JP2004519242A - 完全にまたは部分的に乾燥した１つ以上の酵素を含む安定化反応混合物の製造方法、および該反応混合物並びにこれを含有するキット - Google Patents
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Abstract
本発明は、単一容器で（ａ）少なくとも１つの酵素を含む反応混合物の水溶液と、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤と、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤と、（ｉｉｉ）乾燥試薬の移動を防止する網構造を生成できる少なくとも１つの不活性重合体と、を含む安定化混合物の水溶液と、を接触させるステップを含む方法に関する。本発明は、さらに、生成された水溶液中に含まれる水の一部または全部を除去するステップを含む。前記方法は、酵素反応、例えば、核酸の増幅、配列決定及び特性決定の実行、雑種形成試験の実行、及び制限分析に適している。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、反応混合物を含有する溶液に安定化混合物を添加し、続いて生成された溶液中に存在する水を全部または一部除去することによって、完全にまたは部分的に乾燥させた、安定化反応混合物の製造方法だけでなく、生成された反応混合物及び反応混合物を含むキットに関するものである。
【０００２】
（背景技術）
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）は、遺伝情報の貯蔵及び伝達に寄与する長い線形の巨大分子である。これらはヌクレオチドと称する単量体単位を持ち、これらの単位は各々窒素含有プリンまたはピリミジン塩基、簡単な糖（ＤＮＡの場合デオキシリボース、及びＲＮＡの場合リボース）、及び無機燐酸塩で形成される。核酸でヌクレオチドは、隣接したヌクレオチドの糖を通じてリン酸ジエステル結合により共に結び付く。これらの窒素含有塩基は、糖−燐酸骨格に共有結合する。全ての核酸は主に４個の相異なる窒素含有塩基、つまり２個のピリミジン塩基と２個のプリン塩基を持つ。プリン塩基は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれにも同一で、これらは共にアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）を含有する。ピリミジン塩基に対し、前記両方の核酸は、共にシトシン（Ｃ）、ＤＮＡ特異的なチミン（Ｔ）、及びＲＮＡ特異的なウラシル（Ｕ）を含有する。これらの窒素含有塩基の配列は核酸により隨伴される遺伝情報だけでなく、これらの３次元形状を決定する。ＲＮＡが実際には、一般的に単一ポリヌクレオチド鎖として発見される反面、ＤＮＡは通常に二重ポリヌクレオチド鎖として発見されて、この時両方のストランドは互いに補い合うようなプリン塩基とピリミジン塩基との間に形成された水素結合により結び付ける反平行方式で配列される。
【０００３】
核酸の増幅は、核酸の特異的または特徴的な断片の初期量の指数的な増幅になされた所定の核酸を正確に同定するのに最も広範囲に使われる道具である。増幅された断片を後続の用途、例えばクローニング及び制限分析に使用することができる。核酸の配列決定は、所定の核酸断片のヌクレオチド配列の測定でなされる。核酸の増幅及び配列決定だけでなく断片制限分析、制限酵素と称するエンドヌクレアーゼ酵素により引き起こされた差別的な大きさを基準とした核酸の同定、または特性決定でなされた技法は、他の可能な用途の中からも生物医学的研究、感染性及び遺伝性疾病の医学及び獣医学的診断、人間及び動物遺伝子分析、食品分析、環境制御及び法医学的分析に広範囲に使われる技法である。
【０００４】
生体の他核酸合成及び増幅には、多数の方法が存在する。最もよく知られ最もよく使われるのは、一般に英語の略字でＰＣＲと称するポリメラーゼ連鎖反応である（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４（１９８５）， Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，８００，１５９号）。最も簡単な形態のＰＣＲは、核酸または核酸の混合物中に含まれた少なくとも１つの特定のＤＮＡ配列を、これは塩基の相補性により、熱により先行的に変成された問題ＤＮＡの２個の対面領域に特異的に結合する２個のオリゴヌクレオチドプライマにより指数的に増幅させることを通した周期的なＤＮＡ増幅過程からなる。
【０００５】
相応するプライマに結び付いた問題ＤＮＡストランドは、各々重合反応のプライマとしてオリゴヌクレオチドを使用し、ＤＮＡポリメラーゼ活性の作用により相補的なＤＮＡ形態をコピーできる。この方法の連続的な繰り返し性により、オリゴヌクレオチドの雑種形成地点の間に含まれた問題ＤＮＡ断片の指数的な濃縮が得られる。熱安全性ＤＮＡポリメラーゼの使用で、連続的な変性周期を行うことができ、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ基質にアニーリングさせることができ、この鎖を各周期で新しいポリメラーゼ活性の追加なく延長させることができる。ＤＮＡの存在を相対的な豊富性で分析する場合、この方法はそれの確認に充分である。それにもかかわらず、この問題ＤＮＡの豊富さが簡単なＰＣＲの限界以下のサンプルを分析することが頻繁に起きる。このようなサンプルを分析するために重複ＰＣＲ技法が開発された。２個の結び付いた増幅過程をシステムで行い、このうち２度目の過程は、基質として最初のＰＣＲの増幅された産物を使用する。前記過程の特異性を増加させるために、２度目の増幅反応に使われたオリゴヌクレオチドは、最初に使われたものと相異なり、これらを最初の増幅産物の内部領域と雑種形成させる。
【０００６】
増幅反応が基質としてＤＮＡ分子を必要とするＤＮＡポリメラーゼ活性を使用する場合、ＲＮＡ分子の直接的な分析は、問題ＲＮＡに相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を合成する先行逆転写（ＲＴ）段階を必要とする。続いて、それによって得たｃＤＮＡを増幅反応基質として使用することができる（Ｍｏｃｈａｒｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９３：２７１−２７５（１９９０））。使用した増幅システムは、本来ＲＮＡ基質の相対的な豊富性によって簡単な反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であったり、または重複増幅（ＲＴ−重複ＰＣＲ）でありうる。逆転写酵素活性により変更されたＤＮＡポリメラーゼ活性の発達で、非常に厳しい条件下で単一酵素の活性を利用することによって、ＲＴ−増幅過程を行えるようになった。
【０００７】
前述した周期的な核酸増幅方法は、相異なる好熱性微生物、例えば特に、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｋａｌｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ４５， ６４４−６５１（１９８０）； Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：１５５０−１５５７（１９７６）；米国特許第４，８８９，８１８号）、及びサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｒｕｔｔｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：４１−４６（１９８５））から得た熱安全性ポリメラーゼ酵素を使用する。このような熱安全性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のうち多数、例えばＴ．アクアティカス酵素（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：８３８７−８３８８（１９８９））だけでなく、一部の中温性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、例えば大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０：３８３４−３８３８（１９７３）；Ｌｅｏｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ２４２：６６−６９（１９７３））は、反応混合物の中に存在する補助因子によって二重酵素活性、つまりＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素活性を表し、したがってマグネシウムイオンの存在のもとでは、ＤＮＡポリメラーゼ活性が現れる反面、マンガンイオンの存在のもとでは、逆転写酵素活性が現れる。
【０００８】
中温蛋白質とは異なり、熱安全性酵素は熱により変成されず、むしろその活性を行うためには高温を必要とする。これは主にその全体的な蛋白質の折り畳みまたは３次構造で伝えられるそのアミノ酸配列の変更から起因する。これは劇的な変更ではなく、むしろ熱安全性が小さいエンタルピーとエントロピー類型の相互作用の合の結果として起きて、より剛性で耐熱性の２次構造を得るのに上昇作用的に寄与する。アミノ酸の変化は、これらの変更の中でも顕著で、これによってより剛性の３次構造が生成されたり（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ ａｎｄ Ａｒｇｏｓ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２０６：３９７−４０６（１９８９））、または特に蛋白質のより敏感な領域、例えばループで脱アミン化（Ａｓｎ，Ｇｌｎ）または酸化（Ｍｅｔ，Ｃｙｓｎ）による分解に敏感な残基が除去される（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６６：２４２８７−２４２９４（１９９１））。
【０００９】
これらの間、蛋白質のアミノ酸の間だけでなく、媒質の水分子との水素架橋形成及び広範囲なネットワークの形成（Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０：７５−８３（１９９６））及び帯電された表面残基らの間の塩類架橋の形成、または蛋白質の疏水性内部に残っている極性残基を中和させる方式（Ｙｉｐ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ３：１１４７−１１５８（１９９５））としてのもう１つの変更により熱安全性が生成される。このような類型の他の変更では、２次構造、特に内部双極子の安定化によるα−螺旋の形成（Ｒｅｎｔｉｅｒ−Ｄｅｌｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２９：８５−９３）及び水素結合の形成（Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｓｋｏ， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．， ８：９０５−９１３（１９９５））だけでなく、疏水性内部への包装の増加、すなわち蛋白質をより緻密に作ること（Ｍａｔｔｈｅｗｓ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０：３５−４１（１９９６））がある。前述したように、熱安全性酵素の３次構造の保存及び結果的なその活性及び作用性は、非熱安全性中温酵素よりにはるかに、蛋白質とそれをめぐっている水性分子との相互作用の完全性を保存させることが明白である。
【００１０】
特にゼラチン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、硫酸アンモニウム及びテシットのような生成物は、ポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰを安定化させ、非イオン性界面活性制、例えばＮＰ４０及びツイン２０は、核酸増幅反応を改善させることでよく知られている（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【００１１】
制限酵素としては、ＤＮＡ二重鎖内のリン酸ジエステル結合を破壊するエンドヌクレアーゼ酵素がある。これらの制限酵素のうち、１つの類型のＩＩ型は、所定のＤＮＡヌクレオチド配列を認識し、所定の配列内部でヌクレオチドを共に連結する結合を破壊し、結果的に単一ＤＮＡを正確に再現可能な断片で切断させて制限地図と称するものを生成させる性質を持つ。ＩＩ型酵素は、多様な分子生物学技法、例えば特にクローニング、特定のＤＮＡ配列及び断片の同定、及び制限地図分析に広範囲に使われる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２ｎｄ Ｅｄ． １９８９）。
【００１２】
抗原及び抗体を含んだ酵素及び他の生物学的巨大分子の活性は頻繁に、３次構造と称するその３次元形状によって主に変わり、したがって３次元形状が任意の因子により変更される場合、巨大分子の生物活性または作用性が減少したり、さらに消えることもある。水は、生物学的巨大分子の周囲に保護ラップを形成し、疏水性／親水性の相互作用により巨大分子の３次構造を安定化させる。このような相互作用は、また巨大分子の表面上で発見できる化学的反応グループを遮断する。例えば、任意の乾燥過程で発生する水性保護ラップの除去時に、巨大分子の３次構造に変形がおきることがあり、これにより分子が変更され、化学的反応グループ（アミン、燐酸塩、カルボキシル基等）が相互に、または隣接した他の巨大分子の他の試薬グループと自由に反応し、本来の３次構造の喪失に寄与することができ、さらに互いに類似または相異なる多様な巨大分子の間に凝集を形成させ、これはまた一般的に巨大分子の生物活性または作用性の減少またはさらに喪失だけでなく、その３次構造の変更を伴う。
【００１３】
このような周辺の化学的反応グループとの間の反応は、一旦、巨大分子が、これらが位置している媒質の可塑性により適合に乾燥した場合にも起きることがあり、その理由は時間の経過時、乾燥した巨大分子の生物活性または作用性の減少が現れ得るためである。結果的に、巨大分子周囲の水性ラップを、巨大分子の３次構造を維持する機能及び表面反応グループを安定化及び保護する機能において、水分子を效率的に代替する保護剤に入れ替えることが非常に重要である。
【００１４】
前述したＤＮＡポリメラーゼ酵素及び制限酵素だけでなく、分子生物学及び前述した用途で使われる他の酵素を保存して運搬する通常的な方法は、これらの酵素を−２０℃で凍結させ、これらを主にその水性形態にグリセロールを添加することによって低温で耐えるように安定化させることを含む。この方法は、保存温度が−２０℃を越えない限り、ほぼいかなる活性喪失もなく数カ月間酵素活性を保存させ、したがって低温流通（この低温流通が数時間の間中断される場合、酵素活性または不活性の重大な喪失が記録される）を保存することが非常に重要である。−２０℃での凍結による運搬及び保存方法を使用する場合にも、これらの反応成分を、すべて単一容器、バイアル、またはチューブに入れ保存することは薦められないが、その理由は相異なる成分との間の好ましくない化学的または生化学的反応により、これらの成分が不活性化されたりまたは実験結果の解析を妨害したり見分けることができる人為的な産物が発生できるからである。前述したように、巨大分子を室温で保存及び運搬できるようにし、したがって、特に保存システムが単一容器内で目的とする酵素反応を行うのに必要とする全ての要素（酵素、補助因子、添加剤等）を市場に送りだす場合、必要とする低温流通保存を防止できるシステムを製造することが経済的に非常に便利であると推論できる。
【００１５】
前述した技法による核酸増幅では、反応に干渉するそれぞれの成分、すなわちＤＮＡポリメラーゼ酵素、反応促進添加剤、または安定化剤を含有する反応緩衝剤、塩化マグネシウム、またはＲＴの場合に塩化マンガン、反応プライマとして使われるオリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、及び増幅させる核酸を含有するサンプルを分離させ、前述したように凍結により保存し、これらを反応遂行の前に混合する必要がある。この場合、それぞれの成分を非常に少量（μＬ）で添加及び混合することが必要であり、この場合、それぞれの試薬を投与及びピペッチングするのに頻繁な誤謬が発生し、これは前記技法を適用することによって得た結果に対する再現性に対して不確実性、特に人間診断の場合に先取的な不確実性を発生させる。増幅反応に添加する相異なる試薬のピペッチング誤謬の可能性による変化性は、またこの技法の感度に影響を及ぼし、これはこの技法を人間疾病の診断、及び特に感染水準及び遺伝子発現水準の測定に適用させることに対し、新しい不確実性を発生させる。
【００１６】
さらに、分析するサンプルを反応混合物にピペッチング及び添加する間、分析サンプルの間に交差汚染を頻繁に発生させるエアゾールが生成され（Ｋｗｏｋ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３９：２３７−２３８（１９８９））、したがって偽り陽性結果が生成されるが、これはまた人間診断の場合に非常に重要である。
生物学的巨大分子の乾燥による保存に対して多様な技法が開示されて使われ、これらの用途及び適用性は、これが適用される生成物の作用特徴を保存する能力により決定される。
【００１７】
ここに開示した技法の中で、凍結乾燥が乾燥による主要保存技法であり、これは習性生成物を凍結させ、低圧条件下で氷を後続的に昇華させることによって水の除去を達成する方法である。昇華は、固体が液体状態を経たず、増発する過程であり、したがって前述した低圧という用語は、水が固体、液体、及び気体状態で共存する気体圧力である水の三重点以下の気体圧力値を示す。凍結乾燥を行うために、凍結乾燥させる溶液または生成物を凍結乾燥させる物質の類型に伴う温度及び速度で完全に凍結させなければならない。必要とする凍結乾燥装備は値段が高く、凍結乾燥過程は比較的に遅く、したがってこれらの経済的因子は、非常に頻繁にその使用を断念させる。
【００１８】
他の乾燥システム、例えば流動層上での乾燥、室温及び大気圧での乾燥、室温及び減圧での乾燥、高温及び大気圧での乾燥、高温及び減圧での乾燥が広く知られている。使用する乾燥方法を選択することは、その効率性の程度、乾燥により保存される造成に対するその多少の攻撃性、及び経済的な因子によって変わる。
乾燥過程の間、生物学的巨大分子の完全性を保存することだけでなく、保存及び保管過程の間、乾燥した要素の作用性を安定化及び保存するための相異なる溶液が提案された。
【００１９】
文献［Ｃｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １９：３０６−３１６（１９８２）］には、乾燥の細胞反応に対するグリセロール及びトレハロースの保護効果が開示されている。
文献［Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：３４６−３５６（１９８３）， Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２３２：４００−４９７（１９８４）、及びＢｉｏｃｈｉｍｉａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ７６９：１４１−１５０（１９８４）］には、細胞器官の乾燥においてトレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）として知られている非還元二糖より顕著に大きい保護効果を表す、細胞膜の安定化に対する多様な炭水化物の作用が開示されている。
文献［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４：４５５−４６４（１９８７）］はマルトース、スクロース、ラクトーズ及びトレハロース二糖が乾燥後のホスホフルクトキナーゼ酵素の精製された調剤の活性安定性を増加させることを指摘する。
【００２０】
和光純薬工業株式会社に属する欧州特許出願ＥＰ１４０４８９号には、免疫活性蛋白質（抗体）を随意的に牛血清アルブミンのような蛋白質と共に糖溶液に浸漬させることによって室温での乾燥に対し、担体（例えばグラスビード）上で保護する方法が開示されている。相当な数の糖が言及されており（リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトーズだけでなく、他のオリゴ糖及び多糖）、より大きい保護効果をふまえてラクトーズ、スクロース及びデキストリン溶液が好ましい。
【００２１】
クァドラント・バイオリソース・リミテッド（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に許与された米国特許第４，８９１，３１９号には、蛋白質、抗体、及び他の生物学的巨大分子の乾燥保護剤としてトレハロースの用途が開示されている。
文献［Ｏ．Ｔｏｏｒｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ９５：５１７（１９８１）］には、魚の筋繊維の変性及び乾燥に対する糖及びアルコキシル糖の保護効果が開示されている。
特許出願ＥＰ９１２５８号には、精製したＴＮＦ蛋白質を牛血清アルブミンまたはゼラチンのような安定化蛋白質の存在下で保管または凍結乾燥させることによって、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）を安定化させる方法が開示されている。
【００２２】
クァドラント・ホールディングス・ケンブリッジ（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃａｍｂｒｉｇｅ）社に属する特許出願ＷＯ９１／１８０９１には、ポリハイドロキシル化された化合物（好ましくはソルビトールまたはマンニトール）からの非還元グリコシド、例えばマルチトール、ラクチトール、及び２つのパラチニトール異性体、及び非還元オリゴ糖、例えばラフィノース、スタキオーズ及びメレチトースを使用して乾燥した状態で生物学的物質を保存する方法が開示されている。
文献［ｌｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．ＪＰＮ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｏｃ， ３４：４０３−４０７（１９９１）］は、Ｌ−リジンが生物学的巨大分子の周辺部に位置したアミンとカルボニルグループとの間の縮合反応の抑制剤であることを指している。
【００２３】
クァドラント・ホールディングス・ケンブリッジ・リミテッドに付与された米国特許第５，９５５，４４８号は、非還元炭水化物及び周辺のアミンとカルボニルグループとの間の縮合反応抑制剤を添加することによって、乾燥したサンプル及びエンドヌクレアーゼ制限酵素を含んだ生物学的巨大分子を安定化させる方法を請求する。洗剤またはグリセロールのような安定化剤を使用することによって、再組合β−インターフェロンを安定化させることも知られており、この安定化剤は、また追加的な安定化剤として他の蛋白質、スクロース、トレハロース、及び他のポリハイドロキシル誘導体、特にデキストロースを含有することができる。
【００２４】
生物学的巨大分子の乾燥に対する乾燥及び保存方法に対し、他の参考文献、例えば文献［Ｐｉｋａｌ Ｍ．Ｊ．， ＢｉｏＰｈａｒｍ ３：１８−２０， ２２−２３， ２６−２７（１９９０），Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：４５９−７０（１９８８）， Ｒｏｓｅｒ Ｂ．， ＢｉｏＰｈａｒｍ ４：４７−５３，（１９９１）， Ｃｏｌａｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１００７−１０１１（１９９２），及びＣａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：２４４−２５５（１９８８）］を参照できる。
【００２５】
一方で、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）社に許与された米国特許第５，８６１，２５１号は、保存剤としてグルコースまたはソルビトールをＤＮＡ増幅反応の遂行に必要とする全ての成分、すなわち熱安全性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、この反応の遂行に必要とする全ての成分を含有する反応緩衝剤、及び重合反応の基質として必要とするデオキシヌクレオチド三燐酸塩またはジデオキシヌクレオチド三燐酸塩、水溶性染料を含有する反応混合物に添加することによって、凍結乾燥により乾燥したＤＮＡ増幅のための即席試薬を製造する方法を請求しているが、即席試薬にオリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマを添加することは言及していない。
【００２６】
ジェン・プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）社に許与された米国特許第５，６１４，３８７号には、保存剤として非還元二糖、好ましくはトレハロースまたはスクロース及び／またはポリビニルピロリドンをＲＮＡ増幅の遂行に必要な全ての試薬、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び／または逆転写酵素を、反応の遂行に必要とした全ての成分を含有する反応緩衝剤、及び重合反応の基質として必要とするデオキシヌクレオチド三燐酸塩またはジデオキシヌクレオチド三燐酸塩、水溶性染料と共に含有する反応混合物に添加することによる、凍結乾燥により乾燥した核酸増幅用即席試薬が開示されているが、実施例で任意の熱安全性酵素を言及していない。
旭化成工業（株）に許与された米国特許第５，９３５，８３４号は、トレハロースの存在下で乾燥及び保存させることによって収得でき、ウイルスからのＲＮＡの逆転写を行うのに必要とする全ての要素を含有する即席試薬を請求している。
【００２７】
乾燥過程の間、生物学的巨大分子の完全性を保存することだけでなく、保存及び保管過程の間、乾燥した要素の作用性を安定化及び保存するための多様な解決法が提示されたが、このような目的を満足させるための可能な手段を増加させるまた別の解決法の開発が依然として必要である。本発明は、これらの必要に対する解決法を提供する。
【００２８】
（発明の開示）
本発明は、完全にまたは部分的に乾燥した、少なくとも１つの酵素を含む安定化反応混合物の製造方法を提供し、前記方法は、ａ）単一容器で、ｉ）少なくとも１つの酵素を含む反応混合物の水溶液と、ｉｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤と、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤と、乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成できる少なくとも１つの不活性重合体と、から構成された安定化混合物の水溶液、とを接触させて、前記反応混合物と前記安定化混合物とを含む水溶液を得るステップと、ｂ）少なくとも１つの酵素を含む、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を得るために、前記酵素及び前記安定化混合物を含み、３０％以下の水分含有量を有する完全にまたは部分的に乾燥した混合物が得られるまで、前記ステップａ）で得た水溶液中に含まれている水の一部または全部を除去するステップと、を含む。
【００２９】
前記反応混合物は、１つ以上の酵素反応に干渉する１つ以上の酵素を、酵素が干渉する酵素反応を行うのに必要とする試薬の一部または全部と共に含む。特定の実施態様おいて、反応混合物は反応混合物中に存在する酵素を適合量で容器、例えば反応チューブまたは多重ウェルプレートのウェルで混合する反応、または反応を行うのに必要とする全ての試薬を含有し、この時行う酵素反応は基質または問題サンプルの再水和及び添加後に後続的に遂行されるはずである。
【００３０】
前記反応混合物中に存在する酵素または酵素らは任意の酵素でありうる。特定の実施態様おいて、前記酵素はＲＮＡとＤＮＡ核酸の両方からの熱安全性及び熱不安定性の核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択される。したがって、特定の実施態様おいて、反応混合物は核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素、及びこれらの混合物の中から選択された酵素を、前述した酵素が干渉する反応を行うのに必要とする全ての試薬、及び補助因子、酵素基質、及び酵素反応を促進させる他の添加剤と共に含み、また随意的に標示されたり非標示されたオリゴヌクレオチドプライマ及び特定の増幅を行うためのプローブ、例えばサンプル中の所定の病源体または遺伝子突然変異を探知するためのプローブを含むことができる。
【００３１】
前記反応混合物の水溶液を容器の外で製造して後続的に添加したり、または容器自体で相異なる反応混合物の成分を添加して混合することで容器で直接形成させることができる。
前記安定化混合物は、（ｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤；及び（ｉｉｉ）乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成させる少なくとも１つの不活性重合体を含む。
【００３２】
乾燥保護剤は、乾燥過程の間、反応混合物中に随意的に存在する酵素及びヌクレオチドの３次構造を安定化させることが主要任務であり、このような目的で保護剤は、巨大分子の３次元構造を維持し、さらに巨大分子の表面上に存在することができる化学的反応グループらの間に発生できる反応を遮断することを助ける水溶液で保護ラップを形成する水分子を代えて、それによって、これはさらに乾燥した混合物の長期的な保存に対して安定化効果を持つ。乾燥保護剤は適合した、非還元炭水化物、特に非還元二糖または三糖、または化合物の混合物でありうる。特定の実施態様おいて、乾燥保護剤は、非還元二糖のパラチニトール（６α−Ｄ−グルコピラノシル−マンニトール）及びトレハロース、非還元三糖のラフィノース及びメレチトース、及びこれらの混合物の中から選択される。他の非還元炭水化物、例えばスクロースが酵素乾燥に有効なことで立証されたが、酵素とオリゴヌクレオチドの両方の乾燥においてはそうでない。
【００３３】
ポリアルコールグループからの多数の非還元化合物、例えばソルビトール及びグリセロールが乾燥保護剤として、及び保管中の乾燥した混合物の安定化剤として分析された。両方の乾燥過程中の酵素の保護及び後続的な保存（特にソルビトール）に対する薬剤としてのそれらの独立的な用途に比較的有効なことに立証された。非還元炭水化物、縮合反応の抑制剤及び不活性重合体を含有する安定化混合物と共に、酵素とオリゴヌクレオチドの両方を含有する反応混合物の乾燥過程で、グリセロールは全ての場合に安定化混合物の成分、特に非還元炭水化物のメレチトース、パラチニトール、トレハロース、及びスクロースと共に有利な保護効果を表す反面、ソルビトールはいかなる有利な効果も表さず、むしろ逆に要素の保護効果を抑制することが分かる。乾燥保護剤として、及び反応混合物の保存中の安定化剤としてソルビトールの使用は、オリゴヌクレオチドが反応混合物中に存在しない場合に効果的で、これはオリゴヌクレオチド鎖が混合物中に存在する場合、保護または安定化作用を現さないことを表す。したがって、少なくとも１つの非還元炭水化物とは別途に、安定化混合物は、乾燥保護剤としてグリセロールを随意的に含有することができる。
【００３４】
前記縮合反応の抑制剤は、乾燥させる反応混合物中に存在する巨大分子の表面上に存在するカルボキシル、カルボニル、アミンと燐酸基の間に発生できる縮合反応を抑制する目的を持ち、したがって抑制効果を発揮するためには充分な量の抑制剤が存在しなければならない。使われる反応抑制剤は、競合的または非競合的でありえる。競合的な抑制剤の中から多数のアミノ酸が最も効果的なものとして立証され、リジン、アルギニン及びトリプトファンが最も卓越し、このうちでも特にリジンが卓越している。非競合的なものの中では、ベタイン及びアミノグアニジン誘導体が最も効率的なものと立証された。非競合的な抑制剤を使われる非還元炭水化物によって選択し、したがってラフィノースの存在下で最も効果的で非競合的な抑制剤はベタインである反面、他の炭水化物の存在のもとではアミノグアニジン誘導体が最も効果的である。したがって、特定の実施態様おいて、安定化混合物は、リジン、アルギニン、トリプトファン、ベタイン、アミノグアニジン誘導体、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択された、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応の抑制剤を含有する。
【００３５】
水溶液の乾燥時、乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成させることができる不活性重合体の主要目的は、反応混合物を構成する多様な反応物の移動を防止する網を生成させることによって、乾燥した反応混合物の保管中の安全性を向上させることである。したがって反応物は重合体で形成された小さな細胞内に多少の程度で固定化されて結果的にこれらの反応物は互いに近づくことができず、したがって表面反応グループの化学反応が防止される。一方で、重合体は反応混合物を構成するいかなる反応物とも反応してはならず、もう一方で、これは乾燥時３次または４次構造の変形なしで、その網の中に個別化された巨大分子を捕捉させるのに十分に微細で成形可能なグリッドを生成させなければならない。
【００３６】
特定の実施態様おいて、不活性重合体はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、多様な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、澱粉、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社からのスクロースから合成された非イオン性重合体）と称する化合物、グリコーゲン、アカシアゴム、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択される。一般的に、グリコーゲンとアカシアゴムが保護作用において、最も効果的なものと立証された不活性重合体である。不活性重合体の追加的な目的は、乾燥過程の特徴である初期凍結過程の間、水が決定化されることを防止する非結晶性網を生成させることによって、凍結乾燥により乾燥される反応混合物中に存在する巨大分子の低温保護剤として使われることである。乾燥混合物に添加される不活性重合体の量は、乾燥した反応混合物を再水和させた後に発生する酵素反応を後に妨害しないながらも、巨大分子の移動を防止するのに十分に緻密な網を生成させるのに充分でなければならない。
【００３７】
前記安定化混合物の３つの成分（保護剤、縮合反応抑制剤、及び不活性重合体）の合同作用で前述した反応混合物が、乾燥及び延長された保管後に完全に作用性になる。これらの成分中１つまたは２つを、他の２つまたは残りの成分の存在なく添加することは、乾燥後に活性でなかったりまたは乾燥後の数日後に活性が消える反応混合物を生成させ、その結果、保管中に安全性が非常に減少する。
【００３８】
非還元炭水化物（保護剤）は、縮合反応の抑制剤と共にまたはこの抑制剤なく酵素、及びオリゴヌクレオチドプライマまたはプローブを除外した反応を行うのに必要な全ての試薬を含有する反応混合物を乾燥に対して效率的に保護し、保管中に安定化させることができる。ここで、オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物は安定化させることができない。これはまた非還元ポリアルコールソルビトールにより起こり、ソルビトールはオリゴヌクレオチドを除外した必要な試薬をすべて含有する反応混合物の良好な保護剤と安定化剤として別途に立証され、反応混合物中にオリゴヌクレオチドが存在する場合、保護効果の発揮は停止される。
【００３９】
乾燥または不活性重合体の存在下で広範囲に使われる縮合反応抑制剤は、反応混合物を乾燥過程中にオリゴヌクレオチドなく保護することができ、反応混合物がオリゴヌクレオチドを含有する場合、反応収率が減少する。
前記安定化混合物の水溶液を容器の外で製造して後続的に加えたり、または安定化混合物の相異なる成分を容器自体内で加えて混合することで、容器で直接的に製造することができる。
【００４０】
反応混合物の水溶液と安定化混合物を容器で混合した後に、少なくとも１つの酵素を安定化混合物と共に含む反応混合物を含有する水溶液を製造する。続いて、安定化混合物との反応混合物から生成された水溶液中に含まれていた水の一部または全部を、酵素または酵素を、安定化混合物と共に含む完全にまたは部分的に乾燥した混合物が得られ、水分含有量が３０％以下になる時まで除去し、したがって完全にまたは部分的に乾燥した、少なくとも１つの酵素を含む安定化された反応混合物を得る。
【００４１】
反応混合物を安定化混合物と混合した後に、容器で得た水溶液中に存在する水の全部または一部を、例えば凍結乾燥、流動層上での乾燥、室温及び大気圧での乾燥、室温及び減圧での乾燥、高温及び大気圧での乾燥、高温及び減圧での乾燥を含んだ任意の通常的な乾燥方法で除去できる。好ましい乾燥方法は、１５℃ないし６０℃の温度及び大気圧未満の減圧での乾燥である。前述したことと同様の他の方法を乾燥に適用できるが、より高い費用または少ない効率性または乾燥させる反応混合物の成分に対するより大きい攻撃性は、これらの使用を断念させる。
本発明で提供した乾燥した、安定化した反応混合物は３０％以下、好ましくは２０％以下の水分含有量を持つ。
【００４２】
完全に乾燥した反応混合物、すなわち残留水の存在が１％以下の反応混合物は、より高いパーセントの水を含有するので、保管中に安全性が低い傾向があり、完全に乾燥した混合物で再水和及び反応基質の添加後に反応収率が顕著に減少する。一方、残留水のパーセントが１ないし２０％の乾燥した混合物で巨大分子は、その完全な移動性を防止する不活性重合体の存在にもかかわらず、好ましくない化学または酵素反応を起こしえる移動性を表し、したがって室温（２５℃）で数週の安全性を表すが、好ましくは、その適合した長期作用性を保障するために、４℃ないし１０℃の温度で保管しなければならない。選択する乾燥の程度は、主に経済的な因子（工程費用、所定の乾燥度に到達するのに必要とする時間等）及び乾燥度と反応混合物の安全性との間に存在する比率によって変わる。結果的に、特定の実施態様おいて、安定化かつ乾燥した反応混合物の中に残っている相対的の水分パーセントは、１乃至２０％である。
【００４３】
本発明の方法により、完全にまたは部分的に乾燥した、安定化した反応混合物が得られ、この混合物は単一チューブまたはプレートのウェルに、これを再水和させ、基質または問題サンプルを添加した後、目的とする酵素反応を遂行できるようにするために必要とする全ての要素（例えば酵素、補助因子、基質、オリゴヌクレオチド反応プライマ、及び酵素反応を促進または調節する他の添加剤）を含有し、したがってこれらの乾燥した反応混合物を運搬及び取り扱うに当たって、低温流通を維持する必要性がなくなり、それぞれの反応酵素を別途に保存し添加する必要性がなくなることによって、酵素反応、例えば核酸増幅を行うのに必要とする通常的な処理が簡単になり、交差汚染及びピペッチング誤謬が防止され、その結果分析の反復性と信頼性が向上する。完全にまたは部分的に乾燥した、安定化した反応混合物は、室温で運搬及び保存後に顕著な損失なくその活性を維持する。
【００４４】
本発明は、また水分含有量が３０％以下、好ましくは１乃至２０％である完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、この混合物は少なくとも１つの酵素、及び（ｉ）乾燥に対する少なくとも１つの保護剤、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応に対する少なくとも１つの抑制剤；及び（ｉｉｉ）乾燥した反応物の移動を防止する網構造を生成させることができる少なくとも１つの不活性重合体を含むことで、上で定義したような安定化混合物を含む。
【００４５】
特定の実施態様おいて、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物は、核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択された酵素を、酵素が干渉する酵素反応を行うのに必要とする試薬、例えば補助因子、酵素基質及び酵素反応を促進させる他の添加剤の一部または全部、好ましくは試薬全部と共に含有し、また随意的に標示されたり非標示されたオリゴヌクレオチドプライマ及び特定の増幅を行うためのプローブ、例えばサンプル中の所定の病源体または遺伝子突然変異を探知するためのプローブを含むことができる。このような方式で、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物が得られ、混合物は単一チューブまたはプレートのウェルに、これを再水和させ、基質または問題サンプルを添加した後、目的とする反応を遂行できるようにするために必要な全ての要素（例えば酵素、補助因子、基質、オリゴヌクレオチド反応プライマ及び酵素反応を促進または調節する他の添加剤）を含有する。
【００４６】
特定の実施態様おいて、本発明はサンプル中に存在する少なくとも１つの核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも１つの特定配列の増幅に有用な、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を提供する。反応混合物は、任意の公知された方法で標示されたり標示されない、熱安定、または熱安定性ではないデオキシヌクレオチド三燐酸塩のＤＮＡポリメラーゼ酵素または逆転写酵素、酵素活性に必要な全ての補助因子及び酵素活性を促進させたり調節する任意の他の添加剤を含む。この安定化かつ乾燥した反応混合物は、また任意の公知された方法により、標示されたり標示されないオリゴヌクレオチド反応プライマ（これは任意の公知された方法で標示されたり標示されない標的ヌクレオチド配列及び／またはオリゴヌクレオチド・プローブの特定の増幅に必要で、雑種形成分析を行うのに必要とする）だけでなく、雑種形成反応に対する任意の添加剤または補助剤を含有する。安定化かつ乾燥した反応混合物は、単一容器、例えば反応チューブまたは多重ウェルプレートのウェルに存在し、目的する反応を行うためには、ただ反応混合物を蒸留水及び分析するサンプルの添加により再水和させることが必要である。乾燥方法は、好ましくは前述したことであり、開示した安定化混合物を含有する。
【００４７】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は核酸の配列決定に有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、ここでジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を先行開示された安定化かつ乾燥した反応混合物に添加し、水溶性染料は排除させる。乾燥方法は前述したことであり、開示された安定化混合物を含有することが好ましい。
【００４８】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は多重ウェルプレート上で制限分析を行うのに有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって分析するサンプルをサンプルに処理される所定の制限酵素だけでなく、制限分析を行うのに必要とする全ての補助因子及び添加剤を含有する反応混合物の乾燥した要素を含有するウェル上に沈着させ、後続的にサンプルを再水和された反応混合物と共に培養させる。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００４９】
もう１つの特定実施態様において本発明は、核酸の配列決定に有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、ここでジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）をまた先行開示された安定化かつ乾燥した混合物に添加し、水溶性染料は排除させる。乾燥方法は前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５０】
もう１つの特定実施態様において本発明は、多重ウェルプレート上で制限分析を行うのに有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって分析するサンプルを、サンプルに処理しようとする所定の制限酵素だけでなく、制限分析を行うのに必要な全ての補助因子及び添加剤を含有する反応混合物の乾燥した要素を含有するウェル上に沈着させ、後続的にサンプルを再水和された反応混合物と共に培養させる。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５１】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は多重ウェルプレート上で雑種形成を行うための完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって雑種形成させるサンプルを任意の公知された方法で標示されたり標示されない、雑種形成分析を行うのに必要とする乾燥したオリゴヌクレオチド・プローブだけでなく、雑種形成反応に対する任意の添加剤または補助剤を含有する容器上に沈着させ、後続的に雑種形成反応を行う。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５２】
本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物は「即席使用」類型であり、以下に開示して本明細書に添付の実施例に例示した方法によって多数の用途を持つ、特に疾病の診断、ＤＮＡ配列の測定、または核酸制限分析に使われる。
【００５３】
さらに、本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を高温の開始反応システムとして使用することができる。本発明者が遂行した多数の研究は、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を含有するチューブを使用する増幅反応が、ＰＣＲ遂行前にチューブの内容物の再懸濁の可否と関係なく同一の効率性で遂行されることを明確に明らかにした（実施例Ｉ参照）。これは完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物の試薬が反応の最初段階の中、例えば高温での培養中に有効に放出されることを意味することができる。このような事実は本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物が、高温の開始システムを行うことができるようにする。この実施態様は、多数の理由によって非常に重要であり、したがって： ａ）実用的な観点で、これは混合物の再懸濁を防止することによって、システムの取扱いを容易にし［実際に、大きなサンプルの体積（２０チューブ以上）に対してチューブそれぞれの個別的な再懸濁は、通常的な混合物の製造よりさらに長くあり得る時点まで多くの作業を伴う］；反面に、これと対照的に再懸濁を行う必要がないことは、行うべき作業を劇的に減少させ；ｂ）科学的な観点で、高温の開始システムは、これがシステムの特異性を増加させるので増幅システムに理想的であり；このような意味で本発明によって提供されたシステムは、氷上でチューブを安らかに作業できるようにして試薬が熱を放出できるようにする。
【００５４】
本発明はまた、水分含有量が３０％以下、好ましくは１乃至２０％である、本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を含むキットを提供する。特定の実施態様おいて、前記キットは、サンプル中に存在する少なくとも１つの核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも１つの特定配列の増幅に、または核酸雑種形成分析を行うのに、または核酸の配列決定に、または多重ウェルプレート上での制限分析の遂行に、または多重ウェルプレート上での雑種形成の遂行に適合したものである。本発明のキットは、酵素反応に干渉する少なくとも１つの酵素を含む、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物と別途に、酵素反応の遂行に必要とする試薬、因子、添加剤及び／またはオリゴヌクレオチド配列の全部または一部、好ましくは全部を含有する。
【００５５】
（発明を実施するための最良の形態）
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明し、本発明の範囲に対する制限として解析してはいけない。
実施例Ｉ
ＤＮＡ増幅のための反応混合物の乾燥
本実施例及び下記の実施例で使用した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、異なって表現しない限りＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製したサーマス・サーモフィルス再結合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．， Ｓｐａｉｎ所有、ＢＩＯＴＯＯＬＳ ＤＮＡポリメラーゼ）である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ＮＰ４０を含有する保管緩衝液の中で保管した。反応緩衝液は、７５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するもので製造した。
【００５６】
保管緩衝液中に保存されたＤＮＡポリメラーゼ酵素（１Ｕ／：１）１μＬ、反応緩衝液５μＬ及びＤＮＡ増幅反応に干渉する４個のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を同モル比で含有する溶液１μＬを各々０．２ｍｌの実験に使われた反応チューブに加えた。複数のチューブを前述した方式で準備し、適合した体積の表１に含まれたそれぞれの安定化混合物を各チューブに加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、乾燥させる混合物の最終体積によって変わる。
【００５７】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。表１に示す時間を決定すれば、２次蒸留水４３μＬ、それぞれの反応プライマ：Ｉ−１：５’−ＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡ−３’（配列識別番号：１）；及びＩ−２：５’−ＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＡ−３’（配列識別番号：２）１μＬ、及びＤＮＡ５００ｎｇを最終体積５０μＬで加えることによって、シトクロムｂ（３５９塩基対（ｂｐ）の大きさを持つ）の特定領域に対する増幅反応により活性を分析した。
【００５８】
バイアルのゲル化された内容物を５０μＬ添加した水、プライマ及びＤＮＡにピペッチング（５回）することで、チューブの半分に再懸濁させた。バイアルからのゲル化された内容物をチューブの残り半分には再懸濁しなかった。培養を９４℃で２分間（この培養周期は、厳密に言えば必要としたものではなく、むしろ任意的なものである）行い、続いて３５周期の変性（９４℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）及び延長（７２℃、４０秒）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。同じく、乾燥したチューブでの活性の進展を検査するために、前記ＤＮＡサンプルを新しい混合物を使用し、同一な増幅条件で増幅させた。
【００５９】
全ての場合に、増幅反応の結果を２％アガロースゲル（重量／体積）で分析し、増幅が陽性の全ての場合に、単一の３５９ｂｐバンドが発見された。乾燥した反応混合物と新しい混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータプログラムを使用して増幅により生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対し、半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００６０】
得られた活性結果を表１で「実施例Ｉ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
全ての場合に、バイアルのゲル内容物をＰＣＲ遂行前に再懸濁したチューブで得た活性と、再懸濁しなかったチューブで得た活性が似ていると現れた。このような事実は、高温で培養中にゲル化された混合物に含まれていた試薬が效果的に放出され、したがってこれは高温の開始システムとして作用することを立証するものと見える。
【００６１】
実施例ＩＩ
逆ＲＮＡ転写及び後続的なｃＤＮＡ増幅のための反応混合物の乾燥
本実施例に使われた熱安定性逆転写酵素はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製した、実施例Ｉに示した酵素に対して向上した逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィルス再結合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．，Ｓｐａｉｎ所有、ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ＮＰ４０を含有する保管緩衝液中で保管した。反応緩衝液は、逆転写を行うために７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２及びそれぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）０．１２５ｍＭを含有するもので製造した。
【００６２】
保管緩衝液中に保存された前記酵素（５Ｕ／：１）１．５μＬ、逆転写用反応緩衝液４μＬ、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰを同モル比で含有する溶液１μＬを各々０．２ｍｌの本実験に使われた反応チューブに加えた。７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、０．７５ｍＭ ＥＧＴＡ及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する反応緩衝液６μＬをもう１つの０．２ｍｌチューブに加えた。複数のチューブを前述した方式で準備し、表１に含まれたそれぞれの安定化混合物をチューブの各々に加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。
【００６３】
反応混合物の活性及び新しい乾燥していない混合物の活性を、乾燥した混合物を２次蒸留水１５μＬで再水和し、それぞれの反応プライマ：ＩＩ−１：５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴ−３’（配列識別番号：３）；及びＩＩ−２：５’−ＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ−３’（配列識別番号：４）１．２５μＬ、及びＣＤ８αマウスから抽出した伝令ＲＮＡ１００ｎｇを最終体積２０μＬで加えることによって、（１、１２２ｂｐの大きさを持つ）ＣＤ８αマウス遺伝子の特定領域に対する増幅反応により分析した。この方式で再造成した逆転写混合物を、ｃＤＮＡ合成のために６０℃で３０分間培養させた。続いて、ＤＮＡ増幅混合物を有する乾燥したチューブを３０：１Ｈ２Ｏで再水和させた。再水和された反応緩衝液の全体体積を逆転写反応が行われたチューブに加えた。続いて４０周期の変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。
【００６４】
実験を逆転写反応に使われるチューブと後続のＤＮＡ増幅反応に使われるチューブを乾燥し、同一の条件下で保管するように構想した。増幅産物を１％アガロースゲル（重量／体積）で電気泳動により分析し、増幅が陽性の全ての場合に単一の１，２２２ｐｂバンドが発見された。全サンプルの増幅バンドの濃度をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対して半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００６５】
得られた活性結果を表１で「実施例ＩＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００６６】
実施例ＩＩＩ
切断緩衝剤を共に使用した制限酵素の乾燥
ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）が市販する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（１Ｕ／：１）１μＬを酵素と共に製造社が供給した１０倍切断緩衝液１μＬと共に本実験に使われた１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。複数のチューブを前述した方式で準備し、適合した体積の表１に示す相異なる安定化混合物の各々を前記に加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００６７】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。２次蒸留水８μＬに再水和した後、一旦表１に示す相応する時間が経過すれば３７℃で２時間ラムダファージＤＮＡ（１５０ｎｇ／：１）０．３μｇを切断させることによって、これらの活性を分析した。切断反応の結果に対する電気泳動を同一の時間及び温度条件で行われた新しい酵素製剤を使用した切断と並行し、１％アガロースゲル（重量／体積）で遂行した。乾燥した酵素の活性を下記３個の範ちゅうに分けた：Ａ）完全なＤＮＡ切断がなされた時、最適活性（表１で「切断」）で、この時新しい酵素による切断時、得られたパターンと同一な制限パターンを持ち；Ｂ）部分切断の存在によって新しい酵素により得たパターンと相異なる制限パターンが得られた時、平均活性（表１で「部分」）であり；Ｃ）切断の完全な部材が観察された時、不活性（表１で「非切断」）である。
【００６８】
乾燥した制限酵素の活性を、その切断緩衝剤と共に新しい乾燥していない酵素で生成した同一の特徴物の切断により現れる活性と比較した結果を、表１の「実施例ＩＩＩ活性」項で見ることができる。結論的に、またメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有する安定化混合物がより長い保存時間内に完全な切断を発生させるものである反面、他の分析された混合物は、部分的な切断を発生させたり、または切断させられない。
Ｍｂｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ及びＡｃｃ Ｉのような他の制限酵素を、同じく分析して同一の結果を得た。
【００６９】
実施例ＩＶ
所定のＤＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中、及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥
実施例Ｉに開示した全ての成分以外に、スペイン特許出願第Ｐ２００１００５６８号に開示され、人間からマラリアを発病させる４個のプラスモジウム種を同定するのに使用する反応プライマだけでなく、単一段階で半重複反応機構により単一の複合的な増幅反応で陽の反応対照群として作用する人間ＤＮＡを含有する反応混合物を製造した。この方法で、通常的な方法により全血から抽出した人間ＤＮＡサンプルを分析する。
【００７０】
４個のプラスモジウム種及び人間ＤＮＡ増幅対照群それぞれの同時的なＤＮＡ増幅反応を、２５：１の反応混合物と下記組成物を別の反応チューブ（０．２ｍｌまたは０．５ｍｌ）に含めることによって遂行した：７５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ツイン２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．０４：Ｍ Ｈ１プライマ（配列識別番号：５）、０．０４：Ｍ Ｈ２プライマ（配列識別番号：６）、２．２５：Ｍ Ｐ１プライマ（配列識別番号：７）、０．０１：Ｍ Ｐ２プライマ（配列識別番号：８）、０．６：Ｍ Ｆプライマ（配列識別番号：９）、０．１５：Ｍ Ｍプライマ（配列識別番号：１０）、０．３７５：Ｍ Ｏプライマ（配列識別番号：１１）、０．１５：Ｍ Ｖプライマ（配列識別番号：１２）及び２単位のＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＴＯＯＬＳ ＤＮＡポリメラーゼ）。
【００７１】
複数のチューブを前述した方式で準備し、表１に示す安定化混合物のうち、１つをそれぞれのチューブに、混合物を完成するそれぞれの要素に対し、相異なる濃度で添加した。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００７２】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。前記表１に示す保存周期後に、乾燥した混合物を２次蒸留水２０μＬ及び相異なるプラスモジウム種により感染した患者から由来したＤＮＡ５０ｎｇで最終体積２５μＬで再水和した後、活性を分析した。同じく、活性の基準として新しい乾燥していない混合物を有するチューブを全ての実験に含めた。使われた増幅周期は８５℃で３分間の初期加熱周期、続いて９４℃で７分間の変性段階を含む。続いて、４０回の反復された周期でなされた増幅循環を行い、これらのそれぞれの周期は９４℃で４５秒間の変性段階、６２℃で４５秒間の雑種形成段階及び７２℃で１分間の延長段階を持つ。一旦、４０回の増幅周期が終了すると、最終延長段階を７２℃で１０分間行う。
【００７３】
増幅反応をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器で遂行した。増幅結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性の全ての場合に、３９５ｂｐ及び２３１ｂｐの２個のバンドが発見され、これらは各々Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及び人間ＤＮＡの増幅産物に相応する。乾燥した反応混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対し、半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００７４】
得られた活性結果を表１で「実施例ＩＶ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００７５】
ヌンク（Ｎｕｎｃ）ポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００７６】
実施例Ｖ
所定のＲＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥
実施例ＩＩに開示した全ての成分以外に、スペイン特許出願第Ｐ２００１００５６７号に開示され、カップリングされた逆転写システムに続いて単一チューブまたはウェルで半重複増幅反応により腸内ウイルスゲノムを、一般的に探知する作用をする反応プライマを含有する反応混合物を製造した。
【００７７】
逆転写反応を行うために、それぞれの反応に対して７５ｍＭトリスＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、それぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）０．１２５ｍＭ及び１０ピコモルのＥＶ１Ｍプライマ：５’−ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列識別番号：１３）及び７．５単位の実施例ＩＩに示したＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する２０μＬの混合物を製造する。
【００７８】
ＤＮＡ増幅反応を行うために、それぞれの反応に対して７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％ツイン２０、０．７５ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ピコモルのＥＶ２Ｐプライマ：５’−ＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列式弁番号：１４）及び０．５ピコモルのＥＶ１Ｐプライマ：５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＲＣＧＣＣＴＧＴＴ−３’（配列式弁番号：１５）を含有する３０μＬの混合物を製造する。
【００７９】
複数のチューブを前述した方式で製造し、表１に示す相異なる体積のそれぞれの安定化混合物をそれぞれのチューブに加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００８０】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。また表１に示す時間内に、乾燥した逆転写混合物を２次蒸留水１５μＬで再水和し、ＲＮＡ１００ｎｇを最終体積２０μＬに加えた後、活性を分析した。４８℃／５分及び６０℃／１５分の４回の周期を遂行した。逆転写に使われたその同族体と同一の安定化混合物を含有する、後続のＤＮＡ増幅反応に使われる０．２ｍｌチューブを３０μＬの２次蒸留水に再懸濁し、その体積を逆転写生成物を含有する０．２ｍｌチューブに加えた。３５周期の変性（９４℃、１分）、アニーリング（４８℃、１分）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。
【００８１】
増幅反応結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性に明らかになった全ての場合に、３９０ｂｐ及び４８９ｂｐの２個のバンドが現れた。全ての実験で、活性基準として使われる新しい混合物を有するチューブを含めた。乾燥した反応混合物と新しい反応混合物に対する活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００８２】
得られた活性結果を表１で「実施例Ｖ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００８３】
ヌンクポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００８４】
実施例ＶＩ
所定のＤＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中、及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥に続き後続的に多重ウェルプレート上で制限分析を行う（この時、それぞれのウェルは前記分析の遂行に必要な乾燥した制限酵素を含有する）
【００８５】
本システムを乳頭種ウイルス同定及び分類方法を使用して分析した。前記方法は、２個のウイルスゲノム領域、すなわち全ての乳頭種ウイルスのゲノムに保存されるＬ１領域の４５０ｂｐ断片、及び発癌性乳頭種ウイルスにのみ存在するＥ６−Ｅ７領域の２５０ｂｐ断片の第１球−増幅段階からなる。増幅混合物は、７５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．０１％ツイン２０、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、２．５ピコモルのプライマ：ＶＩ−１：５’−ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ−３’（配列識別番号：１６）及びＶＩ−２：５’−ＣＧＴＣＣＭＡＲＲＧＧＡＷＡＣＴＧＡＴＣ−３’（配列識別番号：１７）、１．２５ピコモルのプライマ：ＶＩ−３：５’−ＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’（配列識別番号：１８）及びＶＩ−４：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣ−３’（配列識別番号：１９）、及び１単位の実施例Ｉに示したＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する。増幅産物の分析により乳頭種ウイルス（４５０ｂｐバンド）の存在を確認できるだけでなく、任意の発癌性種（２５０ｂｐバンド）が存在するかどうかを決定できる。
【００８６】
続いて、５個の制限酵素（Ｒｓａ Ｉ、Ａｃｃ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ及びＢｇｌ ＩＩ）による切断で、各サンプル中に存在する乳頭種が特性決定される。したがって、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８及びＨＰＶ ３３の増幅された２５０ｐｂバンド（発癌性ゲノムに相応する）をＡｖａ ＩＩのみによって切断し、ＨＰＶ ３１のものをＲｓａ Ｉにより切断し、ＨＰＶ ３５のものをＡｖａ Ｉにより、ＨＰＶ ５２ｂのものをＢｇｌ ＩＩにより、ＨＰＶ ５８のものをＡｃｃ Ｉにより切断させ、それぞれの場合にアガロースゲルで容易に差別化できる相異なる制限基準を得る。またＲｓａ Ｉ活性を有する４５０ｂｐバンドの切断基準により非発癌性遺伝子型を分類できる。
【００８７】
複数のチューブを前に開示した方式で製造し、表１に示す相異なる体積のそれぞれの安定化混合物をチューブ各々に加えた。前述したそれぞれの制限酵素（チューブ当たり１単位の各酵素）及び１μＬのそれぞれの１０倍反応緩衝液を有するチューブをまた準備した。このように用意した全てのチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００８８】
乾燥後、チューブを表１に示す温度で維持させた。一旦表１に示す保存時間が経過したならば、乾燥した混合物を２次蒸留水４５μＬ及びＨＰＶ １８で感染した患者から抽出したＤＮＡ２５ｎｇで最終体積５０μＬに再水和した後、活性を分析した。３０周期の変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、１分）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。増幅反応結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性と明らかになった全ての場合に、各々２５０ｂｐ及び４５０ｂｐの２個のバンドが発見された。乾燥した反応混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００８９】
続いて、制限酵素により乾燥したチューブとウェルを新しい混合物を使用して行われた１０μＬの増幅水で再懸濁させた。混合物を３７℃で３０分間培養した後、切断産物を１．５％アガロースで分析した。これは： 最適活性（表１で「切断」）は、２５０塩基対（ｂｐ）バンドの完全な切断で、平均活性（表１で「部分」）は、バンドの部分的な切断で、不活性（表１で「非切断」）は、切断の完全な部材であると見なされる。
【００９０】
増幅反応を遂行した後に得た密度測定結果を表１で「実施例ＶＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好した活性を保存することによって適合すると見なすことができるが、より高い活性を保存するのはメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
制限酵素の活性に対し、制限酵素の乾燥に使われた混合物がメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有する場合に使われた５個の酵素に対して最適の結果が得られた。
【００９１】
ヌンクポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００９２】
実施例ＶＩＩ
共有結合したオリゴヌクレオチド及び乾燥した反応混合物を有する多重ウェルプレート上での所定のＤＮＡ配列の増幅に続くビオチン化プローブとの雑種形成による分析
【００９３】
本システムをプラスモジウムＤＮＡの臨床的サンプルを増幅及び同定するのに使用した。これをために、ポリスチレン多重ウェルプレート（Ｃｏｖａｌｉｎｋ ＮＨ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ，Ｎｕｎｃ）を使用した。実施例ＩＶに示したプラスモジウム中Ｐ１プライマを前でその５’端部を通じてプレートの各ウェルに共有結合させたが、これは後続の増幅反応でプライマとして作用するはずである。実施例ＩＶに開示された反応混合物だけでなく、実施例ＩＶ及び表１に開示された相異なる安定化混合物をプレートの各ウェルに加えた。複数のプレートを後続的に分析しようとする保管時間及び温度として準備した（表１）。一旦プレートが用意されたら、これらのを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させた。
【００９４】
乾燥したサンプルを２０μＬの滅菌水で再水和し、プラスモジウムに感染した患者からのＤＮＡ５μＬを１０ｎｇ／：１の濃度で加えた。続いて、増幅反応を多重ウェルプレートに対してエッペンドルフ勾配熱循環器を使用し、実施例ＩＶ開示した条件で遂行した。全ての場合に、増幅を活性基準として使用するために乾燥していないプレートを使用して同一な条件で遂行した。
【００９５】
一旦反応が終了されたならば、反応混合物を各ウェルから除去し、したがってウェルには二重バンド増幅産物だけがウェル中に結び付いたままである。バンドのうちひとつを一般的なＰ１プライマから延長により合成する場合、バンドはウェルに共有結び付いたままである。対照的に、他のＤＮＡバンドは詳報的な塩基対形成により最初のものに結びつく．単一ＤＮＡバンドを後続の雑種形成反応に対する基質として使用することが必要な場合、プレートをウェルに共有結合しないＤＮＡバンドを除去して、ただＰ１オリゴヌクレオチドから合成されたバンドを残す目的で洗浄した。このために、５０％フォルムアミド、５倍ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの造成を有する反応緩衝液を製造した。混合物５０μＬを各ウェルに加え、８０℃で１０分間培養した。続いて、混合物を除去して洗浄過程を３回反復した。
【００９６】
雑種形成反応をビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して遂行した。このために、各ウェルを４Ｘ ＳＳＣ、１０Ｘデンハールト（Ｄｅｎｈａｒｔ）及び２００：ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する雑種形成反応緩衝液中から６０℃で２時間の間、１０ｆｍｏｌのプローブと共に培養した。続いて、雑種形成混合物を除去して各ウェルを２００：１の０．１Ｘ ＳＳＣ稀釈液で２回洗浄した後、１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．３％ツイン２０で洗浄し、１００ｍＭマレインサン遮断反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ＢＳＡで最終洗浄した。
【００９７】
一旦遮断が終了したならば、先行開示された遮断反応緩衝液中のペルオキシダーゼと共液した１：２０００のストレプトアビジンを各ウェルに加え、２３℃で４５分間培養した。最後に、ウェルを２００μＬの１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．３％ツイン２０で３回洗浄し、２００μＬの１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄した。最後に、１００μＬのＴＭＢを各ウェルに加え、前記を暗室で１０分間培養させた。反応を停止した後、吸光度を４５０ｎｍで測定し、この時全ての値を６５５ｎｍでプラスチックの吸光度値で補正した。
【００９８】
乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００９９】
得られた活性結果を表１の「実施例ＶＩＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって、適合したと見なされることができるが、より高い活性を保存するのはメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
【表１２】
【０１１２】
実施例ＶＩＩＩ
混合された相反応システムの使用による連続的な反応の区画化
本実施例に使用した熱安定性逆転写酵素は、実施例ＩＩと同じようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製した、実施例Ｉに示した酵素に対して向上した逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィルス再組合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．、Ｓｐａｉｎ所有、ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）である。前記酵素はＭｎ２＋イオンの存在下で逆転写酵素活性を表し、Ｍｇ２＋イオンの存在のもとではＤＮＡポリメラーゼ活性を表し、２つの反応はすべて通常的な条件下で排他的である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ ＮＰ４０を含有する保管緩衝液で保管した。
【０１１３】
ＰＣＲ反応を行うために１．５ｍＭ ＥＧＴＡ及び４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する反応緩衝液を製造した。先行開示された混合物１０μＬをそれぞれの０．２ｍｌチューブに加え、先行実験（実施例Ｉ乃至ＶＩＩ）で良好な活性が立証された安定化混合物、すなわちメレチトースまたはパラチニトールをリジンまたはグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に添加した。このように用意した全てのチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は使用する安定化混合物によって変わる。乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。これらの活性を前記表１に示す保存期間後に分析した。
【０１１４】
最後に、逆転写反応を行うために、７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、５単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）及び２０ピコモルのそれぞれのＩＩ−１及びＩＩ−２プライマ（実施例ＩＩに開示）（ＣＤ８αマウス遺伝子からｍＲＮＡの１、１２２ｂｐの断片を増幅させる）を含有する反応緩衝液を製造した。
【０１１５】
活性分析のために、１５μＬの逆転写反応混合物及び１００ｎｇのマウスＲＮＡをＰＣＲ混合物が乾燥している全ての０．２ｍｌチューブに加え、最終体積をＨ２Ｏで２０μＬ以下に調節した。チューブの半分で、チューブのゲル化された内容物をピペッチングにより再懸濁１クラスならば、他の半分では再懸濁しなかった。対照群として、２−段階ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施例ＩＩに開示した条件下で全ての実験に含め、ここで安定化混合物は含めなかった。
【０１１６】
全てのチューブに逆転写増幅の単一段階循環を加え、過程の間試薬は含めなかった。前記反応は９４℃で１分の培養に続いて６０℃で３０分の培養でなされた。続いて、チューブに高温を加えて非再懸濁かつゲル化された混合物中に含めた試薬の放出を許容し、これは８３℃で５分間の培養に続いて９４℃で３分間の培養でなされる。最後に、４０回の反復された周期を行い、これらのそれぞれの周期は９４℃で４５秒間の変性段階、５５℃で３０秒間の雑種形成段階、及び７２℃で１分間の延長段階を持った。一旦４０回の増幅段階が終了されたならば、最終延長段階を７２℃で７分間遂行した。増幅反応をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器で遂行した。
【０１１７】
増幅された産物を１％アガロースゲル（重量／体積）での電気泳動により分析し、反応が陽性の全ての場合に単一の１，１２２ｂｐ増幅バンドを発見した。分析された反応混合物の活性を、ＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用してやはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して生成されたバンドの密度測定により測定した。
【０１１８】
増幅反応の活性分析は反応がゲル化された混合物を逆転写反応の遂行前にピペッチングし、したがってＭｎＣｌ２、ＥＧＴＡ及びＭｇＣｌ２と接触させることによって再懸濁した全てのチューブで抑制されたことを立証した。一方、ゲル化された混合物を再懸濁しないチューブでは、２−段階逆転写及び増幅反応で得たものと類似の密度を有する量の結果を得た。このような事実はＭｇＣｌ２及びＥＧＴＡゲル化された混合物が高温での培養により放出される時まで区画化されたまま維持され、これにより互いに排他的な２個の反応を配列化させることができることを立証する。
（技術分野）
本発明は、反応混合物を含有する溶液に安定化混合物を添加し、続いて生成された溶液中に存在する水を全部または一部除去することによって、完全にまたは部分的に乾燥させた、安定化反応混合物の製造方法だけでなく、生成された反応混合物及び反応混合物を含むキットに関するものである。
【０００２】
（背景技術）
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）は、遺伝情報の貯蔵及び伝達に寄与する長い線形の巨大分子である。これらはヌクレオチドと称する単量体単位を持ち、これらの単位は各々窒素含有プリンまたはピリミジン塩基、簡単な糖（ＤＮＡの場合デオキシリボース、及びＲＮＡの場合リボース）、及び無機燐酸塩で形成される。核酸でヌクレオチドは、隣接したヌクレオチドの糖を通じてリン酸ジエステル結合により共に結び付く。これらの窒素含有塩基は、糖−燐酸骨格に共有結合する。全ての核酸は主に４個の相異なる窒素含有塩基、つまり２個のピリミジン塩基と２個のプリン塩基を持つ。プリン塩基は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれにも同一で、これらは共にアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）を含有する。ピリミジン塩基に対し、前記両方の核酸は、共にシトシン（Ｃ）、ＤＮＡ特異的なチミン（Ｔ）、及びＲＮＡ特異的なウラシル（Ｕ）を含有する。これらの窒素含有塩基の配列は核酸により隨伴される遺伝情報だけでなく、これらの３次元形状を決定する。ＲＮＡが実際には、一般的に単一ポリヌクレオチド鎖として発見される反面、ＤＮＡは通常に二重ポリヌクレオチド鎖として発見されて、この時両方のストランドは互いに補い合うようなプリン塩基とピリミジン塩基との間に形成された水素結合により結び付ける反平行方式で配列される。
【０００３】
核酸の増幅は、核酸の特異的または特徴的な断片の初期量の指数的な増幅になされた所定の核酸を正確に同定するのに最も広範囲に使われる道具である。増幅された断片を後続の用途、例えばクローニング及び制限分析に使用することができる。核酸の配列決定は、所定の核酸断片のヌクレオチド配列の測定でなされる。核酸の増幅及び配列決定だけでなく断片制限分析、制限酵素と称するエンドヌクレアーゼ酵素により引き起こされた差別的な大きさを基準とした核酸の同定、または特性決定でなされた技法は、他の可能な用途の中からも生物医学的研究、感染性及び遺伝性疾病の医学及び獣医学的診断、人間及び動物遺伝子分析、食品分析、環境制御及び法医学的分析に広範囲に使われる技法である。
【０００４】
生体の他核酸合成及び増幅には、多数の方法が存在する。最もよく知られ最もよく使われるのは、一般に英語の略字でＰＣＲと称するポリメラーゼ連鎖反応である（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４（１９８５）， Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，８００，１５９号）。最も簡単な形態のＰＣＲは、核酸または核酸の混合物中に含まれた少なくとも１つの特定のＤＮＡ配列を、これは塩基の相補性により、熱により先行的に変成された問題ＤＮＡの２個の対面領域に特異的に結合する２個のオリゴヌクレオチドプライマにより指数的に増幅させることを通した周期的なＤＮＡ増幅過程からなる。
【０００５】
相応するプライマに結び付いた問題ＤＮＡストランドは、各々重合反応のプライマとしてオリゴヌクレオチドを使用し、ＤＮＡポリメラーゼ活性の作用により相補的なＤＮＡ形態をコピーできる。この方法の連続的な繰り返し性により、オリゴヌクレオチドの雑種形成地点の間に含まれた問題ＤＮＡ断片の指数的な濃縮が得られる。熱安全性ＤＮＡポリメラーゼの使用で、連続的な変性周期を行うことができ、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ基質にアニーリングさせることができ、この鎖を各周期で新しいポリメラーゼ活性の追加なく延長させることができる。ＤＮＡの存在を相対的な豊富性で分析する場合、この方法はそれの確認に充分である。それにもかかわらず、この問題ＤＮＡの豊富さが簡単なＰＣＲの限界以下のサンプルを分析することが頻繁に起きる。このようなサンプルを分析するために重複ＰＣＲ技法が開発された。２個の結び付いた増幅過程をシステムで行い、このうち２度目の過程は、基質として最初のＰＣＲの増幅された産物を使用する。前記過程の特異性を増加させるために、２度目の増幅反応に使われたオリゴヌクレオチドは、最初に使われたものと相異なり、これらを最初の増幅産物の内部領域と雑種形成させる。
【０００６】
増幅反応が基質としてＤＮＡ分子を必要とするＤＮＡポリメラーゼ活性を使用する場合、ＲＮＡ分子の直接的な分析は、問題ＲＮＡに相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を合成する先行逆転写（ＲＴ）段階を必要とする。続いて、それによって得たｃＤＮＡを増幅反応基質として使用することができる（Ｍｏｃｈａｒｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９３：２７１−２７５（１９９０））。使用した増幅システムは、本来ＲＮＡ基質の相対的な豊富性によって簡単な反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であったり、または重複増幅（ＲＴ−重複ＰＣＲ）でありうる。逆転写酵素活性により変更されたＤＮＡポリメラーゼ活性の発達で、非常に厳しい条件下で単一酵素の活性を利用することによって、ＲＴ−増幅過程を行えるようになった。
【０００７】
前述した周期的な核酸増幅方法は、相異なる好熱性微生物、例えば特に、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｋａｌｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ４５， ６４４−６５１（１９８０）； Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：１５５０−１５５７（１９７６）；米国特許第４，８８９，８１８号）、及びサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｒｕｔｔｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：４１−４６（１９８５））から得た熱安全性ポリメラーゼ酵素を使用する。このような熱安全性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のうち多数、例えばＴ．アクアティカス酵素（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：８３８７−８３８８（１９８９））だけでなく、一部の中温性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、例えば大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０：３８３４−３８３８（１９７３）；Ｌｅｏｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ２４２：６６−６９（１９７３））は、反応混合物の中に存在する補助因子によって二重酵素活性、つまりＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素活性を表し、したがってマグネシウムイオンの存在のもとでは、ＤＮＡポリメラーゼ活性が現れる反面、マンガンイオンの存在のもとでは、逆転写酵素活性が現れる。
【０００８】
中温蛋白質とは異なり、熱安全性酵素は熱により変成されず、むしろその活性を行うためには高温を必要とする。これは主にその全体的な蛋白質の折り畳みまたは３次構造で伝えられるそのアミノ酸配列の変更から起因する。これは劇的な変更ではなく、むしろ熱安全性が小さいエンタルピーとエントロピー類型の相互作用の合の結果として起きて、より剛性で耐熱性の２次構造を得るのに上昇作用的に寄与する。アミノ酸の変化は、これらの変更の中でも顕著で、これによってより剛性の３次構造が生成されたり（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ ａｎｄ Ａｒｇｏｓ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２０６：３９７−４０６（１９８９））、または特に蛋白質のより敏感な領域、例えばループで脱アミン化（Ａｓｎ，Ｇｌｎ）または酸化（Ｍｅｔ，Ｃｙｓｎ）による分解に敏感な残基が除去される（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６６：２４２８７−２４２９４（１９９１））。
【０００９】
これらの間、蛋白質のアミノ酸の間だけでなく、媒質の水分子との水素架橋形成及び広範囲なネットワークの形成（Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０：７５−８３（１９９６））及び帯電された表面残基らの間の塩類架橋の形成、または蛋白質の疏水性内部に残っている極性残基を中和させる方式（Ｙｉｐ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ３：１１４７−１１５８（１９９５））としてのもう１つの変更により熱安全性が生成される。このような類型の他の変更では、２次構造、特に内部双極子の安定化によるα−螺旋の形成（Ｒｅｎｔｉｅｒ−Ｄｅｌｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２９：８５−９３）及び水素結合の形成（Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｓｋｏ， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．， ８：９０５−９１３（１９９５））だけでなく、疏水性内部への包装の増加、すなわち蛋白質をより緻密に作ること（Ｍａｔｔｈｅｗｓ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０：３５−４１（１９９６））がある。前述したように、熱安全性酵素の３次構造の保存及び結果的なその活性及び作用性は、非熱安全性中温酵素よりにはるかに、蛋白質とそれをめぐっている水性分子との相互作用の完全性を保存させることが明白である。
【００１０】
特にゼラチン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、硫酸アンモニウム及びテシットのような生成物は、ポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰを安定化させ、非イオン性界面活性制、例えばＮＰ４０及びツイン２０は、核酸増幅反応を改善させることでよく知られている（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【００１１】
制限酵素としては、ＤＮＡ二重鎖内のリン酸ジエステル結合を破壊するエンドヌクレアーゼ酵素がある。これらの制限酵素のうち、１つの類型のＩＩ型は、所定のＤＮＡヌクレオチド配列を認識し、所定の配列内部でヌクレオチドを共に連結する結合を破壊し、結果的に単一ＤＮＡを正確に再現可能な断片で切断させて制限地図と称するものを生成させる性質を持つ。ＩＩ型酵素は、多様な分子生物学技法、例えば特にクローニング、特定のＤＮＡ配列及び断片の同定、及び制限地図分析に広範囲に使われる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２ｎｄ Ｅｄ． １９８９）。
【００１２】
抗原及び抗体を含んだ酵素及び他の生物学的巨大分子の活性は頻繁に、３次構造と称するその３次元形状によって主に変わり、したがって３次元形状が任意の因子により変更される場合、巨大分子の生物活性または作用性が減少したり、さらに消えることもある。水は、生物学的巨大分子の周囲に保護ラップを形成し、疏水性／親水性の相互作用により巨大分子の３次構造を安定化させる。このような相互作用は、また巨大分子の表面上で発見できる化学的反応グループを遮断する。例えば、任意の乾燥過程で発生する水性保護ラップの除去時に、巨大分子の３次構造に変形がおきることがあり、これにより分子が変更され、化学的反応グループ（アミン、燐酸塩、カルボキシル基等）が相互に、または隣接した他の巨大分子の他の試薬グループと自由に反応し、本来の３次構造の喪失に寄与することができ、さらに互いに類似または相異なる多様な巨大分子の間に凝集を形成させ、これはまた一般的に巨大分子の生物活性または作用性の減少またはさらに喪失だけでなく、その３次構造の変更を伴う。
【００１３】
このような周辺の化学的反応グループとの間の反応は、一旦、巨大分子が、これらが位置している媒質の可塑性により適合に乾燥した場合にも起きることがあり、その理由は時間の経過時、乾燥した巨大分子の生物活性または作用性の減少が現れ得るためである。結果的に、巨大分子周囲の水性ラップを、巨大分子の３次構造を維持する機能及び表面反応グループを安定化及び保護する機能において、水分子を效率的に代替する保護剤に入れ替えることが非常に重要である。
【００１４】
前述したＤＮＡポリメラーゼ酵素及び制限酵素だけでなく、分子生物学及び前述した用途で使われる他の酵素を保存して運搬する通常的な方法は、これらの酵素を−２０℃で凍結させ、これらを主にその水性形態にグリセロールを添加することによって低温で耐えるように安定化させることを含む。この方法は、保存温度が−２０℃を越えない限り、ほぼいかなる活性喪失もなく数カ月間酵素活性を保存させ、したがって低温流通（この低温流通が数時間の間中断される場合、酵素活性または不活性の重大な喪失が記録される）を保存することが非常に重要である。−２０℃での凍結による運搬及び保存方法を使用する場合にも、これらの反応成分を、すべて単一容器、バイアル、またはチューブに入れ保存することは薦められないが、その理由は相異なる成分との間の好ましくない化学的または生化学的反応により、これらの成分が不活性化されたりまたは実験結果の解析を妨害したり見分けることができる人為的な産物が発生できるからである。前述したように、巨大分子を室温で保存及び運搬できるようにし、したがって、特に保存システムが単一容器内で目的とする酵素反応を行うのに必要とする全ての要素（酵素、補助因子、添加剤等）を市場に送りだす場合、必要とする低温流通保存を防止できるシステムを製造することが経済的に非常に便利であると推論できる。
【００１５】
前述した技法による核酸増幅では、反応に干渉するそれぞれの成分、すなわちＤＮＡポリメラーゼ酵素、反応促進添加剤、または安定化剤を含有する反応緩衝剤、塩化マグネシウム、またはＲＴの場合に塩化マンガン、反応プライマとして使われるオリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、及び増幅させる核酸を含有するサンプルを分離させ、前述したように凍結により保存し、これらを反応遂行の前に混合する必要がある。この場合、それぞれの成分を非常に少量（μＬ）で添加及び混合することが必要であり、この場合、それぞれの試薬を投与及びピペッチングするのに頻繁な誤謬が発生し、これは前記技法を適用することによって得た結果に対する再現性に対して不確実性、特に人間診断の場合に先取的な不確実性を発生させる。増幅反応に添加する相異なる試薬のピペッチング誤謬の可能性による変化性は、またこの技法の感度に影響を及ぼし、これはこの技法を人間疾病の診断、及び特に感染水準及び遺伝子発現水準の測定に適用させることに対し、新しい不確実性を発生させる。
【００１６】
さらに、分析するサンプルを反応混合物にピペッチング及び添加する間、分析サンプルの間に交差汚染を頻繁に発生させるエアゾールが生成され（Ｋｗｏｋ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３９：２３７−２３８（１９８９））、したがって偽り陽性結果が生成されるが、これはまた人間診断の場合に非常に重要である。
生物学的巨大分子の乾燥による保存に対して多様な技法が開示されて使われ、これらの用途及び適用性は、これが適用される生成物の作用特徴を保存する能力により決定される。
【００１７】
ここに開示した技法の中で、凍結乾燥が乾燥による主要保存技法であり、これは習性生成物を凍結させ、低圧条件下で氷を後続的に昇華させることによって水の除去を達成する方法である。昇華は、固体が液体状態を経たず、増発する過程であり、したがって前述した低圧という用語は、水が固体、液体、及び気体状態で共存する気体圧力である水の三重点以下の気体圧力値を示す。凍結乾燥を行うために、凍結乾燥させる溶液または生成物を凍結乾燥させる物質の類型に伴う温度及び速度で完全に凍結させなければならない。必要とする凍結乾燥装備は値段が高く、凍結乾燥過程は比較的に遅く、したがってこれらの経済的因子は、非常に頻繁にその使用を断念させる。
【００１８】
他の乾燥システム、例えば流動層上での乾燥、室温及び大気圧での乾燥、室温及び減圧での乾燥、高温及び大気圧での乾燥、高温及び減圧での乾燥が広く知られている。使用する乾燥方法を選択することは、その効率性の程度、乾燥により保存される造成に対するその多少の攻撃性、及び経済的な因子によって変わる。
乾燥過程の間、生物学的巨大分子の完全性を保存することだけでなく、保存及び保管過程の間、乾燥した要素の作用性を安定化及び保存するための相異なる溶液が提案された。
【００１９】
文献［Ｃｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １９：３０６−３１６（１９８２）］には、乾燥の細胞反応に対するグリセロール及びトレハロースの保護効果が開示されている。
文献［Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：３４６−３５６（１９８３）， Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２３２：４００−４９７（１９８４）、及びＢｉｏｃｈｉｍｉａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ７６９：１４１−１５０（１９８４）］には、細胞器官の乾燥においてトレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）として知られている非還元二糖より顕著に大きい保護効果を表す、細胞膜の安定化に対する多様な炭水化物の作用が開示されている。
文献［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４：４５５−４６４（１９８７）］はマルトース、スクロース、ラクトーズ及びトレハロース二糖が乾燥後のホスホフルクトキナーゼ酵素の精製された調剤の活性安定性を増加させることを指摘する。
【００２０】
和光純薬工業株式会社に属する欧州特許出願ＥＰ１４０４８９号には、免疫活性蛋白質（抗体）を随意的に牛血清アルブミンのような蛋白質と共に糖溶液に浸漬させることによって室温での乾燥に対し、担体（例えばグラスビード）上で保護する方法が開示されている。相当な数の糖が言及されており（リボース、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトーズだけでなく、他のオリゴ糖及び多糖）、より大きい保護効果をふまえてラクトーズ、スクロース及びデキストリン溶液が好ましい。
【００２１】
クァドラント・バイオリソース・リミテッド（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に許与された米国特許第４，８９１，３１９号には、蛋白質、抗体、及び他の生物学的巨大分子の乾燥保護剤としてトレハロースの用途が開示されている。
文献［Ｏ．Ｔｏｏｒｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ９５：５１７（１９８１）］には、魚の筋繊維の変性及び乾燥に対する糖及びアルコキシル糖の保護効果が開示されている。
特許出願ＥＰ９１２５８号には、精製したＴＮＦ蛋白質を牛血清アルブミンまたはゼラチンのような安定化蛋白質の存在下で保管または凍結乾燥させることによって、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）を安定化させる方法が開示されている。
【００２２】
クァドラント・ホールディングス・ケンブリッジ（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃａｍｂｒｉｇｅ）社に属する特許出願ＷＯ９１／１８０９１には、ポリハイドロキシル化された化合物（好ましくはソルビトールまたはマンニトール）からの非還元グリコシド、例えばマルチトール、ラクチトール、及び２つのパラチニトール異性体、及び非還元オリゴ糖、例えばラフィノース、スタキオーズ及びメレチトースを使用して乾燥した状態で生物学的物質を保存する方法が開示されている。
文献［ｌｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．ＪＰＮ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｏｃ， ３４：４０３−４０７（１９９１）］は、Ｌ−リジンが生物学的巨大分子の周辺部に位置したアミンとカルボニルグループとの間の縮合反応の抑制剤であることを指している。
【００２３】
クァドラント・ホールディングス・ケンブリッジ・リミテッドに付与された米国特許第５，９５５，４４８号は、非還元炭水化物及び周辺のアミンとカルボニルグループとの間の縮合反応抑制剤を添加することによって、乾燥したサンプル及びエンドヌクレアーゼ制限酵素を含んだ生物学的巨大分子を安定化させる方法を請求する。洗剤またはグリセロールのような安定化剤を使用することによって、再組合β−インターフェロンを安定化させることも知られており、この安定化剤は、また追加的な安定化剤として他の蛋白質、スクロース、トレハロース、及び他のポリハイドロキシル誘導体、特にデキストロースを含有することができる。
【００２４】
生物学的巨大分子の乾燥に対する乾燥及び保存方法に対し、他の参考文献、例えば文献［Ｐｉｋａｌ Ｍ．Ｊ．， ＢｉｏＰｈａｒｍ ３：１８−２０， ２２−２３， ２６−２７（１９９０），Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：４５９−７０（１９８８）， Ｒｏｓｅｒ Ｂ．， ＢｉｏＰｈａｒｍ ４：４７−５３，（１９９１）， Ｃｏｌａｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１００７−１０１１（１９９２），及びＣａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：２４４−２５５（１９８８）］を参照できる。
【００２５】
一方で、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）社に許与された米国特許第５，８６１，２５１号は、保存剤としてグルコースまたはソルビトールをＤＮＡ増幅反応の遂行に必要とする全ての成分、すなわち熱安全性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、この反応の遂行に必要とする全ての成分を含有する反応緩衝剤、及び重合反応の基質として必要とするデオキシヌクレオチド三燐酸塩またはジデオキシヌクレオチド三燐酸塩、水溶性染料を含有する反応混合物に添加することによって、凍結乾燥により乾燥したＤＮＡ増幅のための即席試薬を製造する方法を請求しているが、即席試薬にオリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマを添加することは言及していない。
【００２６】
ジェン・プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）社に許与された米国特許第５，６１４，３８７号には、保存剤として非還元二糖、好ましくはトレハロースまたはスクロース及び／またはポリビニルピロリドンをＲＮＡ増幅の遂行に必要な全ての試薬、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び／または逆転写酵素を、反応の遂行に必要とした全ての成分を含有する反応緩衝剤、及び重合反応の基質として必要とするデオキシヌクレオチド三燐酸塩またはジデオキシヌクレオチド三燐酸塩、水溶性染料と共に含有する反応混合物に添加することによる、凍結乾燥により乾燥した核酸増幅用即席試薬が開示されているが、実施例で任意の熱安全性酵素を言及していない。
旭化成工業（株）に許与された米国特許第５，９３５，８３４号は、トレハロースの存在下で乾燥及び保存させることによって収得でき、ウイルスからのＲＮＡの逆転写を行うのに必要とする全ての要素を含有する即席試薬を請求している。
【００２７】
乾燥過程の間、生物学的巨大分子の完全性を保存することだけでなく、保存及び保管過程の間、乾燥した要素の作用性を安定化及び保存するための多様な解決法が提示されたが、このような目的を満足させるための可能な手段を増加させるまた別の解決法の開発が依然として必要である。本発明は、これらの必要に対する解決法を提供する。
【００２８】
（発明の開示）
本発明は、完全にまたは部分的に乾燥した、少なくとも１つの酵素を含む安定化反応混合物の製造方法を提供し、前記方法は、ａ）単一容器で、ｉ）少なくとも１つの酵素を含む反応混合物の水溶液と、ｉｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤と、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤と、乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成できる少なくとも１つの不活性重合体と、から構成された安定化混合物の水溶液、とを接触させて、前記反応混合物と前記安定化混合物とを含む水溶液を得るステップと、ｂ）少なくとも１つの酵素を含む、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を得るために、前記酵素及び前記安定化混合物を含み、３０％以下の水分含有量を有する完全にまたは部分的に乾燥した混合物が得られるまで、前記ステップａ）で得た水溶液中に含まれている水の一部または全部を除去するステップと、を含む。
【００２９】
前記反応混合物は、１つ以上の酵素反応に干渉する１つ以上の酵素を、酵素が干渉する酵素反応を行うのに必要とする試薬の一部または全部と共に含む。特定の実施態様おいて、反応混合物は反応混合物中に存在する酵素を適合量で容器、例えば反応チューブまたは多重ウェルプレートのウェルで混合する反応、または反応を行うのに必要とする全ての試薬を含有し、この時行う酵素反応は基質または問題サンプルの再水和及び添加後に後続的に遂行されるはずである。
【００３０】
前記反応混合物中に存在する酵素または酵素らは任意の酵素でありうる。特定の実施態様おいて、前記酵素はＲＮＡとＤＮＡ核酸の両方からの熱安全性及び熱不安定性の核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択される。したがって、特定の実施態様おいて、反応混合物は核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素、及びこれらの混合物の中から選択された酵素を、前述した酵素が干渉する反応を行うのに必要とする全ての試薬、及び補助因子、酵素基質、及び酵素反応を促進させる他の添加剤と共に含み、また随意的に標示されたり非標示されたオリゴヌクレオチドプライマ及び特定の増幅を行うためのプローブ、例えばサンプル中の所定の病源体または遺伝子突然変異を探知するためのプローブを含むことができる。
【００３１】
前記反応混合物の水溶液を容器の外で製造して後続的に添加したり、または容器自体で相異なる反応混合物の成分を添加して混合することで容器で直接形成させることができる。
前記安定化混合物は、（ｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤；及び（ｉｉｉ）乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成させる少なくとも１つの不活性重合体を含む。
【００３２】
乾燥保護剤は、乾燥過程の間、反応混合物中に随意的に存在する酵素及びヌクレオチドの３次構造を安定化させることが主要任務であり、このような目的で保護剤は、巨大分子の３次元構造を維持し、さらに巨大分子の表面上に存在することができる化学的反応グループらの間に発生できる反応を遮断することを助ける水溶液で保護ラップを形成する水分子を代えて、それによって、これはさらに乾燥した混合物の長期的な保存に対して安定化効果を持つ。乾燥保護剤は適合した、非還元炭水化物、特に非還元二糖または三糖、または化合物の混合物でありうる。特定の実施態様おいて、乾燥保護剤は、非還元二糖のパラチニトール（６α−Ｄ−グルコピラノシル−マンニトール）及びトレハロース、非還元三糖のラフィノース及びメレチトース、及びこれらの混合物の中から選択される。他の非還元炭水化物、例えばスクロースが酵素乾燥に有効なことで立証されたが、酵素とオリゴヌクレオチドの両方の乾燥においてはそうでない。
【００３３】
ポリアルコールグループからの多数の非還元化合物、例えばソルビトール及びグリセロールが乾燥保護剤として、及び保管中の乾燥した混合物の安定化剤として分析された。両方の乾燥過程中の酵素の保護及び後続的な保存（特にソルビトール）に対する薬剤としてのそれらの独立的な用途に比較的有効なことに立証された。非還元炭水化物、縮合反応の抑制剤及び不活性重合体を含有する安定化混合物と共に、酵素とオリゴヌクレオチドの両方を含有する反応混合物の乾燥過程で、グリセロールは全ての場合に安定化混合物の成分、特に非還元炭水化物のメレチトース、パラチニトール、トレハロース、及びスクロースと共に有利な保護効果を表す反面、ソルビトールはいかなる有利な効果も表さず、むしろ逆に要素の保護効果を抑制することが分かる。乾燥保護剤として、及び反応混合物の保存中の安定化剤としてソルビトールの使用は、オリゴヌクレオチドが反応混合物中に存在しない場合に効果的で、これはオリゴヌクレオチド鎖が混合物中に存在する場合、保護または安定化作用を現さないことを表す。したがって、少なくとも１つの非還元炭水化物とは別途に、安定化混合物は、乾燥保護剤としてグリセロールを随意的に含有することができる。
【００３４】
前記縮合反応の抑制剤は、乾燥させる反応混合物中に存在する巨大分子の表面上に存在するカルボキシル、カルボニル、アミンと燐酸基の間に発生できる縮合反応を抑制する目的を持ち、したがって抑制効果を発揮するためには充分な量の抑制剤が存在しなければならない。使われる反応抑制剤は、競合的または非競合的でありえる。競合的な抑制剤の中から多数のアミノ酸が最も効果的なものとして立証され、リジン、アルギニン及びトリプトファンが最も卓越し、このうちでも特にリジンが卓越している。非競合的なものの中では、ベタイン及びアミノグアニジン誘導体が最も効率的なものと立証された。非競合的な抑制剤を使われる非還元炭水化物によって選択し、したがってラフィノースの存在下で最も効果的で非競合的な抑制剤はベタインである反面、他の炭水化物の存在のもとではアミノグアニジン誘導体が最も効果的である。したがって、特定の実施態様おいて、安定化混合物は、リジン、アルギニン、トリプトファン、ベタイン、アミノグアニジン誘導体、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択された、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応の抑制剤を含有する。
【００３５】
水溶液の乾燥時、乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成させることができる不活性重合体の主要目的は、反応混合物を構成する多様な反応物の移動を防止する網を生成させることによって、乾燥した反応混合物の保管中の安全性を向上させることである。したがって反応物は重合体で形成された小さな細胞内に多少の程度で固定化されて結果的にこれらの反応物は互いに近づくことができず、したがって表面反応グループの化学反応が防止される。一方で、重合体は反応混合物を構成するいかなる反応物とも反応してはならず、もう一方で、これは乾燥時３次または４次構造の変形なしで、その網の中に個別化された巨大分子を捕捉させるのに十分に微細で成形可能なグリッドを生成させなければならない。
【００３６】
特定の実施態様おいて、不活性重合体はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、多様な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、澱粉、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社からのスクロースから合成された非イオン性重合体）と称する化合物、グリコーゲン、アカシアゴム、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択される。一般的に、グリコーゲンとアカシアゴムが保護作用において、最も効果的なものと立証された不活性重合体である。不活性重合体の追加的な目的は、乾燥過程の特徴である初期凍結過程の間、水が決定化されることを防止する非結晶性網を生成させることによって、凍結乾燥により乾燥される反応混合物中に存在する巨大分子の低温保護剤として使われることである。乾燥混合物に添加される不活性重合体の量は、乾燥した反応混合物を再水和させた後に発生する酵素反応を後に妨害しないながらも、巨大分子の移動を防止するのに十分に緻密な網を生成させるのに充分でなければならない。
【００３７】
前記安定化混合物の３つの成分（保護剤、縮合反応抑制剤、及び不活性重合体）の合同作用で前述した反応混合物が、乾燥及び延長された保管後に完全に作用性になる。これらの成分中１つまたは２つを、他の２つまたは残りの成分の存在なく添加することは、乾燥後に活性でなかったりまたは乾燥後の数日後に活性が消える反応混合物を生成させ、その結果、保管中に安全性が非常に減少する。
【００３８】
非還元炭水化物（保護剤）は、縮合反応の抑制剤と共にまたはこの抑制剤なく酵素、及びオリゴヌクレオチドプライマまたはプローブを除外した反応を行うのに必要な全ての試薬を含有する反応混合物を乾燥に対して效率的に保護し、保管中に安定化させることができる。ここで、オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物は安定化させることができない。これはまた非還元ポリアルコールソルビトールにより起こり、ソルビトールはオリゴヌクレオチドを除外した必要な試薬をすべて含有する反応混合物の良好な保護剤と安定化剤として別途に立証され、反応混合物中にオリゴヌクレオチドが存在する場合、保護効果の発揮は停止される。
【００３９】
乾燥または不活性重合体の存在下で広範囲に使われる縮合反応抑制剤は、反応混合物を乾燥過程中にオリゴヌクレオチドなく保護することができ、反応混合物がオリゴヌクレオチドを含有する場合、反応収率が減少する。
前記安定化混合物の水溶液を容器の外で製造して後続的に加えたり、または安定化混合物の相異なる成分を容器自体内で加えて混合することで、容器で直接的に製造することができる。
【００４０】
反応混合物の水溶液と安定化混合物を容器で混合した後に、少なくとも１つの酵素を安定化混合物と共に含む反応混合物を含有する水溶液を製造する。続いて、安定化混合物との反応混合物から生成された水溶液中に含まれていた水の一部または全部を、酵素または酵素を、安定化混合物と共に含む完全にまたは部分的に乾燥した混合物が得られ、水分含有量が３０％以下になる時まで除去し、したがって完全にまたは部分的に乾燥した、少なくとも１つの酵素を含む安定化された反応混合物を得る。
【００４１】
反応混合物を安定化混合物と混合した後に、容器で得た水溶液中に存在する水の全部または一部を、例えば凍結乾燥、流動層上での乾燥、室温及び大気圧での乾燥、室温及び減圧での乾燥、高温及び大気圧での乾燥、高温及び減圧での乾燥を含んだ任意の通常的な乾燥方法で除去できる。好ましい乾燥方法は、１５℃ないし６０℃の温度及び大気圧未満の減圧での乾燥である。前述したことと同様の他の方法を乾燥に適用できるが、より高い費用または少ない効率性または乾燥させる反応混合物の成分に対するより大きい攻撃性は、これらの使用を断念させる。
本発明で提供した乾燥した、安定化した反応混合物は３０％以下、好ましくは２０％以下の水分含有量を持つ。
【００４２】
完全に乾燥した反応混合物、すなわち残留水の存在が１％以下の反応混合物は、より高いパーセントの水を含有するので、保管中に安全性が低い傾向があり、完全に乾燥した混合物で再水和及び反応基質の添加後に反応収率が顕著に減少する。一方、残留水のパーセントが１ないし２０％の乾燥した混合物で巨大分子は、その完全な移動性を防止する不活性重合体の存在にもかかわらず、好ましくない化学または酵素反応を起こしえる移動性を表し、したがって室温（２５℃）で数週の安全性を表すが、好ましくは、その適合した長期作用性を保障するために、４℃ないし１０℃の温度で保管しなければならない。選択する乾燥の程度は、主に経済的な因子（工程費用、所定の乾燥度に到達するのに必要とする時間等）及び乾燥度と反応混合物の安全性との間に存在する比率によって変わる。結果的に、特定の実施態様おいて、安定化かつ乾燥した反応混合物の中に残っている相対的の水分パーセントは、１乃至２０％である。
【００４３】
本発明の方法により、完全にまたは部分的に乾燥した、安定化した反応混合物が得られ、この混合物は単一チューブまたはプレートのウェルに、これを再水和させ、基質または問題サンプルを添加した後、目的とする酵素反応を遂行できるようにするために必要とする全ての要素（例えば酵素、補助因子、基質、オリゴヌクレオチド反応プライマ、及び酵素反応を促進または調節する他の添加剤）を含有し、したがってこれらの乾燥した反応混合物を運搬及び取り扱うに当たって、低温流通を維持する必要性がなくなり、それぞれの反応酵素を別途に保存し添加する必要性がなくなることによって、酵素反応、例えば核酸増幅を行うのに必要とする通常的な処理が簡単になり、交差汚染及びピペッチング誤謬が防止され、その結果分析の反復性と信頼性が向上する。完全にまたは部分的に乾燥した、安定化した反応混合物は、室温で運搬及び保存後に顕著な損失なくその活性を維持する。
【００４４】
本発明は、また水分含有量が３０％以下、好ましくは１乃至２０％である完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、この混合物は少なくとも１つの酵素、及び（ｉ）乾燥に対する少なくとも１つの保護剤、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応に対する少なくとも１つの抑制剤；及び（ｉｉｉ）乾燥した反応物の移動を防止する網構造を生成させることができる少なくとも１つの不活性重合体を含むことで、上で定義したような安定化混合物を含む。
【００４５】
特定の実施態様おいて、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物は、核酸増幅酵素、制限酵素、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択された酵素を、酵素が干渉する酵素反応を行うのに必要とする試薬、例えば補助因子、酵素基質及び酵素反応を促進させる他の添加剤の一部または全部、好ましくは試薬全部と共に含有し、また随意的に標示されたり非標示されたオリゴヌクレオチドプライマ及び特定の増幅を行うためのプローブ、例えばサンプル中の所定の病源体または遺伝子突然変異を探知するためのプローブを含むことができる。このような方式で、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物が得られ、混合物は単一チューブまたはプレートのウェルに、これを再水和させ、基質または問題サンプルを添加した後、目的とする反応を遂行できるようにするために必要な全ての要素（例えば酵素、補助因子、基質、オリゴヌクレオチド反応プライマ及び酵素反応を促進または調節する他の添加剤）を含有する。
【００４６】
特定の実施態様おいて、本発明はサンプル中に存在する少なくとも１つの核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも１つの特定配列の増幅に有用な、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を提供する。反応混合物は、任意の公知された方法で標示されたり標示されない、熱安定、または熱安定性ではないデオキシヌクレオチド三燐酸塩のＤＮＡポリメラーゼ酵素または逆転写酵素、酵素活性に必要な全ての補助因子及び酵素活性を促進させたり調節する任意の他の添加剤を含む。この安定化かつ乾燥した反応混合物は、また任意の公知された方法により、標示されたり標示されないオリゴヌクレオチド反応プライマ（これは任意の公知された方法で標示されたり標示されない標的ヌクレオチド配列及び／またはオリゴヌクレオチド・プローブの特定の増幅に必要で、雑種形成分析を行うのに必要とする）だけでなく、雑種形成反応に対する任意の添加剤または補助剤を含有する。安定化かつ乾燥した反応混合物は、単一容器、例えば反応チューブまたは多重ウェルプレートのウェルに存在し、目的する反応を行うためには、ただ反応混合物を蒸留水及び分析するサンプルの添加により再水和させることが必要である。乾燥方法は、好ましくは前述したことであり、開示した安定化混合物を含有する。
【００４７】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は核酸の配列決定に有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、ここでジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を先行開示された安定化かつ乾燥した反応混合物に添加し、水溶性染料は排除させる。乾燥方法は前述したことであり、開示された安定化混合物を含有することが好ましい。
【００４８】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は多重ウェルプレート上で制限分析を行うのに有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって分析するサンプルをサンプルに処理される所定の制限酵素だけでなく、制限分析を行うのに必要とする全ての補助因子及び添加剤を含有する反応混合物の乾燥した要素を含有するウェル上に沈着させ、後続的にサンプルを再水和された反応混合物と共に培養させる。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００４９】
もう１つの特定実施態様において本発明は、核酸の配列決定に有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、ここでジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）をまた先行開示された安定化かつ乾燥した混合物に添加し、水溶性染料は排除させる。乾燥方法は前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５０】
もう１つの特定実施態様において本発明は、多重ウェルプレート上で制限分析を行うのに有用な、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって分析するサンプルを、サンプルに処理しようとする所定の制限酵素だけでなく、制限分析を行うのに必要な全ての補助因子及び添加剤を含有する反応混合物の乾燥した要素を含有するウェル上に沈着させ、後続的にサンプルを再水和された反応混合物と共に培養させる。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５１】
もう１つの特定の実施態様において、本発明は多重ウェルプレート上で雑種形成を行うための完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を提供し、したがって雑種形成させるサンプルを任意の公知された方法で標示されたり標示されない、雑種形成分析を行うのに必要とする乾燥したオリゴヌクレオチド・プローブだけでなく、雑種形成反応に対する任意の添加剤または補助剤を含有する容器上に沈着させ、後続的に雑種形成反応を行う。乾燥方法は、前述したことであり、開示した安定化混合物を含有することが好ましい。
【００５２】
本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物は「即席使用」類型であり、以下に開示して本明細書に添付の実施例に例示した方法によって多数の用途を持つ、特に疾病の診断、ＤＮＡ配列の測定、または核酸制限分析に使われる。
【００５３】
さらに、本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を高温の開始反応システムとして使用することができる。本発明者が遂行した多数の研究は、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物を含有するチューブを使用する増幅反応が、ＰＣＲ遂行前にチューブの内容物の再懸濁の可否と関係なく同一の効率性で遂行されることを明確に明らかにした（実施例Ｉ参照）。これは完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物の試薬が反応の最初段階の中、例えば高温での培養中に有効に放出されることを意味することができる。このような事実は本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物が、高温の開始システムを行うことができるようにする。この実施態様は、多数の理由によって非常に重要であり、したがって： ａ）実用的な観点で、これは混合物の再懸濁を防止することによって、システムの取扱いを容易にし［実際に、大きなサンプルの体積（２０チューブ以上）に対してチューブそれぞれの個別的な再懸濁は、通常的な混合物の製造よりさらに長くあり得る時点まで多くの作業を伴う］；反面に、これと対照的に再懸濁を行う必要がないことは、行うべき作業を劇的に減少させ；ｂ）科学的な観点で、高温の開始システムは、これがシステムの特異性を増加させるので増幅システムに理想的であり；このような意味で本発明によって提供されたシステムは、氷上でチューブを安らかに作業できるようにして試薬が熱を放出できるようにする。
【００５４】
本発明はまた、水分含有量が３０％以下、好ましくは１乃至２０％である、本発明で提供した完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を含むキットを提供する。特定の実施態様おいて、前記キットは、サンプル中に存在する少なくとも１つの核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも１つの特定配列の増幅に、または核酸雑種形成分析を行うのに、または核酸の配列決定に、または多重ウェルプレート上での制限分析の遂行に、または多重ウェルプレート上での雑種形成の遂行に適合したものである。本発明のキットは、酵素反応に干渉する少なくとも１つの酵素を含む、完全にまたは部分的に乾燥かつ安定化した反応混合物と別途に、酵素反応の遂行に必要とする試薬、因子、添加剤及び／またはオリゴヌクレオチド配列の全部または一部、好ましくは全部を含有する。
【００５５】
（発明を実施するための最良の形態）
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明し、本発明の範囲に対する制限として解析してはいけない。
実施例Ｉ
ＤＮＡ増幅のための反応混合物の乾燥
本実施例及び下記の実施例で使用した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、異なって表現しない限りＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製したサーマス・サーモフィルス再結合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．， Ｓｐａｉｎ所有、ＢＩＯＴＯＯＬＳ ＤＮＡポリメラーゼ）である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ＮＰ４０を含有する保管緩衝液の中で保管した。反応緩衝液は、７５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するもので製造した。
【００５６】
保管緩衝液中に保存されたＤＮＡポリメラーゼ酵素（１Ｕ／：１）１μＬ、反応緩衝液５μＬ及びＤＮＡ増幅反応に干渉する４個のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を同モル比で含有する溶液１μＬを各々０．２ｍｌの実験に使われた反応チューブに加えた。複数のチューブを前述した方式で準備し、適合した体積の表１に含まれたそれぞれの安定化混合物を各チューブに加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、乾燥させる混合物の最終体積によって変わる。
【００５７】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。表１に示す時間を決定すれば、２次蒸留水４３μＬ、それぞれの反応プライマ：Ｉ−１：５’−ＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡ−３’（配列識別番号：１）；及びＩ−２：５’−ＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＡ−３’（配列識別番号：２）１μＬ、及びＤＮＡ５００ｎｇを最終体積５０μＬで加えることによって、シトクロムｂ（３５９塩基対（ｂｐ）の大きさを持つ）の特定領域に対する増幅反応により活性を分析した。
【００５８】
バイアルのゲル化された内容物を５０μＬ添加した水、プライマ及びＤＮＡにピペッチング（５回）することで、チューブの半分に再懸濁させた。バイアルからのゲル化された内容物をチューブの残り半分には再懸濁しなかった。培養を９４℃で２分間（この培養周期は、厳密に言えば必要としたものではなく、むしろ任意的なものである）行い、続いて３５周期の変性（９４℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）及び延長（７２℃、４０秒）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。同じく、乾燥したチューブでの活性の進展を検査するために、前記ＤＮＡサンプルを新しい混合物を使用し、同一な増幅条件で増幅させた。
【００５９】
全ての場合に、増幅反応の結果を２％アガロースゲル（重量／体積）で分析し、増幅が陽性の全ての場合に、単一の３５９ｂｐバンドが発見された。乾燥した反応混合物と新しい混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータプログラムを使用して増幅により生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対し、半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００６０】
得られた活性結果を表１で「実施例Ｉ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
全ての場合に、バイアルのゲル内容物をＰＣＲ遂行前に再懸濁したチューブで得た活性と、再懸濁しなかったチューブで得た活性が似ていると現れた。このような事実は、高温で培養中にゲル化された混合物に含まれていた試薬が效果的に放出され、したがってこれは高温の開始システムとして作用することを立証するものと見える。
【００６１】
実施例ＩＩ
逆ＲＮＡ転写及び後続的なｃＤＮＡ増幅のための反応混合物の乾燥
本実施例に使われた熱安定性逆転写酵素はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製した、実施例Ｉに示した酵素に対して向上した逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィルス再結合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．，Ｓｐａｉｎ所有、ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ＮＰ４０を含有する保管緩衝液中で保管した。反応緩衝液は、逆転写を行うために７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２及びそれぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）０．１２５ｍＭを含有するもので製造した。
【００６２】
保管緩衝液中に保存された前記酵素（５Ｕ／：１）１．５μＬ、逆転写用反応緩衝液４μＬ、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰを同モル比で含有する溶液１μＬを各々０．２ｍｌの本実験に使われた反応チューブに加えた。７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、０．７５ｍＭ ＥＧＴＡ及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する反応緩衝液６μＬをもう１つの０．２ｍｌチューブに加えた。複数のチューブを前述した方式で準備し、表１に含まれたそれぞれの安定化混合物をチューブの各々に加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。
【００６３】
反応混合物の活性及び新しい乾燥していない混合物の活性を、乾燥した混合物を２次蒸留水１５μＬで再水和し、それぞれの反応プライマ：ＩＩ−１：５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴ−３’（配列識別番号：３）；及びＩＩ−２：５’−ＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ−３’（配列識別番号：４）１．２５μＬ、及びＣＤ８αマウスから抽出した伝令ＲＮＡ１００ｎｇを最終体積２０μＬで加えることによって、（１、１２２ｂｐの大きさを持つ）ＣＤ８αマウス遺伝子の特定領域に対する増幅反応により分析した。この方式で再造成した逆転写混合物を、ｃＤＮＡ合成のために６０℃で３０分間培養させた。続いて、ＤＮＡ増幅混合物を有する乾燥したチューブを３０：１Ｈ２Ｏで再水和させた。再水和された反応緩衝液の全体体積を逆転写反応が行われたチューブに加えた。続いて４０周期の変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。
【００６４】
実験を逆転写反応に使われるチューブと後続のＤＮＡ増幅反応に使われるチューブを乾燥し、同一の条件下で保管するように構想した。増幅産物を１％アガロースゲル（重量／体積）で電気泳動により分析し、増幅が陽性の全ての場合に単一の１，２２２ｐｂバンドが発見された。全サンプルの増幅バンドの濃度をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対して半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００６５】
得られた活性結果を表１で「実施例ＩＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００６６】
実施例ＩＩＩ
切断緩衝剤を共に使用した制限酵素の乾燥
ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）が市販する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（１Ｕ／：１）１μＬを酵素と共に製造社が供給した１０倍切断緩衝液１μＬと共に本実験に使われた１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。複数のチューブを前述した方式で準備し、適合した体積の表１に示す相異なる安定化混合物の各々を前記に加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００６７】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。２次蒸留水８μＬに再水和した後、一旦表１に示す相応する時間が経過すれば３７℃で２時間ラムダファージＤＮＡ（１５０ｎｇ／：１）０．３μｇを切断させることによって、これらの活性を分析した。切断反応の結果に対する電気泳動を同一の時間及び温度条件で行われた新しい酵素製剤を使用した切断と並行し、１％アガロースゲル（重量／体積）で遂行した。乾燥した酵素の活性を下記３個の範ちゅうに分けた：Ａ）完全なＤＮＡ切断がなされた時、最適活性（表１で「切断」）で、この時新しい酵素による切断時、得られたパターンと同一な制限パターンを持ち；Ｂ）部分切断の存在によって新しい酵素により得たパターンと相異なる制限パターンが得られた時、平均活性（表１で「部分」）であり；Ｃ）切断の完全な部材が観察された時、不活性（表１で「非切断」）である。
【００６８】
乾燥した制限酵素の活性を、その切断緩衝剤と共に新しい乾燥していない酵素で生成した同一の特徴物の切断により現れる活性と比較した結果を、表１の「実施例ＩＩＩ活性」項で見ることができる。結論的に、またメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有する安定化混合物がより長い保存時間内に完全な切断を発生させるものである反面、他の分析された混合物は、部分的な切断を発生させたり、または切断させられない。
Ｍｂｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ及びＡｃｃ Ｉのような他の制限酵素を、同じく分析して同一の結果を得た。
【００６９】
実施例ＩＶ
所定のＤＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中、及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥
実施例Ｉに開示した全ての成分以外に、スペイン特許出願第Ｐ２００１００５６８号に開示され、人間からマラリアを発病させる４個のプラスモジウム種を同定するのに使用する反応プライマだけでなく、単一段階で半重複反応機構により単一の複合的な増幅反応で陽の反応対照群として作用する人間ＤＮＡを含有する反応混合物を製造した。この方法で、通常的な方法により全血から抽出した人間ＤＮＡサンプルを分析する。
【００７０】
４個のプラスモジウム種及び人間ＤＮＡ増幅対照群それぞれの同時的なＤＮＡ増幅反応を、２５：１の反応混合物と下記組成物を別の反応チューブ（０．２ｍｌまたは０．５ｍｌ）に含めることによって遂行した：７５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ツイン２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．０４：Ｍ Ｈ１プライマ（配列識別番号：５）、０．０４：Ｍ Ｈ２プライマ（配列識別番号：６）、２．２５：Ｍ Ｐ１プライマ（配列識別番号：７）、０．０１：Ｍ Ｐ２プライマ（配列識別番号：８）、０．６：Ｍ Ｆプライマ（配列識別番号：９）、０．１５：Ｍ Ｍプライマ（配列識別番号：１０）、０．３７５：Ｍ Ｏプライマ（配列識別番号：１１）、０．１５：Ｍ Ｖプライマ（配列識別番号：１２）及び２単位のＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＴＯＯＬＳ ＤＮＡポリメラーゼ）。
【００７１】
複数のチューブを前述した方式で準備し、表１に示す安定化混合物のうち、１つをそれぞれのチューブに、混合物を完成するそれぞれの要素に対し、相異なる濃度で添加した。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度でエッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００７２】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。前記表１に示す保存周期後に、乾燥した混合物を２次蒸留水２０μＬ及び相異なるプラスモジウム種により感染した患者から由来したＤＮＡ５０ｎｇで最終体積２５μＬで再水和した後、活性を分析した。同じく、活性の基準として新しい乾燥していない混合物を有するチューブを全ての実験に含めた。使われた増幅周期は８５℃で３分間の初期加熱周期、続いて９４℃で７分間の変性段階を含む。続いて、４０回の反復された周期でなされた増幅循環を行い、これらのそれぞれの周期は９４℃で４５秒間の変性段階、６２℃で４５秒間の雑種形成段階及び７２℃で１分間の延長段階を持つ。一旦、４０回の増幅周期が終了すると、最終延長段階を７２℃で１０分間行う。
【００７３】
増幅反応をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器で遂行した。増幅結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性の全ての場合に、３９５ｂｐ及び２３１ｂｐの２個のバンドが発見され、これらは各々Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及び人間ＤＮＡの増幅産物に相応する。乾燥した反応混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。それぞれの乾燥したチューブの活性に対する結果を新しい混合物を使用して得た結果に対し、半定量的に表した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００７４】
得られた活性結果を表１で「実施例ＩＶ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００７５】
ヌンク（Ｎｕｎｃ）ポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００７６】
実施例Ｖ
所定のＲＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥
実施例ＩＩに開示した全ての成分以外に、スペイン特許出願第Ｐ２００１００５６７号に開示され、カップリングされた逆転写システムに続いて単一チューブまたはウェルで半重複増幅反応により腸内ウイルスゲノムを、一般的に探知する作用をする反応プライマを含有する反応混合物を製造した。
【００７７】
逆転写反応を行うために、それぞれの反応に対して７５ｍＭトリスＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、それぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）０．１２５ｍＭ及び１０ピコモルのＥＶ１Ｍプライマ：５’−ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列識別番号：１３）及び７．５単位の実施例ＩＩに示したＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する２０μＬの混合物を製造する。
【００７８】
ＤＮＡ増幅反応を行うために、それぞれの反応に対して７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％ツイン２０、０．７５ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ピコモルのＥＶ２Ｐプライマ：５’−ＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列式弁番号：１４）及び０．５ピコモルのＥＶ１Ｐプライマ：５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＲＣＧＣＣＴＧＴＴ−３’（配列式弁番号：１５）を含有する３０μＬの混合物を製造する。
【００７９】
複数のチューブを前述した方式で製造し、表１に示す相異なる体積のそれぞれの安定化混合物をそれぞれのチューブに加えた。このように準備したチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００８０】
乾燥後に、チューブを表１に示す温度及び時間で維持させた。また表１に示す時間内に、乾燥した逆転写混合物を２次蒸留水１５μＬで再水和し、ＲＮＡ１００ｎｇを最終体積２０μＬに加えた後、活性を分析した。４８℃／５分及び６０℃／１５分の４回の周期を遂行した。逆転写に使われたその同族体と同一の安定化混合物を含有する、後続のＤＮＡ増幅反応に使われる０．２ｍｌチューブを３０μＬの２次蒸留水に再懸濁し、その体積を逆転写生成物を含有する０．２ｍｌチューブに加えた。３５周期の変性（９４℃、１分）、アニーリング（４８℃、１分）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。
【００８１】
増幅反応結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性に明らかになった全ての場合に、３９０ｂｐ及び４８９ｂｐの２個のバンドが現れた。全ての実験で、活性基準として使われる新しい混合物を有するチューブを含めた。乾燥した反応混合物と新しい反応混合物に対する活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００８２】
得られた活性結果を表１で「実施例Ｖ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって適合したものと見なすことができるが、より高い活性を保存するのは、メレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【００８３】
ヌンクポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００８４】
実施例ＶＩ
所定のＤＮＡ配列の特異的な増幅のためのチューブ中、及び多重ウェルプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマを含む反応混合物の乾燥に続き後続的に多重ウェルプレート上で制限分析を行う（この時、それぞれのウェルは前記分析の遂行に必要な乾燥した制限酵素を含有する）
【００８５】
本システムを乳頭種ウイルス同定及び分類方法を使用して分析した。前記方法は、２個のウイルスゲノム領域、すなわち全ての乳頭種ウイルスのゲノムに保存されるＬ１領域の４５０ｂｐ断片、及び発癌性乳頭種ウイルスにのみ存在するＥ６−Ｅ７領域の２５０ｂｐ断片の第１球−増幅段階からなる。増幅混合物は、７５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．０１％ツイン２０、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、２．５ピコモルのプライマ：ＶＩ−１：５’−ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ−３’（配列識別番号：１６）及びＶＩ−２：５’−ＣＧＴＣＣＭＡＲＲＧＧＡＷＡＣＴＧＡＴＣ−３’（配列識別番号：１７）、１．２５ピコモルのプライマ：ＶＩ−３：５’−ＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’（配列識別番号：１８）及びＶＩ−４：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣ−３’（配列識別番号：１９）、及び１単位の実施例Ｉに示したＤＮＡポリメラーゼ酵素を含有する。増幅産物の分析により乳頭種ウイルス（４５０ｂｐバンド）の存在を確認できるだけでなく、任意の発癌性種（２５０ｂｐバンド）が存在するかどうかを決定できる。
【００８６】
続いて、５個の制限酵素（Ｒｓａ Ｉ、Ａｃｃ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ及びＢｇｌ ＩＩ）による切断で、各サンプル中に存在する乳頭種が特性決定される。したがって、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８及びＨＰＶ ３３の増幅された２５０ｐｂバンド（発癌性ゲノムに相応する）をＡｖａ ＩＩのみによって切断し、ＨＰＶ ３１のものをＲｓａ Ｉにより切断し、ＨＰＶ ３５のものをＡｖａ Ｉにより、ＨＰＶ ５２ｂのものをＢｇｌ ＩＩにより、ＨＰＶ ５８のものをＡｃｃ Ｉにより切断させ、それぞれの場合にアガロースゲルで容易に差別化できる相異なる制限基準を得る。またＲｓａ Ｉ活性を有する４５０ｂｐバンドの切断基準により非発癌性遺伝子型を分類できる。
【００８７】
複数のチューブを前に開示した方式で製造し、表１に示す相異なる体積のそれぞれの安定化混合物をチューブ各々に加えた。前述したそれぞれの制限酵素（チューブ当たり１単位の各酵素）及び１μＬのそれぞれの１０倍反応緩衝液を有するチューブをまた準備した。このように用意した全てのチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は、使用する安定化混合物によって変わる。
【００８８】
乾燥後、チューブを表１に示す温度で維持させた。一旦表１に示す保存時間が経過したならば、乾燥した混合物を２次蒸留水４５μＬ及びＨＰＶ １８で感染した患者から抽出したＤＮＡ２５ｎｇで最終体積５０μＬに再水和した後、活性を分析した。３０周期の変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、１分）及び延長（７２℃、１分）をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器を使用して遂行した。増幅反応結果に対する電気泳動を２％アガロースゲル（重量／体積）で行い、増幅が陽性と明らかになった全ての場合に、各々２５０ｂｐ及び４５０ｂｐの２個のバンドが発見された。乾燥した反応混合物の活性をＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用し、やはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して増幅から生成されたバンドの密度測定により測定した。乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００８９】
続いて、制限酵素により乾燥したチューブとウェルを新しい混合物を使用して行われた１０μＬの増幅水で再懸濁させた。混合物を３７℃で３０分間培養した後、切断産物を１．５％アガロースで分析した。これは： 最適活性（表１で「切断」）は、２５０塩基対（ｂｐ）バンドの完全な切断で、平均活性（表１で「部分」）は、バンドの部分的な切断で、不活性（表１で「非切断」）は、切断の完全な部材であると見なされる。
【００９０】
増幅反応を遂行した後に得た密度測定結果を表１で「実施例ＶＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好した活性を保存することによって適合すると見なすことができるが、より高い活性を保存するのはメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
制限酵素の活性に対し、制限酵素の乾燥に使われた混合物がメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有する場合に使われた５個の酵素に対して最適の結果が得られた。
【００９１】
ヌンクポリスチレン多重ウェルプレートの各ウェル上にオリゴヌクレオチドプライマを含有する、前述した反応混合物を沈着し、プレートを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させることによって、同一の分析過程を行った。それぞれの温度及び時間の時点に対してプレートを準備し、後続的に分析した。同じく、新しい乾燥していないウェルを活性基準としてそれぞれの実験で製造した。増幅条件及び結果分析は、前述したものと同様であった。乾燥したサンプル活性測定結果は、前述したチューブの場合に対して得たものと完全に一致する。
【００９２】
実施例ＶＩＩ
共有結合したオリゴヌクレオチド及び乾燥した反応混合物を有する多重ウェルプレート上での所定のＤＮＡ配列の増幅に続くビオチン化プローブとの雑種形成による分析
【００９３】
本システムをプラスモジウムＤＮＡの臨床的サンプルを増幅及び同定するのに使用した。これをために、ポリスチレン多重ウェルプレート（Ｃｏｖａｌｉｎｋ ＮＨ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ，Ｎｕｎｃ）を使用した。実施例ＩＶに示したプラスモジウム中Ｐ１プライマを前でその５’端部を通じてプレートの各ウェルに共有結合させたが、これは後続の増幅反応でプライマとして作用するはずである。実施例ＩＶに開示された反応混合物だけでなく、実施例ＩＶ及び表１に開示された相異なる安定化混合物をプレートの各ウェルに加えた。複数のプレートを後続的に分析しようとする保管時間及び温度として準備した（表１）。一旦プレートが用意されたら、これらのを乾燥器に導入してポンプにより真空を発生させて乾燥させた。
【００９４】
乾燥したサンプルを２０μＬの滅菌水で再水和し、プラスモジウムに感染した患者からのＤＮＡ５μＬを１０ｎｇ／：１の濃度で加えた。続いて、増幅反応を多重ウェルプレートに対してエッペンドルフ勾配熱循環器を使用し、実施例ＩＶ開示した条件で遂行した。全ての場合に、増幅を活性基準として使用するために乾燥していないプレートを使用して同一な条件で遂行した。
【００９５】
一旦反応が終了されたならば、反応混合物を各ウェルから除去し、したがってウェルには二重バンド増幅産物だけがウェル中に結び付いたままである。バンドのうちひとつを一般的なＰ１プライマから延長により合成する場合、バンドはウェルに共有結び付いたままである。対照的に、他のＤＮＡバンドは詳報的な塩基対形成により最初のものに結びつく．単一ＤＮＡバンドを後続の雑種形成反応に対する基質として使用することが必要な場合、プレートをウェルに共有結合しないＤＮＡバンドを除去して、ただＰ１オリゴヌクレオチドから合成されたバンドを残す目的で洗浄した。このために、５０％フォルムアミド、５倍ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの造成を有する反応緩衝液を製造した。混合物５０μＬを各ウェルに加え、８０℃で１０分間培養した。続いて、混合物を除去して洗浄過程を３回反復した。
【００９６】
雑種形成反応をビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して遂行した。このために、各ウェルを４Ｘ ＳＳＣ、１０Ｘデンハールト（Ｄｅｎｈａｒｔ）及び２００：ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する雑種形成反応緩衝液中から６０℃で２時間の間、１０ｆｍｏｌのプローブと共に培養した。続いて、雑種形成混合物を除去して各ウェルを２００：１の０．１Ｘ ＳＳＣ稀釈液で２回洗浄した後、１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．３％ツイン２０で洗浄し、１００ｍＭマレインサン遮断反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ＢＳＡで最終洗浄した。
【００９７】
一旦遮断が終了したならば、先行開示された遮断反応緩衝液中のペルオキシダーゼと共液した１：２０００のストレプトアビジンを各ウェルに加え、２３℃で４５分間培養した。最後に、ウェルを２００μＬの１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．３％ツイン２０で３回洗浄し、２００μＬの１００ｍＭマレインサン反応緩衝液（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄した。最後に、１００μＬのＴＭＢを各ウェルに加え、前記を暗室で１０分間培養させた。反応を停止した後、吸光度を４５０ｎｍで測定し、この時全ての値を６５５ｎｍでプラスチックの吸光度値で補正した。
【００９８】
乾燥した混合物は、新しい混合物に対しバンドの濃度が９０％±１０％である場合、最大活性（表１で＋＋＋）であり； 活性が９０乃至５０％の範囲の場合、最適活性（表１で＋＋）であり； 活性が５０％未満の場合には、低い活性（表１で＋）であり； 増幅反応の結果が陰性の場合、活性が無し（表１で−）であると見なした。
【００９９】
得られた活性結果を表１の「実施例ＶＩＩ活性」の項で見ることができる。結論的に、複数の安定化混合物が反応混合物の乾燥及び後続的な保管後に良好な活性を保存することによって、適合したと見なされることができるが、より高い活性を保存するのはメレチトースまたはパラチニトールをリジン及びグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に含有するものである。
【０１００】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
実施例ＶＩＩＩ
混合された相反応システムの使用による連続的な反応の区画化
本実施例に使用した熱安定性逆転写酵素は、実施例ＩＩと同じようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌで発現され、同じ会社が開発した非クロマトグラフィー的方法で精製した、実施例Ｉに示した酵素に対して向上した逆転写酵素活性を有するサーマス・サーモフィルス再組合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ，Ｓ．Ａ．、Ｓｐａｉｎ所有、ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）である。前記酵素はＭｎ２＋イオンの存在下で逆転写酵素活性を表し、Ｍｇ２＋イオンの存在のもとではＤＮＡポリメラーゼ活性を表し、２つの反応はすべて通常的な条件下で排他的である。精製後に、酵素を−２０℃で３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ツイン２０及び０．２５％ ＮＰ４０を含有する保管緩衝液で保管した。
【０１１３】
ＰＣＲ反応を行うために１．５ｍＭ ＥＧＴＡ及び４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する反応緩衝液を製造した。先行開示された混合物１０μＬをそれぞれの０．２ｍｌチューブに加え、先行実験（実施例Ｉ乃至ＶＩＩ）で良好な活性が立証された安定化混合物、すなわちメレチトースまたはパラチニトールをリジンまたはグリコーゲンまたはアカシアゴムと共に、またはラフィノースをベタイン及びグリコーゲンと共に添加した。このように用意した全てのチューブを３０乃至１２０分間、１０℃乃至６０℃の温度で、エッペンドルフ５３０１遠心分離蒸発機で乾燥させた。前述した温度及び時間は使用する安定化混合物によって変わる。乾燥後に、チューブを表１に示す温度で維持させた。これらの活性を前記表１に示す保存期間後に分析した。
【０１１４】
最後に、逆転写反応を行うために、７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％ツイン２０、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、５単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＥＴＲＯＴＯＯＬＳ ｃＤＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ）及び２０ピコモルのそれぞれのＩＩ−１及びＩＩ−２プライマ（実施例ＩＩに開示）（ＣＤ８αマウス遺伝子からｍＲＮＡの１、１２２ｂｐの断片を増幅させる）を含有する反応緩衝液を製造した。
【０１１５】
活性分析のために、１５μＬの逆転写反応混合物及び１００ｎｇのマウスＲＮＡをＰＣＲ混合物が乾燥している全ての０．２ｍｌチューブに加え、最終体積をＨ２Ｏで２０μＬ以下に調節した。チューブの半分で、チューブのゲル化された内容物をピペッチングにより再懸濁１クラスならば、他の半分では再懸濁しなかった。対照群として、２−段階ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施例ＩＩに開示した条件下で全ての実験に含め、ここで安定化混合物は含めなかった。
【０１１６】
全てのチューブに逆転写増幅の単一段階循環を加え、過程の間試薬は含めなかった。前記反応は９４℃で１分の培養に続いて６０℃で３０分の培養でなされた。続いて、チューブに高温を加えて非再懸濁かつゲル化された混合物中に含めた試薬の放出を許容し、これは８３℃で５分間の培養に続いて９４℃で３分間の培養でなされる。最後に、４０回の反復された周期を行い、これらのそれぞれの周期は９４℃で４５秒間の変性段階、５５℃で３０秒間の雑種形成段階、及び７２℃で１分間の延長段階を持った。一旦４０回の増幅段階が終了されたならば、最終延長段階を７２℃で７分間遂行した。増幅反応をエッペンドルフマスターサイクラー熱循環器で遂行した。
【０１１７】
増幅された産物を１％アガロースゲル（重量／体積）での電気泳動により分析し、反応が陽性の全ての場合に単一の１，１２２ｂｐ増幅バンドを発見した。分析された反応混合物の活性を、ＴＤＩゲルプリンタ相分析機を使用してやはりＴＤＩが開発したゲルスーパーコンピュータープログラムを使用して生成されたバンドの密度測定により測定した。
【０１１８】
増幅反応の活性分析は反応がゲル化された混合物を逆転写反応の遂行前にピペッチングし、したがってＭｎＣｌ２、ＥＧＴＡ及びＭｇＣｌ２と接触させることによって再懸濁した全てのチューブで抑制されたことを立証した。一方、ゲル化された混合物を再懸濁しないチューブでは、２−段階逆転写及び増幅反応で得たものと類似の密度を有する量の結果を得た。このような事実はＭｇＣｌ２及びＥＧＴＡゲル化された混合物が高温での培養により放出される時まで区画化されたまま維持され、これにより互いに排他的な２個の反応を配列化させることができることを立証する。
Claims (37)
- 完全にまたは部分的に乾燥した、少なくとも１つの酵素を含む安定化反応混合物の製造方法において、
ａ）単一容器で
ｉ）少なくとも１つの酵素を含む反応混合物の水溶液と、
ｉｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤と、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤と、乾燥した試薬の移動を防止する網構造を生成できる少なくとも１つの不活性重合体と、から構成された安定化混合物の水溶液、とを接触させて、前記反応混合物と前記安定化混合物とを含む水溶液を得るステップと、
ｂ）少なくとも１つの酵素を含む、完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を得るために、前記酵素及び前記安定化混合物を含み、３０％以下の水分含有量を有する完全にまたは部分的に乾燥した混合物が得られるまで、前記ステップａ）で得た水溶液中に含まれている水の一部または全部を除去するステップと、
を含むことを特徴とする安定化反応混合物の製造方法。 - 請求項１に記載の方法において、前記反応混合物は、酵素反応に干渉する少なくとも１つの酵素を、前記酵素が干渉する前記酵素反応の実行
に必要な試薬の一部または全部と共に含むことを特徴とする方法。 - 請求項２に記載の方法において、前記反応混合物は、酵素反
応に干渉する少なくとも１つの酵素を、前記酵素が干渉する前記酵素反応の実行に必要な試薬の全部と共に含むことを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法において、前記酵素は、ＲＮＡおよび
ＤＮＡの両核酸からの熱安定性及び熱不安定性の両核酸増幅酵素と、制限酵素と、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素と、これらの混合物と
で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法において、前記反応混合物は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両核酸からの熱安定性及び熱不安定性の両核酸増幅酵素と、制限酵素と、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素と、これらの混合物とで形成されたグループの中から選択された酵素を、前記酵素が干渉する酵素反応の実行に必要な全ての試薬と共に含むことを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、前記容器は、反応チューブ、または多重ウェルプレートのウェルであることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、前記乾燥保護剤は、非還元炭水化物であることを特徴とする方法。
- 請求項７に記載の方法において、前記乾燥保護剤は、非還元二糖、非還元三糖及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項７に記載の方法において、前記乾燥保護剤は、パラチニトール（６−α−Ｄ−グルコピラノシル−マンニトール）、トレハロース、ラフィノース、メレチトース及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項７に記載の方法において、前記安定化混合物は、乾燥保護剤である非還元炭水化物と別途に、グリセロールを含むことを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する前記抑制剤は、競合的な抑制剤または非競合的な抑制剤であることを特徴とする方法。
- 請求項１１に記載の方法において、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する前記抑制剤は、リジン、アルギニン、トリプトファン、ベタイン、アミノグアニジン誘導体及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、乾燥試薬の移動を防止する網構造を生成できる前記不活性重合体は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、澱粉、ＦＩＣＯＬＬと称する化合物、グリコーゲン、アカシアゴム及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、前記ステップａ）で得た水溶液中に存在する水の一部または全部を除去するステップは、任意の従来の乾燥方法により実行されることを特徴とする方法。
- 請求項１４に記載の方法において、前記乾燥方法は、凍結乾燥、流動層上での乾燥、室温及び大気圧での乾燥、室温及び減圧での乾燥、高温及び大気圧での乾燥、及び高温及び減圧での乾燥の中から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項１５に記載の方法において、前記乾燥方法は、１５℃乃至６０℃の温度及び大気圧未満の減圧で乾燥する方法であることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、完全にまたは部分的に乾燥した、前記獲得した安定化反応混合物は、３０％以下の水分含有量を有することを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法において、完全にまたは部分的に乾燥した、前記獲得した安定化反応混合物は、１％乃至２０％の水分含有量を有することを特徴とする方法。
- 完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物であって、少なくとも１つの酵素と、（ｉ）少なくとも１つの乾燥保護剤、（ｉｉ）カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する少なくとも１つの抑制剤、（ｉｉｉ）乾燥試薬の移動を防止する網構造を生成できる少なくとも１つの不活性重合体を含有する安定化混合物と、を含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、水分含有量が３０％以下であることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、水分含有量が１％乃至２０％であることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記酵素は、核酸増幅酵素と、制限酵素と、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素と、これらの混合物とで形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、核酸増幅酵素と、制限酵素と、核酸増幅、配列決定または特性決定反応に干渉する酵素と、これらの混合物とで形成されたグループの中から選択された酵素を、前記酵素が干渉する酵素反応の実行に必要な全てまたは一部の試薬と共に含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項２３に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記酵素が干渉する酵素反応の実行に必要な前記試薬は、補助因子、酵素基質、酵素反応を促進または調節する添加剤、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、随意的標識オリゴヌクレオチドプライマ及びプローブ、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、ＤＮＡポリメラーゼ酵素または熱安定性または非熱安定性の逆転写酵素、随意的標識デオキシヌクレオチド三燐酸、酵素活性に必要な補助因子、及び、前記酵素活性を促進または調節する添加剤を随意的に、含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項２５に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、さらに、標的ヌクレオチド配列の特定的な増幅に必要な、随意的標識オリゴヌクレオチド反応プライマ、および／または雑種形成分析の遂行に必要な、随意的標識オリゴヌクレオチド・プローブを、随意的に雑種形成反応の任意の添加剤または補助剤と共に含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、さらに、ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、制限酵素を、随意的に、制限分析の実行に必要な全ての補助因子及び添加剤と共に含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、「即時使用」フォーマットで提供されていることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記乾燥保護剤は、非還元炭水化物であることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項３０に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記乾燥保護剤は、非還元二糖、非還元三糖、及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項３０に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記乾燥保護剤が、パラチニトール（６−α−Ｄ−グルコピラノシル−マンニトール）、トレハロース、ラフィノース、メレチトース及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、前記安定化混合物は、乾燥保護剤である非還元炭水化物と別途に、グリセロールを含むことを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する前記抑制剤は、競合的な抑制剤または非競合的な抑制剤であることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項３４に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、カルボニルまたはカルボキシル基とアミンまたは燐酸基との間の縮合反応を抑制する前記抑制剤は、リジン、アルギニン、トリプトファン、ベタイン、アミノグアニジン誘導体及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８に記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物において、乾燥試薬の移動を防止する網構造を生成できる前記不活性重合体は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、澱粉、ＦＩＣＯＬＬと称する化合物、グリコーゲン、アカシアゴム及びこれらの混合物で形成されたグループの中から選択されることを特徴とする完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物。
- 請求項１８乃至３６のいずれかに記載の完全にまたは部分的に乾燥した安定化反応混合物を含むことを特徴とするキット。
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