JP2003250600A

JP2003250600A - 標的核酸の検出方法

Info

Publication number: JP2003250600A
Application number: JP2002052725A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Tanaka; 康進田中; Keisaku Okada; 圭策岡田; Riyouko Asai; 量子浅井
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2003-09-09

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】従来のハイブリダイゼーション法に比べて非常
に操作性に優れた、迅速かつ簡便な標的核酸の検出方
法、ならびに当該検出方法に好適に使用される標的核酸
の検出用キットの提供。【解決手段】標的核酸との結合性を有する捕捉プローブ
と、標的核酸とは結合性を有しないが、該捕捉プローブ
とは結合性を有する競合プローブとを用いる標的核酸の
検出方法であって、（ａ）該競合プローブとシグナルレ
ポーターとを有する標識複合体と、被検試料とを混合す
る工程、（ｂ）該捕捉プローブを固定化してなる固定相
を有する吸水性基材上に、工程（ａ）で得られた混合物
を導入する工程、（ｃ）ストリンジェントな条件下、吸
水性基材上で該混合物を展開する工程、ならびに（ｄ）
固定相において該シグナルレポーターからのシグナルを
検出する工程、を含む。ならびに前記の標識複合体と吸
水性基材とを含んでなる標的核酸の検出用キットの提
供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の検出方
法および標的核酸の検出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっているサルモネラ菌をは
じめとする病原性微生物などの、食品中や患者からの検
出には、多くの日数、煩雑な操作を要する場合が多い。
また、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。

【０００３】これらの検出や診断には、標識化免疫測定
法などの種々の免疫測定法（イムノアッセイ）が用いら
れ、最近では免疫クロマトグラフ方式による、迅速・簡
便な検査も広く行われている。このような測定法では、
検査対象となる微生物に対する抗体が必要不可欠であ
る。しかしながら、微生物によっては種レベルではな
く、属レベルでの検出が要求されるため、様々な血清型
を有する細菌が検出対象となりうる。このような場合に
は種々の抗原に対する抗体が必要となるため、抗体の確
保に多大な労力と費用が求められる。

【０００４】そこで近年では、ＤＮＡプローブなどを用
いたハイブリダイゼーション法が用いられるようになっ
てきた。たとえば、特定の微生物を検出するための方法
においては、細菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を標
的としてハイブリダイゼーションが行われる。細菌のｒ
ＲＮＡの塩基配列は細菌の系統進化を反映している観点
から、その有効性が広く世に知られている〔DeLong E.
F.ら、Science 243:1360-1363(1989)〕。従って、かか
る方法は、特定の微生物を検出する方法として優れたも
のである。しかしながら、通常のハイブリダイゼーショ
ン法にはブロッティング、ハイブリダイゼーション、洗
浄、発色などの手順が含まれており、任意の試料をブロ
ットしたメンブレンをプラスチック製のバッグに密封し
て加熱したり、洗浄を繰り返したりする必要があり、操
作性の点では優れているとは言いがたい。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のハイ
ブリダイゼーション法に比べて非常に操作性に優れた、
迅速かつ簡便に被検試料中の標的核酸の存在を検出する
ことができる標的核酸の検出方法、ならびに当該検出方
法に好適に使用される標的核酸の検出用キットを提供す
ることを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、〔１〕標的核酸との結合性を有する捕捉プローブと、
標的核酸とは結合性を有しないが、該捕捉プローブとは
結合性を有する競合プローブとを用いる標的核酸の検出
方法であって、（ａ）該競合プローブとシグナルレポー
ターとを有する標識複合体と、被検試料とを混合する工
程、（ｂ）該捕捉プローブを固定化してなる固定相を有
する吸水性基材上に、工程（ａ）で得られた混合物を導
入する工程、（ｃ）ストリンジェントな条件下、吸水性
基材上で該混合物を展開する工程、ならびに（ｄ）固定
相において該シグナルレポーターからのシグナルを検出
する工程、を含み、標的核酸を含まない対照試料の場合
と比べて、固定相において該シグナルが低く検出される
場合に被検試料中に標的核酸が含まれると判定する、標
的核酸の検出方法、ならびに〔２〕前記〔１〕に記載の標識複合体と吸水性基材と
を含んでなる標的核酸の検出用キット、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の標的核酸の検出方法（以
下、検出方法という）は、従来のハイブリダイゼーショ
ン法による被検試料中の標的核酸の検出をクロマトグラ
フ方式にて行うことを１つの大きな特徴とする。従っ
て、本発明によれば、従来のハイブリダイゼーション法
の煩雑な操作を行うことなく、本発明において使用する
吸水性基材の上に被検試料や試薬等を導入（たとえば、
滴下）するだけで、迅速かつ簡便に被検試料中の標的核
酸の存在を検出することができる。

【０００８】すなわち、本発明は、クロマトグラフ方式
により標的核酸と競合プローブとを捕捉プローブに対し
競合的にハイブリダイズさせ、捕捉プローブにハイブリ
ダイズした競合プローブの程度を、該競合プローブに結
合したシグナルレポーターからのシグナルとして検出
し、標的核酸が全く含まれない場合、すなわち、競合プ
ローブのみが捕捉プローブにハイブリダイズする場合を
対照として、かかる場合に比し、シグナルの検出レベル
が低下した場合に被検試料中に標的核酸が含まれると判
定する標的核酸の検出方法である。

【０００９】具体的には、当該検出方法は、標的核酸と
の結合性を有する捕捉プローブと、標的核酸とは結合性
を有しないが、該捕捉プローブとは結合性を有する競合
プローブとを用いる標的核酸の検出方法であって、
（ａ）該競合プローブとシグナルレポーターとを有する
標識複合体と、被検試料とを混合する工程、（ｂ）該捕
捉プローブを固定化してなる固定相を有する吸水性基材
上に、工程（ａ）で得られた混合物を導入する工程、
（ｃ）ストリンジェントな条件下、吸水性基材上で該混
合物を展開する工程、ならびに（ｄ）固定相において該
シグナルレポーターからのシグナルを検出する工程、を
含むものである。そして、標的核酸を含まない対照試料
を用いて被検試料と同様の操作を別途行い、対照試料の
場合と比べて、固定相において標識複合体のシグナルレ
ポーターからのシグナルが低く検出される場合に被検試
料中に標的核酸が含まれると判定する。

【００１０】なお、本明細書において「結合性を有す
る」とは、ストリンジェントな条件下に互いにハイブリ
ダイズ可能であることを意味し、「結合性を有しない」
とは、ストリンジェントな条件下に互いにハイブリダイ
ズしないことを意味する。また、「核酸」にはＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）が含ま
れる。当該核酸としては、天然由来の核酸、生物学的方
法および／または化学的方法により作製された核酸、増
幅核酸、組換え核酸等の任意の核酸が含まれる。

【００１１】本発明においては、吸水性基材上に導入さ
れる、該基材上で展開させる成分（以下、展開対象成
分）を毛細管現象により自然展開させるため、当該展開
対象成分は水を媒体とする溶液や分散液等であるのが好
適である。たとえば、そのような形態で提供された被検
試料と標識複合体とを混合〔工程（ａ）〕して得られた
混合物を吸水性基材上の一端に導入〔工程（ｂ）〕する
と、当該混合物は直ちに吸水性基材上で展開〔工程
（ｃ）〕される。

【００１２】被検試料と標識複合体の混合の割合は、本
発明の所望の効果の発現が得られる限り特に限定される
ものではないが、被検試料中の予想される標的核酸の量
と標識複合体中の競合プローブの量がモル比で１：１程
度となるように混合するのが好ましい。また、該混合物
の導入は、本発明の所望の効果が得られるように行われ
る。たとえば、導入は滴下等により適宜行えばよく、そ
の際の滴下量も本発明の所望の効果が得られれば特に限
定されるものではない。導入位置は、吸水性基材上、固
定相から見て一方の側であって、所望の展開移動距離が
確保できる位置であるのが望ましい。かかる展開移動距
離とは、該混合物の導入位置から固定相までの距離をい
う。当該展開移動距離としては、好ましくは５〜３５ｍ
ｍ、より好ましくは１０〜３０ｍｍである。かかる範囲
内であれば、シグナルの検出感度が良好で、測定時間も
適切である。

【００１３】標識複合体に含まれる競合プローブは標的
核酸とは結合性を有しないため、被検試料中に標的核酸
が存在していたとしても互いにハイブリダイズすること
はなく、標的核酸および標識複合体は各々独立に展開さ
れる。標的核酸と標識複合体の競合プローブは共に捕捉
プローブと結合性を有するものであるので、固定相にお
いて固定化捕捉プローブと接触すると、当該捕捉プロー
ブに対し互いに競合的にハイブリダイズすることにな
る。

【００１４】被検試料と標識複合体の混合物を展開して
一定時間経過後、固定相においてシグナルレポーターか
らのシグナルを検出〔工程（ｄ）〕する。

【００１５】また、以上の同様の操作を対照試料を用い
て別途行う。

【００１６】被検試料に標的核酸が全く含まれない場合
には、固定相において標識複合体のみが競合プローブと
捕捉プローブとのハイブリダイゼーションを介して捕捉
されることになるので、シグナルレポーターからのシグ
ナルは対照試料の場合と同程度に検出される。

【００１７】一方、被検試料に標的核酸が含まれる場合
には、標的核酸と競合プローブとの競合的なハイブリダ
イゼーションの結果、固定相では標的核酸の捕捉が生
じ、被検試料中に標的核酸が存在しない場合と比べて標
識複合体の捕捉は減少し、もしくは捕捉が実質的に生じ
ないため、シグナルレポーターからのシグナルは対照試
料の場合と比べて低く検出される。また、標識複合体の
捕捉がない場合には、該シグナルは検出されない。

【００１８】従って、本発明の標的核酸の検出方法にお
いては、対照試料の場合と比べて、シグナルレポーター
からのシグナルが低く検出される場合に、被検試料中に
標的核酸が存在すると判定することができる。

【００１９】本発明において被検試料としては、核酸が
含まれうるものであれば特に限定されるものではない。
被検試料としては、たとえば、食中毒の原因菌（細菌、
たとえば、サルモネラ菌、リステリア菌等）等の特定の
菌種に由来する溶菌液や、各種生物の血液、組織等の細
胞溶解液、ならびにそれらの希釈液等が挙げられる。菌
もしくは細胞の溶解や、得られた溶菌液等の希釈には、
特に限定されるものではないが、水、ホウ酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の水系溶媒を使用するのが好適である。さ
らに、前記溶菌液等に含まれる核酸を鋳型としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた増幅産物をも
被検試料とすることができる。

【００２０】また、標的核酸としては、その配列が既知
のものであれば特に限定されるものではない。たとえ
ば、前記食中毒の原因菌のゲノム上もしくはプラスミド
上に、または各種生物のゲノム上にコードされた特定の
遺伝子領域や、前記原因菌等に含まれるＲＮＡ等を挙げ
ることができる。たとえば、標的核酸が特定の食中毒の
原因菌に固有の塩基配列を有する核酸である場合、本発
明の検出方法により任意の被検試料において当該標的核
酸の存在が確認されれば、当該被検試料の取得源（たと
えば、食品）における当該原因菌の存在が明らかとな
る。かかる標的核酸としては、特定の菌種の属や系統分
類学上の集団に固有の塩基配列が知られている細菌のｒ
ＲＮＡが好適である。また、標的核酸が、特定の疾患の
病因として知られる、もしくは特定の疾患の病状を表わ
すことが知られる、野性型の遺伝子や変異型の遺伝子で
ある場合、被検試料において当該遺伝子の存在が確認さ
れれば、当該被検試料の取得源である生物の疾患の病因
や病状が明らかとなる。さらには、生物の特定の遺伝子
について多型が存在する場合、たとえば、個々の遺伝子
に特徴的な塩基配列を有する遺伝子領域を標的核酸と
し、本発明の検出方法を用いて当該生物由来の被検試料
において当該標的核酸の存在を確認することにより、当
該生物の遺伝子型タイピングを行うことも可能である。

【００２１】本発明の標的核酸の形態としては一本鎖で
あっても二本鎖であってもよいが、一本鎖であるのが好
ましい。たとえば、本発明の標的核酸としては、ＲＮＡ
や公知の方法により任意に合成・増幅して得られた一本
鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸が好適である。かかる一本鎖核
酸としては、たとえば、食品の食中毒の原因菌による汚
染を判定する場合の有用性の観点から、前記細菌のｒＲ
ＮＡが好適であり、中でもサルモネラ菌またはリステリ
ア菌由来のｒＲＮＡがより好適である。被検試料に二本
鎖の核酸が含まれる場合には、本発明の検出方法に供す
る前に、公知のアルカリ処理法や加熱処理法等により、
二本鎖の核酸を予め一本鎖に解離させておくのが好まし
い。

【００２２】本発明の標識複合体は競合プローブとシグ
ナルレポーターとを有してなる。当該競合プローブとし
ては、具体的には標的核酸と実質的に同一の塩基配列を
有しており、かつ固定相の固定化捕捉プローブに対し、
ストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズし
うる核酸プローブであれば特に限定されない。当該競合
プローブとしては、核酸、修飾核酸、核酸アナログ等か
らなるものが挙げられる。競合プローブは一本鎖または
二本鎖の核酸でありうるが、一本鎖の核酸であるのが好
ましい。また、その塩基数としては少なくとも５塩基長
程度であり、好ましくは５〜１００塩基長、より好まし
くは１５〜５０塩基長であるが、数千塩基長であっても
よい。

【００２３】前記修飾核酸としては、修飾された糖基、
リン酸基、または修飾塩基を含む核酸が挙げられる。た
とえば、修飾塩基を含む核酸の例としては、たとえば、
アセチル化された塩基（４−アセチルシチジン等）、カ
ルボキシル化された塩基（５−カルボキシメチルアミノ
メチルウリジン等）、またはメチル化された塩基（１−
メチルイノシン等）等を含む核酸が挙げられる。また、
デアザグアニンおよびウラシルを含む核酸をグアニンお
よびチミンを含む核酸の代わりに競合プローブとして用
いてもよい。かかる場合には、ハイブリダイズした際の
競合プローブの熱安定性が低下する。また、５−メチル
シトシンを含む核酸をシトシンを含む核酸の代わりに競
合プローブとして用いてもよい。かかる場合には、ハイ
ブリダイズした際の競合プローブの熱安定性が向上す
る。核酸のホスホジエステル骨格から負電荷を除去する
ような修飾も競合プローブの熱安定性の向上に寄与す
る。また、競合プローブとしてＲＮＡを用いる場合に
は、当該プローブのヌクレアーゼ感受性を低下させる観
点から、２’−Ｏ−メチル基の付加など、リボースの糖
基を修飾するのが好ましい。

【００２４】前記核酸アナログとしては、たとえば、標
準的な核酸塩基が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
単位の繰り返しからなるペプチド様骨格に結合している
ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる〔Nielsen, P. E.
ら、Science, 254:1497〜1500（1991）〕。ＰＮＡはヌ
クレアーゼによる分解に対して非常に抵抗性が強い点で
有用である。

【００２５】本明細書において「標的核酸と実質的に同
一の塩基配列」とは、標的核酸との配列同一性が好まし
くは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好
ましくは９５％以上である塩基配列をいう。当該配列同
一性とは２つの配列間の塩基の配列類似性をいい、２つ
の適切にアラインメントされた配列を比較することによ
り決定する。具体的には、両方の配列に存在する同一の
塩基を決定して適合部位の数を決定し、次いで比較対象
の配列領域内の塩基の総数で前記適合部位の数を割り、
得られた数値に１００を乗じて配列同一性（％）を算出
する。かかる配列同一性は、たとえば、ＢＬＡＳＴネッ
トワークサービスを利用して適宜求めることが可能であ
る。

【００２６】本明細書においてストリンジェントな条件
としては、非特異的なハイブリダイゼーション反応を有
意に低下させる条件であれば特に限定されない。核酸の
ハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェント
な条件については、たとえば、成書（モレキュラーク
ローニング（Molecular Cloning）第３版、ザンブルー
ク（Sambrook）とラッセル（Russell）著、コールドス
プリングハーバー）等に記載されている。プローブの長
さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間の配列同一
性、温度、およびイオン強度等の要素が、核酸ハイブリ
ッドの安定性に影響する。たとえば、中ストリンジェン
シーまたは高ストリンジェンシー等のストリンジェント
な条件は、競合プローブと捕捉プローブの特性に応じ
て、経験的に決定することができる。

【００２７】上記のような核酸、修飾核酸、核酸アナロ
グ等からなる競合プローブは、所望の性質を有するよう
に公知の方法（たとえば、前記成書参照）に従って適宜
作製することができる。また、任意の配列や修飾（標
識）を有する核酸を合成した市販品を購入することもで
きる。

【００２８】シグナルレポーターは競合プローブと直接
的にまたは間接的に結合させることができ、かつ当該レ
ポーターに由来するシグナルを検出可能なものであれば
特に限定されるものではない。好ましくは機器もしくは
目視により、より好ましくは目視により、当該レポータ
ー由来のシグナルを容易かつ簡便に検出可能であるもの
が好適である。

【００２９】かかるシグナルレポーターとしては、たと
えば、着色粒子、酵素、蛍光色素や、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ
等のラジオアイソトープ等が挙げられる。中でも検出容
易性の観点から、着色粒子、酵素または蛍光色素が好ま
しい。

【００３０】本明細書において着色粒子とは着色された
粒子であって、シグナルを当該粒子から直接的に発せら
れる色として検出しうる粒子をいう。たとえば、当該粒
子としては、金コロイド粒子やセレニウムコロイド粒子
のような金属コロイド粒子や、着色された水分散型高分
子粒子などが挙げられる。水への分散性に優れ、また核
酸や酵素等の固定化容易性の観点から、水分散型高分子
粒子からなるものが好ましい。

【００３１】金属コロイド粒子は入手容易性および安定
性等の観点より、金コロイド粒子が好ましい。また、核
酸やリガンド等の固定化容易性および検出の容易性の観
点から、その粒径（平均粒径）は５〜８０ｎｍが好まし
く、１０〜５０ｎｍがより好ましい。当該粒径は、たと
えば、透過型電子顕微鏡観察下で各粒子の絶対粒径を測
定し、得られた測定値を平均することにより求められ
る。

【００３２】水分散型高分子粒子は、たとえば、公知の
方法に従い、不飽和二重結合を有する単量体の一又は二
以上を乳化重合することによって調製することができ
る。かかる単量体としては、たとえば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニ
ル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、ク
ロロスチレン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル
等の（メタ）アクリル酸エステル系単量体、ブタジエン
等のジエン系単量体等が好適に用いられる。

【００３３】また、本発明に用いられる水分散型高分子
粒子としては、上記単量体の単独重合体や共重合体から
なるものの他、その表面に核酸や酵素等を固定化するた
めのリガンドやスペーサーの導入を目的として、得られ
る粒子に官能基やイオン性基を付与したものでもよく、
また粒子の水性媒体中での分散安定性を高めるなどの目
的で、改質用単量体を共重合してなるものであってもよ
い。

【００３４】そのような官能基やイオン性基としては、
たとえば、カルボキシル基、水酸基、グリシジル基、ア
ミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナ
ート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物
基等を挙げることができ、中でもカルボキシル基が好ま
しい。これらの官能基等を有する水分散型高分子粒子を
調製するには、単量体成分として、たとえば、アクリル
酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有する単量
体、たとえば、ヒドロキシアクリレート、２−ヒドロキ
シエチルアクリレートのような水酸基を有する単量体、
たとえば、グリシジルメタクリレートのようなグリシジ
ル基を有する単量体を、所望により他の共重合性単量体
と乳化重合させることによって、それぞれカルボキシル
基、水酸基およびグリシジル基を有する粒子として得る
ことができる。また所望の単量体成分を重合させた後、
得られた粒子に官能基を導入することもできる。

【００３５】また、前記改質用単量体としては、たとえ
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸
エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ア
クリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホ
プロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジル
メタクリレートなどが用いられる。

【００３６】水分散型高分子粒子の着色は、たとえば、
スダンブルーやスダンレッドＩＶ、スダンＩＩＩ、オイ
ルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔料
や染料、また種々の蛍光色素・顔料を、当該粒子製造時
に任意に添加することで行うことができる。着色された
水分散型高分子粒子をシグナルレポーターとして用いた
場合、それが直接的に発する色として、目視または機器
〔たとえば、クロマトスキャナー（スキャニングデンシ
トメータ）〕により迅速、簡便にシグナルを検出するこ
とができる。目視確認の容易性の観点からは、青色、赤
色、緑色またはオレンジ色等に着色された水分散型高分
子粒子が好ましく、分散安定性や被検物質の検出感度の
調整の容易性などの観点から、青色または赤色に着色さ
れたものがより好ましい。

【００３７】本発明においては、市販されている種々の
着色された水分散型高分子粒子も好適に使用することが
できる。市販されている水分散型高分子粒子としては、
たとえば、ｐ−クロロスチレンの単独重合体または共重
合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アク
リロニトリル−ブタジエン共重合体などの、スチレンま
たはその誘導体を単量体成分として含んでなる単独重合
体または共重合体を挙げることができる。また、（メ
タ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導
体からなる単独重合体や、これらと（メタ）アクリル酸
メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メ
タ）アクリレート等との共重合体も本発明において用い
られる。さらに、スチレンまたはその誘導体と、（メ
タ）アクリル酸エステルまたはその誘導体との共重合体
も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、
微結晶質セルロース等を用いてもよい。

【００３８】なお、本発明の水分散型高分子粒子として
は、前記するような単独重合体または共重合体の１種か
らなるものであっても、２種以上からなるものであって
もよい。

【００３９】水分散型高分子粒子は、その使用時や保存
時に融着や凝集を起こさないものが好ましい。従って、
当該粒子としては所望のガラス転移点を有するように選
択された単量体から構成されたものがよい。当該ガラス
転移点としては、好ましくは１０℃以上、より好ましく
は室温（１５℃）以上である。ガラス転移点は、たとえ
ば、示差走査熱量計で測定できる。

【００４０】このような水分散型高分子粒子の粒径（平
均粒径）は、分散性や吸水性基材内での展開性維持の観
点から、また核酸やリガンド等の固定化性の観点から、
好ましくは３μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下であ
り、核酸やリガンド等を固定する際の精製の容易性の観
点から、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは
０．１μｍ以上である。すなわち、水分散型高分子粒子
の粒径としては、好ましくは０．０１〜３μｍ、より好
ましくは０．１〜２μｍである。なお、当該粒径は、金
属コロイド粒子と同様の方法により測定できる。

【００４１】シグナルレポーターとして酵素を用いる場
合、シグナルは、その基質に対する当該酵素の作用によ
り生ずる産物から発せられる。本発明に用いうる酵素と
して好適には、公知の酵素免疫測定法において標識とし
て常用される酵素を挙げることができる。たとえば、ペ
ルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙
げられる。中でも、より高感度で安定な検出を達成する
観点から、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼが好ましい。

【００４２】また、当該酵素の基質としては、酵素反応
産物の検出が可能であれば特に限定されるものではない
が、迅速、簡便に当該産物の検出を行いうる観点から発
色性基質が好ましい。かかる発色性基質は、使用する酵
素に応じ、公知の酵素免疫測定法において用いられる発
色性基質から適宜選択することができる。

【００４３】発色性基質としては、たとえば、酵素がペ
ルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼと過酸化水素
との組み合わせにより反応して発色しうる基質であれば
よく、たとえば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチル
ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジ
ン（以下、ＴＭＢという) 、ｏ−ジアニジジン、３，
３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等が挙げら
れ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢが好まし
い。

【００４４】本発明においては、基質は溶液状態で、た
とえば、酵素基質液として用いるのが好適である。酵素
基質液としては、前記発色性基質を、たとえば、水、ホ
ウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等に溶解してなるものが好適
である。また、当該基質液には適切な酵素反応を行う上
で好適な、その他の成分（たとえば、過酸化水素等）を
所望により含有させてもよい。

【００４５】また、シグナルレポーターとして使用しう
る蛍光色素としては、フルオレセイン、テトラメチルロ
ーダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。

【００４６】標識複合体は前記のようなシグナルレポー
ターと競合プローブとを直接的にまたは間接的に結合す
ることにより得られる。間接的に結合させる場合とは、
たとえば、シグナルレポーターと競合プローブとの結合
を任意の物質を介して行うような場合をいう。たとえ
ば、シグナルレポーターとして酵素を使用する場合、た
とえば、前記水分散型高分子粒子を介して酵素と競合プ
ローブとを結合することにより標識複合体を得てもよ
い。

【００４７】シグナルレポーターは競合プローブの５’
末端、３’末端および配列内部の少なくとも１つに直接
的にまたは間接的に結合させればよい。両者は必ずしも
１対１で結合させる必要はなく、たとえば、１つの競合
プローブに対し複数のシグナルレポーターを直接的にま
たは間接的に結合させてもよい。

【００４８】標識複合体の調製は以下に示すようにして
行う。たとえば、シグナルレポーターと競合プローブと
の結合は、任意の物質間の結合方法として一般に公知で
ある、共有結合、物理的吸着もしくはイオン結合を利用
する方法を用いて好適に行うことができる。結合安定性
の観点から、共有結合を利用する方法を採用するのが好
ましい。

【００４９】たとえば、シグナルレポーター等に存在す
る官能基やイオン性基を介して直接結合する、または水
溶性カルボジイミドや他の炭素数ｌ〜１２の炭素鎖基を
有する二官能性の有機化合物をスペーサーとして介在さ
せて結合する。また、競合プローブを調製する際に任意
のラジオアイソトープにより標識化した核酸塩基を構成
成分として用い、競合プローブの調製と同時に標識化を
行なって標識複合体を調製してもよい。

【００５０】さらに、たとえば、リガンドをシグナルレ
ポーターに結合しておき、一方、当該リガンドに結合し
うる化合物（以下、リガンド結合化合物という）を競合
プローブに結合し、当該リガンドとリガンド結合化合物
との結合を利用して両者を結合させることも可能であ
る。かかるリガンド−リガンド結合化合物の組み合わせ
の好適な例としては、ビオチン−アビジン、ビオチン−
ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−抗Ｄ
ＩＧ抗体、ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体等が挙げられる。
中でも、ビオチン−ストレプトアビジン、ＤＩＧ−抗Ｄ
ＩＧ抗体の組み合わせは、それらが結合して形成される
複合体の安定性が高く、より好適に用いられる。たとえ
ば、シグナルレポーターとして酵素を用いる場合、なん
らかのスペーサーを介在させることにより標識複合体に
おける自由度を高めることができ、酵素反応の効率を高
める観点から好ましい。

【００５１】また、たとえば、前記水分散型高分子粒子
を介してシグナルレポーターと競合プローブとを結合す
る場合、たとえば、（シグナルレポーター）−（水分散
型高分子粒子）−（競合プローブ）の形を有する標識複
合体を得る場合、当該標識複合体はシグナルレポーター
と水分散型高分子粒子との間および水分散型高分子粒子
と競合プローブとの間を、前記するようにして結合する
ことにより調製することができる。

【００５２】標識複合体は、競合プローブをシグナルレ
ポーターへ結合させた後、たとえば、膜分離法や濾過、
遠心分離法等の慣用の分離法によって、たとえば、結合
を行った反応場である溶媒等から分離精製することによ
り得られる。標識複合体は、たとえば、水中に浸漬し
て、または凍結乾燥して保存すればよい。また、本発明
の検出方法において使用する場合には、得られた標識複
合体を、たとえば、水、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等
に分散または溶解しておくのが好適である。

【００５３】シグナルレポーターとして着色粒子や蛍光
色素を用いた場合は、固定相において、それらが発する
色や蛍光をシグナルとして、たとえば、目視により検出
する。ラジオアイソトープを用いた場合は、たとえば、
オートラジオグラフィにより固定相における放射能の存
在をシグナルとして検出する。

【００５４】シグナルレポーターに酵素を用いた場合
は、本発明の検出方法の工程（ｂ）において、工程
（ａ）で得られた混合物を吸水性基材上に導入した後、
さらに酵素基質液を本発明の所望の効果の発現が得られ
るように導入する。当該酵素基質液の導入位置は前記混
合物の導入位置と同一であっても、異なっていてもよ
い。

【００５５】酵素反応に要する時間は、酵素基質液の展
開時間を含め、酵素基質液を導入してから好ましくは１
〜２０分間程度である。ただし、当該時間は酵素、基
質、反応条件等に依存するため、特に限定されるもので
はない。たとえば、本発明の好適な態様において、発色
性基質を用いた場合、吸水性基材上の固定相においてシ
グナルとして検出される色は、固定相において捕捉され
た標識複合体中のシグナルレポーターの酵素の作用によ
り基質から生じた発色性産物に由来する。

【００５６】本発明の検出方法においては、展開対象成
分は、吸水性基材上でストリンジェントな条件下に展開
される。従って、展開対象成分は、当該条件に適合する
組成を有する、好ましくは水系の分散液または溶液とし
て吸水性基材上に導入する。「条件に適合する組成」と
は、捕捉プローブと競合プローブまたは被検試料中の標
的核酸とがハイブリダイズ可能な組成をいい、用いる核
酸のＴｍ値や反応環境の温度等に応じて適宜選択すれば
よい。かかる組成や温度の条件については、前記成書等
で詳述されている。

【００５７】たとえば、前記被検試料や標識複合体の分
散液や溶液、酵素基質液を、予め作製しておいた上記組
成を有する緩衝液（ハイブリダイゼーションバッファ
ー）の濃縮液および所望により水で希釈し、所望の組成
に調整した後に吸水性基材上に導入する。また、被検試
料等は当初よりハイブリダイゼーションバッファーの組
成を有するように調製しておいてもよい。なお、対照試
料としては水（たとえば、脱イオン水、蒸留水等）を用
いればよい。

【００５８】展開は、標識複合体と被検試料との混合物
を導入後、好ましくは１〜１０分間程度行えばよい。ま
た、該混合物の導入後、非特異的な核酸の吸着を洗い流
す目的で洗浄液を導入してもよい。当該洗浄液としては
前記ハイブリダイゼーションバッファーが好適である。

【００５９】本発明に用いられる吸水性基材としては、
水性の液体を吸収可能な性質を有する基材であれば特に
限定されるものではない。本発明においては、展開対象
成分が速やかに展開できるような適度な吸水性を有する
吸水性基材が好ましい。かかる吸水性基材の具体例とし
ては、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフ
ィルター、ニトロセルロース、多孔質膜等が挙げられ
る。

【００６０】吸水性基材の吸水性の程度は、たとえば、
厚さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×長さ１００ｍｍの吸水性基材の
片端部を水に１分間浸漬した場合に、水に浸漬された部
分と浸漬されない部分との境界位置からの吸水距離が
０．５〜５ｃｍであるのが好ましい。また、吸水性の程
度は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース等の親水性
重合体を、たとえば、吸水性基材の表面に被覆する、も
しくは吸水性基材に含浸させることにより適宜調整する
こともできる。

【００６１】吸水性基材の形状は、前記混合物等を展開
できる形状であれば特に限定されるものではなく、たと
えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等の形状が好
ましい。

【００６２】吸水性基材上の固定相は、標的核酸および
競合プローブに対して結合性を有する、すなわち、スト
リンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な捕捉プロ
ーブを吸水性基材上に直接的にまたは間接的に固定化す
ることにより形成する。当該捕捉プローブは標的核酸お
よび競合プローブの塩基配列に相補的な塩基配列を有す
る。ここで「相補的」とは、捕捉プローブの塩基配列が
標的核酸および競合プローブの塩基配列の相補鎖を正確
に反映している必要はないが、ストリンジェントな条件
下で標的核酸および競合プローブにハイブリダイズでき
る程度には当該相補鎖に充分に類似していることをい
う。当該類似の程度としては、好ましくは８０％以上、
より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以
上である。なお、「類似の程度」は前記「配列同一性」
の算出法に準じて評価することができる。

【００６３】当該捕捉プローブとしては、核酸、修飾核
酸、核酸アナログ等からなるものが挙げられる。捕捉プ
ローブは一本鎖または二本鎖の核酸でありうるが、一本
鎖の核酸であるのが好ましい。また、その塩基数として
は少なくとも５塩基長程度であり、好ましくは５〜１０
０塩基長、より好ましくは１５〜５０塩基長であるが、
数千塩基長であってもよい。

【００６４】前記修飾核酸、核酸アナログとしては前記
のものを挙げることができる。捕捉プローブは、所望の
性質を有するように、前記競合プローブの場合と同様に
して公知の方法に従って適宜作製することができる。

【００６５】固定相は、吸水性基材上の所望の位置に、
捕捉プローブを、ディスペンサー等を用いてライン状に
直接塗布し、またピペット等を用いて円形状に直接スポ
ットし、固定化して形成してもよいが、展開対象成分の
展開方向に対し垂直となる方向の当該吸水性基材の幅と
同様の幅で形成されるのが好ましい。また、吸水性基材
上の固定相の占有面積は吸水性基材の面積に対し百分率
で０．５〜３％であるのが好ましい。

【００６６】吸水性基材上への捕捉プローブの直接の固
定化は、標識複合体の作製においてシグナルレポーター
と競合プローブとを結合するための前記方法に準じて適
宜行うことができる。また、たとえば、簡便に、捕捉プ
ローブを吸水性基材上に直接塗布し、たとえば、１２０
℃で３０分間程度、オーブン中に維持して加熱処理する
ことにより固定化することもできる。

【００６７】捕捉プローブを吸水性基材上に間接的に固
定化して固定相を形成する場合、たとえば、捕捉プロー
ブをガラス繊維等からなるパッドに、捕捉プローブを吸
水性基材上に直接固定化する場合と同様にして固定化
し、得られたパッドを吸水性基材上に、たとえば、接着
することにより貼り合わせ、固定相とするのが好適であ
る。また、当該接着を任意の方法により着脱可能に行え
ば、固定相に捕捉された標的核酸を回収して使用するよ
うな場合に好適である。

【００６８】固定相としては、被検試料中の標的核酸の
含有量が微量であっても、対照試料の場合とのシグナル
の差を検出できる程度に標識複合体を捕捉しうる量で捕
捉プローブが固定化されてなるものが好ましい。固定相
における捕捉プローブの固定化量は、使用する競合プロ
ーブ量との関係において適宜決定され得、一概には決定
できないが、通常、捕捉プローブを好ましくは１〜１０
０ｎｇ／ｃｍ²の範囲で均一に固定化して固定相を形成
するのが好ましい。

【００６９】なお、固定相を形成した吸水性基材は、標
的核酸以外の核酸の当該基材上への非特異的な吸着の防
止、展開の容易性、ならびに固定化した捕捉プローブの
保存安定性の観点から、公知の方法に従ってブロッキン
グ剤、界面活性剤および糖を含有する溶液（以下、処理
液という）に浸漬し、乾燥して用いるのが好ましい。こ
こで、使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アル
ブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン等の吸水性基材に
対し吸着性を有するタンパク質が挙げられる。界面活性
剤としては、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル等が挙げられる。糖としては、サッカロース、ト
レハロース等が挙げられる。なお、前記処理液中のブロ
ッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％
である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好まし
くは０．０１〜１重量％である。前記処理液中の糖の含
有量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。また、
上記操作の実施は、吸水性基材に対し固定相を形成した
後であれば、本発明の所望の効果の発現が阻害されない
限り、本発明の検出方法における使用前において任意に
行うことができる。

【００７０】さらに、吸水性基材には、前記固定相に加
え、滴下パッド部（展開対象成分を滴下するための部
分) 、および／または固定相を挟んで展開対象成分を導
入するための部分とは反対側に、当該展開対象成分の吸
水性基材上における展開を、その水性液体の吸収力によ
り促進させうる手段である吸水パッド部等を設けてもよ
い。滴下パッド部は、たとえば、ポリエステルやレーヨ
ン製の不織布等を所望の形状にて吸水性基材上の所望の
位置に貼り合わせることにより適宜作製できる。また、
吸水パッド部に使用する吸水パッドとしては水性液体の
吸収性に優れる材料が好適であり、たとえば、ガラス繊
維性不織布等を使用することができる。

【００７１】なお、滴下パッド部は、吸水性基材上で、
前記するような所望の展開移動距離が確保できる位置に
設けられるのが望ましい。

【００７２】たとえば、本発明に使用する吸水性基材の
一例として、図１に示す吸水性基材を挙げることができ
る。吸水性基材の大きさは本発明の所望の効果の発現が
得られれば特に限定されるものではないが、たとえば、
３〜１０ｍｍ×４０〜８０ｍｍ程度の大きさを有する。

【００７３】図１に示す吸水性基材は、滴下パッド１、
吸水性基材２、吸水パッド３および固定相４からなる。
滴下パッド１と固定相４との間には、前記好ましい範囲
にある展開移動距離を確保しうる距離が存在する。

【００７４】たとえば、当該吸水性基材を用いて本発明
の検出方法を実施する場合、被検試料と標識複合体との
混合物をピペット等を用いて滴下パッド１に滴下する。
滴下された混合物は、吸水性基材２上で図の右から左へ
延びた矢印の向きに展開され、一定時間後、固定相４に
到達する。固定相４では、捕捉プローブに対して標的核
酸と標識複合体中の競合プローブとが競合的にハイブリ
ダイズする。被検試料に標的核酸が全く含まれない場合
（対照試料を用いた場合）には、固定相４では捕捉プロ
ーブに標識複合体の競合プローブのみがハイブリダイズ
し、ライン状や円形状など、捕捉プローブを固定化した
際の形状となって標識複合体が捕捉される。一方、被検
試料中に標的核酸が含まれる場合は、捕捉プローブと標
的核酸または標識複合体の競合プローブとが競合的にハ
イブリダイズするので、結果として固定相４における標
識複合体の捕捉量が減少する（捕捉されなかった標識複
合体は吸水パッド３まで流れて行く）。さらに所望によ
り洗浄液を滴下パッド１に滴下して展開し、吸水性基材
２上を洗浄する。この時点で、シグナルレポーターが前
述の着色粒子の場合、固定相４に標識複合体が捕捉され
ておれば、捕捉が生じた位置が呈色し、色としてシグナ
ルが検出される。シグナルレポーターが酵素の場合は、
たとえば、該酵素の作用により発色の得られる発色性基
質を滴下パッド１からさらに展開すれば、固定相４が同
様に呈色し、色としてシグナルが検出される。対照試料
の場合と被検試料の場合で、シグナルの検出レベルを比
較し、被検試料の場合に当該検出レベルが低下しておれ
ば、被検試料中に標的核酸が存在すると判定する。な
お、本発明の検出方法は、シグナルの検出レベルの差を
目視観察により捉えうる条件で実施するのが好適である
が、当該差を捉えることが目視観察によっては困難であ
る場合、たとえば、シグナルが色であれば、前記クロマ
トスキャナー等を用いて当該差を捉えるのが好適であ
る。

【００７５】さらに本発明の別の態様として、本発明の
検出方法において有用な標的核酸の検出用キットを提供
する。当該キットとしては、前記固定相を有する吸水性
基材および標識複合体を含んでなるものを挙げることが
できる。さらに、当該キットには、任意にその他の構成
物、たとえば、被検試料を入手する手段や、酵素基質
液、ハイブリダイゼーションバッファー等の適当な試
薬、本発明の検出方法を実施するための説明書等を含め
てもよい。

【００７６】本発明の検出方法によれば、任意の被検試
料等を、本発明において使用する固定相を有する吸水性
基材上に、たとえば、滴下するだけで、たとえば、食中
毒の原因菌による食品の汚染の判定、疾患の病因または
病状の診断、生物の遺伝子型タイピング等を迅速、簡便
に行うことができる。

【００７７】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、さらに具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定さ
れるものではない。

【００７８】製造例１：サルモネラ属細菌ｒＲＮＡ検出
用クロマトグラフ型試験片の作製本製造例では、サルモネラ属細菌のｒＲＮＡ（標的核
酸：サルモネラ属細菌２３ＳｒＲＮＡ）を検出するため
のクロマトグラフ型試験片を以下に示す方法で作製し
た。なお、本明細書において「上流」とは、後述の滴下
パッドが配置される、吸水性基材の末端側を意味する。
また、得られた試験片の構成は図１に示す吸水性基材と
同様である。

【００７９】吸水性基材の材料としてナイロン６６メン
ブレン（孔径５μｍ、６ｍｍ×４０ｍｍ、ＰＡＬＬ製）
を用いた。この上流端から２２．５ｍｍの箇所に、ディ
スペンサーを用いて下記の配列番号：１記載の塩基配列
からなる捕捉プローブ（１０ｐｍｏｌ／μＬ、滅菌脱イ
オン水に溶解）１．５μＬをライン状に塗布した。捕捉
プローブはサルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡの塩基配
列に相補的な塩基配列を有する。風乾の後、１２０℃で
３０分間、加熱処理して、捕捉プローブをメンブレンに
固定化し、固定相を形成した。固定化後、１重量％ウシ
血清アルブミン（オリエンタル酵母製）、１重量％サッ
カロース（和光純薬製）、０．１重量％ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート（和光純薬製）にメンブ
レンを浸漬してブロッキングし、室温で乾燥させた。

【００８０】吸水性基材の上流端より３ｍｍのところか
ら、ポリエステル製不織布ハイボン４８８０Ｃ（厚さ
２．５ｍｍ、大きさ７×１２ｍｍ、シンワ製）を貼り合
わせて滴下パッドを設置した。

【００８１】さらに、吸水性基材の下流端より５〜１０
ｍｍのところから吸水パッドとしてガラス繊維製の吸水
材（１５ｍｍ×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ
製）を貼り合わせ、試験片を作製した。当該試験片を１
００個作製して、以降の検出に用いた。配列番号：１５’−ＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＴＧ
ＴＣＡＧＣ−３’

【００８２】製造例２：サルモネラ属細菌ｒＲＮＡ検出
用標識複合体の調製着色ラテックス粒子（粒径０．１８μｍ、日東電工製）
の水分散液に水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．
２、同仁化学研究所製）０．５ｍＬ、ストレプトアビジ
ン（１ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．
２、ロシュ・ダイアグノスティックス製）２ｍＬを加え
て１０℃で３時間反応させた後、洗浄液として０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２を加えて遠心分離して洗浄
を行い、同緩衝液で固形分濃度５重量％に調整した。な
お、以下の記述ではストレプトアビジンをＳＡと略す。
得られたＳＡ固定化着色ラテックス懸濁液を固形分が終
濃度０．１重量％となるよう前記ホウ酸緩衝液で希釈
し、ここに終濃度５０ｐｍｏｌ／ｍＬの５’末端を公知
の方法によりビオチン標識した下記の配列番号：２記載
の塩基配列からなる競合プローブを添加して穏やかに攪
拌しながら１０℃で３時間反応させ、標識複合体を調製
した。洗浄液としてホウ酸緩衝液を加え、遠心分離して
洗浄を行い、同緩衝液で固形分濃度５重量％に調整し
た。なお、競合プローブは前述の捕捉プローブに相補的
な塩基配列を有し、サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡ
に対して結合性を有しない核酸プローブである。配列番号：２５’−ＧＣＴＧＡＣＡＣＧＴＡＧＧ
ＴＧＡＡＧ−３’

【００８３】製造例３：被検試料の調製表１に示したサルモネラ属細菌および非サルモネラ属細
菌を５ｍＬのニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅ
ｎｔＢｒｏｔｈ）（商品名、日水製薬製の粉末培地を
用いて調製）中にて３７℃、一晩培養して得た培養液か
ら、ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン製）を用
い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出し、滅菌
脱イオン水に溶解して被検試料とした。得られたＲＮＡ
はＯ．Ｄ．２６０の値をもとに１μｇ／μＬとなるよう
適宜希釈した（１Ｏ．Ｄ．２６０＝０．０４μｇ／μＬ
換算）。

【００８４】

【表１】

【００８５】実施例１：クロマトグラフ方式によるサル
モネラ属細菌ｒＲＮＡの存在の特異的検出製造例２および３にて調製した標識複合体と被検試料と
を混合し、以下の組成を有する展開用組成液を調製し
た。対照試料は滅菌脱イオン水とした。

【００８６】〔展開用組成液の組成〕２×ＳＳＣ５０％（w/v）ホルムアミド１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ０．１％（w/v）ＳＤＳ０．０１重量％標識複合体ＲＮＡ

【００８７】なお、２×ＳＳＣは３３．３ｍＭＮａＣ
ｌ、３３．３ｍＭクエン酸ナトリウムからなり、ＲＮ
Ａの濃度条件を０（対照試料）、０．１、１μｇ／ｍＬ
の３種として実験を行った。

【００８８】３７℃に保温した該展開用組成液を、製造
例１で作製した試験片の滴下パッドに１００μＬ滴下し
た。１０分間の展開後、固定相における発色の有無を目
視で観察した。その結果を表２に示す。なお、表２にお
ける判定基準は以下の通りである。

【００８９】〔判定基準〕＋：ラテックス由来の着色あり ±：ラテックス由来の薄い着色あり −：着色なし

【００９０】

【表２】

【００９１】表２に示すように、展開用組成液にサルモ
ネラ属細菌ＲＮＡが含まれない場合、またサルモネラ属
細菌以外の細菌のＲＮＡが含まれる場合には、標識複合
体のみが、その競合プローブと固定相の捕捉プローブと
のハイブリダイゼーションを介して固定相に捕捉される
と考えられ、固定相で着色ラテックス粒子の色としてシ
グナルが検出された。一方、サルモネラ属細菌のＲＮＡ
を１μｇ／ｍＬの濃度で含む展開用組成液を展開させた
場合、固定相で当該シグナルは検出されなかった。これ
はサルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡと競合プローブと
が競合的に捕捉プローブとハイブリダイズしたために、
固定相における標識複合体の捕捉量が減少し、結果とし
て着色ラテックス粒子由来のシグナルが検出されなくな
ったことに起因すると思われる。また展開用組成液中の
サルモネラ属細菌のＲＮＡを０．１μｇ／ｍＬとした場
合には、固定相にて弱いシグナルが検出された。これは
競合プローブと競合するサルモネラ属細菌の２３ＳｒＲ
ＮＡ量が減少したために、一部の標識複合体が固定相に
て捕捉されたためと考えられる。いずれにしても、対照
試料の場合と比べて、標的核酸であるサルモネラ属細菌
２３ＳｒＲＮＡが含まれるサルモネラ属細菌ＲＮＡを含
む被検試料では固定相においてシグナルが低く検出され
たことから、本発明の検出方法により、被検試料中の標
的核酸の存在を検出できることが分かる。

【００９２】これらの反応は展開用組成液を滴下するだ
けの操作で進行し、約１０分間で結果を得ることができ
た。一般的なハイブリダイゼーション法が洗浄や発色等
の煩雑な操作と１〜２日間程度の時間を必要とするのに
対して、本発明の検出方法ではクロマトグラフ方式を採
用することにより、展開用組成液の滴下のみで操作を完
結させることができる。従って、本発明は、被検試料中
の標的核酸の迅速かつ簡便な検出方法として有効である
ことは明らかである。

【００９３】配列表フリーテキスト配列番号：１は、サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡの
塩基配列に基づいてデザインしたプローブの配列であ
る。

【００９４】配列番号：２は、サルモネラ属細菌の２３
ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づいてデザインしたプローブ
の配列である。

【００９５】

【発明の効果】本発明により、従来のハイブリダイゼー
ション法に比べて非常に操作性に優れた、迅速かつ簡便
に被検試料中の標的核酸の存在を検出することができる
標的核酸の検出方法、ならびに当該検出方法に好適に使
用される標的核酸の検出用キットが提供される。本発明
の検出方法によれば、たとえば、食中毒の原因菌による
食品の汚染の判定、疾患の病因または病状の診断、生物
の遺伝子型タイピング等を迅速、簡便に行うことができ
る。

【００９６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> Method of detecting target gene <130> ND-14-010 <150> JP 2001-401187 <151> 2001-12-28 <160> 2

【００９７】 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe based on nucleotide sequence of Salmonella 23SrRNA. <400> 1 cttcacctac gtgtcagc 18

【００９８】 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe based on nucleotide sequence of Salmonella 23SrRNA. <400> 2 gctgacacgt aggtgaag 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に使用する、固定相を有する吸
水性基材の一例を示す模式図である。

【符号の説明】１滴下パッド２吸水性基材３吸水パッド４固定相

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ (72)発明者浅井量子大阪府茨木市下穂積１−１−２日東電工株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB04 FB07 4B063 QA01 QA18 QQ54 QR32 QR56 QR66 QR82 QS03 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸との結合性を有する捕捉プロー
ブと、標的核酸とは結合性を有しないが、該捕捉プロー
ブとは結合性を有する競合プローブとを用いる標的核酸
の検出方法であって、（ａ）該競合プローブとシグナル
レポーターとを有する標識複合体と、被検試料とを混合
する工程、（ｂ）該捕捉プローブを固定化してなる固定
相を有する吸水性基材上に、工程（ａ）で得られた混合
物を導入する工程、（ｃ）ストリンジェントな条件下、
吸水性基材上で該混合物を展開する工程、ならびに
（ｄ）固定相において該シグナルレポーターからのシグ
ナルを検出する工程、を含み、標的核酸を含まない対照
試料の場合と比べて、固定相において該シグナルが低く
検出される場合に被検試料中に標的核酸が含まれると判
定する、標的核酸の検出方法。
【請求項２】シグナルレポーターが着色粒子、酵素ま
たは蛍光色素である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】標的核酸が一本鎖核酸である請求項１ま
たは２記載の検出方法。
【請求項４】一本鎖核酸がリボソームＲＮＡである請
求項３記載の検出方法。
【請求項５】リボソームＲＮＡがサルモネラ菌または
リステリア菌由来のものである請求項４記載の検出方
法。
【請求項６】請求項１に記載の標識複合体と吸水性基
材とを含んでなる標的核酸の検出用キット。