JP2010510789A - 分析や診断目的のための使い捨て可能な実験用具 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
Description
その増幅の配列の同定は、付加的に、制限によってテストされ、たとえば、BamH Iを用いる。ヘーゼルナッツDNAの場合には、これは、20pbと58pbのそれぞれの長さの2つのフラグメント(fragment)をもたらす。ゲノムのヘーゼルナッツDNAのための検出限界は、約50pgである。本反応は、以下の種のいずれの100ngのDNAに対して特有である。ピーナッツ、アーモンド、カシュナッツ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカン・ナッツ(pecan nut)、ピスタチオ、アプリコット、コーン、大豆、セロリ、アブラナ属(brassica))、オレンジ、マンダリン、ブラジル・ナッツ、小麦、ライ麦、大麦、カラスムギ(oat)、スペルト小麦(spelt)、ソバ(fagopyrum)(図1参照)
そのラベルされた反応容器は、実施例1で示したように、生成され、そして、37℃で6月保管された。増幅のために、その反応容器は、12.5μLの2倍に濃縮されたマスターミックス(AmpliTaqGold(登録商標)MasterMix)と、12.5μLのDNA分離体(DNA−isolate)とで満たされて、閉じられ、そして、PCRサイクラー(cycler)(Eppendorf Mastercycler)中へ置かれた。そのDNA分離体(DNA−isolate)は、100pg,50pg,25pg,6.25pg、そして、ヘーゼルナッツDNAなしの量で、ヘーゼルナッツDNAを含む。そのサイクラーのプロファイルは、実施例1でのプロファイルと同一である。そのゲル電気泳動は、ヘーゼルナッツDNAを含まないものを除いた、全ての反応容器において、78bpの長いフラグメントの増幅を示した(図3参照)
50μMol/Lの濃度である0.45μLの第1のプライマーCaMAV−F3、50μMol/Lの濃度である0.45μLの第2のプライマーCa−R05、10μMol/Lの濃度である0.625μLのプローブCaMAV−S1、5mMol/Lである2μLのトレハロース溶液、および、0.475μLの水の混合物を、各反応容器へ加える。参照核酸は、標的配列(単位複製配列)の100回のコピーに相当する、200pgのゲノムのヘーゼルナッツDNAであり、0.475μLに溶解され、水に代わって溶液へ加えられる。乾燥は、周囲圧力の下、乾燥加熱オーブン内において、40℃で3時間以上、実施された。反応容器は、ホイルでラップされ、使用まで、暗所で保管された。
本発明による反応容器は、終点決定で用いるPCR分析を許容するように、標準化される。これは、サルモネラ(salmonella)DNAの決定のために、ここに示される。
本発明に従って準備された反応容器によれば、生体分子の食品分析は、シンプルかつ標準化された方法で、実施される。したがって、革新的な製品が、食品および飼料(fodder)において、特有なDNAフラグメントのシンプルな生体分子の決定にて利用可能になる。その準備された反応容器は、アレルゲン、GMO、動物種、および、衛生の分野において、すべての関連するパラメータに適用される。
食品アレルゲン(foodstuff allergen):ヘーゼルナッツ、アーモンド、くるみ、ペカン・ナッツ、ブラジル・ナッツ、カシュナッツ、ピスタチオ、ピーナッツ、小麦/大麦/ライ麦、小麦、セロリ、マスタード、ゴマ、大豆、魚、ルピナス(lupins)
動物種:豚、牛、反芻動物(ruminant)、哺乳類、チキン、ターキー(turkey)、アヒル(duck)家禽(poultry)、ヒツジ(sheep)、ヤギ(goat)、馬(horse)、リス(rodent)、犬(dog)、猫(cat)
GMO:Screen 35S、Screen nos、Roundup Ready Soy(RRS)、カリフラワー・モザイク・ウィルス(Cauliflower mosaic virus(CMV))、コーン MON810(corn MON810)、コーンMON863(corn MON863)、コーンBT176(corn BT176)、コーンBT11(corn BT11)、コーンGA21(corn GA21)、コーンNK603(corn NK 603)、コーンT25(corn T25)、ライスLL601(rice LL601)、ライスLL62(rice LL62)
衛生(Hygiene):サルモネラ(salmonella)spp、リステリア・モノシトゲン(monocytogene)、カンピロバクター菌(campilobacter)(jejuni, coli, lari)、EHEC、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、セレウス菌(Bacillus cereus)、腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、フレクスナー菌(Shigella flexneri)
・試験システムが、保管可能になること
・プライマーと種の特有のポジティブなコントロールが、すぐに利用できること
・液体なしに、プライマーの取り扱いと必要な制御がされること
・汚染物(contamination)の更なるリスクがないこと
・新規なパラメータと生成物へのシンプルな拡張
・PCRの全体的な標準化
・サンプルの独立
・いくつかのパタメータが、1回で、同時にテストされること
・全てのパタメータのために必要とされるのが、単一なユニバーサル・マスターマトリックスのみであること
Claims (17)
- 分析、診断、および、技術的な目的のためにPCRを実行するためのパッケージング・ユニットまたはキットであって、
適合する試薬、酵素、および、DNAまたはRNAのサンプルの追加後に、PCRにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸と有し、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと
を具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、保管形態において、既知の量のプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および/または、参照核酸が、その反応容器において室温を超えた5から最大30℃の温度で、環境圧力の下、単独で、1〜5mMol/Lのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、乾燥されるように、準備されることを特徴とする、
パッケージング・ユニットまたはキット。 - 分析、診断、および、技術的な目的のためにPCRを実行するためのパッケージング・ユニットまたはキットであって、
適合する試薬、酵素、および、DNAまたはRNAのサンプルの追加後に、PCRにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とを有し、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと
を具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、その反応容器において、既知の量なプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および/または、参照核酸が、環境温度で、0.1〜0.3barの減圧下、単独で、1〜5mMol/Lのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、穏やかに乾燥されるように、生成されることを特徴とする、
パッケージング・ユニットまたはキット。 - 反応容器中の水性溶液の体積が、乾燥前が、1〜25μLであり、プライマーの量が、0.1〜20nMol/Lの間である、
請求項1または2に記載のキット。 - その参照核酸を有する反応容器は、好ましくは、ゲノムのDNAまたはプラスミドとしての10〜10000のコピーの標的配列を含む、
請求項1〜3のいずれかに記載のキット。 - ベッセルの壁上の乾燥ペレットが、炭化水素ワックスによってカバーされ、57℃の温度で溶融が開始し、そして、水性溶液内で浮遊する、
請求項1〜4のいずれかに記載のキット。 - PCRの付加的な試薬を含む水性溶液の追加後に、プライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とが、その水性溶液中に溶解されるように、空間的に分離されたプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とが、トレハロースの存在において、その容器の壁上へ乾燥されている反応容器
をさらに有する、
請求項1〜5のいずれかに記載のキット。 - その反応容器が、マイクロ滴定プレートのウェルである
請求項1〜6のいずれかに記載のキット。 - その反応容器においては、両者のプライマーの量が7.5〜15pMolで、参照核酸の量が標的配列の100または1000のコピーで、標準化されている、
請求項1〜7のいずれかに記載のキット。 - さらに、DNAまたはRNA抽出溶液、プロティナーゼ(proteinase)−K溶液、ゲル・ローディング・バッファ(gel loading buffer)、ヌクレオチドおよび増幅バッファ、DNAポリメラーゼ、AmpliTaqGold MasterMix(登録商標)の1以上の緩衝および反応溶液を含む、
請求項1〜8のいずれかに記載のキット。 - その反応容器は、ハイブリダイゼーション(hybridisation)プローブ(LightCycler(登録商標) probe)、加水分解プローブ(TaqMan(登録商標) probes)、モレキュラー・ビーコン(molecular beacon)、スコーピオン(scorpion)−プライマー、または、Lux(登録商標)−プライマーのような、リアルタイムなPCRのためにラベルされたFRETプローブを含む、
請求項1〜9のいずれかに記載のキット。 - 特定の蛍光放射によって定量化可能であり、2重鎖DNAとDNA蛍光染料コンプレックスを形成する、インターカレートする蛍光染料の存在の下において、PCRの実施のために準備されている、
請求項1〜9のいずれかに記載のキット。 - その蛍光染料は、SYBR−Green(登録商標)、SYBR Gold、SYBR Safe、 YO(オキサゾール・イエロー)、TO(チアゾール・オレンジ)、および、PicoGreen(登録商標)のグループから選択される、
請求項11に記載のキット。 - 保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセット中にて、プライマー−オリゴヌクレオチドと、標的配列を有する参照核酸の量は、そのインターカレートする蛍光染料の存在において、所定数のPCRサイクルの後に、そのDNA蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射のために、視覚的または容易に検出可能なターゲット値が得られるような方法で選択される、
請求項11または12に記載のキット。 - その反応容器は、そのインターカレートする蛍光染料の吸収および放射周波数に対して、透明である、
請求項10〜13のいずれかに記載のキット。 - 分析、診断、および、技術的な目的のためにPCRを実行するプロセスであって、
適合する試薬、酵素、および、DNAまたはRNAのサンプルの追加後に、PCRにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有する、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸と有しており、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットとを使用することを具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、保管形態において、既知の量のプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および/または、参照核酸が、その反応容器において室温を超えた5から最大30℃の温度で、環境圧力の下、単独で、1〜5mMol/Lのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、乾燥されるように、準備されることを特徴とする、
プロセス。 - 保管形態において、既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とを有する、ラベルされた乾燥反応容器のセット中において、プライマー−オリゴヌクレオチドと標的配列を含む参照核酸との量は、既知な量のインターカレートする蛍光染料の存在、および、所定数のPCRサイクルで、そのDNA蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射のための、視覚的または容易に検出可能なターゲット値が得られ、そして、所定数のPCRサイクルの実行後に、DNA蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射の決定が、そのサンプルを含む反応容器中と、参照核酸を含む反応容器中とにおいて、そのターゲット値に到達するような方法で、選択される、
請求項15に記載のプロセス。 - そのDNA蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射の決定は、モバイルな蛍光測定デバイスを用いて実施される、
請求項16に記載のプロセス。
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