
grupos SH, glicerol y EDTA.
Se pueden obtener mezclas de dichas enzimas
mediante la mezcla de las soluciones enzimáticas. Se puede realizar
una dilución adicional para obtener la mezcla enzimática adecuada.
En una realización preferida de la invención la mezcla contiene
polimerasa y exonucleasa a una proporción en volumen dentro del
intervalo comprendido entre 10:1 y 75:1. La
DNA-polimerasa se utiliza según la actividad en un
volumen adecuado, preferiblemente de 5 a 20 unidades/\mul y se
mezcla con una solución de exonucleasa con la concentración adecuada
(preferiblemente de 1 a 10 mg/ml). Sin embargo, se pueden utilizar
concentraciones y proporciones diferentes para obtener mezclas
enzimáticas útiles de acuerdo a la invención.
En una realización preferida de la invención
dichas primera y segunda enzimas termoestables modificadas aceptan
la d-UTP como sustrato en las reacciones de
elongación de la cadena. De acuerdo a la presente invención se
prefiere que dicha primera enzima modificada termoestable sea una
exonucleasa 3'-5' procedente de Archaeoglobus
fulgidus y mientras dicha segunda enzima modificada termoestable
sea una DNA-polimerasa procedente de
Thermus aquaticus.
Una realización de la presente invención es una
"mezcla de reacción" que abarca la novedosa composición. El
término "mezcla de reacción" hace referencia a una solución que
contiene reactivos necesarios para que se lleve a cabo una reacción
dada. Una "mezcla de reacción para la amplificación" hace
referencia a una solución que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo una reacción de amplificación y generalmente contiene
cebadores oligonucleótidos y DNA-polimerasa en un
tampón adecuado. Una "mezcla de reacción para PCR"
generalmente contiene cebadores oligonucleótidos,
DNA-polimerasa termoestable, dNTP y un catión
metálico divalente en un tampón adecuado. Se considera que una
reacción de mezcla es completa si contiene todos los reactivos
necesarios para hacer posible la reacción e incompleta si sólo
contiene una parte de los reactivos necesarios. Los expertos en la
materia serán conocedores de que los componentes de reacción se
almacenan rutinariamente como soluciones separadas, cada una
contiene una parte de los componentes totales por razones de
comodidad y estabilidad durante el almacenamiento y para permitir el
ajuste independiente de las concentraciones de los componentes
dependiendo de su aplicación, es más, los componentes de la reacción
se combinan previamente a la reacción para crear una mezcla de
reacción
completa.
completa.
Los métodos de la presente invención incluyen
llevar a cabo una reacción de amplificación utilizando enzimas
termoestables activadas mediante calor en los que, o bien la segunda
enzima activa, o bien la composición enzimática, es necesaria para
la extensión del cebador. Previamente a la incubación a elevada
temperatura que activa la enzima, la mezcla de reacción en la
amplificación no permite la extensión del cebador y no se forman
productos de extensión inespecíficos ni ningún otro. Tras la
incubación a alta temperatura que reactiva las enzimas, la reacción
de amplificación se mantiene a alta temperatura, la cual asegura la
especificidad de reacción. Por lo tanto los productos de extensión
del cebador se forman sólo en condiciones que aseguran la
especificidad de la amplificación.
En los métodos de la presente invención, la
segunda enzima activada mediante calor, en su estado activo,
cataliza la reacción de extensión del cebador. Para el uso en
reacciones de amplificación típicas, p. ej., una PCR, la segunda
enzima termoestable activada mediante calor posee en su estado
activo actividad DNA-polimerasa.
Otra realización de la presente invención es un
equipo para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa
que incluye la novedosa composición.
La presente invención también está relacionada
con equipos, unidades multicompartimento que contienen componentes
útiles para poner en práctica el presente método. Un equipo útil
consta de enzimas termoestables reversiblemente inactivadas y uno o
varios reactivos para llevar a cabo la reacción de amplificación,
tales como cebadores oligonucleótidos, sustrato de nucleósidos
trifosfato, cofactores y un tampón adecuado.
El número de ciclos térmicos puede oscilar
aproximadamente entre 18 y 50 ciclos, dependiendo de la cantidad de
DNA molde y su pureza.
El novedoso método es relativamente insensible a
varios tampones y concentraciones de desoxinucleótidos y
didesoxinucleótidos.
Entre los componentes del tampón que pueden
utilizarse se encuentran: Tris-HCl a un pH de
alrededor de 7,5 a 9,5 y a una concentración aproximada de 50 a 500
mM, preferiblemente alrededor de 100 a 250 mM; MgCl_{2} a una
concentración de 2 a 6 mM aproximadamente; DMSO a una concentración
aproximada de 1 a 5% del volumen de reacción, M, betaína a una
concentración aproximada de 0,3 mM, opcionalmente alrededor de 0,05
mM, mercaptoetanol al 1%, Tween 20 alrededor del 0,28% y Nonidet40
alrededor del 0,02%. Sin embargo, los componentes del tampón no se
limitan a estos.
La desacilación de los grupos amino modificados
está provocada por el aumento de la temperatura y el descenso
concomitante del pH. Las reacciones de amplificación generalmente se
realizan en un tampón de Tris-HCl formulado a un pH
de 7,5 a 9 a temperatura ambiente. A temperatura ambiente, las
condiciones alcalinas del tampón de la reacción favorecen la forma
acilada del grupo amino. Aunque el pH del tampón de la reacción se
ajusta a un pH de 7,5 a 9 a temperatura ambiente, el pH de un
tampón de reacción Tris-HCl disminuye al aumentar la
temperatura. Por lo tanto, el pH del tampón de la reacción
disminuye a temperaturas elevadas en las que se realiza la
amplificación, en particular, en la incubación donde se produce la
activación. El descenso del pH del tampón de la reacción favorece
la desacilación de los grupos amino.
El cambio de pH resultante de las condiciones de
reacción a alta temperatura depende del tampón utilizado. La
dependencia del pH según la temperatura de varios tampones
utilizados en reacciones biológicas se describe en Good et
al.,1966, Biochemistry 5(2):467-477. Para
estos tampones las variaciones en la pKa, es decir, el pH que se
encuentra a mitad del intervalo de pH en el que actúan, está
relacionado con la temperatura de la manera
siguiente: .\Delta.pKa/ºC=-0,031. Por ejemplo el tampón Tris obtenido a 25ºC experimenta un descenso en el pKa de 2,17 al elevar la temperatura a 95ºC para la activación durante la incubación.
siguiente: .\Delta.pKa/ºC=-0,031. Por ejemplo el tampón Tris obtenido a 25ºC experimenta un descenso en el pKa de 2,17 al elevar la temperatura a 95ºC para la activación durante la incubación.
Aunque las reacciones de amplificación se
realizan generalmente en tampón Tris-HCl pueden
realizarse con tampones que muestran un mayor o menor cambio en el
pH según la temperatura. Según el tampón utilizado, se requiere una
enzima modificada más o menos estable. Por ejemplo, al utilizar un
reactivo modificador que da lugar a una enzima modificada menos
estable, permite la recuperación de suficiente actividad enzimática
con pequeños cambios de pH en el tampón. Una comparación empírica
de la estabilidad relativa de las enzimas modificadas con varios
reactivos, como se muestra más arriba, sugiere la selección de una
enzima modificada adecuada para su uso en determinados tampones.
En una realización especialmente preferida de
esta invención se añaden sustancias a la mezcla de reacción que
hacen descender el punto de fusión del DNA, tales sustancias pueden
ser por ejemplo la glicerina, la trehalosa y otras sustancias tales
como la betaína o el DMSO, conocidos por los expertos en la
materia.
Es posible seleccionar los desoxinucleótidos
dGTP, dATP, dTTP y dCTP, aunque no se limita a estos. Sin embargo,
de acuerdo a la invención, también es posible utilizar derivados de
desoxinucleótidos. Los derivados de desoxinucleótidos se definen
como aquellos desoxinucleótidos o desoxinucleótidos modificados que
pueden ser incorporados por una DNA-polimerasa
termoestable en la molécula de DNA en crecimiento que se sintetizan
en una reacción usando un termociclador. Son ejemplos de derivados
de desoxinucleótidos los tionucleótidos,
7-deaza-2'-dGTP,
7-deaza-2'-dATP,
así como la desoxiinosina trifosfato, que también pueden ser
utilizados como sustitutos de dATP, dGTP, dTTP o dCTP. Sin embargo,
los derivados de los desoxinucleótidos no se limitan a estos
ejemplos. En una realización preferida de la invención se usa dUTP
como sustituto de dTTP para producir DNA que contenga uracilo
(U-DNA) en las reacciones de síntesis de ácidos
nucleicos como las reacciones de amplificación, p. ej. la
PCR.
Los desoxinucleótidos y derivados mencionados
anteriormente se utilizan preferiblemente en concentraciones
aproximadas de 100 \muM a 4 mM.
Otra realización de la presente invención es un
método para la amplificación de ácidos nucleicos diana contenidos
en una muestra que consta de las siguientes fases:
- poner en contacto dicha muestra con una mezcla
de reacción de amplificación que consiste en un cebador
complementario a dicha secuencia diana de ácido nucleico,
desoxinucleótidos o derivados de estos y la novedosa composición de
dicha primera enzima modificada termoestable y dicha segunda enzima
modificada termoestable.
- incubar la muestra y la mezcla de
amplificación a una temperatura superior a 50ºC aproximadamente
durante un tiempo suficiente para reactivar dichas primera y
segunda enzimas termoestables modificadas y permitir así la
formación de productos de extensión del cebador.
En una realización preferida del novedoso método
dicha primera enzima modificada termoestable es una exonucleasa
3'-5' procedente de Archaeoglobus fulgidus
ydicha segunda enzima modificada termoestable es una
DNA-polimerasa tipo Pol I procedente de Thermus
aquaticus.
\newpage
En una realización preferida del novedoso método
uno de los desoxinucleótidos o derivados de estos en la mezcla de
amplificación es dUTP y no dTTP.
La novedosa composición se puede utilizar para
la amplificación de un ácido nucleico. En una realización preferida,
una amplificación mediante PCR se lleva a cabo utilizando una
DNA-polimerasa termoestable reversiblemente
inactivada y una enzima termoestable reversiblemente inactivada que
muestra actividad exonucleasa 3'. Generalmente la temperatura de
hibridación utilizada en una reacción de amplificación mediante PCR
es de alrededor de 55-75ºC y la reacción de
preincubación se lleva a cabo a temperatura igual o superior a la
temperatura de hibridación, preferiblemente a temperatura superior
a 90ºC aproximadamente. La mezcla de reacción para la amplificación
se incuba preferiblemente alrededor de 90-100ºC
hasta 12 minutos aproximadamente para reactivar las enzimas
modificadas con anterioridad a la temperatura del inicio de los
ciclos.
La primera fase en una amplificación típica
mediante PCR consiste en desnaturalizar mediante calor el ácido
nucleico diana bicatenario. Las condiciones exactas que se requieren
para la desnaturalización de la muestra de ácido nucleico dependen
de la longitud y composición de la muestra de ácido nucleico.
Generalmente, una incubación a 90-100ºC durante 10
segundos hasta 4 minutos es efectiva para desnaturalizar
completamente la muestra de ácido nucleico. La fase de
desnaturalización inicial puede servir como prerreacción de
incubación para reactivar la DNA-polimerasa. Sin
embargo, dependiendo de la duración y la temperatura de la fase
inicial de desnaturalización y del reactivo modificador utilizado
para inactivar las enzimas, la recuperación de la actividad
enzimática puede ser incompleta. Si se desea una recuperación máxima
de la actividad enzimática, la reacción de preincubación puede
extenderse o, alternativamente, el número de ciclos de amplificación
puede aumentarse.
En una realización preferida de la invención,
las enzimas modificadas y las condiciones iniciales de
desnaturalización se escogen de tal modo que sólo una fracción de
la actividad enzimática recuperable se recupera durante la fase de
incubación inicial. Los ciclos posteriores de una PCR, en cada uno
de los cuales se incluye una fase de desnaturalización a alta
temperatura, tienen como resultado una recuperación mayor de la
actividad enzimática. De este modo, la activación de la actividad
enzimática sufre un retraso en los ciclos iniciales de la
amplificación. Se ha observado que esta "liberación
progresiva" de la actividad de la DNA-polimerasa
contribuye al descenso de las amplificaciones inespecíficas. Se
sabe que un exceso de DNA-polimerasa contribuye a la
amplificación inespecífica. En los presentes métodos, la cantidad
de actividad DNA-polimerasa presente es baja
durante las fases iniciales de la amplificación cuando el número de
secuencias diana es bajo, lo que reduce la cantidad de productos de
extensión inespecíficos que se forman. La actividad
DNA-polimerasa máxima está presente durante los
últimos estadios de la amplificación cuando el número de secuencias
diana es elevado, lo que hace posible un rendimiento alto de la
amplificación. Si fuera necesario, el número de ciclos de
amplificación puede aumentar para compensar la baja actividad
DNA-polimerasa presente en los ciclos iniciales.
Una ventaja de los métodos de la presente
invención es que los métodos no requieren manipulación de la mezcla
de reacción tras la preparación inicial de ésta. Por lo tanto, los
métodos son ideales para su uso en sistemas de amplificación
automatizados y con métodos de amplificación in situ, en los
que la adición de reactivos tras la fase de desnaturalización
inicial o el uso de barreras de cera no es conveniente ni
práctico.
Los métodos de la presente invención son
particularmente adecuados para reducir la amplificación inespecífica
y para prevenir la contaminación "por arrastre" en la PCR. Sin
embargo, la invención no está restringida a un sistema de
amplificación en particular. Las enzimas inactivadas reversiblemente
de la presente invención pueden ser utilizadas en cualquier sistema
de amplificación basado en cebadores que use enzimas termoestables
y basado en la temperatura de reacción para alcanzar la
especificidad en la amplificación. Los presentes métodos pueden ser
aplicados a sistemas de amplificación isotérmicos que utilicen
enzimas termoestables. Sólo se requiere una incubación transitoria
a temperatura elevada para recuperar la actividad enzimática. Tras
mantener la mezcla de reacción en incubación a alta temperatura
para recuperar la actividad enzimática, la reacción se realiza a
una temperatura de reacción apropiada.
Otros métodos de amplificación además de la PCR
(patentes estadounidenses US 4 683 195, US 4 683 202 y US 4 965
188) incluyen los siguientes, aunque no están limitados a éstos:
reacción en cadena de la ligasa (LCR, Wu y Wallace, 1989, Genomics
4:560-569 y Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:189-193); reacción en cadena de la
polimerasa-ligasa (Barany, 1991, PCR Methods and
Applic. 1:5-16); Gap-LCR
(publicación PCT de la patente núm. WO 90/01069); reacción en
cadena de reparación (publicación de la patente europea núm. 439
182 A2), 3SR (Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173-1177; Guatelli et al.1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878;
Publicación PCT de la patente núm. WO 92/0880A), y NASBA (Patente
estadounidense núm. 5 130 238). Esta invención no se limita a ningún
sistema de amplificación en particular. A medida que otros sistemas
se desarrollen estos sistemas pueden beneficiarse del uso de esta
invención. Una encuesta reciente sobre sistemas de amplificación
fue publicada en Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in
Biotechnology 4:41-47.
Los métodos de preparación de muestras adecuados
para cada reacción de amplificación en este campo (véase, por
ejemplo Sambrook et al., supra, y las referencias que
describen los métodos de amplificación citadas más arriba). Se
describen métodos rápidos y simples de preparación de muestras para
la amplificación de secuencias diana por PCR en Higuchi, 1989, en
PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York), y en
PCR Protocols, Chapters 18-20 (Innis et
al., ed., Academic Press, 1990). Una persona experta en la
materia será capaz de seleccionar y optimizar empíricamente un
protocolo adecuado.
Los métodos para la detección de productos de
amplificación han sido ampliamente descritos en la bibliografía.
Los métodos estándar incluyen análisis por electroforesis en gel o
por hibridación con sondas de oligonucleótidos. La detección de
híbridos formados entre sondas y un ácido nucleico amplificado
pueden realizarse en variedad de tipos distintos de ensayos,
incluyendo el ensayo dot-blot y
dot-blot inverso (véase Saiki et al., 1986,
Nature 324:163-166; Saiki et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230; publicación PCT de
la patente núm. 89/11548; patentes estadounidenses US 5 008 182 y US
5 176 775; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (ed.
Innis et al., Academic Press, San Diego,
CA):337-347. Los métodos de dot-blot
inverso utilizan placas de poliestireno y se describen en la
patente estadounidense pendiente de publicación con núm. de serie
141 355, la patente estadounidense US 5 232 829; Loeffelholz et
al., 1992, J. Clin. Microbiol.
30(11):2847-2851; Mulder et al., 1994,
J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300; y
Jackson et al., 1991, AIDS 5:1463-1467.
Otro método de ensayo adecuado, que hace
referencia a un ensayo nucleasa 5' se describe en la patente
estadounidense US 5 210 015; y Holland et al., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. En
el ensayo nucleasa 5', las sondas marcadas son degradadas
concomitantemente con la extensión del cebador por la actividad 5'-
3' exonucleasa de la DNA-polimerasa, p. ej.,
DNA-polimerasa Taq. La detección del producto
de degradación de la sonda indica que tienen lugar la hibridación
entre la sonda y el DNA diana y la reacción de amplificación. Las
patentes estadounidenses pendientes de aprobación con número de
serie 08/299 682, archivada el 1 de septiembre de 1994, y 08/347
657, archivada el 23 de noviembre de 1994 describen métodos
mejorados para detectar la degradación de la sonda que tiene lugar
concomitantemente a la amplificación.
Un método alternativo para detectar la
amplificación del ácido nucleico mediante el control del aumento en
la cantidad total de DNA bicatenario en la mezcla de reacción se
describe en Higuchi et al., 1992, Bio/Technology
10:413-417; Higuchi et al., 1993,
Bio/Technology 11:1026-1030; y en las publicaciones
de las patentes europeas núm. 487 218 y 512 334. La detección de
DNA diana bicatenario se basa en el aumento de la fluorescencia que
el bromuro de etidio (EtBr) y otros marcadores de unión a DNA
muestran cuando están unidos al DNA bicatenario. El aumento de DNA
bicatenario que resulta de la síntesis de secuencias diana da lugar
a un aumento detectable de fluorescencia. Un problema de este
método es que la síntesis de secuencias que no son diana, p. ej.
amplificaciones inespecíficas, que tienen como resultado un aumento
de la fluorescencia interfieren con la determinación del aumento de
fluorescencia resultante de la síntesis de secuencias diana. De este
modo, los métodos de la presente invención son particularmente
útiles porque reducen la amplificación inespecífica, minimizando así
el aumento de la fluorescencia resultante de la amplificación de
secuencias que no son diana.
Los ejemplos de la presente invención que se
presentan más abajo se facilitan con fines explicativos y no
limitan el alcance de la invención. Para los expertos en la materia,
la lectura del texto y de los ejemplos siguientes revelará
numerosas realizaciones de la invención que se encuentran dentro del
ámbito de las reivindicaciones que se describen tras los
ejemplos.
Figura 1: Ensayo de actividad de FS Exo III
Leyenda:
MWM: Marcador de peso molecular II (Roche
Diagnostics GmbH, Cat. Núm. 236250)
Carril A: muestras almacenadas en hielo
Carril B: muestras incubadas durante 3 h a
80ºC
Carril C: mezcla de reacción (control)
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Reactivación dependiente de
temperatura de FS Exo III.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Reactivación dependiente de
temperatura de FS Taq
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: PCR (CF-31)
Leyenda:
MWM VIII: Marcador de peso molecular VIII (Roche
Diagnostics GmbH, Cat. Núm. 1336045)
Carril 1: amplificación usando la
DNA-polimerasa Taq
Carril 2: amplificación usando la mezcla
Taq/Exo III
Carril A: reacción de amplificación
Carril B: control negativo (amplificación sin
DNA genómico humano)
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5: (reparación de bases erróneas)
Carril 1: amplificación usando la
DNA-polimerasa Taq
Carril 2: amplificación usando el sistema
Expand High Fidelity PCR System
Carril 3: amplificación usando la mezcla
Taq/Exo III
Carril 4: amplificación usando la mezcla FS
Taq/FS Exo III
Carril A: reacción de amplificación
Carril B: reacción de amplificación tratada con
BsiEI
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: descontaminación con la UNG
MWM VIII: Marcador de peso molecular VIII (Roche
Diagnostics GmbH)
Carril 1: producto PCR sin tratamiento de
UNG
Carril 2: producto PCR con tratamiento de
UNG
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7: amplificación PCR de Epo, FS
Taq/FS Exo III
MWM VI: Marcador de peso molecular VI (Roche
Diagnostics GmbH)
Carril 1: 100 ng de DNA genómico humano
Carril 2: 50 ng de DNA genómico humano
Carril 3: 10 ng de DNA genómico humano
Carril 4: 5 ng de DNA genómico humano
Carril 5: 1 ng de DNA genómico humano
Carril 6: 0 ng de DNA genómico humano
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8: amplificación PCR de Epo,
Taq/Exo III
MWM VI: Marcador de peso molecular VI (Roche
Diagnostics GmbH)
Carril 1: 100 ng de DNA genómico humano
Carril 2: 50 ng de DNA genómico humano
Carril 3: 10 ng de DNA genómico humano
Carril 4: 5 ng de DNA genómico humano
Carril 5: 1 ng de DNA genómico humano
Carril 6: 0 ng de DNA genómico humano
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9: amplificación por PCR de tPA, FS
Taq/FS Exo III
MWM II: Marcador de peso molecular II (Roche
Diagnostics GmbH)
Carril 1: 100 ng de DNA genómico humano
Carril 2: 50 ng de DNA genómico humano
Carril 3: 10 ng de DNA genómico humano
Carril 4: 5 ng de DNA genómico humano
Carril 5: 1 ng de DNA genómico humano
Carril 6: 0 ng de DNA genómico humano
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10: amplificación PCR de tPA,
Taq/Exo III
MWM II: Marcador de peso molecular II (Roche
Diagnostics GmbH)
Carril 1: 100 ng de DNA genómico humano
Carril 2: 50 ng de DNA genómico humano
Carril 3: 10 ng de DNA genómico humano
Carril 4: 5 ng de DNA genómico humano
Carril 5: 1 ng de DNA genómico humano
Carril 6: 0 ng de DNA genómico humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la modificación química de
Exo III utilizando anhídrido cis-aconítico. En los
ejemplos I y III se describen determinaciones cuantitativas de la
actividad de la Exo III derivada, que indica la proporción molar
entre el modificador y la enzima en la reacción de inactivación que
se requiere para obtener la inactivación completa de la actividad
Exo III.
La Exo III recombinante se puede purificar de
E. coli LE 392 (Roche Strain BMTU 7369) como se describe,
p. ej. en la patente WO 0 123 583. La Exo III se utilizó a
una concentración de 1,3 mg/ml en Tris 50 mM, KCl 300 mM, EDTA 1
mM, Tween 20 0,2%, a pH 8,0 y 25ºC.
El anhídrido cis-aconítico se
encuentra disponible en el Mercado (Sigma A-3413,
Alemania).
Para un conjunto de reacciones de modificación
el anhídrido cis-aconítico se disolvió en metanol
(Merck) a las siguientes concentraciones: 26,9 mg/ml, 40,3 mg/ml,
53,8 mg/ml, 80,7 mg/ml, 107,6 mg/ml.
Para cada solución de las series, se añadieron
72 \mul de anhídrido cis-aconítico a una solución
de 7,2 ml de Exo III, dando lugar a soluciones que contienen
proporciones molares entre la Exo III y el anhídrido
cis-aconítico de aproximadamente 1:40, 1:60, 1:80,
1:120 y 1:160. Las soluciones se incubaron durante una noche a 4ºC
para inactivar la Exo III. Tras las modificaciones químicas se
practicó una diálisis de la enzima frente al tampón de
almacenamiento (Tris 20 mM, KCl 250 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween
20 0,2%, glicerol 50%, a pH 9,0 y 25ºC). La concentración final
después de la diálisis fue de 4,9 mg/ml. Para la enzima modificada
químicamente se utilizó el término FastStart Exo III (FS Exo
III).
En este ensayo se controló la degradación de un
fragmento lineal de DNA mediante actividad exonucleasa. Este
ejemplo describe el ensayo de actividad de la FS Exo III antes y
después de la reactivación de la FS Exo III mediante calor en la
fase de incubación. Las muestras de FS Exo III modificada (1:40,
1:60, 1:80, 1:120 y 1:160) y Exo III (sin modificar; 4,5 mg/ml) se
diluyeron, respectivamente, a una proporción de 1:10 y 1:45 en un
tampón compuesto de Tris 50 mM, KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgCl_{2} 2 mM. El pH del
tampón era 8,3 a temperatura ambiente (FastStart Taq DNA
Polymerase PCR buffer; Roche Applied Science (RAS), Cat. Núm.
2158264). Se incubaron muestras diluidas de FS Exo III y Exo III a
80ºC durante 3 horas. Adicionalmente, se almacenaron muestras en
hielo como control.
Tampón B SuRE/Cut (10 x conc.; RAS, Cat. núm.
1417967): 80 \mul
pBR 322 DNA (277 ng/\mul; RAS, Cat. núm.
481238): 576 \mul
Bam HI (40 U/\mul; RAS, Cat. Núm.
798975): 16 \mul
Agua: 128 \mul
La mezcla fue incubada durante 20 minutos a 37ºC
y el DNA fragmentado fue purificado con el equipo High Pure PCR
Purification Kit (RAS, Cat. Núm. 1732668). La concentración final
del DNA fragmentado (pBR 322 x Bam HI) fue 141,5 ng/\mul.
Tampón de PCR Expand High Fidelity (10 x conc.;
RAS, Cat. Núm.1732641): 150 \mul
Sustrato (pBR 322 x Bam HI; 141,5
ng/\mul): 105 \mul
Agua: 1095 \mul
Se añadieron 10 \mul de la dilución de la
enzima a 90 \mul de la mezcla de reacción (véase arriba). Tras 3
horas de incubación a 65ºC se detuvo la reacción con 10 \mul de
urea. Una alícuota de la reacción (20 \mul) se analizó en un gel
de agarosa al 0,5% (figura 1).
En condiciones experimentales la exonucleasa
modificada químicamente no mostró actividad residual. Tras la
incubación a 80ºC durante 3 horas la exonucleasa se reactiva y se
observa la actividad. El grado de actividad residual depende de la
proporción molar de reactivo modificador utilizado. El grado de
degradación del sustrato de DNA lineal indica que para proporciones
más bajas de modificación se observa una actividad mayor tras la
reac-
tivación.
tivación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la modificación química de
la DNA-polimerasa Taq utilizando anhídrido
cis-aconítico. La DNA-polimerasa
Taq recombinante purificada de E. coli fue utilizada a
una concentración de 1,22 mg/ml en Tris 50 mM, KCl 300 mM, EDTA 1
mM, Tween 20 0,2%, a pH 8,0 y 25ºC.
Para la reacción de modificación, se disolvió
anhídrido cis-aconítico en metanol con una
concentración final de 22,0 mg/ml. Se añadieron 1061 \mul de
solución de anhídrido cis-aconítico a 106,1 ml de
solución de DNA-polimerasa Taq. La solución
se incubó durante la noche a 4ºC para inactivar la Taq. Tras
la modificación química se le aplicó una diálisis a la enzima
frente al tampón de almacenamiento (Tris 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 0,1
mM, DTT 1 mM, Tween 20 al 0,2%, glicerol al 50% a pH 9,0 y 25ºC).
Después de la diálisis la muestra se diluyó a una proporción de
1:29 con el tampón de almacenamiento. Se utilizó el término
DNA-polimerasa Taq FastStart
(FS Taq).
(FS Taq).
La actividad de la FS Taq se determinó
cuantitativamente como se describe en el ejemplo IV. La enzima fue
incubada a 80ºC durante 3 horas para activar la actividad
polimerasa. La enzima fue diluida (1:300-1:700) en
tampón de almacenamiento y la actividad fue determinada como se
describe más abajo. Las muestras enzimáticas que no fueron
incubadas a 80ºC durante 3 horas no mostraron actividad (<
1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la actividad exonucleasa las
muestras enzimáticas fueron incubadas con 1 \mug de DNA marcado
con ^{3}H durante 1 hora a 65ºC y determinó la cantidad de
nucleótidos liberados marcados con ^{3}H.
La FS Exo III (modificación de 1:40; c = 4,9
mg/ml) fue diluida a una proporción de 1:10 en tampón de PCR
DNA-polimerasa Taq FastStart (RAS, Cat. Núm.
2 158 264). Se incubaron durante 10 minutos alícuotas de 100 \mul
a diferentes temperaturas (65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC, 90ºC y
95ºC).
Mezcla de reacción (10 x)
Tampón de PCR Expand High Fidelity
(10 x conc., RAS, Cat. Núm. 1 732 641): 100
\mul
^{3}H-DNA (ca. 0,25
\mug/\mul): 200 \mul
Agua: 340 \mul.
Se añadieron muestras de la exonucleasa
preincubada (36 \mul, que corresponden a 18 \mul de FS Exo III)
a alícuotas de la mezcla de reacción (64 \mul). Tras incubar
durante 1 hora a 65ºC se enfriaron las muestras en hielo. El DNA se
precipitó al añadir 100 \mul de DNA de esperma de arenque (1
mg/ml) y 300 \mul de solución TCA. Tras el almacenamiento en
hielo durante 20 minutos se centrifugaron las muestras. Se
extrajeron alícuotas del sobrenadante (400 \mul) y se
determinaron cuantitativamente en 2 ml de fluido de centelleo
mediante un detector \beta (Formula 989, Packard Bioscience B.V.).
Para determinar cuantitativamente la tasa de reactivación de la FS
Exo III se calcularon los valores de \Deltacpm.
En condiciones experimentales se observó la
reactivación de FS Exo III a temperaturas de incubación superiores
a 70ºC. A temperaturas de hasta 70ºC no se observó activación (véase
la figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
En esta prueba para determinar la actividad de
la FS Taq se incorporan mediante actividad polimerasa
nucleótidos sin marcar y marcados con
\alpha^{32}P-dCTP a un DNA sintético. Se utiliza
como sustrato un híbrido molde-cebador. El híbrido
molde-cebador está formado por DNA M13mp9ss
hibridado con un cebador M13 secuenciador de (5'- GTA AAA CGA CGG
CCA GT-3'). El producto de síntesis se precipita con
TCA y el \alpha32P-dCTP incorporado se determina
cuantitativamente utilizando un detector de centelleo.
La FS Taq (5 U/\mul, RAS, Cat. núm.
2158264) se diluyó a una proporción de 1:10 en tampón PCR
DNA-polimerasa Taq FastStart; RAS, 10 Cat.
núm. 2158264). Se incubaron alícuotas de 50 \mul durante 10
minutos a diferentes temperaturas (65 C, 70 C, 75ºC, 80ºC, 85ºC, 90
C, 95ºC). Tras la preincubación las muestras fueron diluidas a una
proporción de 1:30 en tampón de almacenamiento (Tris 20 mM, KCl 100
mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween 20 0,2%, glicerol 50% a pH 9,0 y
25ºC).
Las reacciones se realizaron con un volumen de
50 \mul que contenía los siguientes reactivos:
Tris 67 mM, pH 8,3 a 25ºC, MgCl_{2} 5 mM,
mercaptoetanol 10 mM, polidocanol 0,2%, gelatina 0,2 mg/ml, dATP
200 \muM, dCTP 100 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, mix
DNA/cebador (1 \mug DNA, 0,3 \mug cebador) y
\alpha^{32}P-dCTP (1 \muCi).
Se añaden 3 \mul de las diluciones de la
enzima a la solución test mix, se mezclan bien y se incuban durante
60 minutos a 65ºC. Tras la incubación las muestras se colocaron en
hielo y el DNA se precipitó con un 10% de solución TCA. Las muestras
se filtraron mediante filtros GFC (Whatman), se lavaron los filtros
3 veces con TCA al 5%, se dejaron secar y se realizó un recuento en
el contador \beta en 2 ml de fluido de centelleo. Los valores de
\Deltacpm se usaron para determinar cuantitativamente la tasa de
reactivación de la FS Taq.
En condiciones experimentales la reactivación de
la FS Taq se observa a temperaturas de incubación superiores
a los 80ºC. A temperaturas hasta los 80ºC no se observa activación
(véase la figura 3).
\newpage
La Taq/Exo III se utilizó a una
proporción de 10:1 para reacciones de amplificación.
Se mezclaron alícuotas de 90 \mul de
DNA-polimerasa Taq (5 U/\mul, RAS, Cat.
núm. 1146173) con alícuotas de 10 \mul de Exo III (1 mg/ml) y se
almacenaron a -20ºC.
La FS Taq/FS Exo III se utilizó a
proporciones de 10:1 y 75:1.
Las alícuotas a una proporción de 10:1 (90
\mul) de DNA-polimerasa FastStart (5 U/\mul,
RAS, Cat. núm. 2 032 929) se mezclaron con alícuotas (10 \mul) de
Exo III (modificación de 1:40, 4,9 mg/ml). Las alícuotas a una
proporción de 75:1, se mezclaron 74 \mul de
DNA-polimerasa Taq FastStart con 1 \mul de
FS Exo III. Las mezclas enzimáticas se almacenaron a -20ºC.
1)Este ejemplo describe el uso de la
DNA-polimerasa Taq, la mezcla Taq/Exo
III (10:1) y la mezcla FS Taq/FS Exo III (75:1) en
amplificaciones mediante PCR (CF-31).
2) Información previa: El gen CFTR está ubicado
en el brazo largo del cromosoma 7 humano. La solución de cebador
CF-31 (CF-31 Primer Mix, Linear
array CF-31 Kit, RAS, Cat. núm. 3 017 443) contiene
28 cebadores diferentes que amplifican simultáneamente 14 regiones
diferentes de este gen.
La PCR se realizó con 100 \mul de volumen de
reacción en las siguientes condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
- Mantener:
- 10 min/42ºC
- Mantener:
- 2 min/95ºC
- 32 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 30 s/60ºC
- \quad
- 60 s/72ºC
- Mantener:
- 10 min/72ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC
Los productos amplificados se analizaron en un
gel de agarosa al 4% (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
1) Se comprobó la eficiencia de reparación de la
mezcla FS Taq/FS ExoIII durante la PCR con cebadores con
apareamientos erróneos en el extremo terminal 3'. Para la
amplificación mediante PCR los cebadores en sentido de avance que
se utilizan poseen un nucleótido en el extremo 3' que no puede
aparearse con el DNA molde. La escisión del extremo desapareado del
cebador y la amplificación del cebador reparado generan un producto
que puede ser cortado por la endonucleasa de restricción Bsi EI (New
England BioLab), mientras que el producto que aparece debido al
cebador desapareado es resistente a la escisión.
Las secuencias del cebador utilizadas son:
1. Sentido inverso:
- \quad
- 5'- GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG - 3' \hskip2cm (ID. de SEC. núm.: 1)
2. Sentido de avance (apareamiento erróneo
g:t):
- \quad
- 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCT - 3' \hskip1cm (ID. de SEC. núm.: 2)
\newpage
2) La PCR se realiza en un volumen de reacción
de 50 \mul en las siguientes condiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Mantener:
- 5 min/95ºC
- 40 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 30 s/64ºC
- \quad
- 60 s/72ºC
- Mantener:
- 4 min/72ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC
- Mantener:
- 2 min/94ºC
- 40 ciclos:
- 30 s/94ºC
- \quad
- 30 s/60ºC
- \quad
- 60 s/72ºC
- Mantener:
- 4 min/72ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la PCR fueron escindidos
posteriormente con la endonucleasa de restricción Bsi EI. Se
añadieron cinco unidades de la enzima de restricción por \mug de
producto de la PCR. Después de la incubación durante 60 min a 60ºC
se paró la reacción para analizar alícuotas en un gel de agarosa 8%
(véase la figura 5).
1) La uracil-DNA glucosilasa
(UNG, RAS, Cat. núm. 1269062) puede utilizarse con dUTP para
eliminar la contaminación "por arrastre" de las reacciones de
síntesis de DNA previas en la PCR. Para elaborar productos en la
PCR susceptibles a la degradación, debe sustituirse los dTTP por
dUTP en el mix de la reacción
2) La PCR se realizó con un volumen de reacción
de 50 \mul de volumen en las siguientes condiciones:
1 x tampón de PCR DNA-polimerasa
Taq FastStart (RAS)
200 \muM dATP, dCTP, dGTP
600 \muM dUTP
400 nM cebador del Exon 10 de tPA
(5'-AGA CAG TAC AGC CAG CCT
CA-3'(ID. de SEC. núm.: 3)
400 nM cebador del Exon 11 de tPA
(5'-GAC TTC AAA TTT CTG CTC CTC-3'
(ID. de SEC. núm.: 4)
0,5 \mul de mezcla de FS Taq/FS Exo III
(75:1)
200 ng DNA genómico humano (RAS).
\vskip1.000000\baselineskip
- Mantener:
- 5 min/95ºC
- 32 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 30 s/60ºC
- \quad
- 60 s/72ºC
- Mantener:
- 7 min/72ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Anteriormente al tratamiento con
uracil-DNA glucosilasa (UNG) se purificaron los
productos de la PCR utilizando un equipo de purificación
comercializado (High Pure PCR Product Purification Kit, RAS, Cat.
núm. 1732668). Se usaron cuatro unidades de UNG (RAS, Cat. núm.
1269062) para digerir 1 \mug de producto purificado de la PCR en
un volumen de reacción de 50 \mul (1 x tampón de PCR
DNA-polimerasa Taq). Tras 1 hora de
incubación a 37ºC se añadieron 10 \mul de NaOH 0,6 M. Tras 5
minutos adicionales de incubación a 37ºC se añadieron 10 \mul de
HCl 0,6 M y las alícuotas se cargaron en un gel de agarosa (véase la
figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la sensibilidad de la mezcla FS
Taq/FS Exo III se amplificó un fragmento de 1,8 kb del gen
Epo humano usando varias concentraciones de DNA genómico humano.
Las secuencias del cebador utilizadas son las
siguientes:
| Epo 1 sentido de avance: | 5'-CGC GGA GAT GGG GGT GCA CG-3' | (ID. de SEC. núm.: 5) |
| Epo 3 sentido inverso: | 5'- CAT GCA GCT GCA GGG CTC CCA - 3' | (ID. de SEC. núm.: 6) |
Las diluciones de DNA genómico humano utilizadas
son las siguientes:
100 ng/\mul, 50 ng/\mul, 10 ng/\mul, 5
ng/\mul, 1 ng/\mul y 0 ng/\mul.
\newpage
La PCR se realizó con un volumen de reacción de
50 \mul en las condiciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- Mantener:
- 5 min/95ºC
- 35 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 2,5 min/72ºC
- Mantener:
- 4 min/72ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC.
Los productos amplificados se analizaron en un
gel de agarosa al 1%. Los resultados de la mezcla FS Taq/FS
Exo III se muestran en la figura 7. Los resultados obtenidos para la
mezcla Taq/Exo III se muestran en la figura 8.
Para demostrar la sensibilidad de la mezcla FS
Taq/FS Exo III se amplificó un fragmento de 4,8 Kb de DNA
del gen tPA humano usando varias concentraciones de DNA genómico
humano.
Las secuencias del cebador usadas son:
| tPA 7 sentido de avance: | 5'-GGA AGT ACA GCT.CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3' | (ID. de SEC. núm.: 7) |
| tPA 10 sentido inverso: | 5'-GAT GCG AAA CTG AGG CTG GCT GTA CTG TCT C-3' | (ID. de SEC. núm.: 8) |
Las diluciones de DNA genómico humano utilizadas
son:
100 ng/\mul, 50 ng/\mul, 10 ng/\mul, 5
ng/\mul, 1 ng/\mul y 0 ng/\mul
La PCR se realizó con un volumen de reacción de
50 \mul en las condiciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- Mantener:
- 5 min/95ºC
- 10 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 4,5 min/68ºC
- 25 ciclos:
- 30 s/95ºC
- \quad
- 4,5 min/68ºC (+20 s/ciclo)
- Mantener:
- 7 min/68ºC
- Mantener:
- siempre a 4ºC.
Los productos amplificados se analizaron en un
gel de agarosa al 0,5%. Los resultados obtenidos para la mezcla FS
Taq/FS Exo III se muestran en la figura 9.Los resultados
obtenidos para la DNA-polimerasa Taq
FastStart se muestran en la figura 10.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas termoestables modificadas
reversiblemente para la síntesis y amplificación de DNA in
vitro
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21051 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttatcgaa atcagccaca gcg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatacgtc tgaactggtc acggtct
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacagtaca gccagcctca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacttcaaat ttctgctcct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggagatg ggggtgcacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgcagctg cagggctccc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagtacag ctcagagttc tgcagcaccc ctgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcgaaac tgaggctggc tgtactgtct c
\hfill31
Claims (11)
1. La composición que comprende una primera
enzima modificada termoestable que muestra actividad exonucleasa
3', que prácticamente no muestra actividad
DNA-polimerasa y una segunda enzima modificada
termoestable que muestra actividad
DNA-polimerasa,
considerando que la fidelidad del proceso de
amplificación se mejora con el uso de la composición en un proceso
de amplificación, en comparación con el uso de la segunda enzima
solamente y,
considerando que dichas primera y segunda
enzimas termoestables modificadas se modifican reversiblemente
mediante un reactivo inhibidor que provoca prácticamente una
inactivación completa de la actividad enzimática, en la que la
incubación de dichas primera y segunda enzimas termoestables
modificadas en un tampón acuoso a pH alcalino a una temperatura
inferior a 25ºC durante 20 minutos resulta en un aumento no
significativo de la actividad de dichas primera y segunda enzimas
modificadas termoestables, en la que la incubación a temperatura
superior a 50ºC en un tampón acuoso a pH alcalino provoca al menos
un aumento del doble en la actividad enzimática en menos de 20
minutos, lo que permite la formación de productos de extensión del
cebador.
2. Las composiciones de acuerdo a la
reivindicación 1, considerando que dichas primera y segunda enzimas
modificadas termoestables, se producen por una reacción de una
mezcla de, o bien dicha primera, o bien dicha segunda enzima
modificada termoestable y un reactivo modificador, en las que dicha
reacción se realiza a pH alcalino a una temperatura inferior a 25ºC
aproximadamente, y en la que dicho reactivo es un anhídrido
carboxílico de fórmula general:
donde R_{1} y R_{2} son átomos
de hidrógeno o radicales orgánicos, que pueden estar unidos, o bien
presentar la fórmula
general:
donde R_{1} y R_{2} son
radicales orgánicos que pueden estar unidos y los enlaces de
hidrógeno son cis; y en la que dicha reacción da lugar básicamente
a una inactivación completa de la actividad
enzimática.
3. La composición de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que dicho reactivo modificador es el
anhídrido citracónico o el anhídrido
cis-aconítico.
4. La composición de acuerdo con la
reivindicación 2 o 3, en la que dicho reactivo modificador es el
anhídrido cis-aconítico.
5. La composición de acuerdo a la reivindicación
3 o 4 en la que la incubación de dichas primera y segunda enzimas
termoestables modificadas en un tampón acuoso a pH alcalino a
temperatura inferior a 70ºC durante 10 minutos provoca un aumento
no significativo de la actividad de dichas primera y segunda enzimas
modificadas termoestables; en la que una incubación a una
temperatura superior a 70ºC en un tampón acuoso a pH alcalino
provoca al la duplicación de la actividad enzimática en menos de 10
minutos, lo que permite la formación de productos de extensión del
cebador.
6. La composición de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 5 en la que dichas primera y segunda
enzimas termoestables modificadas aceptan d-UTP como
sustrato en las reacciones de elongación de la cadena.
7. La composición de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 6 en la que dicha primera enzima
termoestable modificada es una exonucleasa 3'-5'
procedente de Archaeoglobus fulgidus, mientras que dicha
segunda enzima termoestable modificada es una
DNA-polimerasa procedente de Thermus
aquaticus.
8. Un equipo para realizar una reacción en
cadena de la polimerasa que comprende una composición de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.
9. Un método para la amplificación de un ácido
nucleico diana contenido en una muestra consta de las fases
siguientes:
- poner en contacto dicha muestra con una mezcla
de reacción de amplificación que consiste en un cebador
complementario a dicha secuencia diana de ácido nucleico,
desoxinucleótidos o derivados de estos y una composición de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.
- incubar la muestra y la mezcla de
amplificación a una temperatura superior a 50ºC aproximadamente
durante un tiempo suficiente para reactivar dichas primera y
segunda enzimas termoestables modificadas y permitir así la
formación de productos de extensión del cebador.
10. Un método de acuerdo a la reivindicación 9
en el que uno de los desoxinucleótidos o derivados de éstos es dUTP
y en el que el dTTP no está presente en la mezcla para
amplificación.
11. El uso de la composición de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 para amplificar un
ácido nucleico diana.
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