JP2009538146A - 室温で安定な分子診断用キット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照としてその全体が組み入れられる、2006年5月23日に出願された、Boaz Arieliらの、室温で安定な分子検出用キット(Ambient temperature stable kits for molecular detection)との標題の米国仮特許第60/802,510号に対する優先権および利益を主張する。
PCR通常混合物−酵素緩衝液×1(10mM トリス pH8.3、40mM KCl)、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP混合物、0.3μMのプライマー混合物、および0.5単位の好熱性DNAポリメラーゼ。
1.PCR保存溶液容量を加え、濃縮する。水戻し後、該溶液は以下の成分を含有する:10mM トリス pH8.3、40mM KCl、1.5mM MgCl2、3%のスクロース、1mg/mlのBSA、および0.04%のクレゾールレッド。
2.0.2mM dNTP混合物を加える。
3.5単位/μlの酵素ストックから0.8ユニットの好熱性DNAポリメラーゼを加える。
4.プライマー混合物を加えて、0.3μMの濃度を得る。
5.成分を混合して、0.2mlのPCRチューブに分配する。
6.55℃で90分間、オーブン内で乾燥することにより、水分減少を行う。
7.チューブを室温に冷やし、チューブのキャップを閉じる。
8.最大24ヶ月間室温で保存する。
9.使用前に水戻しする。
PCR混合物の性能
第1の実験において、着色PCR通常混合物内の好熱性DNAポリメラーゼ活性を評価した。着色PCR通常混合物を、(1)さらなる処置なし(水分含有混合物)で増幅したか、(2)55℃に加熱して水分減少させ、増幅前に水戻ししたか、または(3)−20℃に凍結し、一晩凍結乾燥し、増幅前に水戻しした。
本発明のPCR混合物の使用期限延長
本発明のPCR混合物の使用期限を評価するために、通常の好熱性DNAポリメラーゼおよびホットスタート酵素含有混合物に関して、別々の試験を行った。
プライマーおよび内部対照が組み入れられたPCR即時使用混合物
陽性対照を含有するPCRアッセイ混合物は典型的に、標的DNAに特有の特定の遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの1セット、およびDNAのより広範なファミリーに共通の別の遺伝子領域に特異的な第2のオリゴヌクレオチドプライマーの1セットを含む。内部対照は、上記アッセイの構成成分、および対照プライマーの遺伝子領域を含有し、かつ、標的DNAの特有の遺伝子領域を含有しないDNAの試料を含む。
蛍光標識オリゴヌクレオチドが組み入れられたPCR即時使用混合物
リアルタイム定量的PCRの使用により、通常のPCR増幅に比較して、きわめて少量の標的DNA(遺伝子発現アッセイでは約10pg、汚染検出アッセイでは0.01pg)が検出できる程度まで、検出感度が増強する。定量的PCR反応を行うための周囲温度安定化キットは、単一の混合物中に、該混合物が水分減少を受ける前において、上記実施例3に示されたようにオリゴヌクレオチドプライマーと共に本発明の透明水分減少PCRホットスタート混合物の全ての成分、および蛍光標識オリゴヌクレオチドまたはSYBR(登録商標)Greenなどの蛍光放射剤を組み入れる。
本発明のPCR混合物の使用期限延長
本発明のPCR混合物の使用期限を判定するために、通常の好熱性DNAポリメラーゼ(PCR即時使用混合物)およびホットスタート酵素(PCR即時使用ホットスタート)含有混合物について別の試験を実施した。
通常のPCR混合物および水分減少を受ける水分減少PCR混合物を用いた二重PCRにおける反応最適化を促進するための種々の試薬成分の比率バランス調整の必要性
当業者に知られているように、二重または多重PCR反応における各々のアッセイの最適な増幅を促進するために、PCR混合物の種々の試薬成分の比率バランス調整が必要である。水分減少を受けない水分含有PCR混合物(「通常PCR混合物」)を用いた、多重反応に最適であると考えられる種々の試薬成分の比率バランス調整が、水分減少を受けるPCR混合物(「水分減少PCR混合物」)を用いた最適な増幅を可能にするのに必要な調整の予測とならないという新たな知見を本実施例で実証する。
通常PCR混合物および水分減少を受ける水分減少PCR混合物を用いるリアルタイム二重PCRにおける反応最適化を促進するための種々の試薬成分の比率バランス再調整の要件
上記のように、反応における混合物成分は、本発明の水分減少処理の間に、水分減少前の相互作用と異なる形式で互いに相互作用すること、および、これが、水分減少PCR混合物が後に水戻しされてPCRに使用される場合に二重または多重反応アッセイの性能に顕著な影響が及ぼすということが、本特許の教示である。二重および多重の定量的リアルタイムPCR増幅反応(QRT−PCR)は、二重標識プローブが存在することおよびホットスタートDNAポリメラーゼを使用することに因ってより特異的である傾向がある一方、水分減少を受けない水分含有QRT−PCR混合物(「通常QRT−PCR混合物」)を用いる多重反応に最適であると考えられる種々の試薬成分の比率バランスの調整は、水分減少を受けるQRT−PCR混合物(「水分減少QRT−PCR混合物」)を用いて最適増幅を可能にするのに必要な調整を予測するものではないという知見が本実施例により示される。
二重定量的リアルタイムPCRアッセイが組み入れられた本発明混合物の使用期限安定性
多重リアルタイムPCR適用のための本発明のPCR混合物の性能および使用期限安定性を確立するために、二重プライマー−プローブアッセイを用意した。
Claims (21)
- 増幅操作に使用するためのDNAポリメラーゼおよび/またはdNTPを処理する方法であって、
DNAポリメラーゼおよび/またはdNTP、緩衝液、ならびに少なくとも1種の安定化剤を含む溶液混合物を提供すること;および
前記提供された溶液混合物が0℃から約100℃の間の温度で水分減少を受けるように、前記溶液混合物を水分減少させることを含む方法。 - 前記水分減少溶液混合物を、周囲室温で最大24ヶ月間保存すること;
前記保存された水分減少溶液混合物を水戻しすること;および
前記水戻しされた水分減少溶液混合物を用いて増幅操作を行うことをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記DNAポリメラーゼが、好熱性DNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記溶液混合物を水分減少することが、オーブン中、約55℃の温度で前記溶液混合物を加熱することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記溶液混合物が、50パーセントから100パーセントの間で水分減少を受ける、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の安定化剤が、少なくとも1種の糖および少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記糖が非還元糖を含み、前記タンパク質がBSAである、請求項6に記載の方法。
- 前記非還元糖がスクロースを含み、最終濃度のスクロースが1〜20%の範囲であり、BSAの濃度範囲が0.5〜3mg/mlである、請求項7に記載の方法。
- 前記溶液混合物が、配列が互いに異なる2種のオリゴヌクレオチドプライマーのセット;塩化マグネシウム;水溶性色素;核酸鋳型および蛍光色素からなる群から選択されるいずれか1つ以上の成分をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸の増幅用キットであって、好熱性DNAポリメラーゼおよびdNTP、緩衝液、少なくとも1種の安定化剤、塩化マグネシウム、配列が互いに異なる2種のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、ならびに、前記2種のオリゴヌクレオチドプライマーのセットと配列が異なるオリゴヌクレオチドプローブを核酸鋳型と共にまたは核酸鋳型なしで含む水分減少溶液を含む、キット。
- 核酸の増幅および検出用キットであって、
a.好熱性DNAポリメラーゼおよびdNTP、緩衝液、少なくとも1種の安定化剤、塩化マグネシウム、配列が互いに異なる2種のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む溶液、
b.配列が互いに異なり、前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一のセットにより増幅され得る標的領域と異なる標的DNAの領域を増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つの追加セットを含み、
キット試薬が、高温での乾燥、凍結乾燥、真空水分除去、スプレー乾燥、流動床乾燥、またはドラム乾燥により水分減少を受け、前記キット試薬が、周囲温度で最大90日間保存され、続いて水戻しされた後、核酸増幅を行うことができる、キット。 - 前記第一および第二のオリゴヌクレオチドプライマーセットと配列が異なる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項11に記載のキット。
- 前記試薬成分が、水分減少を受ける試薬の水分減少前に、単一のPCR反応用マイクロチューブ内に予め入れられている、マイクロチューブストリップの一部であるPCR反応用マイクロチューブ内に予め入れられている、あるいはマルチウェルプレートのウェル内に予め入れられている、請求項11に記載のキット。
- 前記水分減少溶液が、水溶性色素をさらに含み、増幅処理がPCRである、請求項13に記載のキット。
- 前記試薬成分が、水分減少を受ける試薬の水分減少前に、単一のPCR反応用マイクロチューブ内に予め入れられている、マイクロチューブストリップの一部であるPCR反応用マイクロチューブ内に予め入れられている、あるいはマルチウェルプレートのウェル内に予め入れられている、請求項12に記載のキット。
- 前記水分減少溶液が蛍光色素をさらに含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが検出可能な標識部分により標識され、増幅処理が定量的PCRである、請求項15に記載のキット。
- 1つのオリゴヌクレオチドプローブが標的配列の増幅を定量的に検出することができ、少なくとも1つのさらなるオリゴヌクレオチドプローブが異なる標的配列の増幅を定量的に検出することができる、請求項16に記載のキット。
- 核酸の増幅用および検出用キットであって、
a.一方または双方が蛍光標識されている2種のオリゴペプチドプライマーおよび/または標識プローブである追加の第三のオリゴヌクレオチドの第一のセット、ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、配列が互いに異なり、定量的PCR反応において特有の核酸配列の存在を検出できる、
b.一方または双方がプローブとしてとして働くために蛍光標識されているオリゴペプチドプライマーの第二のセットまたはプローブとして働く第三のオリゴヌクレオチドを加えた前記第二のセット、ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの第二のセットは、配列が互いに異なり、定量的PCR反応により前記プライマーおよびプローブの第一のセットにより検出される核酸配列と異なる別の核酸配列の存在を検出できる、
c.DNAポリメラーゼ酵素、
d.dNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、
e.1種以上の安定化剤を含有する緩衝液、および
f.塩化マグネシウムを、
g.内部対照として働くDNA鋳型と共にまたは該DNA鋳型なしで含み、
DNAポリメラーゼ酵素およびdNTPを含むキット試薬の少なくとも一部は、高温での乾燥、凍結乾燥、真空水分除去、スプレー乾燥、流動床乾燥、またはドラム乾燥により水分減少を受け、単一混合物として一緒になったキット試薬は、周囲温度で最大90日間保存され、続いて水戻しされた後、核酸増幅を行うことが可能である、キット。 - 多重PCR反応を行うことができるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの少なくとも1つの追加セットをさらに含む、請求項18に記載のキット。
- 前記1つ以上のオリゴヌクレオチドが、検出プローブとして働くために蛍光部分で単一標識されているか、または蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)プローブとして二重標識されている、請求項18に記載のキット。
- 水分減少前に溶液中に塩化マグネシウムが含まれず、塩化マグネシウムは後に前記溶液に添加されて核酸増幅を促進させる、請求項18に記載のキット。
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