DE602004008740T2

DE602004008740T2 - Verfahren zur Bestimmung der in einer Probe vorliegenden Menge einer Templatnukleinsäure

Info

Publication number: DE602004008740T2
Application number: DE602004008740T
Authority: DE
Inventors: Laurence Carlo Ely TISI; James Augustus Henry Murray
Original assignee: Lumora Ltd
Current assignee: Lumora Ltd
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2024-01-15
Also published as: DK1585836T3; ES2295815T3; GB0300802D0; DE602004008740D1; ATE372392T1; CA2513073C; US7371545B2; EP1585836A2; PT1585836E; CN1852990A; WO2004062338A3; WO2004062338A8; JP4521581B2; JP2006516891A; EP1585836B1; CY1107021T1; AU2004204396A1; AU2004204396B2; CA2513073A1; WO2004062338A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von in einer Probe vorliegenden Templatnukleinsäure, umfassend die Schritte: i) das Inverbindungbringen sämtlicher der für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten und sämtlicher der für ein Biolumineszenz-Assay für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten und nachfolgend: ii) das Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion der Zielnukleinsäure unter Einbeziehen von mehr als einem Amplifikationszyklus; iii) das Überwachen der Lichtausgabeintensität von dem Biolumineszenz-Assay; und iv) das Bestimmen der Menge von in der Probe vorliegender Templatnukleinsäure.
Hintergrund
Eine Nukleinsäure-Amplifikation kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Templatnukleinsäure in einer Probe vorliegt. Falls ein Amplifikationsprodukt erzeugt wird, gibt dies an, dass die Templatnukleinsäure in der Probe vorlag. Umgekehrt gibt die Abwesenheit jedes Amplifikationsprodukts die Abwesenheit der Templatnukleinsäure in der Probe an. Solche Techniken sind in diagnostischen Anwendungen von großer Bedeutung, z.B. zum Bestimmen, ob ein Pathogen in einer Probe vorliegt.
Nukleinsäuren können durch eine Vielfalt von Thermocycling und isothermen Techniken amplifiziert werden. Thermocycling-Techniken, wie die Polymerase Kettenreaktion (PCR), verwenden ein Temperaturcycling, um wiederholte Zyklen einer DNA Synthese zu betreiben, die zu großen Mengen an neuer DNA führen, die proportional zur ursprünglichen Menge an Templat DNA synthetisiert werden. Vor kurzem ist auch eine Anzahl isothermer Techniken entwickelt worden, die nicht auf Thermocycling beruhen, um die Amplifikationsreaktion zu betreiben. Isotherme Techniken, die DNA-Polymerasen mit einer Strand Displacement Aktivität verwen den, sind für Amplifikationsreaktionen entwickelt worden, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen. Ähnlich sind für Amplifikationsreaktionen, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen, isotherme Techniken entwickelt worden, die reverse Transkriptase, RNase H und eine DNA abhängige Polymerase verwenden.
Die Produkte der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen sind herkömmlicher Weise unter Verwendung von Gelelektrophorese (entweder auf Agarose oder auf Acrylamid basierend) unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes (Ethidiumbromid) analysiert worden, um vorliegende DNA zu färben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Anzahl, die Menge und die Größe der amplifizierten Produkte anzugeben. Jedoch erfordern die Präparation, das Ablaufen und die Analyse von Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von Gelelektrophorese ein erhebliches manuelles Eingreifen und gefährliche Reagenzien, und sie sind zeitaufwendig (typischerweise wird insgesamt etwa 1 Stunde benötigt). Zusätzlich sind mehrere PCR Zyklen (typischerweise 30) erforderlich, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen. Vor kurzem sind Verfahren mit einer erhöhten Empfindlichkeit im Vergleich zu einer Gelelektrophorese entwickelt worden, die auf Fluoreszenz basierenden Techniken oder einem Trübungsassay beruhen, um die Produkte von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen in Echtzeit zu überwachen.
Eine Eigenschaft von DNA- und RNA-Polymerasen ist die Tatsache, dass sie die Verbindung Pyrophosphat (PPi) jedes Mal freisetzen, wenn sie eine neue Base in das größer werdende DNA/RNA Molekül einbauen. Somit wird PPi als ein Nebenprodukt in einer stöchiometrischen Menge erzeugt, da Nukleotide zu der wachsenden Nukleotidkette hinzugegeben werden. Somit folgt, dass die Konzentration an PPi proportional zur Menge an Nukleinsäuresynthese, die aufgetreten ist, und deshalb zur Anreicherung eines Amplikons ist. Für ein Polymer der Länge n kann die Reaktion dargestellt werden als:
Ein empfindliches Assay für PPi ist bekannt als das enzymatische, luminometrische, anorganische Pyrophosphat Nachweisassay (engl.: Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay (ELIDA)) (siehe Nyren, P. und Lundin, A., Anal. Biochem. 151: (2) 504-509 (1985)). Dieses Assay weist zwei Schritte auf: (1) Umsetzung von Pyrophosphat (PPi) zu ATP durch das Enzym ATP-Sulphurylase und (2) Verwendung des ATPs, um Licht in der Gegenwart von Luciferin und Sauerstoff zu erzeugen, was durch Luciferase katalysiert wird:
Die Verwendung von Assays des ELIDA Typs ist darin vorteilhaft, dass Biolumineszenz Messwerte schnell aus kleinen Probenvolumina erhalten werden können und die Messwerte unter Verwendung einfacher, billiger Überwachungvorrichtungen erzeugt werden können, wie eines photographischen Films oder ladungsgekoppelten Vorrichtungs-(CCD) Kameras.
Die US 5,534,424 , US 5,498,523 , WO 98/28440 , WO 98/13523 und WO 02/20836 beschreiben die Verwendung von auf ELIDA basierenden Verfahren zum Sequenzieren von kurzen Bereichen einer DNA. Das ELIDA Assay wurde verwendet, um den Einbau von einzelnen Nukleotiden in ein DNA Molekül durch eine Polymerase während eines einzelnen Durchlaufs einer Polymerisation während eines Pyrosequenzierens zu verfolgen. Das Pyrosequenzieren ist eine sich wiederholende Technik, wodurch nur eine der vier Desoxynukleotid-Triphosphate („dNTPs") in jedem der sich wiederholenden Assays vorliegt, um jedes zu testende Desoxynukleotid-Triphosphat („dNTPs") an jeder Position der Sequenz zu ermöglichen. Somit liegen nie alle Komponenten gleichzeitig vor, die für eine DNA Synthese erforderlich sind.
Die Verwendung eines Assays des Typs Endpunkt ELIDA, das als „H3PIM" bezeichnet wird, zum Überwachen einer Thermocycling Polymerase Kettenreaktion („PCR") ist auch beschrieben worden (siehe WO 92/16654 und Tarbary et al., J. Immunological Methods, 156 (1992) 55-60). Aliquote der Reaktionsmischung wurden in vorbestimmten regelmäßigen Zeitintervallen während des ganzen Reaktionsvorgangs und/oder am Ende des Amplifikationsvorgangs entnommen. Somit wird ein langwieriges, schrittweises Assay beschrieben, das die mehrfache Zugabe von Reagenzien einbezieht.
Die WO 02/064830 beschreibt die Verwendung eines ELIDA Assays, um ein Endpunkt Assay zum Überwachen einer Thermocycling PCR-Reaktion durchzuführen. In der WO 02/064830 kann das ELIDA Assay in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, während in der WO 92/16654 mehrfache Zugaben und ein Inkubationsschritt zum Überwachen einer Thermocycling PCR als ein Endpunkt Assay erforderlich sind.
Die WO 01/42496 und Nygren et al., (Analytical Biochemistry, Bd. 288, Nr. 1, (2001), 28-38) beschreiben Verfahren zum Beurteilen der Menge einer Zielnukleinsäure in einer Probe. Die Verfahren beziehen ein Koamplifizieren der Zielnukleinsaure mit mindestens einem Konkurrenz Nukleinsäuremolekül ein, das eine einzigartige charakteristische Sequenz enthält. Nach einer Amplifizierung werden die relativen Mengen der entsprechenden Amplikons dann unter Verwendung eines Primer Extensionsassays mit den Ziel- und Konkurrenz-Amplifikationsprodukten als Templates bestimmt. Somit sind die Verfahren zwei-Schrittverfahren, in denen i) das Ziel amplifiziert wird; und ii) die Menge an Amplikon nachgewiesen wird. Ein Biolumineszenz-Assay wird in einem Nachweisschritt nach der Amplifikation verwendet.
Es gibt eine Anzahl von Problemen, die mit den oben beschriebenen Endpunkt Assays in Verbindung gebracht werden. Zunächst erfordern sie, dass Komponenten des Biolumineszenz-Assays zu der Reaktionsmischung nach der Amplifikationsreaktion hinzugegeben werden. Ein Öffnen des Röhrchens kann zu einer Kontamination der Probe und darüber hinaus zu einer Kontamination des Labors führen. Falls die Probe selbst kontaminiert wird, dann kann dies zu falsch positiven Ergebnissen oder falsch negativen Ergebnissen führen, die erzeugt werden. Falls das Labor mit der amplifizierten Templatnukleinsäure kontaminiert wird, erhöht dies darüber hinaus die Wahrscheinlichkeit, dass zukünftige Proben kontaminiert werden und falsch positive Ergebnisse oder falsch negative Ergebnisse erhalten werden (siehe zum Beispiel Viktor, T. et al., „Laboratory experience und guidelines for avoiding false-positive polymerase chain-reactions results", Eur. J. Clin. Chem. & Clin. Biochem., 31(8): 531-535 (1993)). Somit stellt die Möglichkeit einer Kontamination einen schweren Nachteil in der Verwendung einer Endpunkt Analyse dieses Typs im diagnostischen Verfahren dar.
Ein weiteres Problem bei der Verwendung einer Endpunkt Analyse, wie oben beschrieben, liegt darin, dass dATP auch als ein Substrat für Luciferase wirkt. Wenn dATP als ein Substrat für die Polymerase verwendet wird, ergibt sich somit eine spektrale Interferenz aus dATP anstatt ATP, das mit der Luciferase reagiert. Die WO 02/064830 beschreibt, wie das Lichtsignal von der ELIDA schnell abnimmt, wenn dATP als das Substrat in der Amplifikationsreaktion verwendet wird. Diese Abnahme wäre ein erhebliches Hindernis für die Verwendung eines Endpunkt Assays, da der gemessene Lichtwert nicht nur eine Funktion der PPi Konzentration, sondern auch der Zeit wäre. Falls die Endpunkt Assays nicht mit einer genauen zeitlichen Steuerung durchgeführt werden, werden sie daher nicht quantitativ sein.
Eine Alternative zu Endpunkt Assays sind Assays, die in der Lage sind, die Synthese von Nukleinsäure während einer Amplifikationsreaktion in „Echtzeit" zu überwachen, d.h. indem die Nukleinsäure Synthese weitergeht. Vorhandene Assays in Echtzeit schließen auf Fluoreszenz basierende Techniken und Trübungsassays ein.
Auf Fluoreszenz basierende Techniken funktionieren durch ein Überwachen der Änderung in einer Fluoreszenz, die mit der Anhäufung eines Amplifikationsprodukts durch irgendwelche Mittel in Verbindung gebracht wird. Zum Beispiel sind Verfahren zum Überwachen der Amplifikation von DNA während einer PCR unter Verwendung von Farbstoffen, die an doppelsträngige DNA binden (insbesondere Hybridisierungssonden, die Donor- und Akzeptorfluorophore enthalten), in der US 5,944,056 , WO 97/44486 , WO 99/42611 und US 6,174,670 beschrieben. Diese auf Echtzeit Fluoreszenz basierenden Techniken ermöglichen es, eine PCR ohne eine Entnahme von flüssigen Proben zu verfolgen, wodurch das Erfordernis das Reaktionsröhrchen zu öffnen, vermieden wird und daher die Risiken einer Kontamination verringert werden.
Jedoch weisen auf Fluoreszenz basierende Techniken signifikante Nachteile auf. Insbesondere die Kosten von Fluoreszenzreagenzien, insbesondere von Fluoreszenz markierten Primern, sind hoch, und eine Probenpräparation kann mühsam sein. Weiterhin kann die Anwendung von auf Fluoreszenz basierenden Systemen durch die eingeschränkte Kapazität an Ausstattung und deren hohe Kosten behindert werden. Normalerweise wird ein Computer gesteuertes integriertes Thermocycler-Fluorimeter erforderlich, da die Verfahren eher häufig einer PCR in Echtzeit folgen als für eine Endpunkt Analyse angewendet zu werden. Als ein Ergebnis wird die Zugänglichkeit (Kosten) und Tragbarkeit eines solchen Systems beeinträchtigt. Da ein Nachweis innerhalb des PCR Geräts durchgeführt wird, sind solche Verfahren nur für geeignet ausgestattete Labors verfügbar.
Trübungsassays in Echtzeit beziehen ein Überwachen der Gegenwart oder Abwesenheit eines weißen Präzipitats aus Magnesium-Pyrophosphat in der Amplifikationsreaktionsmischung als ein Verfahren zum Bestimmen ein, ob PPi erzeugt worden ist. Dies ist als ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine isotherme, durch Schleifen vermittelte Amplifikationsreaktion aufgetreten ist, beschrieben worden (siehe Mori, Y. et al., „Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation", Biochem. and Biophys. Res. Comm., 289, 150-154 (2001)). Jedoch ist dieses Verfahren nicht sehr empfindlich und benötigt PPi Konzentrationen von etwa 0,6 mM bevor eine signifikante Trübung beobachtet wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von in einer Probe vorliegender Templatnukleinsäure bereit, umfassend die Schritte:

i) das Inverbindungbringen sämtlicher der für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten und sämtlicher der für ein Biolumineszenz-Assay für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten, einschließlich: a) einer Nukleinsäure-Polymerase, b) der Substrate für die Nukleinsäure-Polymerase, c) mindestens zweiter Primer, d) einer thermostabilen Luciferase, e) Luciferin, f) gegebenenfalls ATP-Sulphurylase, und g) gegebenenfalls Adenosin-5'-Phosphosulfat, und nachfolgend:
ii) das Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion der Zielnukleinsäure unter Einbeziehen von mehr als einem Amplifikationszyklus,
iii) das Überwachen der Lichtausgabeintensität von der Biolumineszenzreaktion und
iv) das Bestimmen der Menge von in der Probe vorliegender Templatnukleinsäure.

PPi wird als eine Konsequenz einer Nukleinsäure-Polymerisation während der Amplifikationsreaktion erzeugt. Ein erfindungsgemäßes Verfahren bezieht ein Koppeln dieser Erzeugung von PPi an eine Lichtausgabe von dem Biolumineszenz-Assay ein. Vorzugsweise wird PPi zuerst zu ATP umgesetzt. Das ATP wird dann durch ein Biolumineszenz-Assay nachgewiesen, der durch eine Luciferase katalysiert wird, die ATP als ein Substrat für die Erzeugung von Licht in der Gegenwart von Luciferin und Sauerstoff verwendet. Somit wird die Luciferase verwendet, um Änderungen in der Konzentration von ATP zu verfolgen. Vorzugsweise wird dies unter Verwendung eines Assays vom ELIDA Typ erreicht, in dem PPi durch eine ATP-Sulphurylase zu ATP umgesetzt wird und anschließend das ATP durch die Luciferase verwendet wird, um Licht zu erzeugen. Alternativ wird PPi direkt durch die Luciferase nachgewiesen. Durch ein Überwachen der Lichtausgabeintensität von dem Biolumineszenz-Assay ist es möglich, zu bestimmen, wie viel PPi in der Reaktionsmischung vorliegt und dadurch die Menge an Templatnukleinsäure zu bestimmen, die in der Probe vorliegt. Somit testet das Verfahren die enzymatische in vitro Synthese einer Nukleinsäure und ermöglicht es, das Maß zu quantifizieren, bis zu dem die Nukleinsäure ein Ergebnis einer de novo Polymerisation während der Amplifikationsreaktion amplifiziert worden ist.
Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) kann mit einer „weiter verarbeitenden" Nukleinsäure-Polymerasereaktion gleichgesetzt werden, dahingehend, dass mehr als ein Nukleotidzugabe Zyklus ohne weitere Zugaben oder einer Manipulation der Pufferkomponenten durchgeführt wird.
Die Gegenwart der Luciferase und anderer Komponenten des Biolumineszenz-Assays während der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) vereinfacht die Analyse der Probe, da sie das Erfordernis nach einer weiteren Manipulation der Reaktionsmischung vermeidet, sobald die Amplifikationsreaktion einmal begonnen hat. Zum Beispiel ist es nicht notwendig, Aliquote aus der Probe zu entnehmen, um zu bestimmen, wie viel PPi erzeugt worden ist. Stattdessen wird der Biolumineszenz-Assay direkt über der Reaktionsmischung durchgeführt, die für die enzymatische Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in der Gegenwart sämtlicher Komponenten verwendet wird, die für die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion erforderlich sind, d.h. über der Reaktionsmischung, die in Schritt i) gebildet wird. Weder ist es erforderlich, die Komponenten des Biolumineszenz-Assay zu der Reaktionsmischung während oder nach der Amplifikationsreaktion zuzugeben.
Die Komponenten des Biolumineszenz-Assays (auch bekannt als das „Pyrophosphat-Assay", oder das „PPi-Assay") und die Amplifikationsreaktion müssen in der Lage sein, den Bedingungen der Nukleinsäurereaktion von Schritt ii) standzuhalten. Zum Beispiel können eine thermostabile ATP-Sulphurylase und/oder eine thermostabile Luciferase und/oder eine thermostabile Nukleinsäure-Polymerase verwendet werden. Der Begriff „thermostabil", wie hier bezüglich eines Enzyms verwendet, bezeichnet ein Enzym, das innerhalb des Temperaturbereichs stabil ist, bei dem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) durchgeführt wird.
Die Komponenten von Schritt i) sind vorzugsweise durch eine Lyophilisierung oder durch die Gegenwart eines Stabilisierungsfaktors stabilisiert. Somit werden Stabilisatoren auch vorzugsweise mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht. Zum Beispiel können eines oder mehrere aus BSA, Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Dithiothreitol (DTT) mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht werden. Vorzugsweise werden sämtliche dieser Stabilisatoren in Verbindung mit der Probe in Schritt i) gebracht.
Die Temperatur und die Zeit, die für Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen erforderlich sind, sind beachtlich unterschiedlich von jenen, die für Nukleinsäure-Polymerisationsreaktionen erforderlich sind. Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen erfordern entweder eine hohe Temperatur oder eine lange Dauer (z.B. 15 Minuten bis 24 Stunden) oder beides. Im Gegensatz dazu können Nukleinsäure-Polymerisations-Reaktionen schnell bei geringen Temperaturen (z.B. 37°C) durchgeführt werden. Luciferasen sind dafür bekannt, instabil zu sein. Zum Beispiel inaktiviert eine Wildtyp Leuchtkäfer Luciferase schnell bei 37°C. Luciferasen sind auch dafür bekannt, dass sie leicht gehemmt werden, zum Beispiel durch Oxyluciferin, das Produkt ihrer eigenen Lichtreaktion. Jedoch ist überraschenderweise nachgewiesen worden, dass Luciferasen während der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) stabil bleiben können. Darüber hinaus ist nachgewiesen worden, dass Luciferasen während des gesamten Verlaufs der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) stabil bleiben können. Dies ist aufgrund der langen Dauer, die für bestimmte Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen erforderlich ist, überraschend.
Die thermostabile Luciferase, die mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht wird, ist ein Luciferaseenyzm, das innerhalb des Temperaturbereichs stabil ist, bei dem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) durchgeführt wird. Die besondere Luciferase, die verwendet wird, wird von den Bedingungen abhängen, unter denen die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) durchgeführt wird. Der Begriff „Luciferase", wie hier verwendet, bezeichnet ein Enzym, das eine Biolumineszenzreaktion katalysiert. Luciferasen, die für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, schließen sowohl Wildtyp Luciferasen als auch mutierte oder variante Luciferasen ein, vorausgesetzt, dass diese innerhalb des Temperaturbereichs stabil sind, bei dem die Nukleinsäurereaktion von Schritt ii) durchgeführt wird. Ein Beispiel einer thermostabilen Luciferase, die für eine Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist die thermostabile Luciferase Ultra-Glow von Promega.
Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) kann einen RNA Syntheseschritt einbeziehen oder nicht. In Verfahren, in denen die Amplifikationsreaktion von Schritt ii) keinen RNA Syntheseschritt einbezieht, schließen die Substrate für die Polymerase jedes der vier dNTPs ein: dATP, dTTP, dCTP und dGTP. Eines oder mehrere der dNTPs können durch ein geeignetes Analogon ersetzt werden. In diesen Ausführungsformen verwendet die Luciferase vorzugsweise ATP als ein Substrat zur Erzeugung von Licht. Beispiele von Luciferasen, die ATP als ein Substrat zur Erzeugung von Licht verwenden, sind die Leuchtkäfer Luciferase (von Photinus pyralis) und Mutanten davon. Vorzugsweise ist die Luciferase, die ATP als ein Substrat zur Erzeugung von Licht verwendet, die thermostabile Luciferase Ultra-Glow von Promega. In Ausführungsformen, in denen die Luciferase verwendet wird, um Änderungen der Konzentration von ATP zu verfolgen, liegt die ATP-Sulphurylase in der Reaktionsmischung vor. Vorzugsweise sind die Ausführungsformen, in denen die Luciferase verwendet wird, um Änderungen in der Konzentration von ATP zu verfolgen, jene Ausführungsformen, in denen die Amplifikationsreaktion von Schritt ii) keinen RNA Syntheseschritt einbezieht. Alternativ kann eine Luciferase, die sich selbst wie eine ATP-Sulphurylase verhält, zusätzlich zum Katalysieren des Biolumineszenz-Assays verwendet werden. In solchen Fällen ist es nicht erforderlich, ATP-Sulphurylase zu der Reaktionsmischung in Schritt i) zuzugeben.
Adenosin-5'-Phosphosulfat ist für die ATP-Sulphurylase erforderlich, um ATP aus PPi zu erzeugen und wird zu der Reaktionsmischung in Schritt i) zugegeben, wenn die ATP-Sulphurylase vorliegt und auch wenn eine Luciferase, die sich selbst wie eine ATP-Sulphurylase verhält, zusätzlich zum Katalysieren des Biolumineszenz-Assays verwendet wird.
Für Amplifikationsreaktionen, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen, schließen die Substrate für die Polymerase jedes der vier dNTPs (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) und jedes der vier Nukleotid-Triphosphate („NTPs") (ATP, UTP, CTP und GTP) ein. Eines oder mehrere der dNTPs und/oder NTPs kann/können durch ein geeignetes Analogon ersetzt werden. Wenn die Amplifikationsreaktion einen RNA Syntheseschritt einbezieht, liegt somit endogenes ATP in der Reaktionsmischung als eines der Substrate für die Polymerase vor, es sei denn ein ATP Analogon wird verwendet, das von der RNA Polymerase verwendet werden kann, aber nicht mit der Luciferase reagiert. Signifikante Mengen an endogenem ATP in der Reaktionsmischung würden die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens erheblich beeinträchtigen, in dem es erforderlich ist, dass die Luciferase, die mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht wird, für kleine Änderungen der Konzentration von ATP empfindlich ist. Um dieses Problem zu überwinden, wird vorzugsweise eine reversibel gehemmte Luciferase in Ausführungsformen verwendet, in denen die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) einen RNA Syntheseschritt einbezieht und eine endogene ATP in der Reaktionsmischung vorliegt. Der Begriff „reversibel gehemmte Luciferase", wie hier verwendet, bezeichnet eine Luciferase, die durch eine Komponente abweichend von PPi gehemmt wird, aber deren Hemmung durch geringe Konzentrationen an PPi abgebaut wird. Luciferasen sind zum Beispiel dafür bekannt, dass sie durch Oxyluciferin, dem Produkt ihrer eigenen Reaktion, gehemmt werden. Für diese Hemmung ist nachgewiesen worden, dass sie durch geringe Konzentrationen an PPi abgebaut wird. Somit ermöglicht die Verwendung einer reversibel gehemmten Luciferase, dass PPi direkt durch die Luciferase nachgewiesen wird, da PPi direkte Wirkungen auf eine gehemmte Luciferase aufweist. Eine Reihe von Kontrollreaktionen unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen der Templatnukleinsäure können durchgeführt werden, um die Zeit, die für die Hemmung der reversibel gehemmten Luciferase benötigt wird, die durch PPi abgebaut werden soll, für besondere Konzentrationen der Templatnukleinsäure zu bestimmen.
Die reversibel gehemmte Luciferase kann durch eine Komponente abweichend von PPi vor einem Zugeben der Luciferase zu der Reaktionsmischung in Schritt i) gehemmt werden. Alternativ kann die reversibel gehemmte Luciferase in situ aufgrund der Gegenwart des Inhibitors in der Reaktionsmischung gebildet werden. Die reversibel gehemmte Luciferase ist vorzugsweise eine Luciferase, die in ihrem nicht gehemmten Zustand ATP verwendet, um Licht zu erzeugen. Insbesondere ist die Luciferase vorzugsweise eine Käfer Luciferase und ist vorzugsweise eine Leuchtkäfer Luciferase.
In Ausführungsformen, in denen die Luciferase, die mit der Probe in Schritt i) eines Verfahrens der Erfindung in Verbindung gebracht wird, eine reversibel gehemmte Luciferase ist, werden ATP-Sulphurylase und Adenosin-5'-Phosphosulfat nicht mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht. Jedoch in Ausführungsformen, in denen die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) einen RNA Syntheseschritt einbezieht und ein geeignetes ATP Analogon, das ein Substrat für die RNA-Polymerase, aber nicht für die Luciferase ist, (oder zumindest ein sehr schlechtes Substrat für die Luciferase ist), eher mit der Probe in Schritt i) als mit ATP selbst in Verbindung gebracht wird, kann dann die Luciferase, die mit der Probe in Schritt i) in Bindung gebracht wird, eine Luciferase sein, die ATP zur Erzeugung von Licht verwendet, und dann werden ATP-Sulphurylase und vorzugsweise Adenosin-5'-Phosphosulfat in Verbindung mit der Probe in Schritt i) gebracht werden.
Eine reversibel gehemmte Luciferase kann auch in erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet werden, in denen die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) keinen RNA Syntheseschritt einbezieht. In solchen Fällen wird die ATP-Sulphurylase und das Adenosin-5'-Phosphosulfat nicht mit der Probe in Schritt i) in Verbindung gebracht werden.
Ein weiterer Vorteil eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Einfachheit mit der die Lichtausgabe in Schritt iii) nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise wird die Lichtausgabeintensität des Schritts iii) visuell überwacht. Geeignete Verfahren zum Überwachen der Lichtausgabeintensität beziehen ein Verwenden von photographischem Film oder einer ladungsgekoppelten Vorrichtungs-(CCD) Kamera ein. Alternativ wird die Lichtausgabeintensität von dem Biolumineszenz-Assay un ter Verwendung einer CCD Kamera überwacht. Die Lichtausgabe kann für eine Visualisierung, falls erforderlich, amplifiziert werden. Somit weist die Fähigkeit, die Lichtausgabe unter Verwendung nur von photographischem Film oder einer CCD Kamera nachzuweisen, gegenüber Techniken, die eine Fluoreszenzanalyse oder eine auf einem Gel basierende Analyse einsetzen, den Vorteil auf dass, keine komplexe Hardware oder Optik erforderlich ist. Darüber hinaus kann die Lichtausgabeintensität ohne das Erfordernis, die Probe auf irgendeine Weise zu bestrahlen (wie es in Techniken erforderlich ist, die Fluoreszenz und Absorptionsvermögen einbeziehen), ohne das Erfordernis irgendeiner elektrochemischen Kopplungsstelle mit der Probe (wie z.B. in auf Halbleitern basierten Ansätzen: Wilding, P. et al., (1994) „PCR in a silicon microstructure", Clinical Chemistry, 40 (9): 1815-1818) oder ohne das Erfordernis einer indirekten Bestrahlung (z.B. wie in Oberflächen Plasmon Resonanz Ansätzen: Bianchi, N. et al., (1997) „Biosensor technology and surface plasmon resonance for real-time detection of HIV-1 genomic sequences amplified by polymerase chain reaction", Clinical and Diagnostic Virology, 8 (3): 199-208) überwacht werden.
Weiterhin kann eine oder mehr als eine (zum Beispiel Tausende) der Proben gleichzeitig überwacht werden, zum Beispiel unter Verwendung einer einzigen CCD Kamera. Somit kann ein erfindungsgemäßes Verfahren einfache, billige Hardware mit der Möglichkeit der Tragbarkeit und der Miniaturisierung und eines einfachen Einbaus in Hochdurchsatz Systeme verwenden.
Schritt i) eines erfindungsgemäßen Verfahrens schließt auch vorzugsweise ein Inverbindungbringen eines geeigneten Puffers mit der Probe ein. Puffer, die für eine Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, schließen Puffer ein, die es ermöglichen, dass die Amplifikationsreaktion weitergeht und die auch ermöglichen, dass das Biolumineszenz-Assay weitergeht. Vorzugsweise umfasst der Puffer eine Magnesiumionen Quelle. Diese kommen vorzugsweise in der Form von MgCl₂ oder MgSO₄ vor. Zum Beispiel kann ein geeigneter Puffer Tris-Acetat, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Triton X-100 bei einem pH-Wert von 8,8 bei 25°C enthalten.
Vorteilhafterweise werden zumindest die Schritte ii) und iii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einem versiegelten Gefäß durchgeführt. Dies ist von großem Nutzen, da die Fähigkeit sowohl die Amplifikationsreaktion als auch das Biolumineszenz-Assay in einem versiegelten Gefäß durchzuführen, die Möglichkeit verringert oder sogar verhindert, dass die Probe kontaminiert wird. Darüber hinaus verringert oder verhindert sie sogar die Möglichkeit, dass das Labor kontaminiert wird. Dies ist insbesondere wichtig, da falls sogar nur eine Kopie der Templatnukleinsäure in das Labor entweicht, könnte dies potenziell zu testende Proben kontaminieren oder falsch positive Ergebnisse ergeben. Somit ist die Fähigkeit, eine Kontamination zu verhindern von besonderer Wichtigkeit, falls ein erfindungsgemäßes Verfahren in einer diagnostischen Anwendung verwendet wird.
Um weiterhin eine Kontamination zu verhindern, wird nach Schritt iv) das Gefäß vorzugsweise einer geeigneten Behandlung unterzogen, um die Nukleinsäure, die in ihm enthalten ist, zu zerstören, insbesondere, um die Templatnukleinsäure zu zerstören. Das Gefäß selbst wird vorzugsweise nach Schritt iv) oder nach dem Zerstören der Nukleinsäure, die darin enthalten ist, zerstört. Dies minimiert die Möglichkeit, dass das Labor und/oder weitere Proben kontaminiert wird/werden.
Vorzugsweise wird in Schritt iii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens die Lichtausgabeintensität während der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion überwacht. Dies ist nur als ein Ergebnis der Komponenten für das Biolumineszenz-Assay möglich, die während der ganzen Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt i) vorliegen. Vorzugsweise wird die Lichtausgabeintensität über den Zeitverlauf der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion überwacht, d.h. vom Anfang bis zum Ende der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion. Alternativ kann die Lichtausgabeintensität während mindestens eines Teils der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion überwacht werden. Alternativ und/oder zusätzlich kann die Lichtausgabeintensität nachdem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) beendet worden ist und/oder bevor der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) beginnt, überwacht werden, um zum Beispiel einen Kontrollmesswert zu nehmen. Die Fähigkeit, die Lichtausgabeintensität während der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) zu überwachen, vereinfacht die Handhabung des Reaktionsgefäßes und ermöglicht auch eine schnelle Bestimmung der Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt. Ein weiterer Vorteil des Überwachens der Lichtausgabeintensität während des Verlaufs der Amplifikationsreaktion liegt darin, dass jedes Hintergrundsignal, das durch dATP erzeugt wird, das mit der Luciferase reagiert, das erfindungsgemäße Verfahren nicht beeinflusst. Dies stellt nur bei einer Endpunkt Analyse ein Thema dar.
Vorzugsweise schließt Schritt iii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens weiterhin ein Erzeugen eines Datensatzes einer Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit ein. Der Datensatz wird verwendet, um die Menge an Templatnukleinsäure zu bestimmen, die in der Probe vorliegt. Vorzugsweise wird der Datensatz durch einen Softwareanwendung analysiert und/oder ist in der Form einer Graphik oder einer Liste von Ziffern dargestellt. Zum Beispiel kann der Datensatz als ein Diagramm der Lichtintensität im Verlauf der Zeit oder ein Diagramm der Änderungsrate der Lichtintensität im Verlauf der Zeit (d.h. die erste Ableitung) dargestellt werden.
Die Lichtausgabeintensität kann zu einer oder mehreren vorbestimmten Zeiten überwacht werden. Diese vorbestimmten Zeiten liegen vorzugsweise bei vorbestimmten Zeiten nach der Zeit, bei der sämtliche Bedingungen vorhanden sind, die erforderlich sind, dass die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) stattfindet, wobei die Zeit (t) = 0 min beträgt. Solche Bedingungen sind die, dass eine Reaktionsmischung gebildet worden ist, wie in Schritt i) dargestellt, und dass die Reaktionsmischung bei einer geeigneten Temperatur vorliegt, dass die Amplifikation weiter geht, wobei die Temperatur auch eine Temperatur ist, bei der die Komponenten der Amplifikationsreaktion und des Biolumineszenz-Assays stabil sind. Zum Beispiel kann die Lichtausgabeintensität bei festgesetzten vorbestimmten Zeitintervallen während mindestens eines Teils der Amplifikationsreaktion überwacht werden. Vorzugsweise kann die Lichtausgabeintensität bei festgesetzten vorbestimmten Zeitintervallen während der ganzen Amplifikationsreaktion überwacht werden. Zum Beispiel könnten diese Intervalle alle 30 Sekunden, alle 1 Minute, alle 1 Minute 30 Sekunden, etc. betragen. Alternativ können die Intervalle zwischen vorbestimmten Zeitpunkten variieren. Vorzugsweise werden ein, zwei, oder mehrere Lichtmesswerte pro Minute genommen. Je mehr Messwerte pro Minute genommen werden, desto größer wird das Vertrauen in die Ergebnisse bzw. die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sein, und somit ist es vorzuziehen, soviel Messwerte pro Minute wie möglich zu nehmen. Vorzugsweise wird die Lichtausgabe erst zur Zeit = 0 min überwacht. In bestimmten Ausführungsformen kann die Lichtausgabeintensität auch nachdem die Amplifikationsreaktion beendet ist, überwacht werden.
Je höher die Empfindlichkeit des Lichtnachweissystems ist, das verwendet wird, umso mehr Zeitpunkte pro Minute sind möglich, da unter Verwendung einer empfindlicheren Kamera jeder Messwert von einem Integrieren der Lichtemission über eine kürzere Zeit stammt, als mit einer weniger empfindlichen CCD Kamera. Somit ist es vorteilhaft, eine möglichst empfindliche Kamera zu verwenden.
Vorteilhafterweise wird die Lichtausgabeintensität in Schritt iii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens kontinuierlich überwacht. Vorzugsweise wird die Lichtausgabe während mindestens eines Teils der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) kontinuierlich überwacht. Weiter bevorzugt wird die Lichtausgabe während der gesamten Amplifikationsreaktion von Schritt ii) kontinuierlich überwacht. Schritt iii) umfasst auch alternativ oder zusätzlich ein kontinuierliches Überwachen der Lichtausgabeintensität nachdem die Amplifikationsreaktion von Schritt ii) beendet ist.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann verwendet werden, um die Menge an Templatnukleinsäure, die in einer Probe vorliegt, auf eine quantitative Weise und/oder auf eine qualitative Weise zu bestimmen.
Eine Verwendung auf eine quantitative Weise schließt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein, um die Menge an Templat zu bestimmen, die in einer Probe vor der auftretenden Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) vorliegt. Sie schließt auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein, um die Menge an Templatnukleinsäure zu bestimmen, die in einer Probe als ein Ergebnis der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) vorliegt, die entweder während oder nach der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) be stimmt werden kann; d.h. die Quantifizierung, wie viel Nukleinsäure-Amplifikationsprodukt („Amplikon") erzeugt worden ist. Dies ermöglicht es, das Maß der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion zu quantifizieren. Der Begriff „bestimmen" schließt sowohl eine genaue Bestimmung der Menge an Templatnukleinsäure ein, die in der Probe vorliegt, als auch eine Schätzung der Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, wenn er auf eine quantitative Weise verwendet wird.
Überraschenderweise ist festgestellt worden, dass um die Menge an Templatnukleinsäure, die in einer Probe vorliegt, auf eine quantitativen Weise zu bestimmen, die zeitliche Steuerung der Änderung der Lichtausgabeintensität ein proportionaler Faktor zusätzlich zu der Intensität per se der erzeugten Lichtausgabe ist. Zum Beispiel werden für einen besonderen Satz an Reaktionsbedingungen (z.B. eine besondere Templatnukleinsäure, eine besondere Konzentration an Komponenten für die Amplifikationsreaktion und für das Biolumineszenz-Assay und (eine) besondere Temperatur(en) für die Amplifikationsreaktion), falls eine höhere Konzentration an Templatnukleinsäure in der Probe am Beginn der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion vorliegt, die Änderungen der Lichtausgabeintensität nach einer kürzeren Zeitdauer nach dem Start der Amplifikationsreaktion auftreten, als im Vergleich zu einer Reaktion, bei der eine geringere Konzentration an Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt. Somit ist es für einen besonderen Satz an Reaktionsbedingungen möglich, die Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, durch ein Überwachen der Änderung der Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit zu überwachen. Bevorzugt wird eine Reihe von Kontrollreaktionen unter Verwendung unterschiedlicher bekannter Konzentrationen der besonderen Templatnukleinsäure unter dem besonderen Satz an Reaktionsbedingungen durchgeführt, und die Ergebnisse, die von der Probe, die analysiert wird, durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden, werden mit den Ergebnissen verglichen, die aus dieser Reihe von Kontrollreaktionen erhalten werden. Eine Kontrolle kann auch durchgeführt werden, wobei die Menge an Templatnukleinsäure, die während der Amplifikationsreaktion bei vorbestimmten Zeitpunkten erzeugt worden ist, unter Verwendung von Gelelektrophorese und anderen geeigneten quantitativen Verfahren beurteilt wird. Dies wird es ermöglichen, dass die Menge an Templatnukleinsäure in der Kontrollprobe bei den vorbestimmten Zeitpunkten berechnet und mit den entsprechenden Punkten des Datensatzes korreliert werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann, falls es auf eine qualitative Weise verwendet wird, verwendet werden, um zu beurteilen, ob eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion irgendein Amplifikationsreaktionsprodukt erzeugt hat oder nicht und um dadurch zu bestimmen, ob irgendeine Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt. In vielen Anwendungen, in denen die Amplifikationsbedingungen schon ausreichend optimiert sind (z.B. bei einem schnellen Nachweis von Nukleinsäure (vorzugsweise DNA) in Verbindung mit Pathogenen), ist die einzige Information, die erforderlich ist, um zu ermitteln, dass die Ziel DNA-Sequenz in einer Probe vorlag, das Auftreten der Amplifikationsreaktion. Falls die Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt, wird dies zu einem Amplikon führen, das als ein Ergebnis der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) erzeugt wird. Folglich wird dies zu einer Änderung im Muster der Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit im Vergleich zu einer Kontrollreaktion führen, bei der keine Amplifikation stattgefunden hat. Falls keine Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt, wird keine Amplifikationsreaktion in Schritt ii) stattfinden, und somit wird kein Amplikon als ein Ergebnis erzeugt werden. Folglich wird das Muster der Änderung der Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit ähnlich, falls nicht dasselbe wie bei einer Kontrolle sein, in der keine Amplifikation stattgefunden hat. Somit schließt der Ausdruck „Durchführen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion", wie in Schritt ii) verwendet, sowohl ein „Durchführen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion" als auch ein „Schaffen der geeigneten Bedingungen für die aufzutretende Amplifikationsreaktion" ein, da in Ausführungsformen, in denen keine Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt, keine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion auftreten wird. Vorzugsweise wird die Gegenwart oder die Abwesenheit der erwarteten Lichtänderung mit einer vorbestimmten Zeitdauer nach dem Start der Reaktion überwacht.
Wie oben erwähnt ist auch festgestellt worden, dass PPi selbst direkte Wirkungen auf die Luciferase bei hohen Konzentrationen haben kann. Dies trifft sowohl auf Luciferasen, die ATP als ein Substrat zum Erzeugen von Licht verwenden, als auch auf reversibel gehemmte Luciferasen zu. Durch ein Durchführen einer Anzahl von Kontrollexperimenten unter Verwendung verschiedener Konzentrationen einer besonderen Start Templatnukleinsäure unter einem besonderen Satz an Reaktionsbedingungen wird der Fachmann in der Lage sein, aus dem Datensatz die Zeit zu bestimmen, bei der das PPi selbst eine direkte Wirkung auf die Luciferase aufweist. Diese Kontrollergebnisse können dann verwendet werden, um die Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, zu extrapolieren.
Zum Beispiel ist festgestellt worden, dass PPi selbst Luciferase bei hohen Konzentrationen hemmen kann. Der Punkt, bei dem die Lichtausgabeintensität beginnt schnell abzunehmen, korreliert mit dem Punkt, bei dem die Luciferase durch eine bestimmte Konzentration an PPi gehemmt worden ist. Dieser kann dem Punkt entsprechen, bei dem die Lichtausgabeintensität an einem Maximum liegt, d.h. der Punkt, der den Übergang zwischen dem Zunehmen der Lichtausgabe und dem Abnehmen der Lichtausgabe markiert. Alternativ kann er den Punkt darstellen, bei dem die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt, z.B. von einer allmählichen Abnahme zu einer schnellen Abnahme. Durch ein Durchführen einer Anzahl von Kontrollexperimenten unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Templatnukleinsäure kann die Zeit, zu der die Lichtausgabeintensität beginnt schnell abzunehmen, für jede besondere Start Templatnukleinsäure Konzentration unter einem besonderen Satz an Reaktionsbedingungen bestimmt werden. Diese Kontrollergebnisse können dann verwendet werden, um die Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, zu extrapolieren.
Alternativ kann PPi eine Zunahme der Lichtemission von einer Luciferase verursachen, die durch eine Substanz abweichend von PPi gehemmt wird, wie in der Ausführungsform der reversibel gehemmten Luciferase, die oben erwähnt ist.
Ob PPi das Biolumineszenz-Assay, das durch Luciferase katalysiert wird, stimuliert oder nicht stimuliert oder eben nicht, hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, die den genauen Typ der verwendeten Luciferase, die Temperatur der Reaktion, die Konzentration an PPi und die Gegenwart anderer Verbindungen einschließen, welche die Luciferaseaktivität beeinflussen können. Durch das Durchführen einer Anzahl von Kontrollexperimenten unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen einer besonderen Start Templatnukleinsäure unter einem besonderen Satz an Reaktionsbedingungen wird der Fachmann in der Lage sein, aus dem Datensatz die Zeit, bei der PPi selbst eine direkte Wirkung auf die Luciferase aufweist, und die Art dieser Wirkung zu bestimmen. Diese Kontrollergebnisse können dann verwendet werden, um die Menge an Templatnukleinsäure zu extrapolieren, die in der Probe vorliegt.
Der Datensatz der Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit kann auf eine Anzahl unterschiedlicher Weisen interpretiert werden, um die Menge an Templatnukleinsäure zu bestimmen, die in der Probe vorliegt. Besondere Punkte des Datensatzes stellen Zeitpunkte dar, bei denen spezifische Konzentrationen an PPi vorliegen. Diese können mit der Menge an Templatnukleinsäure korreliert werden, die in der Probe vorliegt. Zum Beispiel werden ein oder mehrere der folgenden Punkte des Datensatzes bevorzugt überwacht: i) die benötigte Zeit, um den Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität beginnt abzunehmen; ii) die benötigte Zeit, um den Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate einer Zunahme der Lichtausgabeintensität zunimmt oder abnimmt; iii) die benötigte Zeit, um den Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich von einer Zunahme in eine Abnahme (dies ist vorzugsweise der Punkt der maximalen Lichtausgabeintensität oder der „Höchstwert" der Lichtausgabeintensität) oder von einer Abnahme in eine Zunahme ändert; iv) die benötigte Zeit, um den Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate der Zunahme an Lichtausgabeintensität zunimmt oder abnimmt; und/oder v) die benötigte Zeit, um den Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität ein vorbestimmtes Maß erreicht oder überschreitet.
Zur Bestimmung der Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, auf eine quantitativen Weise sind die Punkte des Datensatzes, die überwacht werden, vorzugsweise jene Punkte, bei denen die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich signifikant ändert. Wenn der Datensatz interpretiert wird, werden die Punk te, bei denen die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich signifikant ändert, dem Fachmann offensichtlich werden.
Am meisten bevorzugt wird ein Punkt, bei dem die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich signifikant ändert, ein Punkt sein, der einen Übergang zwischen dem Zunehmen der Lichtausgabeintensität und dem Abnehmen der Lichtausgabeintensität darstellt. Ein Punkt, der einen Übergang zwischen dem Abnehmen der Lichtausgabeintensität und dem Zunehmen der Lichtausgabeintensität darstellt, ist auch ein Punkt, bei dem die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich signifikant ändert. Ein Punkt, der einen Übergang zwischen dem Zunehmen der Lichtausgabeintensität und dem Abnehmen oder dem Abnehmen und Zunehmen markiert, wird vorzugsweise als ein Wendepunkt dargestellt werden, wenn die Ergebnisse über eine Graphik der Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit dargestellt werden. Ein Punkt, bei dem sich die Lichtausgabeintensität von einer konstanten Intensität in eine Zunahme oder einer Abnahme der Intensität ändert oder ein Punkt, bei dem sich die Lichtausgabeintensität von einer Zunahme oder einer Abnahme der Intensität in eine konstante Intensität ändert, stellt auch einen Punkt dar, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant ändert.
Alternativ kann ein Punkt, bei dem sich die Lichtausgabeintensität signifikant ändert, ein Punkt sein, bei dem die Zunahmerate der Lichtausgabeintensität oder die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt oder abnimmt. Somit bezeichnet der Ausdruck „ein Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant ändert" vorzugsweise einen Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei einem vorbestimmten Zeitintervall vor diesem Punkt um mindestens 30 % von der Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei dem selben vorbestimmten Zeitintervall nach diesem Punkt unterscheidet. Weiter bevorzugt bezeichnet „ein Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant ändert" einen Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei einem vorbestimmten Zeitintervall vor diesem Punkt um mindestens 50 % von der Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei dem selben vorbestimmten Zeitintervall nach diesem Punkt unterscheidet. Noch weiter bevorzugt bezeichnet „ein Punkt, bei dem sich die Ände rungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant ändert", einen Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei einem vorbestimmten Zeitintervall vor diesem Punkt um mindestens 70 % von der Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei dem selben vorbestimmten Zeitintervall nach diesem Punkt unterscheidet. Alternativ bezeichnet „ein Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant ändert" einen Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität bei einem vorbestimmten Zeitintervall vor diesem Punkt um mindestens 10 %, 20 %, 40 %, 60 % oder 80 % von der Änderungsrate der Lichtintensität bei dem selben vorbestimmten Zeitintervall nach diesem Punkt unterscheidet. Das vorbestimme Zeitintervall beträgt vorzugsweise 30 Sekunden, kann aber alternativ 1 Minute, 1 Minute 30 Sekunden oder mehr betragen. Alternativ kann das vorbestimmte Zeitintervall weniger als 30 Sekunden betragen. Das ausgewählte vorbestimmte Zeitintervall wird von den Zeitintervallen abhängen, bei denen die Lichtausgabeintensität überwacht wird und wird von den Kinetiken der besonderen Amplifikationsreaktion abhängen, die untersucht werden soll.
Somit werden für eine quantitative Bestimmung einer oder mehrere der folgenden Punkte des Datensatzes vorzugsweise überwacht: i) der Punkt, bei dem die Lichtausgabeintensität beginnt zuzunehmen; ii) der Punkt, bei dem die Änderungsrate der Zunahme der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt oder abnimmt; iii) der Punkt, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität von einer Zunahme in eine Abnahme (vorzugsweise der Punkt maximaler Lichtausgabeintensität) oder von einer Abnahme in eine Zunahme ändert und/oder iv) der Punkt, bei dem die Änderungsrate der Zunahme der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt oder abnimmt. Die Zeit, bei der die Lichtausgabeintensität ein vorbestimmtest Maß erreicht oder überschreitet, kann auch überwacht werden.
In Ausführungsformen, in denen eine reversibel gehemmte Luciferase nicht verwendet wird, wird die Menge an Nukleinsäure, die in der Probe vorliegt, vorzugsweise auf eine quantitative Weise durch ein Überwachen einer oder mehrerer der folgenden Punkte bestimmt: i) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität beginnt zuzunehmen; ii) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität sich von einer Zunahme in eine Abnahme ändert; iii) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate der Abnahme der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt; iv) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Änderungsrate der Abnahme der Lichtausgabeintensität signifikant abnimmt; und v) die benötigte Zeit für die Lichtausgabeintensität, um ein vorbestimmtes Maß zu erreichen oder zu überschreiten.
In Ausführungsformen, in denen eine reversibel gehemmte Luciferase verwendet wird, nimmt die Lichtausgabeintensität allmählich ab, während die Luciferase durch das Produkt ihrer Reaktion gehemmt wird. Sobald eine bestimmte Menge an PPi als ein Ergebnis der Amplifikationsreaktion erzeugt ist, wird die Luciferase dann gegenüber PPi empfindlich und somit de-inhibiert, und die Lichtausgabeintensität nimmt zu. Die Lichtausgabeintensität nimmt dann allmählich ab, bis eine bestimmte Menge an PPi bei dem Punkt erzeugt worden ist, bei dem die Änderungsrate der Abnahme der Lichtsausgabeintensität zunimmt und die Lichtausgabeintensität dann auf ein Maß abnimmt, das geringer ist als die Lichtausgabeintensität einer Kontrollreaktion, bei der keine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion stattgefunden hat. Die Änderungsrate der Abnahme der Lichtausgabeintensität nimmt dann ab. Somit wird in Ausführungsformen, in denen eine reversibel gehemmte Luciferase mit der Reaktionsmischung in Schritt i) in Verbindung gebracht wird, die Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, vorzugsweise auf eine quantitative Weise durch ein Überwachen von einem oder mehreren der folgenden Punkte bestimmt: i) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem sich die Lichtausgabeintensität von einer allmählichen Abnahme in eine Zunahme ändert (d.h. der Punkt, bei dem die Lichtausgabeintensität beginnt zuzunehmen); ii) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität signifikant zunimmt (vorzugsweise von einer allmählichen Abnahme in eine schnelle Abnahme); und iii) die benötigte Zeit, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität signifikant abnimmt (vorzugsweise von einer schnellen Abnahme in eine allmähliche Abnahme).
Wie oben erwähnt, hängt die Zeit, die benötigt wird, um einen besonderen Punkt für eine besondere Templatnukleinsäure zu erreichen, von der Konzentration der Templatnukleinsäure ab, die in der Probe am Beginn der Amplifikationsreaktion vorliegt. Somit umfasst Schritt iv) eines erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise weiterhin ein Vergleichen der Lichtausgabeintensität mit der Lichtausgabeintensität einer Standardkurve, die durch die Ergebnisse von einer Anzahl von Kontrollen gebildet wird, bei denen die Proben bekannte Mengen an Templatnukleinsäure umfassen, um die Menge an Templatnukleinsäure in der Probe zu bestimmen.
Für die Bestimmung der Menge an Templatnukleinsäure, die in der Probe vorliegt, auf eine qualitative Weise, d.h. ob Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt oder nicht, ist der Punkt des Datensatzes, der überwacht wird, vorzugsweise der Punkt, bei dem die Lichtausgabeintensität eine vorbestimmtes Maß erreicht oder überschreitet.
In Ausführungsformen, in denen eine reversibel gehemmte Luciferase nicht verwendet wird, wird eine Zunahme der Lichtausgabeintensität die Gegenwart der Templatnukleinsäure in der Probe angeben. Vorzugsweise ist die Zunahme der Lichtausgabeintensität relativ zu einer Kontrollreaktion, bei der keine Amplifikation stattgefunden hat. Zum Beispiel wird eine solche Kontrollreaktion vorzugsweise eine sein, bei der keine Templatnukleinsäure vorliegt, oder eine, bei der keine Polymerase vorliegt. Somit können in diesen Ausführungsformen die Menge an Nukleinsäure, die in der Probe vorliegt, auf eine qualitative Weise durch ein Überwachen, ob die Lichtausgabeintensität über die einer Kontrolle ansteigt, in der keine Amplifikation stattgefunden hat, bestimmt werden. Weiter bevorzugt kann in diesen Ausführungsformen die Menge an Nukleinsäure, die in der Probe vorliegt, auf eine qualitative Weise durch ein Überwachen, ob die Lichtausgabeintensität ein vorbestimmtes Maß erreicht oder darüber ansteigt, bestimmt werden. Zum Beispiel könnte das vorbestimmte Maß bei 125 % oder 150 % der Lichtausgabe am Beginn der Amplifikationsreaktion bei dem Punkt festgesetzt werden, bei dem die Abnahmerate der Lichtintensität bei einem Minimum liegt. Falls die Lichtausgabeintensität dieses vorbestimmte Maß erreicht oder darüber hinaus zunimmt, wird dies die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe angeben. Falls jedoch die Lichtausgabeintensität dieses vorbestimmte Maß nicht erreicht, wird dies die Abwesenheit von Templatnukleinsäure in der Probe angeben.
Das vorbestimmte Maß kann in Abhängigkeit von einem oder mehreren Faktoren variieren, die einschließen: die verwendete Templatnukleinsäure, die Konzentration der Komponenten, die in der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet werden, und die Temperatur, die für die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet wird. Durch ein Durchführen von Kontrollexperimenten, in denen die Templatnukleinsäure vorliegt oder die Templatnukleinsäure nicht vorliegt, wird der Fachmann leicht in der Lage sein, ein geeignetes vorbestimmtes Maß zu bestimmen.
Vorzugsweise gibt die Gegenwart der Zunahme der Lichtausgabeintensität innerhalb einer dem Start der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) folgenden vorbestimmten Zeitlänge die Gegenwart der Templatnukleinsäure in der Probe an, und die Abwesenheit der Zunahme der Lichtausgabeintensität innerhalb der dem Start der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) folgenden vorbestimmten Zeitlänge gibt die Abwesenheit der Templatnukleinsäure in der Probe an. Falls zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Verfahren für ein Genotypisieren verwendet wird, bei dem eine bestimmte Menge an Testmaterial immer eine bestimme Menge eines Zieltemplat enthalten würde, kann dann, falls die Ziel Templatnukleinsäure vorliegt, zuverlässig die Aussage gemacht werden, dass falls die Lichtausgabeintensität nicht innerhalb einer vorbestimmten Zeit zugenommen hat, das Ziel dann abwesend ist.
Vorzugsweise wird die vorbestimmte Zeitlänge eine Zeit sein, die während der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) auftritt. Je weniger Templatnukleinsäure am Beginn der Reaktion vorliegt, desto länger benötigt die Amplifikationsreaktion von Schritt ii). Durch ein Durchführen einer Anzahl von Kontrollexperimenten für eine besondere Templatnukleinsäure unter einem bestimmten Satz an Reaktionsbedingungen, bei dem die Templatnukleinsäure in variierenden Konzentrationen vorliegt oder die Templatnukleinsäure nicht vorliegt, wird der Fachmann leicht in der Lage sein, eine geeignete vorbestimmte Zeit zu bestimmen, durch welche die Zunahme für diese besondere Templatnukleinsäure unter diesem besonderen Satz an Reaktionsbedingungen aufgetreten sein muss oder nicht aufgetreten sein muss. Zum Beispiel kann die vorbestimmte Zeitlänge innerhalb von 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder mehr Minuten ab dem Start der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion liegen.
Alternativ oder zusätzlich gibt ein erfindungsgemäßes Verfahren eine Abnahme der Lichtausgabeintensität relativ zu einem vorbestimmten Maß die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe an. Es wird angenommen, dass diese Abnahme auftritt, wenn die Luciferase durch PPi gehemmt wird. Zum Beispiel könnte das vorbestimmte Maß bei 25 %, 20 %, 15 %, 10 % oder 5 % der Lichtausgabe am Beginn der Amplifikationsreaktion bei dem Punkt festgesetzt werden, bei dem die Abnahmerate der Lichtintensität an einem Minimum liegt. Falls die Lichtausgabeintensität bis zu diesem vorbestimmten Maß abnimmt oder darüber hinaus abnimmt, wird dies die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe angeben. Falls jedoch die Lichtausgabeintensität dieses vorbestimmte Maß nicht erreicht, wird dies die Abwesenheit von Templatnukleinsäure in der Probe angeben.
Das vorbestimmte Maß kann in Abhängigkeit von einem oder mehreren Faktoren variieren, die einschließen: die verwendete Templatnukleinsäure, die Konzentration der Komponenten, die in der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet werden, und die Temperatur der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion. Durch das Durchführen von Kontrollexperimenten in denen die Templatnukleinsäure vorliegt oder die Templatnukleinsäure nicht vorliegt, wird der Fachmann leicht in der Lage sein, ein geeignetes vorbestimmtes Maß zu bestimmen.
Schritt iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst vorzugsweise weiterhin das Vergleichen der Lichtausgabeintensität mit der Lichtausgabeintensität von einer Kontrolle, in der keine Amplifikation stattgefunden hat. Zum Beispiel kann eine solche Kontrolle eine sein, bei der dieselben Schritte wie in einem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass entweder die Templatnukleinsäure und/oder eine der anderen Komponenten, die für die Amplifikationsreaktion benötigt werden (z.B. die Polymerase), weggelassen wird/werden. Dies ermöglicht, dass der Abfall der Biolumineszenz im Verlauf der Zeit berücksichtigt wird.
Obwohl in einem erfindungsgemäßen Verfahren eine Kontrolle vorzugsweise gleichzeitig mit der Probe, die analysiert wird, laufen gelassen wird, ist es dafür nicht erforderlich, dass das der Fall ist. Zum Beispiel kann die Kontrolle eine Kontrolle sein, die zuvor laufen gelassen worden ist, und die Daten, die daraus erhalten wurden, könnten für einen Vergleich mit zahlreichen anderen Proben verwendet werden.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren gibt eine Abnahme der Lichtausgabeintensität relativ zu einer Kontrollreaktion, in der keine Amplifikation stattgefunden hat, die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe an. Diese Abnahme relativ zur Kontrolle wird anschließen bei den anderen Änderungen der Lichtausgabeintensität relativ zur Kontrolle auftreten, die oben beschrieben sind. Das Ergebnis, dass die Lichtausgabeintensität letztlich auf ein Maß abnimmt, das geringer als eine Kontrollreaktion ist, in der keine Amplifikation stattgefunden hat, ist überraschend, da der Fachmann erwarten würde, dass die Lichtausgabeintensität weiter zunimmt, da mehr PPi erzeugt wird. Es wird angenommen, dass die Lichtausgabeintensität auf ein Maß abnimmt, das geringer als die Kontrolle ist, da die Luciferase durch PPi gehemmt wird. Obwohl das Überwachen der Lichtausgabeintensität, um zu bestimmen, ob sie geringer als jene einer Kontrolle ist, bei der keine Amplifikation stattgefunden hat, vorzugsweise während der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) durchgeführt wird, kann es alternativ nach der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) durchgeführt werden. Vorzugsweise nimmt die Lichtausgabeintensität auf ein Maß ab, das 30 % oder weniger der Lichtausgabeintensität der Kontrollreaktion beträgt. Weiter bevorzugt nimmt die Lichtausgabeintensität auf ein Maß ab, das 20 % oder weniger der Lichtausgabeintensität der Kontrollreaktion beträgt. Noch weiter bevorzugt nimmt die Lichtausgabeintensität auf ein Maß ab, das 10 % oder weniger der Lichtausgabeintensität der Kontrollreaktion beträgt. Alternativ kann die Lichtausgabeintensität auf ein Maß abnehmen, das 90 % oder weniger, 80 % oder weniger, 70 % oder weniger, 60 % oder weniger, 50 % oder weniger oder 40 % oder weniger der Lichtausgabeintensität der Kontrollreaktion beträgt.
Vorzugsweise gibt die Gegenwart der Abnahme der Lichtausgabeintensität relativ zu dem vorbestimmten Maß oder zu der Kontrollreaktion innerhalb einer dem Start der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion folgenden vorbestimmten Zeitlänge die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe an, und die Abwesenheit der Abnahme der Lichtausgabeintensität relativ zu dem vorbestimmten Maß oder zu der Kontrollreaktion innerhalb der dem Start der Amplifikationsreaktion folgenden vorbestimmten Zeitlänge gibt die Abwesenheit von Templatnukleinsäure in der Probe an. Die vorbestimmte Zeitlänge liegt vorzugsweise innerhalb 20, 25, 35, 40, 45, 50 oder mehr Minuten ab dem Start der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion. Durch das Durchführen von Kontrollexperimenten, in denen verschiedenen Konzentrationen der Templatnukleinsäure vorliegen oder Templatnukleinsäure nicht vorliegt, wird der Fachmann leicht in der Lage sein, eine geeignete vorbestimmte Zeit zu bestimmen, durch welche die Abnahme aufgetreten sein muss oder nicht aufgetreten sein muss.
Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) wird vorzugsweise innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, in welchem die Luciferase ausreichend aktiv und stabil ist, um eine ausreichende und stabile Lichtausgabe über die Dauer der Amplifikationsreaktion zu ergeben. Weiterhin ist die Amplifikationsreaktion von Schritt ii) vorzugsweise eine, die bei einer ausreichend geringen Temperatur durchgeführt werden kann und die ausreichend schnell ist, dass die Luciferase während der Amplifikationsreaktion stabil bleibt. Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann isotherm durchgeführt werden oder kann ein Thermocycling-Verfahren sein. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens isotherm durchgeführt. Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, die isotherm durchgeführt werden, sind jene Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, die nicht auf einem Thermocycling beruhen, dass die Amplifikationsreaktion weitergeht.
Beispiele von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen und die für ein Überwachen durch ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignet sind, schließen sowohl isotherme Verfahren als auch Thermocycling-Verfahren, wie PCR ein.
Isotherme Verfahren, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen, gehen mittels Strand Displacement weiter. Solche Verfahren schließen ein: Rolling Circle Amplifikation (siehe Fire, A. und Xu, S.-Q. (1995) „Rolling replication of short DNA circles", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645), Rolling Circle Amplifikation Technology (siehe http://www.molcularstaging.com/Pages/RCATdetails_.html; ein auf Phi29 basierendes Amplifikations-Kit von Amersham's, Produktionsnummern: 25-6400-10 und 25-6400-50), isotherme Verzweigungsamplifikation (Zhang, W. et al., „Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study", J. Clin. Microbiol., Jan 2002, 128-132), Restriktions-Endonuklease abhängige Strand Displacement Amplifikation (Walker, G.T., "isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA-Polymerase system", PNAS, (1992), 89, 392-396), durch Schleifen vermittelte isotherme Amplifikation (engl.: Loop Mediated Amplification (LAMP)) (Notomi, T., "Loop-mediated isothermal amplification of DNA", Nucl. Acids. Res., 2000, 28(12), e63, i-vii) und Varianten dieser Verfahren. Isotherme Nukleinsäure-Amplifikationstechniken, die keinen RNA Syntheseschritt einbeziehen und die mittels Strand Displacement Mechanismen weiter gehen, sind auch als „isotherme PCR" Techniken bekannt. Das Ergebnis, dass ein Biolumineszenz-Assay, das auf einem ELIDA Assay basiert, verwendet werden kann, um Amplifikationsreaktionen zu überwachen, die mittels des Strand Displacements weiter gehen, ist unter Anbetracht der Anzahl von Hintergrundreaktionen überraschend, die aufgrund der geringen Temperatur der Amplifikationsreaktion auftreten.
Alternativ können Thermocycling-Verfahren, die keine RNA Synthese einbeziehen, in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, dass alle Komponenten der Amplifikationsreaktion und des Biolumineszenz-Assays bei den Temperaturen stabil sind, durch welche die PCR Zyklen durchlaufen. Vorzugsweise ist die Thermocycling-Reaktion ein Niedertemperatur-Thermocycling- Verfahren, in dem eine Primer Verlängerung in einem Cycling-Temperaturbereich durchgeführt wird, der 75°C nicht übersteigt und der vorzugsweise 70°C nicht übersteigt, und das eine mäßig thermostabile DNA-Polymerase verwendet. Ein solches Verfahren ist eine LoTemp^® PCR, die eine HiFi^® DNA-Polymerase verwendet und unter www.hifidna.com/FQAall.htm beschrieben ist. Alternativ ist die Thermocycling-Reaktion ein Niedertemperatur-Thermocycling-Verfahren, welches das Klenow Fragment einer DNA-Polymerase I in der Gegenwart von Prolin verwendet (siehe Nucleic Acid Research, (1999), 27(6), 1566-1568).
Beispiele isotherme Amplifikationsreaktionen, die einen RNA Syntheseschritt einbeziehen und die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren überwacht werden können, schließen Transkriptionsvermittelte Amplifikationen (engl.: transcription mediated amplification (TMA)) oder eine auf einer Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikation (engl.: nucleic acid sequence based amplification (NASBA)) (Guatelli, J.C. et al., "Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled after retroviral replication", PNAS, (1990), 87, 1874-1878) und Varianten dieser Verfahren ein.
Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) wird innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, innerhalb dessen die Komponenten der Amplifikationsreaktion und des Biolumineszenz-Assays stabil bleiben. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereich durchgeführt, der 75°C nicht überschreitet. Weiter bevorzugt wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 70°C nicht überschreitet. Noch weiter bevorzugt wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 65°C nicht überschreitet. Am meisten bevorzugt wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 60°C nicht überschreitet, d.h. ein Temperaturbereich, innerhalb dessen die thermostabile Luciferase Ultra-Glow von Promega ausreichend aktiv und stabil ist, um eine ausreichende und stabile Lichtausgabe über die Dauer der Amplifikationsreaktion zu ergeben. Alternativ kann die Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt werden, der 55°C, 50°C, 45°C oder 40°C nicht überschreitet.
Vorzugsweise wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 20°C nicht unterschreitet. Weiter bevorzugt wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 30°C nicht unterschreitet. Noch weiter bevorzugt, wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt, der 40°C nicht unterschreitet. Alternativ kann die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt werden, der 25°C, 35°C, 45°C, 50°C, 55°C oder 60°C nicht unterschreitet.
Vorzugsweise wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs von 30°C bis 75°C durchgeführt. Weiter bevorzugt wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb des Temperaturbereichs von 30°C bis 65°C durchgeführt. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb des Temperaturbereichs von 45°C bis 65°C oder 35°C bis 40°C durchgeführt werden.
Die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) kann bei einer konstanten Temperatur innerhalb des oben spezifizierten Temperaturbereichs durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion bei 37°C durchgeführt. Zum Bespiel kann unter Verwendung eines mutierten Leuchtkäfer Luciferaseenzyms, das bei 37°C stabil ist (Wildtyp Enzym inaktiviert schnell bei dieser Temperatur), die Erzeugung von PPi während der isothermen Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer Standard ELIDA Reaktion überwacht werden. Ein Beispiel eines mutierten Leuchtkäfer Luciferaseenzyms, das bei 37°C stabil ist und das für eine Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, wird von Tisi, L. et al. beschrieben (Tisi, L. C. et al., (2002) „Development of a thermostable firefly luciferase", Analytica Chimica Acta, Bd. 457, 115-123).
Alternativ kann die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) bei mehr als einer Temperatur innerhalb des bevorzugten Temperaturbereichs durchgeführt werden.
Falls festgestellt wird, dass die Luciferase, die verwendet wird, eine geringere gesamte Lichtausgabeintensität aus dem Biolumineszenz-Assay erzeugt (ob Amplifikation auftritt oder nicht), wenn die Temperatur, bei der die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, erhöht wird, ist es für die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) vorteilhaft, sie bei einer geringeren Temperatur ablaufen zu lassen. Dies weist den zweifachen Vorteil auf, dass die Lichtausgabeintensität erhöht wird und dass die Amplifikationsreaktion langsamer auftritt. Eine langsamere Amplifikationsreaktion ist insbesondere für eine quantitative Analyse vorteilhaft, da die Datenpunkte, die den verschiedenen Punkten entsprechen, bei denen eine Variation in der Änderungsrate der Lichtintensität mit der Zeit vorliegt, für Proben mit unterschiedlichen Mengen der Templatnukleinsäure über eine längere Zeitdauer als wenn die Amplifikationsreaktion bei der höheren Temperatur überwacht wird auftreten, und somit leichter zu überwachen sind.
Jedoch könnte ein Ablaufen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion bei einer geringeren Temperatur potenziell die Spezifität der Amplifikationsreaktion beeinflussen. Zum Beispiel könnte sich eine höhere Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnisses ergeben, wenn die Temperatur der Amplifikationsreaktion verringert wird, da die Wahrscheinlichkeit einer Wiederanlagerung von Primern an Sequenzen abweichend von der erwünschten Zielsequenz ansteigt, wenn die Temperatur der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verringert wird. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, in dem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) bei einer höheren Temperatur begonnen wird und anschließend auf eine geringere Temperatur abfällt. Vorzugsweise liegen diese höhere und geringere Temperatur innerhalb eines bevorzugten Temperaturbereichs, wie oben diskutiert. Dies weist den Vorteil auf, dass die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion bei einer höheren Temperatur ausgelöst werden kann, bei der die Spezifität größer ist, bevor die Amplifikation in eine nachweisbare, exponentielle Phase eintritt, kann die Temperatur dann erniedrigt werden, um die Lichtintensität zu erhöhen und den Ablauf der Ergebnisse zu verlangsamen.
Die relativ geringe Temperatur der isothermen Verfahren und die geringe Temperatur der Thermocycling-Verfahren im Vergleich zu Verfahren, die eine herkömmliche Thermocycling PCR verwenden, bei der die Temperatur auf 95°C erhöht wird, ermöglichen, dass kleinere Probenvolumina analysiert werden. Insbesondere in Ausführungsformen, in denen der Temperaturbereich 55°C nicht übersteigt, können ausnehmend kleine Probenvolumina durch ein erfindungsgemäßes Verfahren analysiert werden. Zum Beispiel können Probenvolumina von weniger als 10 μl und sogar Proben von weniger als 1 μl durch ein erfindungsgemäßes Verfahren analysiert werden. Die hohen Temperaturen, die bei einer herkömmlichen PCR erforderlich sind, machen sehr kleine Probenvolumina zu einer technischen Herausforderung. Die Fähigkeit, sehr kleine Probenvolumina zu analysieren, hat auch den Vorteil des Herabsetzens von Reagenzkosten.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfordert somit ein erfindungsgemäßes Verfahren, dass in der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) die Polymerasereaktion isotherm durchgeführt wird und dass die Luciferase, die verwendet wird, bei dieser Temperatur stabil ist. Dies bietet die folgenden Vorteile:

i) die isotherme Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion könnte kontinuierlich in Echtzeit überwacht werden;
ii) die isotherme Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion könnte in einem vollständig geschlossenen System ohne das Erfordernis einer weiteren Reagenzzugabe überwacht werden;
iii) die relativ geringe Temperatur des Assays würde es ermöglichen, dass ausnehmend kleine Probenvolumina analysiert werden können (die hohe Temperatur herkömmlicher PCR macht sehr kleine Probenvolumina zu einer technischen Herausforderung), so dass Reagenzkosten herabgesetzt werden; und
iv) eine einfache CCD Kamera könnte eingesetzt werden, um gleichzeitig tausende isotherme PCR Reaktionen zu überwachen.

Es ist ein Merkmal der Erfindung, dass PPi von der Nukleinsäuresynthese während der Nukleinsäure-Amplifikation nachgewiesen werden kann, wenn die Nukleinsäure, die synthetisiert worden ist, durch eine Gelelektrophorese nicht nachweisbar wäre, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und einer verringerten Amplifikationszeit führt. Während weiterhin das Trübungsverfahren von Mori et al. (Mori, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., (2001) 289, 150-154) PPi Konzentrationen von ~0,6 mM erfordert bevor eine signifikante Trübung beobachtet wird, führen unter Verwendung eines Pyrophosphat-Assays, in dem PPi durch ATP-Sulphurylase zu ATP umgesetzt wird und durch das das erzeugte ATP durch eine Luciferase verwendet wird, um Licht zu erzeugen, PPi Konzentrationen von weniger als 0,5 μM zu einem linearen Verhältnis zwischen der PPi Konzentration und der Biolumineszenz (Nyren & Lundin, Analytical Biochemistry, 151(2), 405-409 (1985)). Dies stellt eine Zunahme der Empfindlichkeit eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweisen von PPi von mindestens 1200-fach im Vergleich zu einem Trübungsassay dar. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch empfindlicher als auf Fluoreszenz basierende Verfahren.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann in medizinischen Diagnostikanwendungen verwendet werden. Derzeit müssen die meisten diagnostischen Testzentren ihre Tests zur Analyse versenden, da herkömmliche Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, wie PCR, eine komplizierte Hardware und Optik erfordern. Die Verwendung eines wie oben beschriebenen Verfahrens wird ermöglichen, dass Testergebnisse am Ort der Untersuchung analysiert werden können. Zum Beispiel könnte es in Kliniken, die für die auf das Geschlecht bezogene Gesundheit sorgen, verwendet werden, um zum Beispiel zu sehen, ob ein Pathogen, wie ein besonderes Bakterium oder ein besonderes Virus, in einer Probe vorliegt. Es kann auch verwendet werden, um die Menge an Bakterien oder Viren die in einer Probe vorliegen, zu bestimmen, um zum Beispiel das Ausmaß einer Infektion zu bestimmen.
Eine weitere Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Bestimmen, ob eine besondere Nukleinsäuresequenz im genetischen Code eines Organismus vorliegt. Zum Beispiel könnte es zum Bestimmen verwendet werden, ob die Nukleinsäure, von der die Templatnukleinsäure abstammt, genetisch modifiziert worden ist, zum Nachweis von DNA, die mit einer besonderen nicht genetisch modifizierten Sorte einer Pflanze oder einer genetisch modifizierten Pflanze in Verbindung gebracht wird, zum Nachweis einer DNA, die mit Stammbaumrassen eines Tieres in Verbindung gebracht wird, oder zu medizinischen oder veterinärmedizinischen diagnostischen Anwendungen, wie eine genetisches Testen oder der Forensik.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann verwendet werden, um die Gegenwart eines Organismus in einer Probe nachzuweisen. Wie oben erwähnt kann dieser Organismus ein Pathogen sein. Jedoch kann das Verfahren auch verwendet werden, um einen nicht pathogenen Organismus nachzuweisen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann auch in der Immuno-Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie verwendet werden (als Beispiel siehe Sano, T. et al., (1992) Science, Bd. 258, 120-122) (z.B. zur Identifikation einer besonderen Templatnukleinsäure, die mit einem Antikörper verbunden ist). Das Verfahren ist auch für eine Verwendung in situ geeignet, worin Techniken, wie Fluoreszenz oder Absorptionsvermögen, technisch schwierig zu verwenden wären. Zum Beispiel könnte ein erfindungsgemäßes Verfahren auf einer Metalloberfläche verwendet werden. Somit kann ein erfindungsgemäßes Verfahren verwendet werden, um zum Beispiel Prione auf einer Skalpellklinge zu suchen.
Obwohl Kits nicht besonders vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung umfasst sind, kann ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleinsäure-Polymerase, die Substrate für die Nukleinsäure-Polymerase, mindestens zwei Primer, eine thermostabile Luciferase, Luciferin und gegebenenfalls ATP-Sulphurylase und Adenosin-5'-Phosphosulfat umfassen. Weiter bevorzugt umfasst das Kit weiterhin Pufferreagenzien, wie eine Magnesiumionen Quelle. Alternativ kann ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren nur einige dieser Komponenten und/oder zusätzliche Komponenten umfassen. Die Probe und irgendwelche anderen Komponenten, die aus dem Kit weggelassen worden sind, können dann zu dem Kit während der Verwendung zugegeben werden.
Zum Beispiel kann ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren Gefäße umfassen, die jeweils enthalten:

a) eine gepufferte Mischung einer Nukleinsäure-Polymerase, eine Mg Quelle und dNTPs; und
b) eine Luciferase, ein Luciferin und eine ATP-Sulphurylase.

Vorzugsweise ist mindestens eine der Komponenten des Kits lyophilisiert oder liegt in einer anderen Form vor, die für eine Lagerung im Kit geeignet ist. Weiter bevorzugt sind alle Komponenten des Kits lyophilisiert oder liegen in einer oder mehren anderen Formen vor, die für eine Lagerung im Kit geeignet sind. Solche anderen Formen schließen Komponenten, zu denen stabilisierende Faktoren zugegeben worden sind, und/oder einen gekühlten oder gefrorenen Mastermix ein, der Komponenten des Kits enthält.
Eine bevorzugte Form eines Kits ist ein Miniatur „Flüssigkeits" Kreislauf. Vorzugsweise wird ein Kit zur erfindungsgemäßen Verwendung in der Größe einer Kreditkarte für eine leichte Handhabung vorliegen.
Ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren kann verwendet werden, um eine Probe zur gleichen Zeit oder mehr als eine Probe zur gleichen Zeit zu analysieren. Zum Beispiel kann ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um 2, 3, ..., 50, ..., 100, ... 200 bis zu 1000-de Proben zur gleichen Zeit zu überwachen.
In Ausführungsformen, in denen ein erfindungemäßes Verfahren verwendet wird, um mehr als eine Probe zur gleichen Zeit zu überwachen, kann das Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart einer Nukleinsäure derselben Sequenz in jeder Probe verwendet werden, oder es kann zum Nachweisen der Gegenwart von Templatnukleinsäuren mit verschiedenen Sequenzen in verschiedenen Proben verwendet werden.
Die Ergebnisse können auf einer Testkarte dargestellt werden, welche die Ergebnisse von einer Probe oder mehr als einer Probe darstellt. Vorzugsweise liegt die Testkarte etwa in der Größe einer Kreditkarte für eine leichte Handhabung vor.
Die Erfindung wird nun weiter nur beispielhaft unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 eine Anordnung zeigt, die verwendet wird, um eine LAMP Reaktion zu verfolgen;
2 die Ausgabe von der LAMP in der Gegenwart einer Ziel DNA und bei einer Kontrolle ohne Bst DNA-Polymerase zeigt;
3 die Ergebnisse von doppelten LAMP Proben und doppelten Kontrollen zeigt;
4 die Ergebnisse von Proben zeigt, die wie in 2 & 3 hergestellt wurden, die aber Unterschiede in der absoluten Lichtintensität zeigen;
5 die Lichtemissionsprofile für LAMP unter Verwendung verschiedener Mengen an Zieltemplat (2-fache Ausführung) bei 55°C zeigt;
6 die Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission zeigt;
7 ein Diagramm der Rohausgabe von einer LAMP Reaktion in dreifacher Ausführung zeigt;
8 Diagramme der 1. Ableitung der in 7 gezeigten Kurven zeigt;
9 einen Vergleich von Kontrollen mit Proben zeigt;
10 eine LAMP Reaktion zeigt, bei der die Temperatur von 55°C auf 50°C nach zehn Minuten verringert wird;
11 ein Diagramm der Lichtintensität gegen die Zeit für ATP-Sulphurylase freie LAMP mit unterschiedliche Mengen an Starttemplat zeigt; und
12 ein differenzielles Diagramm (subtrahierte Kontrolle) der normalisierten Lichtausgaben für die ATP-Sulphurylase freien LAMP Reaktionen der Proben zeigt, die unterschiedliche Mengen an Zieltemplat enthalten.
BEISPIELE
Beispiel 1: Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens
Die isotherme Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, bekannt als durch Schleifen vermittelte Amplifikation (LAMP), wurde ausgewählt, um das Potenzial zum Verwenden eines einfachen Biolumineszenz-Assays beispielhaft darzustellen, um eine Nukleinsäure-Amplifikation in Echtzeit zu verfolgen.
Die vorliegende, schnellste Form des LAMP Verfahrens verwendet sechs Primer. Diese Form ist darstellt worden, um 10⁵ Kopien einer Ziel DNA in nur 15 Minuten nachzuweisen (Nagamine et al., 2002, Molecular and Cellular Probes, 16, S. 223-229). LAMP Reaktionen laufen normalerweise bei 60-65°C ab und erfordern mindestens 4 mM Magnesiumionen.
Um eine Biolumineszenzausgabe in Echtzeit von einer LAMP Reaktion darzustellen, war es insbesondere erforderlich, Mittel zu finden, um die Temperatur zu erniedrigen, bei der die LAMP Reaktion abläuft. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass bei Temperaturen von mehr als 65°C selbst die thermostabilste Käfer Luciferase, die derzeit bekannt ist (die thermostabile Luciferase Ultra-Glow von Promega), nicht ausreichend aktiv und/oder stabil ist, um eine ausreichende und stabile Lichtausgabe über die Dauer einer LAMP Amplifikation zu ergeben (etwa 45 Minuten oder länger dürften erforderlich sein, um zu bestätigen, dass eine Probe kein besonderes Ziel DNA Molekül enthält).

Es wurde erkannt, dass ein Erniedrigen der Konzentrationen an Magnesiumionen von 4 mM auf 2 mM es ermöglicht, dass LAMP Reaktionen erfolgreich bei geringeren Temperaturen ablaufen. Weiterhin verringern hohen Konzentrationen an Betain die Fähigkeit von LAMP Reaktionen, reproduzierbar und erfolgreich bei geringeren Temperaturen abzulaufen. Schließlich wurden geeignete stabilisierende Mittel, welche die LAMP Reaktion nicht beeinträchtigen, ausgewählt und in die Formulierungen eingeschlossen. Als ein Ergebnis war es möglich, Bedingungen zu formulieren, bei denen ein Biolumineszenz-Assay gleichzeitig mit einer LAMP Reaktion über die gesamte Dauer der Amplifikation auftreten konnte. Startmaterialien: 1) Reaktionsmischung (wenig Bst DNA-Polymerase oder Ziel DNA)

Menge	Reagenz	Zulieferer
20 mM	Tris-Acetat	Sigma
10 mM	KCl	"
10 mM	Ammoniumsulfat	"
2 mM	Magnesiumsulfat	"
0,10 % V/V	Triton X-100	"
0,5 % W/V	BSA	"
5 % W/V	Trehalose	"
0,4 mg/ml	Polyvinylpyrrolidon	"
9 mM	Dithiothreitol	Melford
100 μg/ml	D-Luciferin (Kaliumsalz)	Europa
54 ng/ml	Luciferase Ultra-Glow	Promega
100 μM	Adenosin-5'-Phosphosulfate	Sigma
0,5 U/ml	ATP-Sulphurylase	"
250 μM	jeweils der vier dNTPs	Amersham Biosci.
0,8 μM	LAMP B1cB2 Primer	PNAC Cambridge UK
0,8 μM	LAMP F1F2c Primer	"
0,4 μM	LAMP Loop B Primer	"
0,4 μM	LAMP Loop F Primer	"
0,2 μM	LAMP B3 Primer	"
0,2 μM	LAMP F3c Primer	"

pH Wert 0,8 @ 25°C (siehe unten für Primersequenzen)

2) DNA-Polymerase

8 U/μl Bst DNA-Polymerase, New England Biolabs

3) Templat DNA

catgaattcgtcaagtctacgataacttagcgcttaggatgtcagatacttatgatgataagctgatagactatcttgc ctggaagcttacttcataatggatgacgtatgccatgatagataccattgtctagacataagactttcaatctgcatag tcatgatcgatccatgctcgagtccaagctagtcatagcttatcatcaactgaatctagtaagtcattgaattctag

Primer Sequenzen

LAMP B1cB2: tat cat ggc ata cgt cat cca ttt tta taa gct gat aga cta tct tgc
LAMP F1F2c: tca atc tgc ata gtc atg atc gtt ttt tga tga taa gct atg act agc
LAMP Loop B: tat gaa gta agc ttc cag
LAMP Loop F: atc cat gct cga gtc caa
LAMP B3 Primer: atg tca gat act tat gat g
LAMP F3c Primer: aat gac tta cta gat tca g

Methode
In ein 200 μl PCR Röhrchen wurden 18,6 μl der Reaktionsmischung zugegeben, gefolgt von 1 μl einer 0,4 ng/μl Templat DNA und 0,4 μl einer Bst DNA-Polymerase. Als eine Kontrolle wurden in einem weiterem 200 μl PCR Röhrchen 18,6 μl der Reaktionsmischung und 0,4 ng/μl der Templat DNA zugegeben, aber keine Bst DNA-Polymerase.
Die Proben wurden auf einem bei 50°C gehaltenen Heizblock gestellt, der in ein Syngene GeneGenius Lichtgehäuse (www.syngene.co.uk) gestellt worden war. Unter Verwendung der Syngene Genesnap Software (www.syngene.co.uk) wurde eine Lichtemission von den Proben aufgezeichnet (durch die geschlossenen Deckel der PCR Röhrchen), wobei eine Reihe von Bildern mit einer CCD Kamera innerhalb des Syngene Lichtgehäuses aufgenommen wurde (1). Jedes Bild stellt die integrierte Lichtemission von der Probe über einen Zeitraum von einer Minute dar.
Insgesamt wurden 40 Frames aufgezeichnet, daher wurde die LAMP Reaktion insgesamt für 40 Minuten beobachtet.
Ergebnisse
Unter Verwendung der Syngene Software wurde die Lichtausgabe von jeder der Proben als eine Funktion der Zeit quantifiziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Unter Verwendung einer Agarose Gelelektrophorese wurde bestätigt, dass die „Probe" (mit der Templatnukleinsäure) in der Tat signifikante Menge an DNA amplifiziert hat, während die Kontrolle nichts synthetisiert hat.
Eine Anzahl von Merkmalen über die Lichtemission wurde bemerkt, die sich im Fall der Amplifikation ergeben.

i) Anfänglich waren die Lichtabnahmerate für die Probe und die Kontrolle ähnlich;
ii) nach einer Zeitdauer begann die Lichtintensität von der Probe zuzunehmen, während die Kontrolle weiter allmählich abnahm;
iii) die Zunahmerate der Lichtemission von der Probe nahm zu, erreichte ein Maximum, nahm dann ab, bis ein Punkt erreicht war, bei dem die größte Menge an Lichtemission während der LAMP Reaktion aufgezeichnet wurde;
iv) nach diesem Maximum an Lichtemission von der Probe wurde eine Abnahme der Lichtemission beobachtet;
v) die Abnahmerate der Lichtemission nahm nach der maximalen Lichtemission zu, und die Menge der Lichtemission wurde weniger als die der Kontrolle;
vi) die Abnahmerate der Lichtemission nahm ab und wurde letztlich der der Kontrolle ähnlich;
vii) am Ende der 40 Minuten betrug die Menge der Lichtemission von der Probe beachtlich weniger als die Kontrolle, obwohl in diesem Fall die Startintensität an Licht der Probe leicht höher war (was auf die Tatsache Bezug nimmt, dass die Lichtemission der Proben nicht auf irgendeine Weise bearbeitet wurde, um die relative Position der Proben relativ zu der Kamera zu berücksichtigen).

Es wird angenommen, dass die Abnahme der Lichtintensität nach dem Höchstwert der Lichtintensität ein Ergebnis dessen ist, dass die Luciferase durch das Pyrophosphat gehemmt wird. Als solcher stellt in der LAMP Reaktion der Höchstwert an Lichtintensität einen Zeitpunkt dar, bei dem sich eine spezifische Menge an Pyrophosphat angehäuft hat. Deshalb stellt der Höchstwert an Lichtintensität einen Zeitpunkt dar, bei dem eine spezifische Menge an DNA synthetisiert worden ist.
Beispiel 2: Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer LAMP Amplifikationsreaktion
Dasselbe Verfahren wurde, wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme durchgeführt, dass mehrere Proben verwendet wurden, um die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zu beurteilen, die in der LAMP Reaktion erhalten wurden.
Startmaterialien und Methoden
Wie in Beispiel 1, nur mit der Ausnahme, dass die Probe und die Kontrolle zweifach oder dreifach durchgeführt wurden und die Temperatur der Reaktion auf 55°C erhöht wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Derselbe Verlauf der Probenkurve wie in Beispiel 1 ist in diesem Fall zu sehen.
In diesem Beispiel sind sowohl die Änderungsrate der Lichtemission als auch die Zeit bis zur maximalen Lichtemission für beide der Beispiele sehr ähnlich. Wieder wird eine Erzeugung von amplifizierter DNA in den Proben durch eine Agarose Gelelektrophorese bestätigt. Während für die Kontrollen die Änderungsrate der Lichtemission in beiden Fällen ähnlich ist, liegt ein geringer Unterschied zum absoluten Wert vor. Wieder wird geglaubt, dass dies eher auf die Wirkungen zurückzuführen ist, die mit dem Lichteinfang durch das verwendete System als mit irgendeinem biochemischen Aspekt in Verbindung gebracht werden. Trotzdem können selbst ohne Datenbearbeitung eindeutige Ergebnisse erhalten werden.
In einigen Fällen könnte die absolute Lichtintensität, die innerhalb z.B. dreifachen Proben beobachtet wird, aufgrund von Lichteinfangwirkungen variieren. Trotzdem sind die Lichtänderungsrate und die Zeit bis zur maximalen Lichtemission ähnlich (4).
Beispiel 3: Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine quantitative Weise
Startmaterialien und Methoden
Dasselbe Verfahren, das in Beispiel ein skizziert ist, wurde wiederholt, aber mit verschiedenen Mengen an Ziel DNA in den Proben. Zweifache Proben wurden vorbereitet, die eine Gesamtmenge von entweder 0,4 ng, 40 pg, 4 pg, oder 0,4 pg Templatnukleinsäure enthielten. Die Temperatur der LAMP Reaktion betrug 55°C.
Ergebnisse
Die Profile der sich ergebenen Lichtemissionen für jede der Proben sind in 5 gezeigt. Die in 5 erhaltenen Ergebnisse stellen eine Schlüsseleigenschaft der erfindungsgemäßen Verfahren dar. Während keine überzeugende Korrelation zwischen der Menge an Zieltemplat und der absoluten Lichtemission vorliegt, liegt eine klare Beziehung zwischen der Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission oder der Zeit bis zu Änderungen in der Änderungsrate der Lichtemission vor.
Ein Diagramm der Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission gegen die Menge an Ziel DNA stellt dar, dass die Korrelation quantitativ ist (siehe 6a, in der die Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission eine lineare Korrelation mit dem log10 der Konzentration an DNA Zieltemplat in der Probe aufweist). In 6b wird die Zeit, um 25 % der gesamten Endmenge an Amplikon zu erzeuge, mit der Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission aufgetragen, und es kann gesehen werden, dass die zwei Parameter korrelieren. Somit stellt ein Vergleichen der Zeiten bis zum Höchstwert der Lichtemission mit Ergebnissen, die mit Agarose Gelelektrophorese erhalten wurden, dar, dass die Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission die Anreicherung von Amplikon und somit die Menge an Templatnukleinsäure widerspiegelt, die in der Probe vorliegt.
Beispiel 4: Datenbearbeitung von Ergebnissen von einem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion eine LAMP Reaktion ist
Dasselbe Verfahren, wie in Beispiel 1, wurde wieder durchgeführt, aber unter Verwendung mehrer Proben, um die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zu beurteilen, die in der LAMP Reaktion erhalten wurden nachdem eine gewisse einfache Datenbearbeitung der Rohdaten durchgeführt worden waren. Insbesondere die 1. Ableitung der Ausgaben wurde graphisch dargestellt.
Startmaterialien und Methoden
Diese sind wie für Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass die Probe und die Kontrolle dreifach durchgeführt wurde, die Temperatur 50°C betrug und insgesamt ein ng Templat in jeder Probe verwendet wurde.
7 zeigt ein Diagramm von Rohdaten aus einem erfindungsgemäßen Verfahren mit diesen Proben. Durch ein graphisches Darstellen der Änderungsrate der Lichtemission im Verlauf der Zeit im Gegensatz zur Lichtintensität im Verlauf der Zeit (d.h. graphisches Darstellen der 1. Ableitung) werden Wendepunkte hervorgehoben. Insbesondere Bereiche der Kurven, die in 7 gezeigt sind, die durch ein Minimum oder Maximum laufen, schneiden die Y Achse bei 0, wenn die 1. Ab leitung der Kurve graphisch dargestellt wird (7). Während die Menge der Intensitäten eine beachtliche Varianz zeigt, sind die Wendepunkte innerhalb der Sätze der Kurven ähnlich.
Die Kurven in 8 für die Proben, bei denen LAMP Amplifikationsreaktion stattgefunden hat, zeigen zwei Punkte, welche die Y-Achse überschreiten. Der erste stellt den ersten Wendepunkt von 7 dar, und der zweite stellt den Punkt der maximalen Lichtintensität dar. Das Minimum und das Maximum, die in 8 gesehen werden, heben Zeitpunkte hervor, die mit maximalen Änderungsraten der Lichtemission in Verbindung gebracht werden. Alle vier Datenpunkte (die zwei Y-Achsenschnittpunkte und das Minimum und das Maximum) zeigen eine gute Überlagerung zwischen den dreifachen Proben. Zu bemerken ist, dass der erste Y-Achsenschnittpunkt fast zehn Minuten vor dem zweiten auftritt.
9 zeigt eine vergrößerte Ansicht der Kurven von 8 und hebt hervor, wie ein graphisches Darstellen der 1. Ableitung die Probe im Vergleich zur Kontrolle unterscheidet.
Aufgrund des inherenten Informationsgehalts der Rohdaten aus einem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer LAMP Reaktion ermöglicht somit selbst eine sehr einfache Datenbearbeitung, wie ein Durchführen der 1. Ableitung, nicht nur dass klare Punkte der sich ergebenden Kurven identifiziert werden können (Y-Achsenschnittpunkte und Maximum und Minimum), sondern sorgt auch dafür, dass die Ergebnisse weniger empfindlich gegenüber der Menge der Lichtsignale werden (verglichen wird z.B. die Überlagerung der Kurven in 7 und 8 – in 8 ist die Überlagerung ähnlicher).
Beispiel 5: Änderung der Temperatur der Amplifikationsreaktion während der Amplifikation
Das LAMP Verfahren kann so geschaffen werden, dass es über den Temperaturbereich von ungefähr 45°C bis 65°C funktioniert. Jedoch je höher die Temperatur ist, bei der die LAMP Reaktion abläuft, desto geringer ist die gesamte Lichtintensi tät eines erfindungemäßen Verfahrens (ob eine Amplifikation auftritt oder nicht). Dies ist auf die verwendete besondere thermostabile Luciferase (die Luciferase Ultra-Glow von Promega) zurückzuführen, welche die Lichtreaktion offensichtlich bei einer geringeren Rate bei höheren Temperaturen katalysiert. Somit ist die Lichtemission, die für die Luciferase Ultra-Glow bei 55°C beobachtet wird, beachtlich geringer, als jene, die bei 50°C beobachtet wird. Jedoch wird nach einem Kühlen von z.B. 55°C auf 50°C eine Zunahme der Lichtemission beobachtet, die durch die Luciferase Ultra-Glow katalysiert wird, daher ist die Wirkung klar reversibel. Die Reversibilität bedeutet, dass die beobachtete Abnahme der Lichtemission bei einer hohen Temperatur nicht nur das Ergebnis eines Denaturierens der Luciferase ist.
Ein Ablaufen einer LAMP Reaktion bei einer Temperatur erhöht daher die Lichtemission von dem Assay. Weiterhin kann ein Ablaufen einer LAMP bei geringeren Temperaturen die Reaktion selbst verlangsamen. Dies kann unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft sein. Wenn zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Verfahren quantitativ verwendet wird, könne sich Vorteile beim Verlangsamen der Amplifikation ergeben, so dass die benötigten Zeiten, um z.B. den Höchstwert der Lichtemission für Proben mit unterschiedlichen Mengen an Zieltemplat zu erreichen, zeitlich stärker getrennt werden als wenn die LAMP Reaktion bei einer höheren Temperatur abläuft.
Jedoch könnte ein Ablaufen von LAMP Reaktionen bei geringen Temperaturen die Spezifität des Vorgangs beeinflussen, das heißt, es könnte sich eine höhere Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse ergeben, da die Temperatur der LAMP verringert ist. Mit anderen Worten nehmen die Wahrscheinlichkeiten einer Wiederanlagerung von Primern an Sequenzen abweichend von der erwünschten Zielsequenz zu, da die Temperatur der LAMP Reaktion verringert wird.
Ein möglicher Kompromiss, um die Vorteile eines Ablaufens der LAMP Reaktion bei geringen Temperaturen zu nutzten und dennoch die maximale Spezifität beizubehalten ist es, die Temperatur während der LAMP Reaktion zu ändern. Insbesondere kann die LAMP Reaktion bei einer höheren Temperatur, bei der die Spe zifität höher ist, ausgelöst werden, anschließend kann, bevor die Amplifikation in eine nachweisbare exponentielle Phase eintritt, die Temperatur erniedrigt werden, um die Lichtintensität zu erhöhen und den Verlauf der Ergebnisse zu verlangsamen.
Startmaterialien und Methoden
Wie für Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass eine Vielfalt von Proben mit unterschiedlichen Mengen an Zieltemplat wie in Beispiel 3 getestet wurden (über den Bereich von 0,02 pg/μl bis 20 pg/μl, d.h. 0,4 pg Gesamtprobe bis 0,4 ng Gesamtprobe). Die LAMP Reaktion wurde bei 55°C ausgelöst, anschließend wurde die Temperatur auf 50°C nach 10 Minuten verringert.
Ergebnisse
Die Rohdaten, die aus den Daten mit einer Temperaturänderung erhalten wurde, sind in 10 gezeigt. Die in 10 gezeigten Daten zeigen, dass das Verfahren mit der Temperaturänderung in der Tat zu einer Zunahme der Lichtemissionsintensität nach einem Abfallen der Temperatur führt. Weiterhin bleibt die LAMP quantitativ insofern, dass die Zeit bis zum Höchstwert der Lichtemission eine Funktion der Startmenge an Templat DNA bleibt. Aus einem Vergleichen von 10 mit 5, wobei äquivalente Mengen an Zieltemplat mit LAMP getestet werden, aber bei einer einzigen Temperatur von 55°C, kann gesehen werden, dass der Zeitunterschied zwischen der Probe mit dem meisten Templat (0,4 ng gesamt/20 pg/μl) und dem wenigsten Templat (0,4 pg gesamt/0,2 pg/μl) ungefähr 8 Minuten beträgt, während im Verfahren mit der Temperaturänderung, das in 10 gezeigt ist, der Zeitunterschied ungefähr 14 Minuten beträgt.
In der Tat können Temperaturen, die höher als 55°C liegen, anfänglich verwendet werden, da, obwohl die Luciferase Ultra-Glow bei 60°C beginnt instabil zu werden, sie es tolerieren kann, sich bei höheren Temperatur für kurze Zeitdauern zu befinden. Dieser Ansatz erhöht deshalb die verfügbaren Temperaturbereiche.
Weiterhin kann dieser Ansatz es ermöglichen, dass weniger stabile Luciferasen eingesetzt werden, falls die Amplifikationsreaktion keine langen Zeitdauern bei Temperaturen benötigt, welche die Luciferase irreversibel inaktivieren können.
Während schließlich klar falsch positive Ergebnisse weiterhin unter Verwendung des Verfahrens mit der Temperaturänderung auftreten können, sollten sie aufgrund der erhöhten Stringenz der höheren Temperaturen bei der anfänglichen Schlüsselphase der Amplifikation weniger häufig sein (d.h. genau vor der exponentiellen Phase).
Beispiel 6: Auf reversibel gehemmter Luciferase basierendes Verfahren
Wie oben diskutiert weist Pyrophosphat direkte Wirkungen auf Luciferase auf. Erstens kann Pyrophosphat unter bestimmten Bedingungen die Hemmung abbauen, welche die Luciferase in der Gegenwart bestimmter Inhibitoren durchläuft, welche Oxyluciferin, das Produkt der Lichtreaktion, einschließen. Zweitens kann Pyrophosphat selbst Luciferase bei hohen Konzentrationen hemmen. Ob Pyrophosphat Licht emittierende Reaktion, die durch Luciferase katalysiert wird, stimuliert oder hemmt oder eben nicht, hängt von einer Anzahl Faktoren ab, die den genauen Typ der Luciferase, die Temperatur, die Konzentration an Pyrophosphat, die Gegenwart anderer Verbindungen, die eine Luciferase Aktivität beeinflussen können, einschließen. Dieses Beispiel zeigt, wie die hemmende Wirkung von Pyrophosphat verwendet werden kann, um eine LAMP Reaktion zu verfolgen. Ein grundlegender Aspekt dieses Ansatzes ist, dass die Gegenwart von ATP in der Probe toleriert werden kann: In Verfahren, in denen das Biolumineszenz-Assay auf dem Nachweis von ATP durch die Luciferase mit der Erzeugung von Licht beruht, würden signifikante Mengen an endogenem ATP in der Probe die Verwendung des Assays stark beeinträchtigen.
Die Tatsache, dass das ATP-Sulphurylase freie Verfahren ATP toleriert (in der Tat funktioniert es am besten in der Gegenwart von ATP) bedeutet, dass es potenziell verwendet werden kann, um auf Pyrophosphat in Amplifikationsreaktionen zu tes ten, die einen RNA Syntheseschritt einschließen, wie eine durch Transkription vermittelte Amplifikation (TAM).

Durch ein Durchführen von Kontrollexperimenten unter einem besonderen Satz von Reaktionsbedingungen wird der Fachmann in der Lage sein, das besondere Verhältnis von Luciferase zu Luciferin zu ATP zu Pyrophosphat (Luciferase:Luciferin:ATP:PPi) zu bestimmen, das für eine Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich ist. Startmaterialien und Methoden 1) ATP-Sulphurylase freie Reaktionsmischung (wenig Bst DNA-Polymerase oder Ziel DNA)

Menge	Reagenz	Zulieferer
20 mM	Tris-Acetat	Sigma
10 mM	KCl	"
10 mM	Ammoniumsulfat	"
2 mM	Magnesiumsulfat	"
0,10 % V/V	Triton X-100	"
0,5 % W/V	BSA	"
5 % W/V	Trehalose	"
0,4 mg/ml	Polyvinylpyrrolidon	"
9 mM	Dithiothreitol	Melford
1 μg/ml	D-Luciferin (Kaliumsalz)	Europa
36 ng/ml	Luciferase Ultra-Glow	Promega
1 mM	Adenosintriphosphat (ATP)	Sigma
250 μM	jeweils der vier dNTPs	Amersham Biosci.
0,8 μM	LAMP B1cB2 Primer	PNAC Cambridge UK
0,8 μM	LAMP F1 F2c Primer	"
0,4 μM	LAMP Loop B Primer	"
0,4 μM	LAMP Loop F Primer	"
0,2 μM	LAMP B3 Primer	"
0,2 μM	LAMP F3c Primer	PNAC Cambridge UK

pH Wert 0,8 @ 25°C (siehe unten für Primersequenzen)

Methode
Die Proben wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die oben beschriebene Reaktionsmischung verwendet wurde. Ein Bereich an Zieltemplat DNA Konzentrationen von 1 pg bis 1ng wurde getestet. Die ATP-Sulphurylase freie LAMP lief bei 55°C ab. Eine Bst DNA-Polymerase freie Probe wurde zur Kontrolle verwendet.
Ergebnisse
Die Rohdaten, die sich aus der ATP-Sulphurylase freien LAMP ergeben, sind in 11 gezeigt. Die in 11 gezeigten Rohdaten zeigen, dass die Proben, die Templatnukleinsäure enthalten, eine charakteristische plötzliche Abnahme der Lichtintensität im Lauf der Zeit zeigen, die in der Kontrolle nicht zu sehen ist. Es wird geglaubt, dass diese Abnahme das Ergebnis von Pyrophosphat ist, das durch die LAMP Reaktion erzeugt wurde, welches die Luciferase hemmt. Als solche ist die plötzliche Abnahme eine Markierung für eine Nukleinsäure-Amplifikation. Dass diese DNA Synthese tatsächlich auftrat, wurde durch eine Agarose Gelelektrophorese der Proben bestätigt.
Eine Datenbearbeitung der Rohdaten ermöglicht eine weitere Interpretation der Ergebnisse. Zuerst wurden die Daten auf die Lichtintensitäten beim Start normalisiert, anschließend wurden die Werte, die von der Kontrolle ohne Polymerase erhalten wurden, von jenen der Templatnukleinsäure enthaltenden Proben subtrahiert (12).
Eine Betrachtung von 12 gibt an, dass die ATP-Sulphurylase freie LAMP auch quantitativ ist, da die benötigte Zeit, um Punkte zu erreichen, bei denen sich die Änderungsrate der Lichtintensität signifikant ändert, proportional zu der Konzentration an Zieltemplat in den Proben zu sein scheint.
Da 1 mM ATP während der ATP-Sulphurylase freien LAMP vorliegt, kann derselbe Ansatz deshalb durchgeführt werden, um auf RNA basierende Amplifikationsverfahren zu verfolgen.
Es sollte bekannt sein, dass die Erfindung oben nur beispielhaft beschrieben worden ist und dass weitere Modifikationen im Detail durchgeführt werden können, die innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung bleiben, wie durch die Ansprüche definiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Bestimmung der in einer Probe vorliegenden Templatnukleinsäuremenge, umfassend die Schritte: i) das Inverbindungbringen sämtlicher der für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten und sämtlicher der für ein Biolumineszenz-Assay für Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Komponenten, einschließlich: a) einer Nukleinsäure-Polymerase, b) der Substrate für die Nukleinsäure-Polymerase, c) mindestens zweier Primer, d) einer thermostabilen Luciferase, e) Luciferin, f) gegebenenfalls ATP-Sulphurylase, und g) gegebenenfalls Adenosin-5'-Phosphosulfat, mit der Probe und nachfolgend: ii) das Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion der Zielnukleinsäure unter Einbeziehen von mehr als einem Amplifikationszyklus, iii) das Überwachen der Lichtausgabeintensität von der Biolumineszenzreaktion und iv) das Bestimmen der Menge von in der Probe vorliegender Templatnukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens die Schritte ii) und iii) in einem versiegelten Gefäß ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei in Schritt iii) die Lichtaus gabeintensität während der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion überwacht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Schritt iii) weiter das Erzeugen eines Datensatzes von Lichtausgabeintensität als eine Funktion der Zeit einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Menge an vorliegender Templatnukleinsäure durch das Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um einen Punkt zu erreichen, bei dem sich die Änderungsrate der Lichtausgabeintensität signifikant verändert, aus dem Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmung der Menge von in der Probe vorliegender Templatnukleinsäure zu Beginn der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmung der Menge von in der Probe vorliegender Templatnukleinsäure als ein Ergebnis der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii).
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Menge an vorliegender Templatnukleinsäure durch Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität anzusteigen beginnt, aus dem Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Menge an vorliegender Templatnukleinsäure durch Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität auf einem Maximum ist, aus dem der Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Menge an vorliegender Templatnukleinsäure durch Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um ei nen Punkt zu erreichen, bei dem die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität ansteigt, aus dem Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Menge von vorliegender Templatnukleinsäure durch Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Abnahmerate der Lichtausgabeintensität abnimmt, aus dem Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Menge an vorliegender Templatnukleinsäure durch Messen der Zeit, welche verwendet wurde, um einen Punkt zu erreichen, bei dem die Lichtausgabeintensität ein vorbestimmtes Maß erreicht oder überschreitet, aus dem Datensatz bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die thermostabile Luciferase, welche in Schritt i) mit der Probe in Verbindung gebracht wird, eine reversibel gehemmte Luciferase ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt iv) weiter das Vergleichen der Lichtausgabeintensität mit der Lichtausgabeintensität von einer Kontrolle umfaßt, in welcher die Probe eine bekannte Menge von Templatnukleinsäure umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Bestimmung, ob die Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei durch Messen aus dem Datensatz, ob die Lichtausgabeintensität ein vorbestimmtes Maß erreicht oder überschreitet, bestimmt wird, ob die Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei ein Ansteigen in der Lichtausgabeintensität relativ zu dem vorbestimmten Maß die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei eine Abnahme in der Lichtausgabeintensität relativ zu dem vorbestimmten Maß die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe anzeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei durch Messen aus dem Datensatz, ob die Lichtausgabeintensität innerhalb einer dem Start der Amplifikationsreaktion von Schritt ii) folgenden vorbestimmten Zeitlänge die Lichtausgabeintensität des vorbestimmten Maßes erreicht oder überschreitet, bestimmt wird, ob die Templatnukleinsäure in der Probe vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt iv) weiter das Vergleichen der Lichtausgabeintensität mit der Lichtausgabeintensität von einer Kontrolle, in welcher keine Amplifikation stattgefunden hat, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei eine Abnahme in der Lichtausgabeintensität relativ zu einer Kontrollreaktion, in welcher keine Amplifikation stattgefunden hat, die Gegenwart von Templatnukleinsäure in der Probe anzeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) ein Niedertemperatur-Thermocycling-Amplifikationsverfahren ist, in welchem der Cycling-Temperaturbereich 75°C nicht überschreitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) isotherm durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) innerhalb eines Temperaturbereichs durchgeführt wird, welcher 75°C nicht überschreitet.
Verfahren nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) bei einer konstanten Temperatur durchge führt wird, bei welcher die Komponenten der Amplifikationsreaktion und des Biolumineszenz-Assays stabil sind.
Verfahren nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) bei mehr als einer Temperatur innerhalb des Temperaturbereichs durchgeführt wird, in welchem die Komponenten der Amplifikationsreaktion und des Biolumineszenz-Assays stabil sind.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion von Schritt ii) bei einer höheren Temperatur begonnen und nachfolgend auf eine niedrige Temperatur gesenkt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der medizinischen Diagnostik.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Bestimmung, ob ein Pathogen in einer Probe vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung, ob eine bestimmte Nukleinsäuresequenz im genetischen Code eines Organismus vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 30 zur Bestimmung, ob die Nukleinsäure, von dem die Templatnukleinsäure abstammt, genetisch modifiziert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Bestimmung, ob ein Organismus in einer Probe vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Verwendung in der Immuno-Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie.