JP2003304880A

JP2003304880A - 標的核酸の検出方法

Info

Publication number: JP2003304880A
Application number: JP2002115307A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Tanaka; 康進田中; Keisaku Okada; 圭策岡田; Riyouko Asai; 量子浅井
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-10-28

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】従来のハイブリダイゼーション法に比べて、迅
速かつ簡便に被検試料中の標的核酸の存在を検出できる
標的核酸の検出方法、それに好適な標的核酸の検出用試
験片ならびに標的核酸の検出用キットを提供すること。【解決手段】共に標的核酸と結合するが、互いに結合性
しない、検出プローブと捕捉プローブとを用い、（ａ）
該検出プローブとシグナルレポーターとを有する標識複
合体と、被検試料との混合、（ｂ）該捕捉プローブをリ
ガンドとリガンド結合性化合物との結合を介して固定化
してなる固定相を有する吸水性基材上への、（ａ）で得
られた混合物の導入、（ｃ）ストリンジェントな条件下
の吸水性基材上での該混合物の展開、（ｄ）固定相にお
ける該シグナルレポーターからのシグナルの検出、の工
程を含む標的核酸の検出方法；上記の吸水性基材からな
る標的核酸の検出用試験片；ならびに前記標識複合体と
前記試験片とを含んでなる標的核酸の検出用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の検出方
法、標的核酸の検出用試験片ならびに標的核酸の検出用
キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっているサルモネラ菌をは
じめとする病原性微生物などの、食品中や患者からの検
出には、多くの日数、煩雑な操作を要する場合が多い。
また、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。

【０００３】これらの検出や診断には、標識化免疫測定
法などの種々の免疫測定法（イムノアッセイ）が用いら
れ、最近では免疫クロマトグラフ方式による、迅速・簡
便な検査も広く行われている。このような測定法では、
検査対象となる微生物に対する抗体が必要不可欠であ
る。しかしながら、微生物によっては種レベルではな
く、属レベルでの検出が要求されるため、様々な血清型
を有する細菌が検出対象となりうる。このような場合に
は種々の抗原に対する抗体が必要となるため、抗体の確
保に多大な労力と費用が求められる。

【０００４】そこで近年では、ＤＮＡプローブなどを用
いたハイブリダイゼーション法が用いられるようになっ
てきた。たとえば、特定の微生物を検出するための方法
においては、細菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を標
的としてハイブリダイゼーションが行われる。細菌のｒ
ＲＮＡの塩基配列は細菌の系統進化を反映している観点
から、その有効性が広く世に知られている〔DeLong E.
F.ら、Science 243:1360-1363(1989)〕。従って、かか
る方法は、特定の微生物を検出する方法として優れたも
のである。しかしながら、通常のハイブリダイゼーショ
ン法にはブロッティング、ハイブリダイゼーション、洗
浄、発色などの手順が含まれており、任意の試料をブロ
ットしたメンブレンをプラスチック製のバッグに密封し
て加熱したり、洗浄を繰り返したりする必要があり、操
作性の点では優れているとは言いがたい。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のハイ
ブリダイゼーション法に比べて非常に操作性に優れた、
迅速かつ簡便に被検試料中の標的核酸の存在を検出する
ことができる標的核酸の検出方法、当該検出方法に好適
に使用される標的核酸の検出用試験片ならびに標的核酸
の検出用キットを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、〔１〕共に標的核酸と結合性を有するが、互いに
結合性を有しない、検出プローブと捕捉プローブとを用
いる標的核酸の検出方法であって、（ａ）該検出プロー
ブとシグナルレポーターとを有する標識複合体と、被検
試料とを混合する工程、（ｂ）該捕捉プローブをリガン
ドとリガンド結合性化合物との結合を介して固定化して
なる固定相を有する吸水性基材上に、工程（ａ）で得ら
れた混合物を導入する工程、（ｃ）ストリンジェントな
条件下、吸水性基材上で該混合物を展開する工程、なら
びに（ｄ）固定相において該シグナルレポーターからの
シグナルを検出する工程、を含み、固定相において該シ
グナルが検出される場合に被検試料中に標的核酸が含ま
れると判定する、標的核酸の検出方法、〔２〕共に標
的核酸と結合性を有するが、互いに結合性を有しない、
検出プローブと捕捉プローブとを用いる標的核酸の検出
方法であって、（ａ）リガンドを有する該検出プローブ
と被検試料とを混合する工程、（ｂ）該捕捉プローブを
リガンドとリガンド結合性化合物との結合を介して固定
化してなる固定相を有する吸水性基材上に、工程（ａ）
で得られた混合物を導入する工程、（ｃ）前記吸水性基
材上に、検出プローブのリガンドに対応するリガンド結
合性化合物を有するシグナルレポーターを導入する工
程、（ｄ）ストリンジェントな条件下、吸水性基材上で
該混合物および該シグナルレポーターを展開する工程、
ならびに（ｅ）固定相において該シグナルレポーターか
らのシグナルを検出する工程、を含み、固定相において
該シグナルが検出される場合に被検試料中に標的核酸が
含まれると判定する、標的核酸の検出方法、〔３〕捕
捉プローブをリガンドとリガンド結合性化合物との結合
を介して固定化してなる固定相を有する吸水性基材から
なる標的核酸の検出用試験片、〔４〕前記〔１〕に記
載の標識複合体と前記〔３〕に記載の試験片とを含んで
なる標的核酸の検出用キット、ならびに〔５〕前記
〔２〕に記載の検出プローブとシグナルレポーター、な
らびに前記〔３〕に記載の試験片を含んでなる標的核酸
の検出用キット、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の標的核酸の検出方法（以
下、検出方法という）は、従来のハイブリダイゼーショ
ン法による被検試料中の標的核酸の検出をクロマトグラ
フ方式にて行うことを１つの大きな特徴とする。従っ
て、本発明によれば、従来のハイブリダイゼーション法
の煩雑な操作を行うことなく、本発明において使用する
吸水性基材の上に被検試料や試薬等を導入（たとえば、
滴下）するだけで、迅速かつ簡便に被検試料中の標的核
酸の存在を検出することができる。

【０００８】本発明の検出方法では、共に標的核酸と結
合性を有するが、互いに結合性を有しない、検出プロー
ブと捕捉プローブとを用いる。なお、本明細書において
「結合性を有する」とは、ストリンジェントな条件下に
互いにハイブリダイズ可能であることを意味し、「結合
性を有しない」とは、ストリンジェントな条件下に互い
にハイブリダイズしないことを意味する。

【０００９】被検試料中の標的核酸の検出は、予め互い
に接触させることにより形成させた検出プローブと標的
核酸とからなる核酸ハイブリッドを、捕捉プローブと該
標的核酸とのハイブリダイゼーションを介して吸水性基
材上の固定相にて捕捉し、該検出プローブに結合させた
シグナルレポーターからのシグナルを検出して捕捉され
た標的核酸の存在を確認することにより行う。標的核酸
が被検試料中に含まれない場合には前記核酸ハイブリッ
ドは形成されず、その固定相での捕捉も生じないため、
前記シグナルは検出されない。このように、本発明の検
出方法では、最終的なシグナルの検出の有無により被検
試料中の標的核酸の存在を判定する。

【００１０】本発明の検出方法には、標的核酸との接触
の工程に使用する検出プローブがシグナルレポーターと
結合したものであるか否かにより、主に２つの態様が存
在する。

【００１１】第１の態様では、シグナルレポーターが直
接的に、もしくは間接的に結合した検出プローブを用い
る。具体的には、当該検出方法は、共に標的核酸と結合
性を有するが、互いに結合性を有しない、検出プローブ
と捕捉プローブとを用いる標的核酸の検出方法であっ
て、（ａ）該検出プローブとシグナルレポーターとを有
する標識複合体と、被検試料とを混合する工程、（ｂ）
該捕捉プローブをリガンドとリガンド結合性化合物との
結合を介して固定化してなる固定相を有する吸水性基材
上に、工程（ａ）で得られた混合物を導入する工程、
（ｃ）ストリンジェントな条件下、吸水性基材上で該混
合物を展開する工程、ならびに（ｄ）固定相において該
シグナルレポーターからのシグナルを検出する工程、を
含むものである。そして、固定相において該シグナルが
検出される場合に被検試料中に標的核酸が含まれると判
定する。

【００１２】第２の態様では、シグナルレポーターが結
合していない検出プローブを用いる。具体的には、当該
検出方法は、共に標的核酸と結合性を有するが、互いに
結合性を有しない、検出プローブと捕捉プローブとを用
いる標的核酸の検出方法であって、（ａ）リガンドを有
する該検出プローブと被検試料とを混合する工程、
（ｂ）該捕捉プローブをリガンドとリガンド結合性化合
物との結合を介して固定化してなる固定相を有する吸水
性基材上に、工程（ａ）で得られた混合物を導入する工
程、（ｃ）前記吸水性基材上に、検出プローブのリガン
ドに対応するリガンド結合性化合物を有するシグナルレ
ポーターを導入する工程、（ｄ）ストリンジェントな条
件下、吸水性基材上で該混合物および該シグナルレポー
ターを展開する工程、ならびに（ｅ）固定相において該
シグナルレポーターからのシグナルを検出する工程、を
含むものである。そして、固定相において該シグナルが
検出される場合に被検試料中に標的核酸が含まれると判
定する。

【００１３】なお、本明細書では、説明の簡略化の観点
から、リガンドおよびリガンド結合性化合物と、その結
合対象等との関係を画一的に記載するが、本発明におい
てはリガンドと当該リガンドに対応するリガンド結合性
化合物とはそれぞれ互いに逆であってもよい。リガンド
結合性化合物とは対応するリガンドに結合しうる化合物
をいう。また、本明細書において「核酸」にはＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）が含ま
れる。当該核酸としては、天然由来の核酸、生物学的方
法および／または化学的方法により作製された核酸、増
幅核酸、組換え核酸等の任意の核酸が含まれる。

【００１４】本発明においては、吸水性基材上に導入さ
れる、該基材上で展開させる成分（以下、展開対象成分
という）を毛細管現象により自然展開させるため、当該
展開対象成分は水を媒体とする溶液や分散液等であるの
が好適である。

【００１５】第１の態様において、たとえば、前記好適
な形態で提供された被検試料と標識複合体とを混合〔工
程（ａ）〕して得られた混合物を吸水性基材上の一端に
導入〔工程（ｂ）〕すると、当該混合物は直ちに吸水性
基材上で展開〔工程（ｃ）〕される。

【００１６】被検試料と標識複合体の混合の割合は、本
発明の所望の効果の発現が得られる限り特に限定される
ものではないが、検出プローブの量が被検試料中の予想
される標的核酸の量とモル単位で同等以上となるように
混合するのが好ましい。また、該混合物の導入は、本発
明の所望の効果が得られるように行われる。たとえば、
導入は滴下等により適宜行えばよく、その際の滴下量も
本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるもので
はない。導入位置は、吸水性基材上、固定相から見て一
方の側であって、所望の展開移動距離が確保できる位置
であるのが望ましい。かかる展開移動距離とは、該混合
物の導入位置から固定相までの距離をいう。当該展開移
動距離としては、好ましくは５〜３５ｍｍ、より好まし
くは１０〜３０ｍｍである。かかる範囲内であれば、シ
グナルの検出感度が良好で、測定時間も適切である。

【００１７】標識複合体に含まれる検出プローブは標的
核酸と結合性を有するため、被検試料中に標的核酸が存
在するとハイブリダイズする。ハイブリダイズに関与し
なかった余剰の検出プローブ（標識複合体）は、標的核
酸がハイブリダイズしたものと共に吸水性基材上で展開
される。標的核酸は捕捉プローブと結合性を有するの
で、固定相において固定化捕捉プローブと接触すると当
該捕捉プローブにハイブリダイズする。その結果、固定
相で標識複合体が捕捉され、固定相では標識複合体の捕
捉の程度に応じてシグナルレポーターからシグナルが発
せられるようになる。

【００１８】被検試料と標識複合体の混合物を展開して
一定時間経過後、固定相においてシグナルレポーターか
らのシグナルを検出〔工程（ｄ）〕する。

【００１９】また、第２の態様において、たとえば、前
記同様に好適な形態で被検試料とリガンドを有する検出
プローブ等が提供された場合、被検試料と該検出プロー
ブとを混合〔工程（ａ）〕して得られた混合物を吸水性
基材上の一端に導入〔工程（ｂ）〕し、次いでリガンド
結合性化合物を有するシグナルレポーターを導入〔工程
（ｃ）〕すると、それらは直ちに吸水性基材上で展開
〔工程（ｄ）〕される。

【００２０】被検試料と検出プローブの混合の割合は、
本発明の所望の効果の発現が得られる限り特に限定され
るものではないが、検出プローブの量が被検試料中の予
想される標的核酸の量とモル単位で同等以上となるよう
に混合するのが好ましい。また、該混合物の導入方法、
導入（滴下）量、および導入位置に関しては、前記第１
の態様と同様でよい。

【００２１】シグナルレポーターの吸水性基材上の導入
位置は、本発明の所望の効果の発現が得られる限り特に
限定はなく、前記混合物の導入位置と同一であっても、
または異なっていてもよい。シグナルレポーターは、本
発明の所望の効果の発現の観点から、検出プローブとモ
ル単位で同等以上の量で導入するのが好ましい。

【００２２】検出プローブは標的核酸と結合性を有する
ため、被検試料中に標的核酸が存在するとハイブリダイ
ズする。ハイブリダイズに関与しなかった余剰の検出プ
ローブは、標的核酸がハイブリダイズしたものと共に吸
水性基材上で展開される。標的核酸は捕捉プローブと結
合性を有するので、固定相において固定化捕捉プローブ
と接触すると、当該捕捉プローブにハイブリダイズし、
その結果、検出プローブが固定相に捕捉されることにな
る。一方、検出プローブとシグナルレポーターとは、リ
ガンドと対応するリガンド結合性化合物との結合を介し
て結合し、検出プローブとシグナルレポーターとを有す
る、いわゆる標識複合体が形成される。それゆえ、固定
相では当該標識複合体の形成の程度に応じてシグナルレ
ポーターからシグナルが発せられるようになる。

【００２３】工程（ｅ）では、展開対象成分である前記
混合物とシグナルレポーターを展開して一定時間経過
後、固定相においてシグナルレポーターからのシグナル
を検出する。

【００２４】被検試料に標的核酸が全く含まれない場
合、固定相では前記標識複合体の捕捉もしくは形成が生
じないので、シグナルレポーターからのシグナルは検出
されない。一方、被検試料に標的核酸が含まれる場合に
は、固定相で前記標識複合体の捕捉もしくは形成が生ず
るので、シグナルレポーターからのシグナルが検出され
ることになる。

【００２５】従って、本発明の検出方法においては、固
定相においてシグナルレポーターからのシグナルが検出
される場合に被検試料中に標的核酸が存在すると判定す
ることができる。

【００２６】本発明において被検試料としては、核酸が
含まれうるものであれば特に限定されるものではない。
被検試料としては、たとえば、食中毒の原因菌（細菌、
たとえば、サルモネラ菌、リステリア菌等）等の特定の
菌種に由来する溶菌液や、各種生物の血液、組織等の細
胞溶解液、ならびにそれらの希釈液等が挙げられる。菌
もしくは細胞の溶解や、得られた溶菌液等の希釈には、
特に限定されるものではないが、水、ホウ酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の水系溶媒を使用するのが好適である。さ
らに、前記溶菌液等に含まれる核酸を鋳型としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた増幅産物をも
被検試料とすることができる。

【００２７】また、標的核酸としては、その配列が既知
のものであれば特に限定されるものではない。たとえ
ば、前記食中毒の原因菌のゲノム上もしくはプラスミド
上に、または各種生物のゲノム上にコードされた特定の
遺伝子領域や、前記原因菌等に含まれるＲＮＡ等を挙げ
ることができる。たとえば、標的核酸が特定の食中毒の
原因菌に固有の塩基配列を有する核酸である場合、本発
明の検出方法により任意の被検試料において当該標的核
酸の存在が確認されれば、当該被検試料の取得源（たと
えば、食品）における当該原因菌の存在が明らかとな
る。かかる標的核酸としては、特定の菌種の属や系統分
類学上の集団に固有の塩基配列が知られている細菌のｒ
ＲＮＡが好適である。また、標的核酸が、特定の疾患の
病因として知られる、もしくは特定の疾患の病状を表わ
すことが知られる、野性型の遺伝子や変異型の遺伝子で
ある場合、被検試料において当該遺伝子の存在が確認さ
れれば、当該被検試料の取得源である生物の疾患の病因
や病状が明らかとなる。さらには、生物の特定の遺伝子
について多型が存在する場合、たとえば、個々の遺伝子
に特徴的な塩基配列を有する遺伝子領域を標的核酸と
し、本発明の検出方法を用いて当該生物由来の被検試料
において当該標的核酸の存在を確認することにより、当
該生物の遺伝子型タイピングを行うことも可能である。

【００２８】本発明の標的核酸の形態としては一本鎖で
あっても二本鎖であってもよいが、一本鎖であるのが好
ましい。たとえば、本発明の標的核酸としては、ＲＮＡ
や公知の方法により任意に合成・増幅して得られた一本
鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸が好適である。かかる一本鎖核
酸としては、たとえば、食品の食中毒の原因菌による汚
染を判定する場合の有用性の観点から、前記細菌のｒＲ
ＮＡが好適であり、中でもサルモネラ菌またはリステリ
ア菌由来のｒＲＮＡがより好適である。被検試料に二本
鎖の核酸が含まれる場合には、本発明の検出方法に供す
る前に、公知のアルカリ処理法や加熱処理法等により、
二本鎖の核酸を予め一本鎖に解離させておくのが好まし
い。

【００２９】本発明の第１の態様において使用される標
識複合体は検出プローブとシグナルレポーターとを有し
てなる。

【００３０】前記検出プローブは、標的核酸の塩基配列
に相補的な塩基配列を有しており、かつ固定相の固定化
捕捉プローブに対し結合性を有しない核酸プローブであ
れば特に限定されない。

【００３１】本明細書において「相補的」とは、プロー
ブ（ここでは、検出プローブ）の塩基配列が標的核酸の
塩基配列の相補鎖を正確に反映している必要はないが、
ストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズ
できる程度には当該相補鎖に充分に類似していることを
いう。当該類似の程度としては、好ましくは８０％以
上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５
％以上である。

【００３２】検出プローブとしては、核酸、修飾核酸、
核酸アナログ等からなるものが挙げられる。検出プロー
ブは一本鎖または二本鎖の核酸でありうるが、一本鎖の
核酸であるのが好ましい。また、その塩基数としては少
なくとも５塩基長程度であり、好ましくは５〜１００塩
基長、より好ましくは１５〜５０塩基長であるが、数千
塩基長であってもよい。

【００３３】前記修飾核酸としては、修飾された糖基、
リン酸基、または修飾塩基を含む核酸が挙げられる。た
とえば、修飾塩基を含む核酸の例としては、たとえば、
アセチル化された塩基（４−アセチルシチジン等）、カ
ルボキシル化された塩基（５−カルボキシメチルアミノ
メチルウリジン等）、またはメチル化された塩基（１−
メチルイノシン等）等を含む核酸が挙げられる。また、
デアザグアニンおよびウラシルを含む核酸をグアニンお
よびチミンを含む核酸の代わりに検出プローブとして用
いてもよい。かかる場合には、ハイブリダイズした際の
検出プローブの熱安定性が低下する。また、５−メチル
シトシンを含む核酸をシトシンを含む核酸の代わりに検
出プローブとして用いてもよい。かかる場合には、ハイ
ブリダイズした際の検出プローブの熱安定性が向上す
る。核酸のホスホジエステル骨格から負電荷を除去する
ような修飾も検出プローブの熱安定性の向上に寄与す
る。また、検出プローブとしてＲＮＡを用いる場合に
は、当該プローブのヌクレアーゼ感受性を低下させる観
点から、２’−Ｏ−メチル基の付加など、リボースの糖
基を修飾するのが好ましい。

【００３４】前記核酸アナログとしては、たとえば、標
準的な核酸塩基が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
単位の繰り返しからなるペプチド様骨格に結合している
ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる〔Nielsen, P. E.
ら、Science, 254:1497〜1500（1991）〕。ＰＮＡはヌ
クレアーゼによる分解に対して非常に抵抗性が強い点で
有用である。

【００３５】標的核酸の塩基配列の相補鎖との検出プロ
ーブの塩基配列の前記「類似の程度」は、該相補鎖と該
検出プローブの塩基配列との間の配列同一性を求めるこ
とにより評価することができる。かかる配列同一性とは
２つの配列間の塩基の配列類似性をいい、２つの適切に
アラインメントされた配列を比較することにより決定す
る。具体的には、両方の配列に存在する同一の塩基を決
定して適合部位の数を決定し、次いで比較対象の配列領
域内の塩基の総数で前記適合部位の数を割り、得られた
数値に１００を乗じて配列同一性（％）を算出する。か
かる配列同一性は、たとえば、ＢＬＡＳＴネットワーク
サービスを利用して適宜求めることが可能である。

【００３６】本明細書においてストリンジェントな条件
としては、非特異的なハイブリダイゼーション反応を有
意に低下させる条件であれば特に限定されない。核酸の
ハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェント
な条件については、たとえば、成書（モレキュラーク
ローニング（Molecular Cloning）第３版、ザンブルー
ク（Sambrook）とラッセル（Russell）著、コールドス
プリングハーバー）等に記載されている。プローブの長
さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間の配列同一
性、温度、およびイオン強度等の要素が、核酸ハイブリ
ッドの安定性に影響する。たとえば、中ストリンジェン
シーまたは高ストリンジェンシー等のストリンジェント
な条件は、標的核酸と検出プローブの特性に応じて、経
験的に決定することができる。

【００３７】上記のような核酸、修飾核酸、核酸アナロ
グ等からなる検出プローブは、所望の性質を有するよう
に公知の方法（たとえば、前記成書参照）に従って適宜
作製することができる。また、任意の配列や修飾を有す
る核酸を合成した市販品を購入することもできる。

【００３８】シグナルレポーターは、当該レポーターに
由来するシグナルを検出可能なものであれば特に限定さ
れるものではない。好ましくは機器もしくは目視によ
り、より好ましくは目視により、当該レポーター由来の
シグナルを容易かつ簡便に検出可能であるものが好適で
ある。

【００３９】かかるシグナルレポーターとしては、たと
えば、着色粒子、酵素、蛍光色素や、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ
等のラジオアイソトープ等が挙げられる。中でも検出容
易性の観点から、着色粒子、酵素、蛍光色素およびラジ
オアイソトープからなる群より選ばれる少なくとも１種
が好ましい。

【００４０】本明細書において着色粒子とは着色された
粒子であって、シグナルを当該粒子から直接的に発せら
れる色として検出しうる粒子をいう。たとえば、当該粒
子としては、金コロイド粒子やセレニウムコロイド粒子
のような金属コロイド粒子や、着色された水分散型高分
子粒子などが挙げられる。水への分散性に優れ、また核
酸や酵素等の固定化容易性の観点から、水分散型高分子
粒子からなるものが好ましい。

【００４１】金属コロイド粒子は入手容易性および安定
性等の観点より、金コロイド粒子が好ましい。また、核
酸やリガンド等の固定化容易性および検出の容易性の観
点から、その粒径（平均粒径）は５〜８０ｎｍが好まし
く、１０〜５０ｎｍがより好ましい。当該粒径は、たと
えば、透過型電子顕微鏡観察下で各粒子の絶対粒径を測
定し、得られた測定値を平均することにより求められ
る。

【００４２】水分散型高分子粒子は、たとえば、公知の
方法に従い、不飽和二重結合を有する単量体の一又は二
以上を乳化重合することによって調製することができ
る。かかる単量体としては、たとえば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニ
ル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、ク
ロロスチレン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル
等の（メタ）アクリル酸エステル系単量体、ブタジエン
等のジエン系単量体等が好適に用いられる。

【００４３】また、本発明に用いられる水分散型高分子
粒子としては、上記単量体の単独重合体や共重合体から
なるものの他、その表面に核酸や酵素等を固定化するた
めのリガンドやスペーサーの導入を目的として、得られ
る粒子に官能基やイオン性基を付与したものでもよく、
また粒子の水性媒体中での分散安定性を高めるなどの目
的で、改質用単量体を共重合してなるものであってもよ
い。

【００４４】そのような官能基やイオン性基としては、
たとえば、カルボキシル基、水酸基、グリシジル基、ア
ミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナ
ート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物
基等を挙げることができ、中でもカルボキシル基が好ま
しい。これらの官能基等を有する水分散型高分子粒子を
調製するには、単量体成分として、たとえば、アクリル
酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有する単量
体、たとえば、ヒドロキシアクリレート、２−ヒドロキ
シエチルアクリレートのような水酸基を有する単量体、
たとえば、グリシジルメタクリレートのようなグリシジ
ル基を有する単量体を、所望により他の共重合性単量体
と乳化重合させることによって、それぞれカルボキシル
基、水酸基およびグリシジル基を有する粒子として得る
ことができる。また所望の単量体成分を重合させた後、
得られた粒子に官能基を導入することもできる。

【００４５】また、前記改質用単量体としては、たとえ
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸
エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ア
クリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホ
プロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジル
メタクリレートなどが用いられる。

【００４６】水分散型高分子粒子の着色は、たとえば、
スダンブルーやスダンレッドＩＶ、スダンＩＩＩ、オイ
ルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔料
や染料、また種々の蛍光色素・顔料を、当該粒子製造時
に任意に添加することで行うことができる。着色された
水分散型高分子粒子をシグナルレポーターとして用いた
場合、それが直接的に発する色として、目視または機器
〔たとえば、クロマトスキャナー（スキャニングデンシ
トメータ）〕により迅速、簡便にシグナルを検出するこ
とができる。目視確認の容易性の観点からは、青色、赤
色、緑色またはオレンジ色等に着色された水分散型高分
子粒子が好ましく、分散安定性や被検物質の検出感度の
調整の容易性などの観点から、青色または赤色に着色さ
れたものがより好ましい。

【００４７】本発明においては、市販されている種々の
着色された水分散型高分子粒子も好適に使用することが
できる。市販されている水分散型高分子粒子としては、
たとえば、ｐ−クロロスチレンの単独重合体または共重
合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アク
リロニトリル−ブタジエン共重合体などの、スチレンま
たはその誘導体を単量体成分として含んでなる単独重合
体または共重合体を挙げることができる。また、（メ
タ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導
体からなる単独重合体や、これらと（メタ）アクリル酸
メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メ
タ）アクリレート等との共重合体も本発明において用い
られる。さらに、スチレンまたはその誘導体と、（メ
タ）アクリル酸エステルまたはその誘導体との共重合体
も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、
微結晶質セルロース等を用いてもよい。

【００４８】なお、本発明の水分散型高分子粒子として
は、前記するような単独重合体または共重合体の１種か
らなるものであっても、２種以上からなるものであって
もよい。

【００４９】水分散型高分子粒子は、その使用時や保存
時に融着や凝集を起こさないものが好ましい。従って、
当該粒子としては所望のガラス転移点を有するように選
択された単量体から構成されたものがよい。当該ガラス
転移点としては、好ましくは１０℃以上、より好ましく
は室温（１５℃）以上である。ガラス転移点は、たとえ
ば、示差走査熱量計で測定できる。

【００５０】このような水分散型高分子粒子の粒径（平
均粒径）は、分散性や吸水性基材内での展開性維持の観
点から、また核酸やリガンド等の固定化性の観点から、
好ましくは３μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下であ
り、核酸やリガンド等を固定する際の精製の容易性の観
点から、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは
０．１μｍ以上である。すなわち、水分散型高分子粒子
の粒径としては、好ましくは０．０１〜３μｍ、より好
ましくは０．１〜２μｍである。なお、当該粒径は、金
属コロイド粒子と同様の方法により測定できる。

【００５１】シグナルレポーターとして酵素を用いる場
合、シグナルは、その基質に対する当該酵素の作用によ
り生ずる産物から発せられる。本発明に用いうる酵素と
して好適には、公知の酵素免疫測定法において標識とし
て常用される酵素を挙げることができる。たとえば、ペ
ルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙
げられる。中でも、より高感度で安定な検出を達成する
観点から、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼが好ましい。

【００５２】また、当該酵素の基質としては、酵素反応
産物の検出が可能であれば特に限定されるものではない
が、迅速、簡便に当該産物の検出を行いうる観点から発
色性基質が好ましい。かかる発色性基質は、使用する酵
素に応じ、公知の酵素免疫測定法において用いられる発
色性基質から適宜選択することができる。

【００５３】発色性基質としては、たとえば、酵素がペ
ルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼと過酸化水素
との組み合わせにより反応して発色しうる基質であれば
よく、たとえば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチル
ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジ
ン（以下、ＴＭＢという) 、ｏ−ジアニジジン、３，
３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等が挙げら
れ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢが好まし
い。

【００５４】本発明においては、基質は溶液状態で、た
とえば、酵素基質液として用いるのが好適である。酵素
基質液としては、前記発色性基質を、たとえば、水、ホ
ウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等に溶解してなるものが好適
である。また、当該基質液には適切な酵素反応を行う上
で好適な、その他の成分（たとえば、過酸化水素等）を
所望により含有させてもよい。

【００５５】また、シグナルレポーターとして使用しう
る蛍光色素としては、フルオレセイン、フルオレセイン
イソチオシアネート、テトラメチルローダミン、Ｃｙ
３、Ｃｙ５等が挙げられる。

【００５６】標識複合体は前記のようなシグナルレポー
ターと検出プローブとを直接的にまたは間接的に結合す
ることにより得られる。間接的に結合させる場合とは、
たとえば、シグナルレポーターと検出プローブとの結合
を任意の物質を介して行うような場合をいう。たとえ
ば、シグナルレポーターとして酵素を使用する場合、た
とえば、前記水分散型高分子粒子を介して酵素と検出プ
ローブとを結合することにより標識複合体を得てもよ
い。

【００５７】シグナルレポーターは検出プローブの５’
末端、３’末端および配列内部の少なくとも１つに直接
的にまたは間接的に結合させればよい。両者は必ずしも
１対１で結合させる必要はなく、たとえば、１つの検出
プローブに対し複数のシグナルレポーターを直接的にま
たは間接的に結合させてもよい。

【００５８】標識複合体の調製は以下に示すようにして
行う。たとえば、シグナルレポーターと検出プローブと
の結合は、任意の物質間の結合方法として一般に公知で
ある、共有結合、物理的吸着もしくはイオン結合を利用
する方法を用いて好適に行うことができる。結合安定性
の観点から、共有結合を利用する方法を採用するのが好
ましい。

【００５９】たとえば、シグナルレポーター等に存在す
る官能基やイオン性基を介して直接結合する、または水
溶性カルボジイミドや他の炭素数ｌ〜１２の炭化水素基
を有する二官能性の有機化合物（たとえば、マレイミ
ド、グルタルアルデヒド等）等をスペーサーとして介在
させて結合する。また、検出プローブを調製する際に任
意のラジオアイソトープにより標識化した塩基を構成成
分として用い、検出プローブの調製と同時に標識化を行
って標識複合体を調製してもよい。

【００６０】また、たとえば、リガンドを検出プローブ
に結合しておき、一方、当該リガンドに対応するリガン
ド結合性化合物を検出プローブに結合し、当該リガンド
とリガンド結合性化合物との結合を利用して両者を結合
させることも可能である。かかるリガンド−リガンド結
合性化合物の組み合わせの好適な例としては、ビオチン
−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシ
ゲニン（ＤＩＧ）−抗ＤＩＧ抗体、ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴ
Ｃ抗体等が挙げられる。中でも、ビオチン−アビジンお
よび／またはビオチン−ストレプトアビジンの組み合わ
せは、それらが結合して形成される複合体の安定性や検
出性が高く、より好適に用いられる。ビオチン−ストレ
プトアビジンの組み合わせは、さらに好ましい。たとえ
ば、シグナルレポーターとして酵素を用いる場合、なん
らかのスペーサーを介在させることにより標識複合体に
おける当該酵素の自由度を高めることができ、酵素反応
の効率を高める観点から好ましい。

【００６１】また、たとえば、前記水分散型高分子粒子
を介してシグナルレポーターと検出プローブとを結合す
る場合、たとえば、（シグナルレポーター）−（水分散
型高分子粒子）−（検出プローブ）の形を有する標識複
合体を得る場合、当該標識複合体はシグナルレポーター
と水分散型高分子粒子との間および水分散型高分子粒子
と検出プローブとの間を、前記するようにして結合する
ことにより調製することができる。

【００６２】一方、本発明の第２の態様において使用さ
れるリガンドを有する検出プローブおよびリガンド結合
性化合物を有するシグナルレポーターは、好ましくは前
記リガンド−リガンド結合性化合物の組み合わせ、より
好ましくはビオチン−アビジンおよび／またはビオチン
−ストレプトアビジンの組み合わせに対し、前記する検
出プローブおよびシグナルレポーターを各々用いて、リ
ガンドと検出プローブとの間、およびリガンド結合性化
合物とシグナルレポーターとの間を、前記標識複合体の
調製における検出プローブとシグナルレポーターとの結
合方法に準じて結合することにより調製することができ
る。

【００６３】標識複合体、ならびにリガンドを有する検
出プローブおよびリガンド結合性化合物を有するシグナ
ルレポーターは、それぞれの構成成分を結合させた後、
たとえば、膜分離法や濾過、遠心分離法等の慣用の分離
法によって、たとえば、結合を行った反応場である溶媒
等から分離精製することにより得られる。それらの標識
複合体等は、たとえば、水中に浸漬して、または凍結乾
燥して保存すればよい。また、本発明の検出方法におい
て使用する場合には、得られた標識複合体等を、たとえ
ば、水、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等に分散または溶
解しておくのが好適である。

【００６４】シグナルレポーターとして着色粒子や蛍光
色素を用いた場合は、固定相において、それらが発する
色や蛍光をシグナルとして、たとえば、目視により検出
する。ラジオアイソトープを用いた場合は、たとえば、
オートラジオグラフィにより固定相における放射能の存
在をシグナルとして検出する。

【００６５】シグナルレポーターに酵素を用いた場合、
本発明の第１の態様では、たとえば、工程（ｂ）におい
て、工程（ａ）で得られた混合物を吸水性基材上に導入
した後、本発明の第２の態様では、たとえば、工程
（ｃ）において、シグナルレポーターを吸水性基材上に
導入した後、さらに酵素基質液を本発明の所望の効果の
発現が得られるように導入する。当該酵素基質液の導入
位置は前記混合物等の導入位置と同一であっても、異な
っていてもよい。

【００６６】酵素反応に要する時間は、酵素基質液の展
開時間を含め、酵素基質液を導入してから好ましくは１
〜２０分間程度である。ただし、当該時間は酵素、基
質、反応条件等に依存するため、特に限定されるもので
はない。たとえば、本発明の好適な態様において、発色
性基質を用いた場合、吸水性基材上の固定相においてシ
グナルとして検出される色は、固定相で捕捉もしくは形
成された標識複合体中のシグナルレポーターの酵素の作
用により基質から生じた発色性産物に由来する。

【００６７】本発明の検出方法においては、展開対象成
分は、吸水性基材上でストリンジェントな条件下に展開
される。従って、展開対象成分は、当該条件に適合する
組成を有する、好ましくは水系の分散液または溶液とし
て吸水性基材上に導入する。「条件に適合する組成」と
は、被検試料中の標的核酸と検出プローブおよび捕捉プ
ローブとがハイブリダイズ可能な組成をいい、用いる核
酸のＴｍ値や反応環境の温度等に応じて適宜選択すれば
よい。かかる組成や温度の条件については、前記成書等
で詳述されている。

【００６８】たとえば、前記被検試料や標識複合体等の
分散液や溶液、酵素基質液を、予め作製しておいた上記
組成を有する緩衝液（ハイブリダイゼーションバッファ
ー）の濃縮液および所望により水で希釈し、所望の組成
に調整した後に吸水性基材上に導入する。また、被検試
料等は当初よりハイブリダイゼーションバッファーの組
成を有するように調製しておいてもよい。なお、陰性対
照についても評価を行う場合には、陰性対照試料として
水（たとえば、脱イオン水、蒸留水等）を用いればよ
い。

【００６９】展開は、本発明の第１の態様では、標識複
合体と被検試料との混合物を導入後、本発明の第２の態
様では、シグナルレポーターを導入後、好ましくは１〜
１０分間程度行えばよい。なお、第２の態様では、検出
プローブと被検試料の混合物の導入からシグナルレポー
ターの導入までの時間は特に限定されない。また、前記
する混合物の導入後もしくはシグナルレポーターの導入
後、非特異的な核酸の吸着を洗い流す目的で洗浄液を導
入してもよい。当該洗浄液としては前記ハイブリダイゼ
ーションバッファーが好適である。

【００７０】本発明に用いられる吸水性基材としては水
性の液体を吸収可能な性質を有する基材であれば特に限
定されるものではないが、シグナルが色である場合に
は、当該色の目視確認性に優れるものであるのが好まし
い。本発明においては、展開対象成分が速やかに展開で
きるような適度な吸水性を有する吸水性基材が好まし
い。かかる吸水性基材の具体例としては、たとえば、不
織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロ
セルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、多孔質膜
等が挙げられる。

【００７１】吸水性基材の吸水性の程度は、たとえば、
厚さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×長さ１００ｍｍの吸水性基材の
片端部を水に１分間浸漬した場合に、水に浸漬された部
分と浸漬されない部分との境界位置からの吸水距離が
０．５〜５ｃｍであるのが好ましい。また、吸水性の程
度は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース等の親水性
重合体を、たとえば、吸水性基材の表面に被覆する、も
しくは吸水性基材に含浸させることにより適宜調整する
こともできる。

【００７２】吸水性基材の形状は、前記混合物等を展開
できる形状であれば特に限定されるものではなく、たと
えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等の形状が好
ましい。

【００７３】吸水性基材上の固定相は、標的核酸の塩基
配列に相補的な塩基配列を有しており、かつ検出プロー
ブに対して結合性を有しない任意の捕捉プローブをリガ
ンドとリガンド結合性化合物との間の結合を介して吸水
性基材上に固定化することにより形成する。捕捉プロー
ブの塩基配列と標的核酸の塩基配列の相補鎖との類似の
程度としては前記検出プローブの場合と同様であり、そ
の評価も同様に行うことができる。

【００７４】当該捕捉プローブとしては、核酸、修飾核
酸、核酸アナログ等からなるものが挙げられる。捕捉プ
ローブは一本鎖または二本鎖の核酸でありうるが、一本
鎖の核酸であるのが好ましい。また、その塩基数として
は少なくとも５塩基長程度であり、好ましくは５〜１０
０塩基長、より好ましくは１５〜５０塩基長であるが、
数千塩基長であってもよい。

【００７５】前記修飾核酸、核酸アナログとしては前記
のものを挙げることができる。捕捉プローブは、所望の
性質を有するように、前記検出プローブの場合と同様に
して公知の方法に従って適宜作製することができる。

【００７６】固定相は、吸水性基材上の所望の位置にお
いて所望の形状にて形成してもよいが、展開対象成分の
展開方向に対し垂直となる方向の当該吸水性基材の幅と
同様の幅で形成されるのが好ましい。また、吸水性基材
上の固定相の占有面積は吸水性基材の面積に対し百分率
で０．５〜３％であるのが好ましい。

【００７７】固定相は、具体的には、リガンドを有する
捕捉プローブを、該リガンドに対応するリガンド結合性
化合物を吸水性基材上の所望の位置に予め固定化してお
き、該リガンドと該リガンド結合性化合物との結合を介
して固定化することにより形成する。

【００７８】リガンドとリガンド結合性化合物とを用い
ることなく、捕捉プローブを直接吸水性基材上に塗布、
乾燥して固定化する方法もあるが、たとえば、捕捉プロ
ーブがオリゴヌクレオチドの場合、吸水性基材への固定
性に問題が生ずる場合が多い。たとえば、吸水性基材の
素材がニトロセルロースの場合、オリゴヌクレオチド溶
液を塗布、乾燥してオリゴヌクレオチドを該基材上に固
定化すると、その固定性が弱く、最終的な検出における
感度低下の原因となったり、実験操作で水に浸したり濡
らしたりするとオリゴヌクレオチドの脱離が起きる問題
がある。また、吸水性基材の素材がナイロンの場合はオ
リゴヌクレオチドの固定性が強く、固定化されたオリゴ
ヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズする際の立体
的な自由度が失われ、結果として標的核酸の検出感度が
低くなる。本発明のようにリガンドとリガンド結合性化
合物とを用い、それらの間の結合を介して吸水性基材上
に捕捉プローブを固定化すれば前記するような問題は生
じず、吸水性基材上への捕捉プローブの安定な固定化お
よび当該プローブと標的核酸とのより良好なハイブリダ
イゼーションの実施が可能となる。また、捕捉プローブ
は、被検試料を吸水性基材上に導入する際には予め固定
相に固定化されていることから、保存安定性が向上する
という優れた効果が奏される。

【００７９】固定相を形成する際に利用されるリガンド
−リガンド結合性化合物の組み合わせとしては、固定性
や安定性の観点から、タンパク質同士の組み合わせが好
適に用いられる。好ましくは前記リガンド−リガンド結
合性化合物の組み合わせ、より好ましくはビオチン−ア
ビジンおよび／またはビオチン−ストレプトアビジンの
組み合わせ、さらに好ましくはビオチン−ストレプトア
ビジンの組み合わせである。本発明においては、検出プ
ローブとシグナルレポーターとを結合させる際に利用す
るリガンド−リガンド結合性化合物の組み合わせと、固
定相を形成する際に利用されるリガンド−リガンド結合
性化合物の組み合わせとは同一であっても異なっていて
もよいが、本発明の検出方法の精度向上の観点から、異
なっているのが好ましい。

【００８０】リガンドを有する捕捉プローブは、前記の
ようなリガンドと捕捉プローブとの間を前記標識複合体
の調製における検出プローブとシグナルレポーターとの
結合方法に準じて結合することにより調製することがで
きる。また、リガンド結合性化合物の吸水性基材上への
固定化も同様にして行うことができるが、たとえば、簡
便に、リガンド結合性化合物を吸水性基材上に直接塗布
し、たとえば、３７℃で２時間程度静置して乾燥させ、
固定化することもできる。捕捉プローブの自由度をさら
に高める観点から、リガンドと捕捉プローブとの間、お
よび／またはリガンド結合性化合物と吸水性基材との間
の結合を、前記水溶性カルボジイミドや他の炭素数１〜
１２の炭化水素基を有する二官能性の有機化合物等のス
ペーサーを介して行うのも好適である。

【００８１】捕捉プローブの吸水性基材上への固定化
は、捕捉プローブのリガンドと吸水性基材上のリガンド
結合性化合物とを接触させて両者を結合させることによ
り行う。たとえば、後述の実施例１に記載のようにして
行えばよい。

【００８２】固定相としては、被検試料中の標的核酸の
全量を捕捉しうる量で捕捉プローブが固定化されてなる
ものが好ましい。固定相における捕捉プローブの固定化
量は特に限定されるものではないが、一般的には、捕捉
プローブを好ましくは１〜１００ｎｇ／ｃｍ²の範囲で
均一に固定化して固定相を形成するのが好ましい。

【００８３】なお、固定相を形成した吸水性基材は、標
的核酸以外の核酸の当該基材上への非特異的な吸着の防
止、展開の容易性、ならびに固定化した捕捉プローブの
保存安定性の観点から、公知の方法に従ってブロッキン
グ剤、界面活性剤および糖を含有する溶液（以下、処理
液という）に浸漬し、乾燥して用いるのが好ましい。こ
こで、使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アル
ブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン等の吸水性基材に
対し吸着性を有するタンパク質が挙げられる。界面活性
剤としては、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル等が挙げられる。糖としては、サッカロース、ト
レハロース等が挙げられる。なお、前記処理液中のブロ
ッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％
である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好まし
くは０．０１〜１重量％である。前記処理液中の糖の含
有量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。また、
上記操作の実施は、吸水性基材に対し固定相を形成した
後であれば、本発明の所望の効果の発現が阻害されない
限り、本発明の検出方法における使用前において任意に
行うことができる。

【００８４】さらに、吸水性基材には、前記固定相に加
え、滴下パッド部（展開対象成分および／または洗浄液
を滴下するための部分) 、および／または固定相を挟ん
で展開対象成分を導入するための部分とは反対側に、当
該展開対象成分の吸水性基材上における展開を、その水
性液体の吸収力により促進させうる手段である吸水パッ
ド部等を設けてもよい。滴下パッド部は、たとえば、ポ
リエステルやレーヨン製の不織布等を所望の形状にて吸
水性基材上の所望の位置に貼り合わせることにより適宜
作製できる。また、吸水パッド部に使用する吸水パッド
としては水性液体の吸収性に優れる材料が好適であり、
たとえば、ガラス繊維性不織布等を使用することができ
る。

【００８５】なお、滴下パッド部は、吸水性基材上で、
前記するような所望の展開移動距離が確保できる位置に
設けられるのが望ましい。

【００８６】また本発明は、捕捉プローブをリガンドと
リガンド結合性化合物との結合を介して固定化してなる
固定相を有する、上記のような吸水性基材からなる、本
発明の検出方法に好適に使用される標的核酸の検出用試
験片も包含する。リガンドとリガンド結合性化合物の組
み合わせ（リガンド−リガンド結合性化合物）は特に限
定されるものではなく、たとえば、前記例示のものを好
適に使用することができるが、中でも、ビオチン−スト
レプトアビジンおよび／またはビオチン−アビジンの組
み合わせがより好適であり、ビオチン−ストレプトアビ
ジンの組み合わせがさらに好適である。

【００８７】たとえば、本発明の試験片の一例として、
図１に示す吸水性基材を挙げることができる。吸水性基
材の大きさは本発明の所望の効果の発現が得られれば特
に限定されるものではないが、たとえば、３〜１０ｍｍ
×４０〜８０ｍｍ程度の大きさを有する。

【００８８】図１に示す吸水性基材は、滴下パッド１
（洗浄液滴下用）、滴下パッド２（被検試料滴下用）、
吸水性基材３、吸水パッド４および固定相５からなる。
滴下パッド２と固定相５との間には、前記好ましい範囲
にある展開移動距離を確保しうる距離が存在する。

【００８９】たとえば、当該吸水性基材を用いて本発明
の検出方法を実施する場合、第１の態様では被検試料と
標識複合体との混合物を、第２の態様では被検試料と検
出プローブとの混合物を、次いでシグナルレポーターを
ピペット等を用いて滴下パッド２に滴下する。なお、第
２の態様ではシグナルレポーターを滴下する前に任意に
洗浄液を滴下パッド１に滴下してもよい。滴下されたそ
れらの展開対象成分は、吸水性基材３上で図の右から左
へ延びた矢印の向きに展開され、一定時間後、固定相５
に到達する。

【００９０】被検試料中に標的核酸が含まれる場合、標
的核酸と検出プローブとがハイブリダイズする。固定相
５では、該標的核酸が捕捉プローブにさらにハイブリダ
イズする。また、第２の態様では、シグナルレポーター
が検出プローブに対してリガンドとリガンド結合性化合
物との結合を介して結合することになる。その結果、第
１の態様では標識複合体が固定相５に捕捉され、第２の
態様では固定相５に捕捉された検出プローブとシグナル
レポーターからなる、いわゆる標識複合体が固定相５で
形成される。一方、被検試料中に標的核酸が全く含まれ
ない場合（たとえば、陰性対照試料を用いた場合）に
は、固定相５では標識複合体の捕捉もしくは形成は生じ
ない。捕捉されなかったものは吸水パッド４まで流れて
いく。さらに所望により、非特異的な核酸吸着を洗い流
す観点から、洗浄液を滴下パッド１に滴下して展開し、
吸水性基材３上を洗浄する。この時点で、シグナルレポ
ーターが前述の着色粒子の場合、固定相５で標識複合体
が捕捉もしくは形成されておれば、固定相５が呈色し、
色としてシグナルが検出される。シグナルレポーターが
酵素の場合は、たとえば、該酵素の作用により発色の得
られる発色性基質を、たとえば、滴下パッド２からさら
に展開すれば、固定相５が同様に呈色し、色としてシグ
ナルが検出される。

【００９１】以上の操作の結果、固定相５でシグナルレ
ポーターからのシグナルが検出された場合、被検試料中
に標的核酸が存在すると判定する。なお、本発明の検出
方法はシグナルの検出を目視観察により行いうる条件で
実施するのが好適であるが、当該検出を目視観察により
行うのが困難である場合には、たとえば、シグナルが色
であれば、前記クロマトスキャナー等を用いて当該シグ
ナルの検出を行うのが好適である。また、シグナルレポ
ーターが蛍光色素の場合は蛍光検出器で、ラジオアイソ
トープの場合はオートラジオグラフィーなどでシグナル
の検出を行えばよい。

【００９２】さらに本発明の別の態様として、本発明の
検出方法において有用な標的核酸の検出用キットを提供
する。具体的には、本発明の第１の態様の検出方法に好
適に使用される、前記標識複合体および前記試験片を含
んでなるキット、ならびに本発明の第２の態様の検出方
法に好適に使用される、リガンドを有する前記検出プロ
ーブとリガンド結合性化合物を有する前記シグナルレポ
ーター、ならびに前記試験片を含んでなるキットを提供
する。当該キットに使用されるリガンドとリガンド結合
性化合物の組み合わせ（リガンド−リガンド結合性化合
物）は特に限定されるものではなく、たとえば、前記例
示のものを好適に使用することができるが、中でも、ビ
オチン−ストレプトアビジンおよび／またはビオチン−
アビジンの組み合わせはより好適であり、ビオチン−ス
トレプトアビジンの組み合わせはさらに好適である。

【００９３】当該キットには、さらに任意にその他の構
成物、たとえば、被検試料を入手する手段や、酵素基質
液、ハイブリダイゼーションバッファー等の適当な試
薬、本発明の検出方法を実施するための説明書等を含め
てもよい。

【００９４】本発明の検出方法によれば、任意の被検試
料等を、本発明において使用する固定相を有する吸水性
基材上に、たとえば、滴下するだけで、たとえば、食中
毒の原因菌による食品の汚染の判定、疾患の病因または
病状の診断、生物の遺伝子型タイピング等を迅速、簡便
に行うことができる。

【００９５】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、さらに具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定さ
れるものではない。

【００９６】製造例１：被検試料の調製表１に示したサルモネラ属細菌および非サルモネラ属細
菌を５ｍＬのニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅ
ｎｔＢｒｏｔｈ）（商品名、日水製薬製の粉末培地を
用いて調製）中にて３７℃、一晩培養して得た培養液か
ら、ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン製）を用
い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出し、滅菌
脱イオン水に溶解して被検試料とした。得られたＲＮＡ
はＯ．Ｄ．２６０の値をもとに１μｇ／μＬとなるよう
適宜希釈した（１Ｏ．Ｄ．２６０＝０．０４μｇ／μＬ
換算）。

【００９７】

【表１】

【００９８】実施例１：サルモネラ属細菌ｒＲＮＡ検出
用クロマトグラフ型試験片の作製本実施例では、サルモネラ属細菌のｒＲＮＡ（標的核
酸：サルモネラ属細菌２３ＳｒＲＮＡ）を検出するため
のクロマトグラフ型試験片を以下に示す方法で作製し
た。なお、本明細書において「上流」とは、後述の滴下
パッドが配置される、吸水性基材の末端側を意味する。
また、得られた試験片の構成は図１に示す吸水性基材と
同様である。

【００９９】吸水性基材の材料としてニトロセルロース
メンブレン（孔径５μｍ、６×４０ｍｍ、ミリポア社
製）を用いた。この上流端から２２．５ｍｍの箇所に、
ディスペンサーを用いてストレプトアビジンの水溶液
（５ｍｇ／ｍＬ）０．１５μＬをライン状に塗布した。
３７℃で２時間静置して乾燥させ、ストレプトアビジン
をメンブレンに固定化した。次いで、公知の方法により
予め５’末端をビオチン標識した、下記の配列番号：１
記載の塩基配列からなる捕捉プローブ（１００ｐｍｏｌ
／０．１５μＬ、滅菌脱イオン水に溶解）０．１５μＬ
を同様にしてライン状に塗布した。なお、捕捉プローブ
は、サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡに相補的な塩基
配列を有し、後述の検出プローブに対して結合性を有し
ないＤＮＡプローブである。さらに吸水性基材をＰＢＳ
〔リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）；１３７ｍＭ
ＮａＣｌ、８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、２．６８ｍＭ
ＫＣｌ、１．４７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄〕ですすぎ、風
乾させた。以上のようにしてメンブレン上に捕捉プロー
ブをビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して固
定化し、固定相（図１の固定相５に相当）を形成した。
固定相形成後、０．１重量％ウシ血清アルブミン（オリ
エンタル酵母製）、１重量％サッカロース（和光純薬
製）、０．１重量％ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート（和光純薬製）にメンブレンを浸漬してブロ
ッキングし、室温で乾燥させた。

【０１００】吸水性基材の上流端より５ｍｍのところか
らポリエステル製不織布ハイボン４８８０Ｃ（厚さ２．
５ｍｍ、大きさ７×１２ｍｍ、シンワ製）を貼り合わせ
て滴下パッド（図１の滴下パッド１に相当）を設置し
た。また、吸水性基材の上流端より１５ｍｍのところに
ポリエステル製不織布ハイボン４８８０Ｃ（厚さ２．５
ｍｍ、大きさ７×７ｍｍ、シンワ製）を貼り合わせて滴
下パッド（図１の滴下パッド２に相当）をさらに設置し
た。

【０１０１】また、吸水性基材の下流端より５〜１０ｍ
ｍのところから吸水パッドとしてガラス繊維製の吸水材
（厚さ５ｍｍ、大きさ１５×３０ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ
製）を貼り合わせ（図１の吸水パッド４に相当）、試験
片を作製した。当該試験片を１００個作製して、以降の
検出に用いた。配列番号：１５’−cttcagctcc atg
agtaaat ca−３’

【０１０２】実施例２：クロマトグラフ方式によるサル
モネラ属細菌ｒＲＮＡの存在の特異的検出公知の方法により予め３’末端をＤＩＧ標識した、下記
の配列番号：２記載の塩基配列からなる検出プローブ
（１００ｐｍｏｌ／μＬ、滅菌脱イオン水に溶解）と製
造例１で得られた被検試料とを混合し、以下の組成を有
する展開用組成液を調製した。なお、検出プローブは、
サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡに相補的な塩基配列
を有し、前記捕捉プローブに対して結合性を有しないＤ
ＮＡプローブである。配列番号：２５’−cttcacctac gtgtcagc−３’

【０１０３】〔展開用組成液の組成〕２×ＳＳＣ５０％（w/v）ホルムアミド１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ０．１％（w/v）ＳＤＳ５００ｐｍｏｌ／ｍＬＤＩＧ標識検出プローブＲＮＡ

【０１０４】なお、２×ＳＳＣは３３．３ｍＭＮａＣ
ｌ、３３．３ｍＭクエン酸ナトリウムからなり、ＲＮ
Ａの濃度条件を０（陰性対照試料）、０．１、０．５、
１、５μｇ／５０μＬの５種として実験を行った。

【０１０５】３７℃で３０分間保温した該展開用組成液
を、実施例１で作製した試験片の滴下パッド（図１の滴
下パッド２に相当）に５０μＬ滴下した。２分間の展開
後、滴下パッド（図１の滴下パッド１に相当）に１００
μＬの洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．２（w/v）％でＰ
ＢＳに溶解したもの）を滴下し、４分間展開させた。続
いて、ペルオキシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ロシュ・ダ
イアグノスティックス製）の溶液〔４５０Ｕ／ｍＬ；
０．５重量％ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノ
スティックス製）と共にＰＢＳに溶解したもの〕２５μ
Ｌを滴下パッド（図１の滴下パッド１に相当）に滴下し
た。そして、２分間の展開の後、前記洗浄液１００μＬ
を滴下パッド（図１の滴下パッド１に相当）に滴下し
て、４分間展開させた。さらに１００μＬの発色性基質
液（ＴＭＢＭｅｍｂｒａｎｅＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒ
ｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．製）を滴下パ
ッド（図１の滴下パッド２に相当）に滴下し、２〜５分
後の固定相における発色（青紫色発色）の有無を目視で
観察した。その結果を表２に示す。なお、表２における
判定基準は以下の通りである。

【０１０６】〔判定基準〕＋：着色あり ±：薄い着色あり −：着色なし

【０１０７】

【表２】

【０１０８】表２に示すように、展開用組成液にサルモ
ネラ属細菌ＲＮＡが含まれない場合、またサルモネラ属
細菌以外の細菌のＲＮＡが含まれる場合には、標的核酸
であるサルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡが存在せず、
該ＲＮＡと検出プローブとからなる核酸ハイブリッド
の、該ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーショ
ンを介する固定相での捕捉が生じず、従って、いわゆる
標識複合体が固定相で形成されないものと考えられ、固
定相では色としてのシグナルは検出されなかった。一
方、サルモネラ属細菌のＲＮＡを含む展開用組成液を展
開させた場合、前記組成液中に含まれるＲＮＡ量の多少
によりその程度は異なるものの、固定相で該シグナルが
検出された。これはサルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡ
と捕捉プローブとがハイブリダイズした結果、固定相で
前記標識複合体が形成されたことによるものと考えられ
る。いずれにしても、標的核酸であるサルモネラ属細菌
２３ＳｒＲＮＡが含まれるサルモネラ属細菌ＲＮＡを含
む被検試料では固定相においてシグナルが検出されたこ
とから、本発明の検出方法により、被検試料中の標的核
酸の存在を検出できることが分かる。

【０１０９】なお、前記検出プローブとシグナルレポー
ターとを混合して、リガンドとリガンド結合性化合物と
の間の結合を介して両者を結合させた標識複合体を用い
て実施例２と同様の操作を行い、被検試料中の標的核酸
の検出を行ったが、同様の結果が得られた。

【０１１０】以上の検出方法は、展開用組成液等を試験
片上に滴下するだけの操作で行うことができ、１５分間
程度で結果を得ることができた。このように、一般的な
ハイブリダイゼーション法が洗浄や発色等の煩雑な操作
と１〜２日間程度の時間を必要とするのに対して、本発
明の検出方法ではクロマトグラフ方式を採用することに
より、迅速・簡便に操作を完結させることができる。

【０１１１】配列表フリーテキスト配列番号：１は、サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡの
塩基配列に基づいてデザインしたプローブの配列であ
る。

【０１１２】配列番号：２は、サルモネラ属細菌の２３
ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づいてデザインしたプローブ
の配列である。

【０１１３】

【発明の効果】本発明により、従来のハイブリダイゼー
ション法に比べて非常に操作性に優れた、迅速かつ簡便
に被検試料中の標的核酸の存在を検出することができる
標的核酸の検出方法、当該検出方法に好適に使用される
標的核酸の検出用試験片ならびに標的核酸の検出用キッ
トが提供される。本発明の検出方法によれば、たとえ
ば、食中毒の原因菌による食品の汚染の判定、疾患の病
因または病状の診断、生物の遺伝子型タイピング等を迅
速、簡便に行うことができる。

【０１１４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> Method of detecting target gene <130> ND-14-001 <160> 2

【０１１５】 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe based on nucleotide sequence of Salmonella 23SrRNA. <400> 1 cttcagctcc atgagtaaat ca 22

【０１１６】 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe based on nucleotide sequence of Salmonella 23SrRNA. <400> 2 cttcacctac gtgtcagc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に使用する、固定相を有する吸
水性基材からなる試験片の一例を示す模式図である。

【符号の説明】

１滴下パッド２滴下パッド３吸水性基材４吸水パッド５固定相

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者浅井量子大阪府茨木市下穂積１−１−２日東電工株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA04 CA09 HA12 HA14 4B063 QA13 QA18 QQ06 QQ54 QR32 QR54 QR55 QR56 QR58 QR66 QR82 QS03 QS17 QS28 QS32 QS34 QS36 QX01 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】共に標的核酸と結合性を有するが、互い
に結合性を有しない、検出プローブと捕捉プローブとを
用いる標的核酸の検出方法であって、（ａ）該検出プロ
ーブとシグナルレポーターとを有する標識複合体と、被
検試料とを混合する工程、（ｂ）該捕捉プローブをリガ
ンドとリガンド結合性化合物との結合を介して固定化し
てなる固定相を有する吸水性基材上に、工程（ａ）で得
られた混合物を導入する工程、（ｃ）ストリンジェント
な条件下、吸水性基材上で該混合物を展開する工程、な
らびに（ｄ）固定相において該シグナルレポーターから
のシグナルを検出する工程、を含み、固定相において該
シグナルが検出される場合に被検試料中に標的核酸が含
まれると判定する、標的核酸の検出方法。
【請求項２】共に標的核酸と結合性を有するが、互い
に結合性を有しない、検出プローブと捕捉プローブとを
用いる標的核酸の検出方法であって、（ａ）リガンドを
有する該検出プローブと被検試料とを混合する工程、
（ｂ）該捕捉プローブをリガンドとリガンド結合性化合
物との結合を介して固定化してなる固定相を有する吸水
性基材上に、工程（ａ）で得られた混合物を導入する工
程、（ｃ）前記吸水性基材上に、検出プローブのリガン
ドに対応するリガンド結合性化合物を有するシグナルレ
ポーターを導入する工程、（ｄ）ストリンジェントな条
件下、吸水性基材上で該混合物および該シグナルレポー
ターを展開する工程、ならびに（ｅ）固定相において該
シグナルレポーターからのシグナルを検出する工程、を
含み、固定相において該シグナルが検出される場合に被
検試料中に標的核酸が含まれると判定する、標的核酸の
検出方法。
【請求項３】リガンドとリガンド結合性化合物の組み
合わせ（リガンド−リガンド結合性化合物）がビオチン
−ストレプトアビジンおよび／またはビオチン−アビジ
ンである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】シグナルレポーターが着色粒子、酵素、
蛍光色素およびラジオアイソトープからなる群より選ば
れる少なくとも１種である請求項１〜３いずれか記載の
方法。
【請求項５】標的核酸が一本鎖核酸である請求項１〜
４いずれか記載の方法。
【請求項６】一本鎖核酸がリボソームＲＮＡである請
求項５記載の方法。
【請求項７】リボソームＲＮＡがサルモネラ菌または
リステリア菌由来のものである請求項６記載の方法。
【請求項８】捕捉プローブをリガンドとリガンド結合
性化合物との結合を介して固定化してなる固定相を有す
る吸水性基材からなる標的核酸の検出用試験片。
【請求項９】リガンドとリガンド結合性化合物の組み
合わせ（リガンド−リガンド結合性化合物）がビオチン
−ストレプトアビジンおよび／またはビオチン−アビジ
ンである請求項８記載の試験片。
【請求項１０】請求項１に記載の標識複合体と請求項
８または９に記載の試験片とを含んでなる標的核酸の検
出用キット。
【請求項１１】請求項２に記載の検出プローブとシグ
ナルレポーター、ならびに請求項８または９に記載の試
験片を含んでなる標的核酸の検出用キット。