JPH07502893A - 核酸ハイブリッド形成アッセイにおける、またはそれに関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸ハイブリット形成アッセイを行なう方法、前記アッセイ用の新規 な組成物、および前記アッセイを行なうためのキットに関する。

発明の背景 現在、核酸ハイブリッド形成アッセイには多数の異なるアプリケーションかあり 、特に感染症または遺伝性疾患の検出および診断に用いられる。

哺乳類細胞中の染色体分析を含む遺伝性疾患の検出および診断には、通常は、た とえばコルヒチンなどのように、有糸分裂における細胞周期の進行を阻害するよ うに設計された物質か存在する栄養培地中で細胞を培養することか必要である。

この段階においては、哺乳類細胞中の染色体は凝縮されており、染色によって容 易に同定可能である。細胞を培養せずども有糸分裂中の低頻度の細胞を見つける ことかできるが、これは細胞のタイプによって異なるか困難である。したがって 、臨床細胞遺伝学の実験室では、末梢血細胞の分析、または羊水穿刺試料（羊膜 細胞（ａｍｎｉｏｃｙｔｅｓ））からの細胞を分析するためには、染色体の分析 の前に数週間にわたってこれらの細胞のタイプを培養することか通例となってい る。

染色体分析の標準的な方法では、固定化細胞の沈殿を顕微鏡のスライド上に置き 、ｌＥＴ？Ｉｉ鏡で分裂細胞を観察することが必要である。染色体は有糸分裂細 胞中で容易に見ることができるが、個々の染色体の同定は困難であり、通常はサ イズおよびＧ（ギムザ）−バンドパターンに基づく染色体の整合対が必要である 。これは多くの場合、染色した染色体の広がりを写真に撮り、その後写真から染 色体を手作業で組み合わせることによって行なわれる。細胞中の、たとえば染色 体の１つのセクションから別のセクションへの転座における染色体の異常を同定 するためには、多くの場合、高度な技術が必要である。たとえば、骨髄性白血病 に関連した９：２２転座においては、細胞遺伝学者は染色体９（「フィラデルフ ィア染色体」）片に結合した短くなった染色体２２を同定しなければならない。

遺伝子中の小さな欠失または突然変異などの染色体内のあまり広範囲ではない異 常は、標準的な視覚的方法の染色体分析では同定することができない。

染色体分析のためにハイブリッド形成プローブを用いることによって、有糸分裂 細胞中の個々の染色体の同定および転座等の異常の分析が非常に容易になった。

たとえば、個々の染色体の動原体領域に対してハイブリッド形成したり　（ｖａ ｎ　Ｄｅｋｋｅｎ　ａｎｄ　Ｂａｕｍａｎ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇ ｅｎｅｔ、。

ｖｏｌｕｍｅ　４８　（１９８８）　ｐ１８８−１８９）、または個々の染色体 の全長に沿って特定の領域に対しハイブリッド形成するＤＮＡプローブ（Ｐｉｎ ｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　ｖｏｌｕｍｅ　８３　（１９８６）　ｐ２９３４−２９３８）が開発さ れている。ハイブリッド形成されたＤＮＡプローブは、通常は蛍光標識によって 視覚化され、これは特定の染色体または染色体のフラグメントを同定する特定の 蛍光信号を発生可能である。ハイブリッド形成プローブは特定の染色体をマーキ ングすることによって、サイズおよびバンドパターンに基づいて特定の染色体を 同定する必要性を克服した。このことは三染色体性などの染色体異常の同定を単 純化し、これにより２つではなくて３つの蛍光マークされた染色体がサイズまた はバンドパターンを全く考慮することなく即座に視覚化される。ある長さの複数 の染色体に対してハイブリッド形成する複数のプローブを用いれば、マークされ ていない染色体に転座した蛍光マークされた染色体のセクションが即座に視覚化 されるため、転座の同定か容易となる。

ハイブリッド形成プローブは、サイズおよびバンドパターンによってではなく、 蛍光ハイブリッド形成信号に基づいて個々の染色体の同定を可能にし、したがっ て、染色による視覚的同定を妨げる分散構造を染色体が有する非分裂（同期）細 胞中の染色体を検出するために、プローブを用いることが可能となっている。個 々の染色体の動原体領域に特異的なプローブを用いる場合は、同期細胞中に２つ の蛍光スポットが存在すれば１対の特定の染色体が存在することを確実に示し、 一方、同じプローブからの３つのスポットは三染色体性を確実に示す。同期細胞 に対する係る染色体の分析により、有糸分裂を蓄積するために細胞を培養する必 要がなくなり、このため、染色体異常の分析に必要な時間および技術を大幅に削 減する。この技術はまた、保存された転座または欠失部位にわたる染色体プロー ブ対を用いて、転座および欠失なとの他の染色体欠陥を検出するためにも適用可 能である。近接した位置の染色体領域に相同性のプローブは、蛍光スポット等の ハイブリット形成シグナルを発生し、これらの蛍光スポットは近接しているため 、同一の染色体フラグメントに対してハイブリッド形成するプローブとして明確 に認識できる。したかって、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）中の９．２２転座等の 転座については、１つの染色体プローブを染色体９中の転座切断点の一方側に対 してハイブリット形成させ、かつ別の染色体プローブを切断点の他方側に対して ハイブリッＩ・形成させることかできるであろう。デュシエーヌ筋ジストロフィ ー（ＤＶＤ）で見られるような欠失については、１つの染色体プローブをＸ染色 体中の欠失領域の一方ｆｉｌｌに対してハイブリッド形成させ、かつ別の染色体 プローブをＤＭＤ中で頻繁に欠失する領域に対してハイブリット形成形成させる ことかできるだろう。そして、検査官かＤＭＤを１対の蛍光スポソ１〜の一方が 欠けているものとして検出することが可能となる。したかって、同期細胞中の染 色体に対してハイブリッド形成した染色体プローブの空間的な位置は、転座また は欠失なとの損傷か存在する場合は、それらを特定的に示す。現在の染色体プロ ーブによる同期細胞の分析技術を広範に使用する上で主要な制限となるのは、ハ イブリッド形成プローブの使用には高度な技術が必要とされることである。した かって、好ましくは操作か少なく、可能ならば厳密なピペット定量工程を用いる ことのない、より単純なハイブリッド形成方法が強く必要とされている。

本発明の目的は、核酸ハイブリッド形成反応を行なうためのより単純な方法を提 供することであり、特に厳密なピペット法を必要としない方法を提供することで ある。

本発明の一局面においては、核酸ハイブリッド形成アッセイ用の組成物が提供さ れ、これは乾燥状態て固相支持体に可逆的に結合された、標識をつけられた核酸 ハイブリット形成プローブまたはその前駆体を含み、前記プローブまたはその前 駆体は水または水溶液を加えることによって放出可能である。

本発明の配合物は、好ましくはプローブまたはその前駆体か固相支持体から容易 に放出可能なものである。ここで［容易に放出可能である」とは、如何なる水溶 液によっても放出可能であるということを本明細書ては意味する。

核酸プローブまたは前駆体は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずかを含み得る。係るプ ローブは当業者に公知の多数の手段のうちのいずれの手段によって標識を付けら れてもよい（例、蛍光標識、放射性標識、酵素標識）。したがって、プローブま たは前駆体は、直接判別可能なハイブリッド形成信号を発生する試薬で標識され てもよく、またはハイブリッド形成の後に１つ以上の他の物質（たとえはアビジ ン）と相互作用する物質（たとえばビオチン）で標識されてもよく、この相互作 用により、判別可能なハイブリッド形成信号が発生する。

これ以降、内容の許す限り、［プローブＪと概して言及することは、その前駆体 にもあてはまることを意図する。

プローブ前駆体は典型的には標識の付いていないプローブである。前駆体に標識 を付けて標識されたプローブを形成することは、前駆体の試料核酸に対するハイ ブリッド形成の前、その間、またはその後に行ない得る。便宜上、前駆体の標識 付けは、標識の付いたヌクレオチドを付加するために（当業者に周知の態様で） ＤＮＡポリメラーゼ■またはＴａｑポリメラーゼなとのポリメラーゼを用いて、 プローブを伸長することによって行なわれる。

固相支持体は、ガラス、ラテックスビーズまたは他の固相微粒子支持体なとの微 粒子物であってもよく、これはそれぞれ粒子の形をとってもよく、またはともに 凝集して錠剤を形成してもよい。係る錠剤を作るのに適した原料成分は当業者に 周知である。

典型的には係る錠剤は、公知の容積の水または緩衝液中で溶解して公知の濃度ま たは濃度範囲のプローブ溶液を生成し、これは当業者には明白なように多数の用 途において使用可能である。

代替的には、固相支持体はほぼ平坦な表面を与え得る。

はぼ平坦な表面を有する支持体は便宜的にはガラスまたはプラスチックを含み得 る。好ましくは、はぼ平坦な表面を有する支持体は、カバーガラス片または顕微 鏡スライドに代表される薄く透明な材料を含む。係る好ましい実施例は以下に議 論するような利点を有する。

プローブ用の固相支持体がガラスからなる場合、水または水溶液を加えることに よって容易に放出可能なように（これは本発明の好ましい特徴である）プローブ が支持体に結合されないということか概して見られる。

この理由は、核酸が多くの負の電荷を含むため、多数の正電荷を一般的に含むガ ラスに強力に結合するためである。

この静電引力の強さを減じるためには、その電荷を少なくともいくぶん中性化す る処理をガラスに行なう必要がある。便宜的には、これは当業者には周知の態様 でたとえばジメチルクロロシランでの処理によってガラスをシリコーン処理して 行なわれる。

係る処理は、多数の正電荷を含まない特別なタイプのガラスまたは他の材料につ いては不必要である。

一般にプローブは水溶液において固相支持体に与えられ、乾燥のために放置され る（室温または乾燥を早めるために上昇させた温度で）。プローブは支持体表面 のｌスポット与えられてもよく、より好ましくは数箇所にわたって与えられてア レイを形成する。代替的には、プローブを疎水性表面（たとえばソリコーン処理 されたガラス）上に広げることか所望される場合は、プローブは有機溶媒混合物 （たとえば５０９６メタノール／１０％酢酸を３　：　Ｉ　（ｖ／ｖ）で水と混 合したもの）、またはドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤溶液中に与えられ てもよい。

特定の具体例においては、複数個の異なるプローブか１つの支持体へ可逆的に結 合されてもよい。これは、もし各々か異なる色の蛍光標識（たとえはフルオレセ インおよびクマリン）で標識を付けられた２つのプローブを用いる場合には特に 便利である。

代替的に、プローブは先に詳細に述へた微粒子支持体などの実質的に平坦でない 表面に可逆的に結合され得る。同様に、実質的に平坦でない表面は吸水性材料（ つまり、毛管力に応答して水性媒質によって横断されやすい、少なくとも０．１ μ、好ましくは少なくとも１μの小孔を有する多孔性材料）から作られてもよい 。係る吸水性材料は一般には親水性であるか、または親水性にすることか可能で あり、次のものを含む。シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナ等の無機粉末 、天然ポリマー材料、特に繊維含有紙（たとえはろ紙、クロマトグラフィー用紙 等）なとのセルロース材料およびセルロースから誘導された材料、ニトロセルロ ース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋結合された デキストラン、アガロース、ポリアクリレート等の合成ポリマーまたは修飾され た天然由来のポリマー、それ自体で用いられるかまたは他の材料とともに用いら れる；セラミック材料：その他。

可逆的に結合されたプローブを放出し得る水溶液は、好ましくはハイブリッド形 成流体を含み、その正確な組成は環境によって様々である。たとえば、ハイブリ ッド形成流体の組成（特にその中の塩の濃度）か他の要因（たとえばハイブリッ ト形成温度）とともにハイブリット形成の厳密性（つまりハイブリット形成され る配列間の相同性の程度）を決定するということは当業者に周知である。典型的 には、ハイブリッド形成流体は、ｐＨか約ｐＨ７に調整された約０．３Ｍ塩化ナ トリウムと約０．０３Ｍクエン酸ナトリウムとの水溶液を含む。しかしながら、 この組成は検定されるへき試料中の核酸プローブと核酸との間の相同性の程度に よって、かつ所望のハイブリット形成の厳密性によって明らかに変化し得る。ハ イブリッド形成流体はさらに、ホルムアルデヒド（約５０％Ｖ　／　Ｖにおいて ）またはデキストラン硫酸（約ｌＯ％Ｗ／Ｖにおいて）なとの任意の添加物を含 んでもよい。

プローブ前駆体はハイブリット形成アッセイを行なう前に標識を付けられること か好ましい。しかしなから、このことは重要ではなく、プローブ前駆体は試料核 酸に対するハイブリット形成の間、またはその後に標識されてもよいと理解され る。

−具体例においては、プローブまたはその前駆体に加えて他の物質が、プローブ ／プローブ前駆体と同し支持体または１つ以上の別個の支持体上に（可逆的また は非可逆的に）固定化され得る。典型的には、これらの他の物質はプローブまた は前駆体と相互作用する。たとえば、それらはプローブもしくは前駆体に結合す る結合物質（それぞれ抗体として）であってもよく、またはプローブもしくは前 駆体に標識を付ける標識試薬であってもよい。

たとえば、標識された核酸プローブ（たとえばビオチンまたはフルオレセインで 誘導されたもの）は、１つのカバーガラス片上に可逆的に固定化することかでき る。また、ハイブリッド形成されるプローブをさらに標識する試薬（たとえば標 識抗ビオチンまたは抗フルオレセイン抗体）は、ハイブリット形成しかつハイブ リッド形成された試料から最初のカバーガラス片を取り除いた後側に与えられる １つまたは２つ以上の別個のカバーガラス片上に固定化することかできる。

代替的に、考えられ得る一例としては、核酸プローブ前駆体とプローブ前駆体を 標識付けするための試薬との組み合わせか、吸水性材料なとにおいて隣接した固 相上に与えられ、これにより核酸プローブ前駆体および標識付は成分を連続して 試料上に導入することかできる。これはたとえばプローブ前駆体および標識付は 成分を吸水性材料の異なるセグメント上に可逆的に固定化し、かつプローブ前駆 体を１つのセグメン！・から試料上にまず交差させ、その後標識試薬を他のセグ メントから試料上に交差させ、その結果プローブ前駆体か試料核酸に対してハイ ブリッド形成し、その後標識試薬によって標識されることによって達成される。

明らかに、標識試薬の代わりの、またはそれに加える物質はプローブ前駆体と同 じかまたは異なる支持体上にともに（可逆的または非可逆的に）固定化され得る 。

たとえば、ＤＮＡポリメラーゼが、試料核酸によって与えられた鋳型上で核酸プ ローブまたはその前駆体の伸長を行なうためにカバーガラス上にともに固定化さ れるか、または第２のカバーガラス上に与えられ得る。さらに、係る伸長用のデ オキシヌクレオチドもまた、同一のまたは別のカバーガラス上に固定化され得る 。こうして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ１米国特許第４６８３１９５および 第４６８３２０２）などの、核酸プローブまたは前駆体からの伸長を含むハイブ リッド形成アッセイは、核酸プローブとともに固相上に伸長反応の成分を与える ことによって都合よく行なわれ得る。哺乳類染色体の分析において特に興味のあ ることは、ブライ７−ｉｎ　５ｉｔｕ標識技術（ＰＲＩＮＳ、　Ｋｏｃｈ　ｅｔ 　ａｌ、。

Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ　ｖｏｌ、９８　（１９８９）　ｐ２５９参照）であり、 これによって、１つ以上の標識されていない核酸プローブが試料染色体調製物の 特定の領域に対してハイブリッド形成され、かつ染色体のハイブリッド形成部位 を視覚化するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、ビオチニル化され たヌクレオチド等の検出可能なヌクレオチドか組み入れられる。以下の例９て説 明するように、核酸プローブ前駆体およびＤＮＡポリメラーゼを同一のカバーガ ラス上にともに固定化することによってＰＲＩＮＳ法か実行され、そしてこの方 法を実行するために特に好都合なプローブおよび酵素を与える手段を提供する。

１つ以上の核酸プローブと特定のハイブリット形成法に関連した試薬との組み合 わせか、吸水性材料なとにおいて隣接する固相上で考え出され、これによって核 酸プローブおよび関連試薬を試料上に連続して導入することかでき、これはたと えば、上に説明したように、プローブおよび関連試薬を吸水性材料の異なるセグ メント上に固定化し、プローブを１つのセグメントから試料上にまず交差させ、 その後関連試薬を他のセグメントから試料上に交差させることによって行なわれ る。

本発明の他の局面において、核酸ハイブリッド形成アッセイを行なうための方法 か提供される。この方法では、乾燥状態て固相支持体に可逆的に結合された標識 された核酸プローブまたはその前駆体を、水または水溶液を加えることによって 処理し、上記プローブまたはその前駆体を放出させる。−」１記プローブまたは 前駆体は水または水溶液を加えると放出可能である。さらにこの方法では、放出 されたプローブまたは前駆体を、相同性の配列またほぼは相同性の配列同士のハ イブリット形成を可能にする条件下で、核酸を含む検定されるへき試料と接触さ せる。必要に応じて前駆体を適切な態様で処理し、標識付けされたプローブを生 成させる。そして、ハイブリッド形成されていないプローブを混合物から取り除 き、かつ試料核酸に対してハイブリッド形成された標識プローブの存在を（もし あれば）測定する。

先行技術と比へた場合のこの方法の利点は、乾燥状態で可逆的に結合されたプロ ーブを用いることによって厳密なピペット法を用いる必要性が少なくなり、相対 的に迅速かつ単純に、相対的に技術力のない者によってアッセイを行うことが可 能になることである。

この方法は定性および定量分析の両方のために使用され得る。

好ましい具体例において、プローブは水または水溶液を加えるだけの１つのステ ップで放出され、そして検定されるへき試料と接触させられる。典型的には、上 に議論したハイブリッド形成流体を含む水溶液が用いられる。

一般に、ハイブリッド形成されていないプローブは１つ以上の洗浄ステップを行 なってハイブリッド形成アッセイ混合物から取り除かれる。典型的には、洗浄流 体はハイブリッド形成流体を含み、その組成は先に詳細に述へたように少し異な る。

アッセイは、核酸ハイブリッド形成プローブが相同性または実質的に相同性の配 列に対してハイブリッド形成するような条件下で実行される。実質的に相同性の 配列は完全にではないがほぼプローブに相補的なものである。典型的には係る実 質的に相同性の配列は少なくとも９０％相同性である。

本発明の好ましい特徴において、特に蛍光標識されたプローブを用いる場合、プ ローブは、はぼ平坦な表面を含むガラスまたはプラスチック等の薄く透明な材料 からなる固相支持体に可逆的に結合される。係る材料は典型的には顕微鏡スライ ドまたはカバーガラスを含む。この構成は多数の利点を有する。

第１に、プローブが可逆的に結合される顕微鏡スライドまたはカバーガラスは、 検定されるべき試料を支持する材料（典型的にはカバーガラスまたは顕微鏡スラ イド）の表面に近接して置かれ、このためプローブを放出するのに用いられるハ イブリッド形成流体が毛管作用によって２つの表面の間から引き出され得る。こ のことは、検定を行なっている人か試薬の量を正確に測定する必要がないために 有利である。さらにもしプローブを支持している材料および検定されるへき試料 を支持している材料の両方ともか透明ならば、蛍光顕微鏡検査法によってハイブ リット形成された蛍光標識プローブの存在を容易に測定し得る。しかし当然なが ら、ハイブリッド形成されたプローブの存在を測定する方法は、プローブが標識 付けされる悪様に依存する。

当業者には容易に明白であるか、上に規定した方法は、新鮮な血液細胞または新 鮮な羊膜細胞の分析を含む哺乳類細胞、特にヒトの細胞の分析（特に染色体分析 ）、ならびに精子細胞、絨毛膜柔突起細胞および―帯血液細胞の分析に特によく 適している。

さらに、上に規定した方法はいくつかの異なる染色体の特徴の分析にも適用され 得るということが理解される。たとえば、特定の染色体に相同性のプローブは、 たとえば三染色体性の存在を決定するためにその染色体複製物の数に関する情報 を提供てきる。転座または欠失切断点にわたるプローブは、染色体が正常（２つ のハイブリッド形成信号が並置されている）か、または転座（一方のハイブリッ ド形成信号か他方から分離されている）、もしくは欠失（１対の２つの隣接した ハイブリッド形成信号のうちの一方か欠けている）においてのように異常である かとうかを示すための、さらなる空間的情報を提供できる。

゛本発明の方法は明らかに、新しく調製された細胞に限定されない。

たとえば、本発明の方法は培養された哺乳類細胞および新しく分離された０１乳 類細胞の両方に等しく適用可能であるということか明らかにされており、ただし プローブを用いて染色体を検出することを最適化するためにある種の細胞につい ては方法を多少変更する必要がある。特に、低張液中てのインキュベーションに よって得られる核酸プローブに対する透過性の程度は、細胞のタイプによって異 なり、羊ｍ細胞を含むある種の細胞は、プローブか結合し得る細胞の成分を取り 除くためにＲＮアーゼまたはプロテイナーゼ、またはその両方で予備処理をする 必要かあるということかオつかっている。

本発明の方法はまた、以前には染色によって分析された細胞遺伝学のスライド等 の「公的記録」物にも適用できるということかわかっており、これは後で染色体 プローブを用いてハイブリッド形成して染色体特異的なハイブリッド形成（，７ 号を生成できる。係る方法は多少の変更を行なって組織切片などの多くの他のタ イプの細胞調製物、および無傷の未分解染色体材料か存在する多様な年齢の材料 に適用可能であるということか理解される。

また、当業者には本発明の方法は哺乳類細胞の染色体分析に特に適しているが、 この用途に限定されるものではないということか理解されるであろう。

たどえば、この方法はほとんとのタイプの哺乳類細胞、核酸を含む微生物、およ び上述のさまざまな調製物に適用され１１する。

この方法は、たとえはウィルスに感染した哺乳類細胞もしくは細菌細胞、真核生 物（酵母、真菌類、原生動物、藻類もしくは植物細胞）の検出、または原核生物 の検出に適用され得る。

特に、本発明の方法は、哺乳類細胞の試料（培養されたか新しく調製されたかを 問わない）または池の微生物（細菌、真菌類もしくは酵母）の培養物試料の中で 微生物（たとえばウィルス、細菌、リケッチア）の検出に適用され得る。

本発明のさらに池の局面においては、核酸ハイブリッド形成アッセイ用のキット が提供され、このキットは、乾燥状態て固相支持体に可逆的に結合された標識核 酸ハイブリッド形成プローブまたはその前駆体と、使用説明書とを含み、ｍｆ記 プローブまたは前駆体は水または水溶液を加えると容易に放出可能である。

このキットはまた、乾燥状魁て同一または他の固相支持体に結合された他の物質 を含んでもよい。前記池の物質は可逆的または非可逆的に結合され得る。

好ましくは、キットかプローブ前駆体を含む場合、このキットは、標識試薬とし て作用し得る、固相支持体に乾燥状態て結合された他の物質を含む。

典型的には、核酸ハイブリット形成プローブはカバーガラスまたは顕微鏡スライ ドに可逆的に結合される。したかって、キットか加硫溶液（当業者には周知の組 成のもの）をさらに含むことは好ましい特徴である。キットの他の好ましい構成 要素には、ハイブリット形成溶液（検定されるへき試料中に意図される標的配列 か存在する状態で、プローブのハイブリット形成の厳密性について理想的な条件 を作るように注意深く調整された組成のもの）、洗浄溶液および抗退色溶液かあ る。

発蛍光団（プローブに蛍光標識を付けるときに使用されるようなもの）からの信 号は、蛍光顕微鏡検査で起こるように発蛍光団の励起の間に時間かたつにつれて クエンチされる傾向がある。当業者に周知の抗退色溶液はこの傾向を阻止する助 けとなる。好ましくは、抗退色溶液はヨウ化ブＵビノウムを含み、これは細胞核 を赤く染める傾向かあるため、ある一般的に用いられる発蛍光団（たとえばフル オレセイン）に対するカウンタ染色として作用し得る。

キｙ１・はまた、羊膜細胞（羊水穿刺から得られるような）を分析する際に得ら れる結果を向上させるために、当業者に公知の態様で処理され得る顕微鏡スライ ドを含んでもよい。

本発明のさまさまな局面は以下の例示的な実施例および図面を参照してよりよく 理解される。

図１は異なる固相支持体」二に可逆的に固定化された核酸ハイブリット形成プロ ーブの概略図であり、図２は、特定のヒト染色体に特異的な蛍光標識プローブを 用いるハイブリット形成アッセイから得られた結果を示す顕微鏡写真であり、さ らに 図３は特定のヒト染色体の２つの遺伝子座に特異的な蛍光標識プローブを用いる ハイブリッド形成アッセイから得ることかできる顕微鏡写真のスケッチである。

８Ｔ細な説明 図１はプローブか固相支持体上に可逆的に固定化され得る態様の例を示す。図１ ａは、はぼ平坦な表面を有する従来の顕微鏡スライドカバーガラス５の一方の表 面上にプローブ２か可逆的に固定化された様子を示す。その後カバーガラスはプ ローブで覆われた側か検定されるへき試料３を支持している従来の顕微鏡スライ ドｌの表面に接触するように位置決めされる。その後適切な量の／％イブリッド 形成流体かスライド上に置かれ、毛管作用によってカバーガラスの下から引き出 され、これによりプローブをカバーガラスから放出し、かつ検定されるべき試料 中の如何なる相同性の配列ともハイブリッド形成することが可能となる。同し効 果を持つ方法としては、ハイブリット形成流体を検定されるへき試料の上に直接 置き、その後、カバーガラスをハイブリット形成流体の上に置く方法かあり、ハ イブリット形成流体は毛管作用によってカバーガラスの下で拡がる。

図１ｂに示される代替的な構成においては、プローブ２て覆われたカバーガラス の表面は、流体を保持するためのウェルを含む顕微鏡スライド８とともに用いら れ得る。検定されるへき試料はハイブリッド形成流体とともにウェルに与えられ 、プローブで覆われたカバーガラスの表面はハイブリッド形成流体と接触し、プ ローブか放出されるように置かれる。

図１ｃに示される他の実施例においては、プローブ（図示せず）は吸水性材料内 に支持される（先に説明したように）。プローブはほぼ均一に吸収されるか、ま たは吸水性材料の局部的領域（図１ｄ中６）に吸収され得る。プローブを含む吸 水性材料は検定されるへき試料を支持する顕微鏡スタイ１ζ１上に置かれる。吸 水性材料はカバーガラスで覆われ、ハイブリッド形成流体か毛管作用によって吸 水性材料中に引き入れられ、こうしてプローブを放出する。図１ｄはプローブか 吸水性材料内に配置された実施例を示す。

係る環境においては、ハイブリッド形成流体を非対称に（吸水性材料中のどこに プローブか位置するかに依存して）塗布して、毛管作用により、ハイブリット形 成流体か可逆的に結合されたプローブを越えて引き出され、検定されるべき試料 と接触することを確実にすることか必要かもしれない。

図２は、以下の例１を参照して説明する。

図３は、ヒトの染色体９上の転座切断点の両側に特異的な１対の蛍光標識プロー ブを用いて得ることかできる模式的な顕微鏡写真のスケッチであり、この転座は 慢性骨髄性白血病（Ｃ〜ｌ）の患者においては染色体９および２２の会合を引き 起こす。図３ａは正常な同期細胞におけるバイブリソ１−形成から得ることかで きる結果を示し、プローブ対は染色体９の各々の複製物に対して隣接してハイブ リット形成しており、転座は発生していない。図３ｂはＣＭＬ患者からの異常な 同期細胞を用いたハイブリッド形成から得ることのできる結果を示し、プローブ 対か染色体９の１つの複製物に対して隣接してハイブリット形成しているか、ま た２つの異なる遺伝子座においてもバイブリソ１〜形成しており、染色体９の１ つの複製物において転座か発生したことを示しており、２つのハイブリッド形成 遺伝子座の物理的な分離を引き起こしている。

例１ この例は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬ　Ｌ）の染色体１２について三染色体的 な細胞の検出に関する。健康なボランティアまたはＣＬＬ患者からの全血の０． １ｍｌが、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０　（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　ＵＫ） 、ｌＯ％子ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、および０．０５ｍ１の植物凝集素溶液 （Ｇｉｂｃｏ、　Ｍ−フオーム）を含む５ｍｌの培地て培養された。

細胞は３７°Ｃて７２時間インキュベートされ、０．０５ｍ１のコルヒチン（Ｓ ｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ、　ＬＩＫ）か加えられた。さらに６０分間インキュベ ーションした後、細胞は遠心分離され、ペレットは０．０７５Ｍ塩化カリウム溶 液中で再懸濁された。１０分後、細胞は再び遠心分離され、ペレットはメタノー ル、氷酢酸５　：　１　（ｖ／ｖ）中に再懸濁された。

細胞はさらにペレット化され、メタノール　酢酸の定着溶液中で３度再懸濁され た。最小濃度１０’／ｍｌの１滴の細胞かいくつかのＩｆｆ微鏡メタイド上に置 かれ、室温で乾燥のため放置された。その後、スライドはホットプレート上で６ ５°Ｃて１時間インキュベートされ、−２０°Ｃで貯蔵された。ハイブリッド形 成の直前に、スライドは冷７０％エタノール中に２分間、冷８５％エタノール中 に２分間、そして最後に冷１００％エタノール中に２分間連続して浸され、その 後乾燥させられた。

ハイブリッド形成については、染色体１２の動原体領域に相同性であるＤＮＡプ ローブか使用された。２５ｕｇのプラスミドｐ−ａ　−１２Ｈ８（Ｌｏｏｙｅｎ ｇａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｆ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　５ ４　（１９９０）　ｐ２１６）か、４０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８および６　ｍＭ 　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２の２５μｌ中０゜００５単位のＤＮアーゼＩ　（Ｌｉｆｅ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｐａ１ｓｌｅｙ。

ＵＫ）を用いて、３７°Ｃで１０分間消化によりニックトランスレーションされ た。反応は７０°Ｃで１０分間加熱することによって停止された。その後、３ｕ ｌの消化されたＤＮＡか、５ｕｌのＪＯＸＡ４緩衝液（２００ｕＭデオキシアデ ノシン三リン酸、２００ｕＭデオキシシトシン三リン酸、０５ＭトリスＨＣＩ　 ｐＨ７，２，０，２ｍＭ　ＭｇＣＬ、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、Ｏ ，１ｍｇ／ｍｌウソ血清アルブミン（フラクションＶ、　Ｓｉｇｍａ）、３゜３ ｕｌ　ｂｉｏ−ＩＩ　ｄＵＴＰ（＋００ｕｇ／ｍｌストックより、Ｓｉｇｍａ） 、および水）とともに混合され４９ｕ１とされた。ＪｕｌのＤＮＡポリメラーゼ ■か加えられ、混合物は１５°Ｃて１．５時間インキュベート・された。反応は ５ｕｌの０．３Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐｒ−ｒｇを加えることによって停止された。い くつかの実験においては、２ｕｌのプローブかｌ００ｕｌのメタノール：氷酢酸 ３　：　１　（ｖ／ｖ）と混合され、シリコーン処理された２５ｍｍ２顕微鏡ス ライド男バーガラス（Ｎｏ、１カバーガラス、ＢＤＨ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）の 印を付けられていない剥土に落とされた。第２のシリコーン処理されたカバーガ ラスがプローブを均一に広げるために印を付けられていない側を介してプローブ 混合物上に置かれ、プローブとカバーガラスのサンドイッチは３７°Ｃで２時間 インキュベートされた。その後、乾いたカバーガラスは離され、両方ともハイブ リッド形成に使用された。他の実験ては、２００ｕｌの水て希釈されたプローブ がカバーガラス上のアレイに各５ｕｌのアリコートとして点状に付与されるか、 またはシリコーン処理されたガラスロッドを用いてカバーガラス上に手作業で広 げられた。どの場合においても、プローブは３７°Ｃでカバーガラス上において 乾燥させられた。

ハイブリッド形成は、各顕微鏡スライド上にあるハイブリッド形成緩衝液（５０ ％ホルムアミド、０．３Ｍ塩化ナトリウム、００３Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７ ，１０％Ｗ／Ｖデキストラン硫酸（分子量平均５００，０００ダルトン、Ｓｉｇ ｍａ））のスポット上にカバーガラスを付与することによって行なわれた。カバ ーガラスはゴム溶液で端部を封止され、スライドは８５°Ｃて１０分間加熱した ブロック上で加熱された。その後、スライドは３７°Ｃて一晩インキユベートさ れた。その後、カバーガラスか取り除かれ、５０％ホルムアミド、０．３Ｍ塩化 ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７中において４５°Ｃで５ 分間３度洗浄された。その後、スライドはＰＮ緩衝液（０，１Ｍリン酸すトリウ ム緩衝液ｐＨ８，０，１％ＮＰ４０）中て５分間、４５°Ｃと室温とのそれぞれ て２度洗浄された。

スライドはそれからＰＭＮ緩衝液（０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐ　ｉ（８、 Ｏ，Ｉ％ＮＰ４０．０．０２％アジ化ナトリウムおよび５９６無脂肪乾燥乳（Ｍ ａｒｖｅｌＴＭ、Ｃａｄｂｕｒｙ。

Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＵＫ）　）中の５　ｕ　ｇ／ｒｎ　Ｉフルオレセイン −アビジンＤＣ３溶液（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｐｅｔｅ ｒｂｏｒｏｕｇｈ。

ＵＫ））において２０分間暗室内で室温でインキュベートされた。スライドはＰ Ｎ緩衝液中で暗室内において３度洗浄され、さらにＰＭＮ緩衝液中５ｕｇ／ｍｌ ビオチニル化ヤギ抗アヒジン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にお いて２０分間暗室内でインキュベートされた。スライドは再びＰＮ緩衝液中で暗 室内て３度洗浄され、過剰な緩衝液か取り除かれ、スライドは２５０ｕｇ／ｍｌ 　１４−ジアザヒシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ，Ａ！ｄｒｉｃｈ、　Ｄｏｒｓｅ ｔ、　ＵＫ）を含むグリセロール中ｊｕｇ／ｒｎｌヨウ化プロヒンウム（Ｓｉｇ ｍａ）において染色された。カバーガラスがｊ［鏡検査の前に各スライドに与え られた。

典型的な結果を図２に示す。

正常なボランティアからの大半の血液細胞（主として巨咳球）については、２つ の蛍光スポットか観察された（図２ａ）か、ＣＬＬ患者からの大半の血液細胞は 三染色体性染色体１２に対応する３つの蛍光スポットを示したく図２ｂ）。

例２ 動原体染色体１２プローブ、または代替的にプラスミドｐ　Ｕ　ＣＬ　７７　（ Ｃｏｏｋｅ　ａｎｄ　ｔｌｉｎｄｌｅｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　６　（１９７９）　ｐ１３７７）から誘導された動原体染色体ｌ プローブのいずれかを用いて、例１の方法が繰り返された。血液細胞を培養する 代わりに、羊膜体液および鮮血の両方について染色体分析が直接行なわれた。正 常な羊膜細胞および正常な血液細胞から１対の蛍光スポットを得るために、細胞 は遠心分離され、細胞ペレットは０．０７５Ｍ塩化カリウム中で３０−６０分間 再懸濁された。その後、細胞は遠心分離され、かつメタノール：米酢ｍ３　：　 ｌ　（ｖ／ｖ）中で再懸濁され、それから顕微鏡スライドに塗布された。

スライド上の細胞はＩ００ｕｇ／ｒｎｌＲＮアーセＡ（ウシＲＮアーセ、　Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｌｅｗｅｓ、　ＬＩＫ）中て３７°Ｃて１時間処理された 。その後、スライドは０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ７中で４度洗浄された。

その後、スライドは７０９６エタノール、８５％エタノールおよび１．００９６ エタノール中で連続して洗浄された。その後、スライ１−は０．５ｕｇ／ｍｌプ ロテイナーゼＫ　（Ｓｉｇｍａ）中で３７°Ｃて３０分間インキュベートされ、 遠心分離され、かつ０．３Ｍ塩化すトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウムｐ 　Ｈ７中で２度洗浄された。その後、スライドは４％パラボルムアルデヒド溶液 中で再懸濁され、遠心分離され、かつ０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエ ン酸すトリウムｐＨ７中で２度洗浄された。その後、スライドは７０％エタノー ル、８５％エタノール、および１００％エタノール中で連続して洗浄され、上記 のようにＤＮＡプローブを用いてハイブリッド形成された。

新鮮な（培養されていない）羊膜細胞または血液細胞のいずれも、その大半につ いては、染色体１２または染色体Ｉ　ＤＮＡプローブのいずれかとともに２つの 蛍光スポットか観察された。

例３ 直接蛍光標識されたプローブを用いることによって、例１および例２の方法から 多数の工程か削除された。プローブＤＮＡは例１に詳細に述へたように二ソクト ランスレーソヨンされたが、ｂｉｏ−Ｉｆ　ｄＵＴＰの代わりにフルオレセイン −デオキシウリジン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 、　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、　ＵＫ）か２０％Ｍの最終濃度で用いら れ、デオキシチミジン三リン酸か２０％Ｍの最終濃度で用いられ、かつ他のデオ キシリボヌクレオチド三リン酸か６０％Ｍの最終濃度で用いられ、インキュベー ションは１５°Ｃて３時間に延長して行なわれた。ＰＮ緩衝液中てのハイブリッ ド形成、インキュベーションおよび洗浄の後、スライドはＤＡＢＣＯ中ｔｕｇ／ ｍｌヨウ化プロヒジウムを用いて直接処理され、ＢＲｆａ鏡で観察された。蛍光 スポットは例１および例２と同じく観察された。

例１ないし例３の方法の「公的記録」物への適用は、３週間経ったスライドを分 析することによって調査された。

固定化した血液細胞を含むスライドはリン酸塩緩衝生理食塩水中で、その後、１ ００％エタノール中で洗浄され、乾燥させられた。その後、スライドはホットプ レート上で６５℃で１時間インキュベートされ、−２０°Ｃで貯蔵された。

ハイブリッド形成が上述のように実行され、ｐ−α−１２Ｈ８からの動原体染色 体１２プローブか大多数の血液細胞中に蛍光スポット対を発生させた。

髭 例３に概要を示す方法を生殖細胞の分析への適用に関して詳しく説明する。特に 、この例は、放射能に晒されたかもしれない患者からの染色体１について二染色 体である細胞の検出に関する。直接標識付けされた染色体１プローブ（プラスミ ドｐＵｃ１．７７−前述例２参照）が用いられた。生殖細胞は健康なボランティ アおよび放射能に晒された患者から寄付された。

生殖細胞はｌ０ｍ１のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−０，１４Ｍ塩化ナトリ ウム、０．００２Ｍ塩化カリウム、０、ＯＩＭオルトリン酸水素二すトリウム、 ０．００１Ｍオルトリン酸二水素カリウムｐＨ７，４）中に懸濁され、混合され 、かつ遠心分離でペレット化された。上清を注意深く取り除いた後、新しい定着 液（メタノール：酢酸３：１（ｖ／ｖ））か「乳状の」溶液か得られるまで加え られた。その後、固定化された細胞は顕微鏡スライドに塗布され、乾燥させられ た。スライド上の細胞はＰＢＳ中で５分間洗浄さ第１．０．１Ｍ　ＤＴＴ／１％ トリプシン溶液中で１２分間処理する前に７０％エタノール、８５％エタノール および１００％エタノール中で連続して脱水された。さらに連続して脱水した後 、試料は上述のようにＤＮＡプローブを用いてハイブリット形成された。健康な ボランティアからの細胞の大半については、染色体ｌプローブを用いて１つの蛍 光スポットか観察された。しかしなから、放射能に晒された患者からの細胞にお いては、少数の細胞か２つの蛍光スポットを含んでおり、小さな割合の二染色体 性１細胞を示している。

例に の例は絨毛膜柔突起試料（ＣＶＳ）における三染色体性１８の出生前の検出に関 する。染色体Ｉ８の動原体領域に相同性のプローブか用いられた（Ｄｅｖｉｌｅ ｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　＋４　： 　２０５９−２０７３．　１９８６）　ｏこのブローゴは本質的には上記の例３ て説明したように調製された。

絨毛膜柔突起細胞は、Ｄｉｓｐａｓｅ　（４ｍ　ｇ／ｍ　Ｉ　）を含む２　ｍ　 ］　Ｃｔ＋ａｎｇ培地（Ｍｅｔａｃｈｅｍ　Ｄｉａｇｏｎｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ、 　Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）中で２時間、乾燥柔毛をインキ ュベーションして調製された。コルヒチン（０，０１％Ｗ／Ｖ）か加えられ、遠 心分離の前にさらに１時間インキュベートされた。結果として生じた細胞ペレッ トは５ｍｌの１％（Ｗ／Ｖ）クエン酸ナトリウム中で再懸濁され、３７°Ｃて１ ５分間インキュベートされ、遠心分離によって細胞がペレット化され、かつ結果 として生した細胞ペレットは水冷固定液（メタノール：酢酸（３：　ｌ）ｖ／ｖ ）中て２度洗浄された。その後、固定化された細胞はガラススライドに塗布され 、エタノール系（７０％、８５％および１００％）を用いて連続的に脱水された 。フルオレセイン標識されたプローブのハイブリッド形成およびハイブリッド形 成の厳密性のための洗浄の後に、スライドは上記の例３と同じように処理された 。大半のＣＶＳ細胞については、１８トリソミ−（エトワーズ症候群）に特有の 蛍光スポットか観察された。

用いて膀帯血液から胎児の性別を判別することに関する。

１０ｕ１の調帯血液かｌ００ｕｌの新しい定着液（メタノール：酢酸（３：　１ ）ｖ／ｖ）にゆっくりと混合しなから加えられた。その後、固定された細胞はガ ラススライドに塗布され、ハイブリット形成の前にエタノール系（７０％、８５ ％および１００％）で連続して脱水された。プローブは、Ｙ染色体のへテロクロ マチン領域およびＸ染色体の動原体領域から誘導された（Ｎａｋａｈｏｒｉ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　＋４　：　７ ５６９−７５８０．　（１９８６）およびＷｉｌｌａｒｄ　ｅｔａｌ、、　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＩ：　２０＋７．　（１９８３ ））　ｏ　プローブはＹプローブに標識付けするために用いられた発蛍光団がヒ ドロキシクマリン６−　ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ ｅｉｎ　ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であったこと以外は、実質的に例３で説明 したように標識された。

ハイブリッド形成、インキユベーシヨンおよび厳密性のだめの洗浄に続いて、ス ライドはベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ ｓ　［ｎｃ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＵＳＡ））中０．７ｕｇ／ｍｌヨウ化 プロビジウムを用いて直接処理され、フルオレセインおよびクマリンについて二 重フィルタブロック（Ｎｉｋｏ口、　Ｊａｐａ口）を用いるエビフルオレセンス 顕微鏡て観察された。

固定化されたリンパ球には１つの黄色スポットと１つの青色スポットか観察され 、この血液は男子の胎児から得たものだということを示している。

これまでに述へてきた例はこの技術を応用し得る試料のタイプを限定するもので は全くなく、その範囲を示すものこの例は、染色体＋３／２ＬＩ８、ＸおよびＹ についてのヒトの羊膜細胞および末梢血細胞の分析に関し、本発明の方法に基つ いて商業的に入手可能なキットの有効性に関する染色体１３／２１．１８、Ｘお よびＹの分析用の「クロモプローブ（Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｂｅ）　Ｊキットは、 Ｃｙｔｏｃｅｌｌ。

Ｌｅｗｋｎｏｒ、　ＵＫから入手され、補助試薬の使用を含む製造者の指示に従 って使用された。公知の染色体相補体試料から同期細胞において蛍光スポットか 表われる頻度が測定され、その結果を以下の表に示すが、ここで表１ａおよび１ ｂは染色体＋　３／２１に特異的なプローブを用いて羊膜細胞および末梢血細胞 のそれぞれから得られた結果を示し、表２ａおよび２ｂは染色体１８に特異的な プローブを用いた場合の同じ細胞タイプ（つまり羊膜細胞および末梢血細胞のそ れぞれ）についての結果を示し、表３ａおよび３ｂはＸ染色体に特異的なプロー ブを用いた場合の同じ細胞タイプについての結果を示し、かつ表４ａおよび４ｂ はＸ染色体に特異的なプローブを用いる場合の同じ細胞タイプについての結果を 示す。

例９ この例は、例Ｉの方法の変法によって慢性リンパ球性白血病（ＣＬ　Ｌ）におけ る染色体１２について三染色体性の細胞を検出することに関する。ＣＬＬ患者か らの細胞は例１に説明したように調製されて顕微鏡スライド上に載せられた。２ ｕｇのプラスミドｐ−α−１２Ｈ８（例１）が製造者の使用説明書に従って用い られる酵素Ｄ　ｄ　ｅ　Ｔ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、　 ＵＫ）を用いて消化された。消化されたプラスミドＤＮＡを、フェノール　クロ ロホルム抽出、エタノール沈澱しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　、　ｅｄｓ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｊａｔｉｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　） ｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）参照）、１０ｕｌの水で再懸濁した。

このＤＮＡのそれぞれｌｕｌのアリコートかシリコーン処理された２５ｍｍ２カ バーガラス上に３×３マトリツクス状に塗布され、乾燥させられた。１ユニツト のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）か製造業者によって推奨されるように 反応緩衝液中で１０ｕ１に希釈され、ｌｕｌアリコ−ｔ−（３ｘ３マトリックス ）として同一のカバーガラスに塗布され、乾燥させられた。

ハイブリット形成および伸長については、各５０ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよ びｄＣＴＰ、ならびに２５ｍＭのフルオレセイン−１２−ｄ　ＵＴ　Ｐ　（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ）　Ｉ　Ｏｕ　］水溶液かスライド上の試料に加えられ、消化 されたブラスミｌ’およびｔａｑポリメラーゼを含むカバーガラスか与えられた 。スライドは９３°Ｃて５分間加熱され、その後７０°Ｃて１時間インキュベー トされた。その後、カバーガラスか取り除かれ、スライドは７０°Ｃて５分間、 ５００ｍＭのＮａＣ］および５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８中で洗浄された。その 後、スライドはヨウ化プロビジウムで染色され、例１と同しく観察された。ＣＬ Ｌ患者からの大半の血液細胞については、染色体１２の３つの複製物の存在に対 応する３つの蛍光スポットか観察された。

上述の例はこの技術か適用され得る試料のタイプを限定するものでは全くなく、 その範囲を示すものである。

スポット数　細胞数　％ ４　９８　７６、６ スポット数　細胞数　％ ３　１６３　２１．８ ４　４４０　５９、０ ４　６０　４０、０ ５　７７　５１．３ ６　０　０．０ ３　＋９　６．３ ４　１２１　４０．３ ５　１５３　５１．０ スポツト数　細胞数　％ ２　５０９　９２、５ ２　１３　１３．７ ３　７７　８１．０ スポット数　細胞数　％ ２　５１４　８６．２ １１０　４０．６ ３　９９　３６、０ スポット数　細胞数　％ スポット数　細胞数　％ ２　４２４　８５．０ 予想されるＹ染色体なし スポット数　細胞数　％ 予想されるＹ染色体あり ０　１０１　３４．０ スポット数　細胞数　％ ０　１１９　２７．７ １　３０５　７０、９ ＡＮＹ　ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ　Ｔ○ Ｆ工ＧＵＲＥ　４ Ｓｔ（ＡＬＬ　ＢＥ　Ｃ０Ｎ５よりＥＲＥＤ　Ｎ０Ｎ−ＥＸ工５ＴＥＮＴ「閣　 闇！　！ｍ　審　÷９　牛 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ 、　ＵＳ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸ハイブリッド形成アッセイで用いるための組成物であって、乾燥状態で 固相支持体に可逆的に結合され、標識付けされた核酸ハイブリッド形成プローブ 、またはその前駆体を含み、前記プローブまたは前駆体は水または水溶液を加え ると放出可能である、組成物。
2. ２．標識付けされていない核酸プローブの形態であるプローブ前駆体を含む、請 求項１に記載の組成物。
3. ３．プローブ前駆体の標識付けは、標識されたヌクレオチドをそれに加えること によって行なわれる、請求項２に記載の組成物。
4. ４．固相支持体は実質的に平坦である、前掲の請求項のいずれかに記載の組成物 。
5. ５．固相支持体は吸水性材料を含む、前掲の請求項のいずれかに記載の組成物。
6. ６．固相支持体は微粒子である、前掲の請求項のいずれかに記載の組成物。
7. ７．固相支持体およびプローブまたは前駆体はともに錠剤を構成する、前掲の請 求項のいずれかに記載の組成物。
8. ８．固相支持体は実質的に平坦である、請求項１ないし３のいずれかに記載の組 成物。
9. ９．固相支持体は顕微鏡スライドまたはカバーガラスを含む、請求項８に記載の 組成物。
10. １０．固相支持体はシリコーン処理されたガラスを含む、前掲の請求項のいずれ かに記載の組成物。
11. １１．複数個の異なるプローブまたはその前駆体は１つの固相支持体に可逆的に 結合される、前掲の請求項のいずれかに記載の組成物。
12. １２．乾燥状態で同一または他の固相支持体に結合される他の物質をさらに含む 、前掲の請求項のいずれかに記載の組成物。
13. １３．前記他の物質は標識試薬を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. １４．核酸ハイブリッド形成アッセイを実行するための方法であって、乾燥状態 で固相支持体に可逆的に結合された標識付けされた核酸プローブまたはその前駆 体を、そのプローブまたは前駆体を放出するように水または水溶液を加えること によって処理するステップを含み、前記プローブまたは前駆体は水または水溶液 を加えると放出可能であり、さらに、放出されたプローブまたは前駆体を、相同 性または実質的に相同性の配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、核酸 を含む検定されるべき試料と接触させるステップと、必要に応じて、標識付けさ れたプローブを生成するように前駆体を適切な態様で処理し、ハイブリッド形成 されていないプローブを混合物から取り除き、かつ標識付けされ、試料核酸にハ イブリッド形成されたプローブの存在を（もしあれば）測定するステップとを含 む、方法。
15. １５．プローブまたはその前駆体はハイブリッド形成流体を加えることによって 放出される、請求項１４に記載の方法。
16. １６．支持体に可逆的に結合される前駆体は、標識されたヌクレオチドを前駆体 に付加するためのポリメラーゼを用いることにより標識プローブを生成させるべ く、適切な態様で処理される、請求項１４または１５に記載の方法。
17. １７．方法は、試薬の量をさらに厳密に測定する必要のない態様で実行される、 請求項１４ないし１６のいずれかに記載の方法。
18. １８．方法は細胞の染色体分析に適用される、請求項１４ないし１７のいずれか に記載の方法。
19. １９．乾燥状態で固相支持体に可逆的に結合された標識核酸プローブまたはその 前駆体と、使用説明書とを含み、前記プローブまたは前駆体は水または水溶液を 加えると放出可能であることを特徴とする、核酸ハイブリッド形成アッセイて使 用するためのキット。
20. ２０．乾燥状態で同一または他の固相支持体に結合される他の物質をさらに含む 、請求項１９に記載のキット。
21. ２１．前記他の物質は標識試薬を含む、請求項１９または２０に記載のキット。
22. ２２．ハイブリッド形成流体、洗浄溶液、加硫溶液、およびヨウ化プロビジウム を含む抗退色溶液のうちの１つ以上のものをさらに含む、請求項１９ないし２１ のいずれかに記載のキット。