JP2006502735A - 色素−ターミネーター配列決定試薬を乾燥するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
DNA配列決定は、生物学的調査、バイオテクノロジー、医療診断、法医学、および他の分野において、ますます重要となっている。ほとんどの配列決定は、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら、1977;Slatkoら、1991)により行われる。配列決定反応は、通常、いくつかの液体アリコート:ポリメラーゼ、四種のデオキシヌクレオチド、四種のチェーンターミネーター、および時には、緩衝液もしくは他の成分の分配を含む。
本発明の一つの実施形態は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を提供する。
(定義)
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方、ならびにジデオキシヌクレオチドおよび他のチェーンターミネーターヌクレオチドのような改変されたヌクレオチドを包含する。ヌクレオチドはまた、ポルヌクレオチド内のヌクレオチド残基を包含する。
本発明は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物に関する。本発明の乾燥組成物は、核酸配列決定反応のような核酸基質についての反応において使用され得る。配列決定反応において、本発明の乾燥組成物のいくつかの実施形態を用いることの利点は、乾燥組成物が、多量の鋳型の使用を許容すること、そしてそのために、より希釈された鋳型サンプルの使用を許容することである。この実施形態は、例えば、細胞全体の溶解物に直接由来する鋳型の配列決定を容易にする。細胞全体は、細胞のコロニーもしくは細胞の懸濁液に由来し得る。本発明の乾燥組成物によって、いくつかの実施形態において、鋳型は、細胞全体の溶解物の懸濁液から、濃縮することなく、より簡単に配列決定され得る。
R21は、C1〜5のアルキルであり;
Z1は、NH、硫黄、もしくは酸素であり;
R22は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり;
R29は、C1〜C5のアルキルであり;そして
Z2は、NH、硫黄、もしくは酸素である。
保存緩衝液(50%w/vグリセロール、100mM KCl、20mM Tris−HCl、pH8.0、0.1mM EDTA、1mM ジチオスレイトール、0.5% TWEEN 20、0.5% TRITON X−100)中の10μM Taq G46D F667Y DNAポリメラーゼ溶液の10μlを、6μlの1×緩衝液(80mM Tris−HCl、pH9.0、2.4mM MgCl2)および4μlの1mM FAS14(+DNAサンプルおよびコントロール)もしくは水(−DNAサンプル)と混合した。FAS14は、鋳型DNAである。FAS14は、ヘアピンループを形成し、ポリメラーゼによりヘアピンループを伸長させる。
BIGDYE TERMINATOR READY REACTION MIX version1.0(BTDキット)およびTMANOを添加したBIGDYE TERMINATOR READY REACTION MIX v1.0の配列決定サンプルを凍結し、そして10μlアリコートにおいて乾燥した。
DNA配列決定におけるシグナル幅およびシグナルの質を最も良く保持させるための条件を同定するために、サンプルの乾燥を、種々の凍結防止剤および種々の乾燥条件を用いて試験した。
この実施例において、BIGDYE TERMINATOR v3.0(Applied Biosystems,Foster City、California)を用いた5μlの配列決定反応混合物を、実施例3に記載のようにグリセロールなしで調製した。この配列決定反応混合物サンプルは、200mMのトレハロースおよび0.2mg/mlのウシ血清アルブミンを含有していた。サンプルを、96ウェル反応プレートに分配し、そして凍結乾燥機での凍結乾燥により乾燥させた。サンプルは、プライマー有りでもしくはプライマーなしで、乾燥させた。サンプルを、TMANOを含まなかった。配列決定反応を、乾燥前、乾燥直後、または室温で、37℃もしくは60℃での8週間までの保存後に実施した。配列決定反応のシグナル強度およびPhred20スコアを定量した。そして結果を表8および9に示す。
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Claims (99)
- 蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する、乾燥組成物。
- 前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 請求項4に記載の組成物であって、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、組成物。
- 前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、2’,3’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項5に記載の組成物。
- 四つのヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項5に記載の組成物。
- 耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項8に記載の組成物。
- 前記組成物が、別の核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項9に記載の組成物。
- 前記組成物が、グリセロールを実質的に含まない、請求項1に記載の組成物。
- 凍結防止剤をさらに含有する、請求項1または8に記載の組成物。
- 前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項12に記載の組成物。
- 前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項13に記載の組成物。
- 前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項1に記載の組成物。
- 前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項15に記載の組成物。
- 前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン;4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項18に記載の組成物。
- 前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項15に記載の組成物。
- 前記アクセプターが、4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が、20重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、20重量%より少ない水含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、5重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、5重量%より少ない水含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、2重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、2重量%より少ない水含量を含む、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を作製する方法であって、前記蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を、乾燥させる工程を包含する、方法。
- 前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項28に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項28に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項28に記載の方法。
- 請求項31に記載の方法であって、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをまとめて含有する一つ以上の溶液を乾燥させる工程をさらに包含し、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、方法。
- 前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、2’,3’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項32に記載の方法。
- 四種のヌクレオシド三リン酸をまとめて含有する一つ以上の溶液を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項32に記載の方法。
- 耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記溶液が、水溶液である、請求項28もしくは35に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項35に記載の方法。
- 前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液が、グリセロールを実質的に含まない、請求項35に記載の方法。
- 前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項35に記載の方法。
- 前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項39に記載の方法。
- 前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項39に記載の組成物。
- 前記乾燥させる工程の少なくとも一部の間、前記溶液の温度が0℃より低い、請求項28に記載の方法。
- 前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥させる工程の少なくとも一部の間、該耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液の温度が0℃より低い、請求項35に記載の方法。
- 前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項28に記載の方法。
- 前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項44に記載の方法。
- 前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン;4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項47に記載の方法。
- 前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項44に記載の方法。
- 前記アクセプターが、4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項49に記載の方法。
- 前記乾燥組成物が、20重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項28に記載の方法。
- 核酸基質における反応を実施する方法であって、該方法が、
(a)蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を含む容器を、提供する工程、ならびに
(b)該容器に水性流体および核酸基質を添加する工程
を包含する、方法。 - 前記反応が、核酸配列決定反応であり、ここで、前記方法が、核酸ポリメラーゼを用いて前記核酸基質にハイブリダイズしたプライマーを伸長する工程ならびに該核酸基質の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに包含する、請求項52に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項52に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項52に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項52に記載の方法。
- 請求項56に記載の方法であって、前記乾燥組成物が、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、方法。
- 前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、2’,3’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項57に記載の方法。
- 前記乾燥組成物が、四種のヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項57に記載の方法。
- 前記乾燥組成物が、耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項52に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項60に記載の方法。
- 前記乾燥組成物が、グリセロールを実質的に含まない、請求項52に記載の方法。
- 前記乾燥組成物が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項52に記載の方法。
- 前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項63に記載の方法。
- 前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項63に記載の方法。
- 前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項52に記載の方法。
- 前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項66に記載の方法。
- 前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン;4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項69に記載の方法。
- 前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項66に記載の方法。
- 前記アクセプターが、4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項71に記載の方法。
- 前記核酸基質が、細胞全体の溶解物由来の非濃縮核酸である、請求項52に記載の方法。
- 前記細胞が、細菌細胞である、請求項73に記載の方法。
- 前記細胞が、動物細胞、真菌細胞、もしくは植物細胞である、請求項73に記載の方法。
- 請求項52に記載の方法であって、ここで、前記核酸基質が、細胞全体の溶解物に由来し、かつ該細胞の溶解後直ちに、その細胞外抽出物における濃度に対して3倍以下に濃縮される、方法。
- 前記乾燥組成物が、20重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項52に記載の方法。
- 核酸の配列を決定するためのキットであって、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を備える、キット。
- 前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項78に記載のキット。
- 前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項78に記載のキット。
- 前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項78に記載のキット。
- 請求項81に記載のキットであって、前記乾燥組成物が、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、キット。
- 前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、2’,3’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項82に記載のキット。
- 前記乾燥組成物が、四種のヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項82に記載のキット。
- 前記乾燥組成物が、耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項78に記載のキット。
- 前記ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項85に記載のキット。
- 前記乾燥組成物が、実質的に、グリセロールを含まない、請求項78に記載のキット。
- 前記乾燥組成物が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項78に記載のキット。
- 前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項88に記載のキット。
- 前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項88に記載のキット。
- 前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項78に記載のキット。
- 前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項91に記載のキット。
- 前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項91に記載のキット。
- 前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン;4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項94に記載のキット。
- 前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項91に記載のキット。
- 前記アクセプターが、4,7−ジクロロフルオレセイン;非対称ベンゾキサンテン;ローダミン;4,7−ジクロロローダミン;カルボキシローダミン;カルボキシR110;カルボキシR6G;もしくはカルボキシ−X−ローダミン色素;もしくはCy5である、請求項96に記載のキット。
- 前記キットが、前記ヌクレオチドを含有する、3つ以上の実質的に同一の乾燥組成物を備え、該乾燥組成物が、固体支持体に規則的パターンで配置されている、請求項78に記載のキット。
- 前記乾燥組成物が、20重量%より少ない溶媒含量を含む、請求項78に記載のキット。
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