ES2295815T3

ES2295815T3 - Metodo para determinar la cantidad de acido nucleico molde presente en una muestra.

Info

Publication number: ES2295815T3
Application number: ES04701994T
Authority: ES
Inventors: Laurence Carlo Tisi; James Augustus Henry Murray
Original assignee: Lumora Ltd
Current assignee: Lumora Ltd
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2024-01-14
Also published as: AU2004204396A1; CN1852990B; US20060257874A1; DE602004008740T2; GB0300802D0; AU2004204396B2; PT1585836E; ATE372392T1; CA2513073A1; JP4521581B2; CY1107021T1; CA2513073C; WO2004062338A3; US7371545B2; EP1585836B1; DE602004008740D1; WO2004062338A2; CN1852990A; WO2004062338A8; DK1585836T3

Abstract

Un método para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, comprendiendo las etapas de: i) poner en contacto con la muestra todos los componentes necesarios para la amplificación de ácido nucleico, y todos los componentes necesarios para un ensayo de bioluminiscencia para la amplificación de ácido nucleico, incluyendo: a) una ácido nucleico polimerasa, b) los sustratos para la ácido nucleico polimerasa, c) al menos dos cebadores, d) una luciferasa termoestable, e) luciferina, f) opcionalmente ATP sulfurilasa, y g) opcionalmente adenosina-5''-fosfosulfato; y posteriormente: ii) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, del ácido nucleico diana, implicando más de un ciclo de amplificación; iii) monitorizar la intensidad de la producción de luz de la reacción de bioluminiscencia; y iv) determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

Description

Método para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra.

La invención se refiere a un método para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, comprendiendo las etapas de: i) poner en contacto con la muestra todos los componentes necesarios para la amplificación de ácido nucleico, y todos los componentes necesarios para un ensayo de bioluminiscencia para la amplificación de ácido nucleico y, posteriormente: ii) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, del ácido nucleico diana, que implica más de un ciclo de amplificación; iii) monitorizar la intensidad de la producción de luz del ensayo de bioluminiscencia; y iv) determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

Antecedentes

La amplificación de ácidos nucleicos se puede utilizar para determinar si un ácido nucleico molde concreto está presente en una muestra. Si se produce un producto de amplificación, esto indica que el ácido nucleico molde estaba presente en la muestra. A la inversa, la ausencia de cualquier producto de amplificación indica la ausencia de ácido nucleico molde en la muestra. Tales técnicas son de gran importancia en aplicaciones diagnósticas, por ejemplo, para determinar si un patógeno está presente en una muestra.

Los ácidos nucleicos pueden ser amplificados mediante varias técnicas de termociclado e isotérmicas. Las técnicas de termociclado tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizan el ciclado de la temperatura para impulsar ciclos reiterados de síntesis de ADN, conduciendo a grandes cantidades de nuevo ADN siendo sintetizado en proporción a la cantidad original de ADN molde. Recientemente, también se han desarrollado algunas técnicas isotérmicas que no cuentan con el termociclado para impulsar la reacción de amplificación. Se han desarrollado técnicas isotérmicas, que utilizan ADN polimerasas con actividad por desplazamiento de las bandas, para reacciones de amplificación que no impliquen una etapa de síntesis de ARN. De manera similar, para reacciones de amplificación que impliquen una etapa de síntesis de ARN, se han desarrollado técnicas isotérmicas que utilizan transcriptasa inversa, RNasa H y una ARN polimerasa dependiente de ADN.

Los productos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos han sido tradicionalmente analizados utilizando electroforesis en gel (basado en agarosa o acrilamida), que utiliza un colorante fluorescente (tal como bromuro de etidio) para teñir la presencia de ADN. Este método se puede utilizar para indicar el número, cantidad y tamaño de los productos amplificados. Sin embargo, la preparación, aplicación y análisis de las reacciones de amplificación utilizando electroforesis en gel requieren una amplia intervención manual y reactivos peligrosos, y exige mucho tiempo (típicamente tardando alrededor de 1 hora en total). Además, se necesitan múltiples ciclos de PCR (típicamente 30) para producir producto detectable. Más recientemente, se han desarrollado métodos con una sensibilidad incrementada sobre la electroforesis en gel, los cuales cuentan con técnicas basadas en fluorescencia o un ensayo de turbidez para monitorizar los productos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real.

Una característica de las ADN y ARN polimerasas es el hecho de que liberan el compuesto pirofosfato (PPi) cada vez que incorporan una nueva base dentro de la molécula de ADN/ARN en crecimiento. De este modo, se produce PPi como producto secundario en una cantidad estequiométrica, a medida que se añaden nucleótidos a una cadena nucleotídica en crecimiento por la polimerasa. Así, se continúa que la concentración de PPi es proporcional a la cantidad de síntesis de ácidos nucleicos que haya ocurrido y, por lo tanto, a la acumulación de amplicón. Para un polímero de longitud n, la reacción puede ser mostrada como:

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Un ensayo sensible para PPi es conocido como Ensayo Enzimático de Detección Luminométrica de Pirofosfato Inorgánico (ELIDA) [ver Nyren P. y Lundin A., Anal. Biochem. 151: (2), 504-509 (1985)]. Este ensayo tiene dos etapas: (1) transformación de pirofosfato (PPi) en ATP mediante la enzima ATP sulfurilasa, y (2) la utilización de la ATP para producir luz en presencia de luciferina y oxígeno, catalizada por luciferasa:

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Es ventajoso el empleo de ensayos tipo ELIDA porque se pueden obtener rápidamente lecturas de bioluminiscencia obtenidas a partir de pequeños volúmenes de muestra, y las lecturas pueden ser hechas utilizando dispositivos de monitorización sencillos y baratos tales como cámaras de película fotográfica o con dispositivo de carga acoplada (CCD).

US 5.534.424, US 5.498.523, WO 98/28440, WO 98/13523 y WO 02/20836 describen el empleo de métodos basados en ELIDA para secuenciar regiones cortas de ADN. El ensayo ELIDA fue utilizado para seguir la incorporación de nucleótidos individuales en una molécula de ADN mediante una polimerasa, durante una ronda simple de polimerización durante la pirosecuenciación. La pirosecuenciación es una técnica iterativa por la que, en cada uno de los ensayos iterativos, solo está presente únicamente uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos ("dNTPs") para permitir que cada desoxinucleótido trifosfato ("dNTP") sea ensayado en cada posición de la secuencia. De este modo, nunca están presentes simultáneamente todos los componentes necesarios para la síntesis de ADN.

También se ha descrito el empleo de un ensayo tipo ELIDA de punto final, denominado "H3PIM", para monitorizar una reacción en cadena de la polimerasa por termociclado ("PCR") [ver WO 92/16654 y Tarbary y col., J. Immunological Methods, 156 (1992), 55-60]. Se tomaron alícuotas de la mezcla de reacción a intervalos de tiempo regulares predeterminados, desde el principio hasta el fin del proceso de reacción y/o al final del proceso de amplificación. De este modo, se describe un extenso ensayo por etapas que implica la adición múltiple de reactivos.

WO 02/064830 describe el empleo de un ensayo ELIDA para realizar un ensayo de punto final para monitorizar una reacción PCR por termociclado. En WO 02/064830, el ensayo ELIDA se puede realizar en una sola etapa, mientras que en WO 92/16654 se necesitan adiciones múltiples y una etapa de incubación para monitorizar la PCR por termociclado como ensayo de punto final.

WO 01/42496 y Nygren y col., [Analytical Biochemistry, vol. 288, nº 1, (2001), 28-38] describen métodos para calcular la cantidad de un ácido nucleico diana en una muestra. Los métodos implican coamplificar el ácido nucleico diana con al menos una molécula de ácido nucleico competidor que contenga una única secuencia discriminadora. Después de la amplificación, se determinan luego las cantidades relativas de los amplicones respectivos utilizando un ensayo de extensión del cebador que tiene los amplicones diana y competidor como moldes. De este modo, los métodos son métodos de dos etapas en las que i) se amplifica la diana; y ii) se detecta la cantidad de amplicón. En la etapa de detección que sigue a la amplificación se utiliza un ensayo de bioluminiscencia.

Existen algunos problemas asociados con los ensayos de punto final descritos anteriormente. En primer lugar, necesitan que los componentes del ensayo de bioluminiscencia sean añadidos a la mezcla de reacción después de la reacción de amplificación. La apertura del tubo puede conducir a la contaminación de la muestra y, además, a la contaminación del laboratorio. Si la muestra misma llegase a ser contaminada, entonces esto podría producir que se generasen falsos positivos o falsos negativos. Además, si se llegase a contaminar el laboratorio con el ácido nucleico molde amplificado, esto aumenta la probabilidad de que se contaminarían las muestras futuras y se obtendrían resultados falso-positivos y resultados falso-negativos [por ejemplo, ver Víctor T. y col., "Laboratory experience and guidelines for avoiding false-positive polymerase chain-reactions results", Eur. J. Clin. Chem. & Clin. Biochem., 31(8): 531-535 (1993)]. Así, la posibilidad de contaminación representa una grave desventaja en el empleo de análisis de punto final de este tipo en métodos diagnósticos.

Un problema adicional con el empleo de análisis de punto final como se describió antes es que el dATP actúa también como sustrato para la luciferasa. De este modo, cuando se utiliza dATP como sustrato para la polimerasa, del dATP resulta una interferencia espectral en lugar de ATP reaccionado con la luciferasa. WO 02/064830 describe, cuando se utiliza dATP como sustrato en la reacción de amplificación, cómo se extingue rápidamente la señal luminosa del ELIDA. Esta extinción sería un serio obstáculo para la utilidad de un ensayo de punto final ya que la lectura de la luz medida sería no solamente función de la concentración de PPi sino también del tiempo. Por lo tanto, si los ensayos de punto final no se realizan con una sincronización estricta, no serán cuantitativos.

Una alternativa a los ensayos de punto final son ensayos que sean capaces de monitorizar en "tiempo real" la síntesis de ácido nucleico durante una reacción de amplificación, esto es, a medida que progresa la síntesis de ácido nucleico. Los ensayos en tiempo real actuales incluyen técnicas basadas en la fluorescencia y ensayos de turbidez.

Las técnicas basadas en la fluorescencia operan monitorizando el cambio en fluorescencia que está asociado con la acumulación de un producto de amplificación por algún medio. Por ejemplo, en US 5.994.056, WO 97/44486, WO 99/42611 y US 6.174.670 se describen métodos para monitorizar la amplificación de ADN durante la PCR, utilizando colorantes de unión al ADN de banda doble (específicamente sondas de hibridación conteniendo fluoróforos donadores y aceptores). Estas técnicas basadas en la fluorescencia en tiempo real hacen posible seguir la PCR sin muestreo del líquido, evitando de este modo la necesidad de que el tubo de reacción sea abierto y, por lo tanto, disminuyendo los riesgos de contaminación.

Sin embargo, las técnicas basadas en fluorescencia tienen inconvenientes importantes. En concreto, es alto el coste de los reactivos fluorescentes, particularmente los cebadores marcados fluorescentemente, y la preparación de la muestra puede ser incómoda. Además, la aplicación de sistemas basados en fluorescencia puede ser estorbada por la capacidad limitada del equipo y su alto coste. Normalmente, se necesita un fluorímetro-termociclador integrado controlado por ordenador, ya que frecuentemente los métodos siguen la PCR en tiempo real antes que emplear análisis de punto final. Por consiguiente, está comprometida la accesibilidad (coste) y portabilidad de tales sistemas. Puesto que la detección se lleva a cabo en el instrumento PCR, tales métodos están únicamente disponibles para laboratorios equipados adecuadamente.

Los ensayos de turbidez en tiempo real suponen monitorizar la presencia o ausencia de un precipitado blanco de pirofosfato de magnesio en la mezcla de la reacción de amplificación, como método para determinar si se ha producido PPi. Esto ha sido descrito como un método para determinar si ha ocurrido o no una reacción de amplificación isotérmica mediada por bucles [ver Mori Y. y col., "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation", Biochem. and Biophys. Res. Comm., 289, 150-154 (2001)]. Sin embargo, este método no es muy sensible y requiere concentraciones de PPi de alrededor de 0'6 mM antes de que se observe una turbidez significativa.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, comprendiendo las etapas de:

i) poner en contacto con la muestra todos los componentes necesarios para la amplificación de ácido nucleico, y todos los componentes necesarios para un ensayo de bioluminiscencia para la amplificación de ácido nucleico, incluyendo:

a): una ácido nucleico polimerasa,

b): los sustratos para la ácido nucleico polimerasa,

c): al menos dos cebadores,

d): una luciferasa termoestable,

e): luciferina,

f): opcionalmente ATP sulfurilasa, y

g): opcionalmente adenosina-5'-fosfosulfato;

y posteriormente:

ii) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, del ácido nucleico diana, que implica más de un ciclo de amplificación;

iii) monitorizar la intensidad de la producción de luz del ensayo de bioluminiscencia; y

iv) determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

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Se produce PPi como consecuencia de la polimerización de ácidos nucleicos durante la reacción de amplificación. Un método de la invención implica el asociar esta producción de PPi con la producción de luz a partir del ensayo de bioluminiscencia. Preferentemente, el PPi es transformado en primer lugar en ATP. Después, se detecta el ATP mediante un ensayo de bioluminiscencia catalizado por una luciferasa que utiliza ATP como sustrato para la producción de luz en presencia de luciferina y oxígeno. De este modo, se emplea luciferasa para seguir los cambios en la concentración de ATP. Preferentemente, esto se consigue utilizando un ensayo tipo ELIDA en el que el PPI es transformado en ATP mediante ATP sulfurilasa, y después el ATP es utilizado por la luciferasa para producir luz. Alternativamente, el PPi es detectado directamente mediante la luciferasa. Monitorizando la intensidad de la producción de luz a partir del ensayo de bioluminiscencia, es posible determinar cuánto PPi está presente en la mezcla de reacción y, por esa razón, determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra. Así, el método ensaya la síntesis enzimática in vitro de ácido nucleico, y hace posible cuantificar el alcance hasta el que ha sido amplificado el ácido nucleico a consecuencia de la polimerización de novo durante la reacción de amplificación.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede ser equiparada con una reacción de ácido nucleico polimerasa "procesiva" en la que se lleva a cabo más de un ciclo de adición de nucleótidos, sin posteriores adiciones o manipulación de los componentes tampón.

La presencia de luciferasa y otros componentes del ensayo de bioluminiscencia durante la reacción de amplificación de la etapa ii) simplifica mucho el análisis de la muestra ya que se evita la necesidad de una posterior manipulación de la mezcla de reacción una vez que haya empezado la reacción de amplificación. Por ejemplo, no es necesario tomar alícuotas de la muestra para determinar cuánto PPI ha sido producido. En cambio, el ensayo de bioluminiscencia se realiza directamente en la mezcla de reacción utilizada para la reacción enzimática de amplificación de ácidos nucleicos, en presencia de todos los componentes necesarios para la reacción de amplificación de ácido nucleico, esto es, en la mezcla de reacción que se forma en la etapa i). Durante o después de la reacción de amplificación no es necesario añadir los componentes del ensayo de bioluminiscencia a la mezcla de reacción.

Los componentes del ensayo de bioluminiscencia (conocido también como el "ensayo de pirofosfato" o "ensayo PPi") y de la reacción de amplificación tienen que ser capaces de resistir las condiciones de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Por ejemplo, se pueden utilizar una ATP sulfurilasa termoestable y/o luciferasa termoestable y/o ácido nucleico polimerasa termoestable. El término "termoestable", como se utiliza aquí con relación a una enzima, se refiere a una enzima que es estable dentro del intervalo de temperatura en el que se lleva a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii).

Los componentes de la etapa i) son preferentemente estabilizados mediante liofilización, o mediante la presencia de factores estabilizantes. De este modo, los estabilizantes son también preferentemente puestos en contacto con la muestra en la etapa i). Por ejemplo, se pueden poner en contacto con la muestra en la etapa i) uno o más de BSA, trehalosa, polivinilpirrolidona y ditiotreitol (DTT). Preferentemente, todos estos estabilizantes son puestos en contacto con la muestra en la etapa i).

La temperatura y tiempo necesarios para las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos son considerablemente diferentes de aquellos necesarios para las reacciones de polimerización de ácidos nucleicos.

Las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos requieren una alta temperatura o una larga duración (por ejemplo, 15 minutos a 24 horas) o ambas. Por contraste, las reacciones de polimerización de ácidos nucleicos se pueden realizar rápidamente a bajas temperaturas (por ejemplo, 37ºC). Las luciferasas son conocidas por ser inestables. Por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga salvaje se inactiva rápidamente a 37ºC. Las luciferasas son también conocidas por ser fácilmente inhibidas, por ejemplo mediante oxiluciferina, el producto de su propia reacción luminosa. Sin embargo, se ha descubierto sorprendentemente que las luciferasas pueden permanecer estables durante la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Además, se ha descubierto que las luciferasas pueden permanecer estables durante el curso completo de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Esto es sorprendente debido a la larga duración requerida para ciertas reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.

La luciferasa termoestable que es puesta en contacto con la muestra en la etapa i) es una enzima luciferasa que es estable dentro del intervalo de temperatura en el que se lleva a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). La luciferasa concentra utilizada dependerá de las condiciones bajo las que se realice la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). El término "luciferasa", como se utiliza aquí, se refiere a una enzima que cataliza una reacción bioluminiscente. Las luciferasas que son apropiadas para su uso en los métodos de la invención abarcan luciferasas salvajes y luciferasas mutantes o variantes, siempre que éstas sean estables dentro del intervalo de temperatura en el que se lleva a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Un ejemplo de luciferasa termoestable, que sea apropiada para su uso en un método de la presente invención, es la luciferasa termoestable Ultra-Glow de Promega.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede o no puede implicar una etapa de síntesis de ARN. En métodos en los que la reacción de amplificación de la etapa ii) no implique una etapa de síntesis de ARN, los sustratos para la polimerasa incluyen cada uno de los cuatro dNTPs: dATP, dTTP, dCTP y dGTP. Se pueden reemplazar uno o más de los dNTPs con un análogo apropiado de los mismos. En estas formas de realización, la luciferasa utiliza preferentemente ATP como sustrato para la producción de luz. Ejemplos de luciferasas que utilicen ATP como sustrato para la producción de luz son la luciferasa de luciérnaga (de Photinus pyralis) y mutantes de la misma. Preferentemente, la luciferasa que utiliza ATP como sustrato para la producción de luz es la luciferasa termoestable Ultra-Glow de Promega. En formas de realización en las que se utilice luciferasa para seguir los cambios en la concentración de ATP, en la mezcla de reacción está presente ATP sulfurilasa. Preferentemente, las formas de realización en las que se utiliza luciferasa para seguir los cambios en la concentración de ATP son aquellas formas de realización en las que la reacción de amplificación de la etapa ii) no implica una etapa de síntesis de ARN. Alternativamente, se puede utilizar una luciferasa que se comporte ella misma como una ATP sulfurilasa, además de catalizar el ensayo de bioluminiscencia. En tales casos, no es necesario añadir ATP sulfurilasa a la mezcla de reacción en la etapa i).

Se necesita adenosina-5'-fosfosulfato para que la ATP sulfurilasa produzca ATP a partir de del PPi, y se añade a la mezcla de reacción en la etapa i) cuando está presente ATP sulfurilasa, y también cuando se utilice una luciferasa que se comporte ella misma como una ATP sulfurilasa, además de catalizar el ensayo de bioluminiscencia.

Para reacciones de amplificación que impliquen una etapa de síntesis de ARN, los sustratos para la polimerasa incluyen cada uno de los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y cada uno de los cuatro nucleótidos trifosfatos ("NTPs") (ATP, UTP, CTP y GTP). Se pueden sustituir uno o más de los dNTPs y/o NTPs por un análogo apropiado. De este modo, cuando la reacción de amplificación implique una etapa de síntesis de ARN, en la mezcla de reacción está presente ATP endógeno como uno de los sustratos para la polimerasa, a menos que se utilice un análogo de ATP que pueda ser utilizado por la ARN polimerasa, pero no reaccione con luciferasa.

Cantidades significativas de ATP endógeno en la mezcla de reacción comprometerían gravemente el empleo de un método de la invención en el que se necesite que la luciferasa, puesta en contacto con la muestra en la etapa i), sea sensible a pequeños cambios en la concentración de ATP. Para superar este problema se utiliza preferentemente una luciferasa, inhibida reversiblemente, en formas de realización en las que la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) implique una etapa de síntesis de ARN y en la mezcla de reacción esté presente ATP endógeno. El término "luciferasa inhibida reversiblemente", como se utiliza aquí, se refiere a una luciferasa que ha llegado a ser inhibida por un componente que no sea PPi, pero cuya inhibición sea suprimida por bajas concentraciones de PPi. Por ejemplo, las luciferasas son conocidas por llegar a ser inhibidas por la oxiluciferina, el producto de su propia reacción. Se ha descubierto que esta inhibición es suprimida por bajas concentraciones de PPi. Así, el empleo de una luciferasa inhibida reversiblemente permite que el PPi sea detectado directamente por la luciferasa puesto que el PPi tiene efectos directos sobre la luciferasa inhibida. Se puede llevar a cabo una serie de reacciones de control, utilizando diferentes concentraciones del ácido nucleico molde, para determinar el tiempo tardado para que la inhibición de la luciferasa inhibida reversiblemente sea suprimida por PPi, para concentraciones concretas de ácido nucleico molde.

La luciferasa inhibida reversiblemente puede ser inhibida por un componente que no sea el PPi, antes de añadir la luciferasa a la mezcla de reacción en la etapa i). Alternativamente, se puede formar in situ luciferasa inhibida reversiblemente debido a la presencia del inhibidor en la mezcla de reacción. Preferentemente, la luciferasa inhibida reversiblemente es una luciferasa que, en su estado no inhibido, utiliza ATP para producir luz. En particular, la luciferasa es preferentemente luciferasa de escarabajo y es, preferentemente, luciferasa de luciérnaga.

En formas de realización en las que la luciferasa puesta en contacto con la muestra en la etapa i) de un método de la invención sea una luciferasa inhibida reversiblemente, no se ponen en contacto ATP sulfurilasa y adenosina-5'-fosfosulfato en la muestra en la etapa i). Sin embargo, en formas de realización en las que la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) implique una etapa de síntesis de ARN, y un análogo de ATP apropiado, que sea un sustrato para la ARN polimerasa pero no para la luciferasa (o, al menos, sea un sustrato muy pobre para la luciferasa), sea puesto en contacto con la muestra en la etapa i) antes que con el mismo ATP, entonces, la luciferasa que es puesta en contacto con la muestra en la etapa i) puede ser una luciferasa que utiliza ATP para la producción de luz, y después la ATP sulfurilasa y, preferentemente, la adenosina-5'-fosfosulfato serán entonces puestas en contacto con la muestra en la etapa i).

También se puede utilizar una luciferasa inhibida reversiblemente en formas de realización de la invención en las que la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) no implique una etapa de síntesis de ARN. En tales casos, la ATP sulfurilasa y la adenosina-5'-fosfosulfato no serán puestas en contacto con la muestra en la etapa i).

Una ventaja adicional de un método de la invención es la facilidad con la que la producción de luz en la etapa iii) puede ser detectada. Preferentemente, la intensidad de la producción de luz en la etapa iii) es monitorizada visualmente. Los métodos apropiados para monitorizar la intensidad de la producción de luz incluyen el utilizar cámara de película fotográfica o con dispositivo de carga acoplada (CCD). Alternativamente, se monitoriza la intensidad de la producción de luz del ensayo de bioluminiscencia utilizando una cámara CCD. Cuando sea necesario, se puede amplificar la producción de luz para su visualización. De este modo, la capacidad para detectar la producción de luz utilizando únicamente una cámara de película fotográfica o CCD tiene la ventaja sobre otras técnicas que emplean análisis por fluorescencia o análisis basados en gel en que no se requiere ningún hardware u óptica complejos. Además, se puede monitorizar la intensidad de la producción de luz sin la necesidad de irradiar la muestra de ninguna manera (como se necesita en técnicas que implican fluorescencia o absorbancia), sin la necesidad de ninguna interfaz electroquímica con la muestra [por ejemplo, como en enfoques basados en semiconductores: Wilding P. y col., (1994), "PCR in silicon microstructure", Clinical Chemistry, 40(9): 1.815-1.818] o sin la necesidad de irradiación indirecta [por ejemplo, como en enfoques de Resonancia de Plasmón Superficial: Bianchi N. y col., (1997), "Biosensor technology and surface plasmon resonante for real-time detection of HIV-1 genomic sequences amplified by polymerase chain reaction", Clinical and Diagnostic Virology, 8(3): 199-208].

Además, se pueden monitorizar simultáneamente una o más de una muestra (por ejemplo, miles), por ejemplo mediante una cámara CCD individual. De este modo, se puede utilizar un método de la invención sencillo, de hardware barato, con la posibilidad de portabilidad y miniaturización, y de fácil integración en sistemas de alto rendimiento.

La etapa i) de un método de la invención también incluye, preferentemente, poner en contacto un tampón apropiado con la muestra. Los tampones que son adecuados para su uso con un método de la invención abarcan tampones que permiten que la reacción de amplificación continúe, y también que proceda el ensayo de bioluminiscencia. Preferentemente, el tampón consta de una fuente de iones magnesio. Estas están preferentemente en forma de Cl_{2}Mg o SO_{4}Mg. Por ejemplo, un tampón apropiado puede contener Tris-acetato, cloruro potásico, sulfato amónico, sulfato magnésico y Tritón-X-100 a pH 8'8 a 25ºC.

Provechosamente, al menos las etapas ii) y iii) de un método conforme a la invención se llevan a cabo en un recipiente cerrado. Esto es de gran utilidad puesto que la capacidad de realizar la reacción de amplificación y el ensayo de bioluminiscencia en un recipiente cerrado reduce o incluso evita la posibilidad de que la muestra llegue a ser contaminada. Además, reduce o incluso previene la posibilidad de que se contamine el laboratorio. Esto es particularmente importante ya que si incluso una copia del ácido nucleico molde escapase dentro del laboratorio, esta podría contaminar potencialmente otras muestras a ensayar y dar resultados falso-positivos. De este modo, la capacidad de evitar la contaminación es de particular importancia donde se utilice un método de la invención en una aplicación diagnóstica.

Para prevenir la posterior contaminación, después de la etapa iv) el recipiente es sometido preferentemente a un tratamiento apropiado para destruir el ácido nucleico contenido en él, en particular para destruir el ácido nucleico molde. Preferentemente, también se destruye el recipiente mismo después de la etapa iv), o después de la destrucción del ácido nucleico contenido en él. Esto minimiza la posibilidad de que el laboratorio y/o muestras adicionales lleguen a ser contaminadas.

Preferentemente, en la etapa iii) de un método de la invención, se monitoriza la intensidad de la producción de luz durante la reacción de amplificación de ácido nucleico. Esto es únicamente posible a consecuencia de los componentes para el ensayo de bioluminiscencia que están presentes de principio a fin de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Preferentemente, la intensidad de la producción de luz es monitorizada durante el transcurso del tiempo de la reacción de amplificación de ácido nucleico, esto es, desde el comienzo hasta el final de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Alternativamente, la intensidad de la producción de luz puede ser monitorizada durante al menos una parte de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Alternativamente y/o adicionalmente, se puede monitorizar la intensidad de la producción de luz después de que la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) haya acabado y/o antes del comienzo de la reacción de amplificación de la etapa ii), por ejemplo, para tomar una lectura de control. La capacidad de monitorizar la intensidad de la producción de luz durante la reacción de amplificación de la etapa ii) simplifica la manipulación del recipiente de reacción y también permite una rápida determinación de la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra. Una ventaja adicional de monitorizar la intensidad de la producción de luz durante el curso de la reacción de amplificación es que cualquier señal de fondo que se produzca por el dATP reaccionando con la luciferasa no interfiere con el método de la invención. Esto únicamente llega a ser una consecuencia con el análisis de punto final.

Preferentemente, la etapa iii) de un método de la invención incluye además el producir un conjunto de datos de la intensidad de la producción de luz en función del tiempo. El conjunto de datos es utilizado para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra. Preferentemente, el conjunto de datos es analizado por una aplicación software y/o es representado en forma de un gráfico o una lista de figuras. Por ejemplo, el conjunto de datos puede ser representado como un diagrama de la intensidad de la luz con el tiempo, o un diagrama de la velocidad de cambio de la intensidad de la luz con el tiempo (esto es, la primera derivada).

La intensidad de la producción de luz puede ser monitorizada en uno o más tiempos predeterminados. Estos tiempos predeterminados son, preferentemente, tiempos predeterminados después del tiempo en el que están presentes todas las condiciones necesarias para que tenga lugar la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii), en cuyo tiempo (t) = 0 minutos. Tales condiciones son que se haya formado una mezcla de reacción como punto de partida en la etapa i), y que la mezcla de reacción esté a una temperatura apropiada para que proceda la amplificación, dicha temperatura siendo también una temperatura a la que los componentes de la reacción de amplificación y del ensayo de bioluminiscencia son estables. Por ejemplo, la intensidad de la producción de luz puede ser monitorizada a intervalos de tiempo predeterminados fijos durante al menos una parte de la reacción de amplificación. Preferentemente, la intensidad de la producción de luz es monitorizada a intervalos de tiempo predeterminados fijos durante la reacción de amplificación total. Por ejemplo, estos intervalos podrían ser cada 30 segundos, cada 1 minuto, cada 1 minuto y 30 segundos, etc. Alternativamente, pueden variar los intervalos entre tiempos predeterminados. Preferentemente, se toman una, dos o más lecturas de la luz por minuto. Cuantas más lecturas se tomen por minuto, mayor será la confianza en los resultados y, de este modo, es preferible tomar tantas lecturas por minuto como sea posible. Preferentemente, la producción de luz es monitorizada en primer lugar a tiempo = 0. En algunas formas de realización, la intensidad de la producción de luz puede ser también monitorizada después de que haya acabado la reacción de amplificación.

Cuanto mayor sea la sensibilidad del sistema de detección de luz utilizado, serán posibles más puntos temporales por minuto puesto que, al utilizar una cámara más sensible, cada datum procede de integrar la emisión de luz durante un tiempo más corto que con una cámara CCD menos sensible. Así, es ventajoso utilizar una cámara tan sensible como sea posible.

Provechosamente, en la etapa iii) de un método de la invención, la intensidad de la producción de luz es monitorizada continuamente. Preferentemente, la producción de luz es monitorizada continuamente durante al menos una parte de la reacción de amplificación de la etapa ii). Más preferentemente, la producción de luz es monitorizada continuamente durante la totalidad de la reacción de amplificación de la etapa ii). La etapa iii) también abarca, alternativa o adicionalmente, el monitorizar la intensidad de la producción de luz continuamente después de que haya terminado la reacción de amplificación de la etapa ii).

Se puede utilizar un método conforme a la invención para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, de una manera cuantitativa y/o de una manera cualitativa.

La utilización de una manera cuantitativa incluye el empleo de un método de la invención para determinar la cantidad de molde presente en una muestra antes de que suceda la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). También incluye el empleo de un método de la invención para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra a consecuencia de la reacción de amplificación de la etapa ii); la cual puede ser determinada durante o después de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii); esto es, la cuantificación de cuánto producto de amplificación de ácido nucleico ("amplicón") ha sido producido. Esto hace posible cuantificar el alcance de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Cuando se utiliza de una manera cuantitativa, el término "determinar" incluye una determinación exacta de la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra y una estimación de la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

Se ha descubierto sorprendentemente que, para determinar de una manera cuantitativa la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, la sincronización del cambio en la intensidad de la producción de luz es un factor proporcionado además de la intensidad per se de la producción de luz producida. Por ejemplo, para un conjunto concreto de condiciones de reacción (por ejemplo, un ácido nucleico molde concreto, una concentración concreta de componentes para la reacción de amplificación y el ensayo de bioluminiscencia, y una temperatura(s) concreta para la reacción de amplificación), si en la muestra está presente una concentración mayor de ácido nucleico molde al comienzo de la reacción de amplificación de ácido nucleico, los cambios en la intensidad de la producción de luz ocurrirán después de un periodo de tiempo más corto, a continuación del inicio de la reacción de amplificación, cuando se compara con una reacción en la que esté presente una menor concentración de ácido nucleico molde en la muestra. De este modo, para un conjunto concreto de condiciones de reacción, es posible determinar la cantidad de ácido nucleico molde que está presente en la muestra, monitorizando el cambio en la intensidad de la producción de luz en función del tiempo.

Preferentemente, se realizan una serie de reacciones de control utilizando diferentes concentraciones conocidas del ácido nucleico molde concreto, bajo el conjunto particular de condiciones de reacción, y los resultados obtenidos a partir de la muestra, según un análisis mediante un método de la invención, son comparados con los resultados obtenidos a partir de esta serie de reacciones de control. También se puede realizar un control en donde se valora la cantidad de ácido nucleico molde, que haya sido producida durante la reacción de amplificación en puntos temporales predeterminados, utilizando electroforesis en gel u otro método cuantitativo apropiado. Esto permitirá que la cantidad de ácido nucleico molde en la muestra de control en puntos temporales predeterminados sea calculada y correlacionada con los respectivos puntos en el conjunto de datos.

Cuando se utiliza de una manera cualitativa, se puede utilizar un método de la invención para evaluar si una reacción de amplificación de ácido nucleico ha producido o no algún producto de amplificación y, de ese modo, determinar si en la muestra está presente algún ácido nucleico molde. En muchas aplicaciones donde las condiciones de amplificación estén ya suficientemente optimizadas [por ejemplo, una rápida detección de ácido nucleico (preferentemente ADN) asociado con patógenos], la única información necesaria para establecer que la secuencia de ADN diana estaba presente en una muestra es el acontecimiento de la reacción de amplificación. Cuando esté presente ácido nucleico molde en la muestra, esto se traducirá en amplicón siendo producido a consecuencia de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Por consiguiente, esto producirá un cambio en el modelo de la intensidad de la producción de luz en función del tiempo, cuando se compare a una reacción de control en la que no ha tenido lugar la amplificación. Cuando en la muestra no esté presente ácido nucleico molde, no tendrá lugar la reacción de amplificación en la etapa ii) y, de este modo, no se producirá amplicón como consecuencia. Por consiguiente, el modelo de cambio en la intensidad de la producción de luz en función del tiempo será similar al control, si no la misma, en el que no ha tenido lugar la amplificación. De este modo, la expresión "realizar la reacción de amplificación de ácido nucleico", como se utiliza en la etapa ii), incluye el "realizar la reacción de amplificación de ácido nucleico" y también "crear las condiciones adecuadas para que suceda la reacción de amplificación", puesto que en formas de realización en las que no exista ácido nucleico molde presente en la muestra, no ocurrirá una reacción de amplificación de ácido nucleico. Preferentemente, la presencia o ausencia del esperado cambio de luz es monitorizada en un periodo de tiempo predeterminado después del inicio de la reacción.

Como se mencionó antes, también se ha descubierto que el PPi puede tener él mismo efectos directos en la luciferasa a altas concentraciones. Esto se aplica a luciferasas que utilicen ATP como sustrato para la producción de luz, y también a luciferasas inhibidas reversiblemente. Llevando a cabo algunos experimentos de control utilizando diferentes concentraciones de un ácido nucleico molde de partida, bajo un conjunto concreto de condiciones de reacción, la persona especializada será capaz de determinar, a partir del conjunto de datos, el momento en el que el PPi mismo tiene un efecto directo sobre la luciferasa. Estos resultados de control pueden ser utilizados después para extrapolar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

Por ejemplo, se ha descubierto que el PPi puede él mismo inhibir la luciferasa a altas concentraciones. El punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a disminuir rápidamente se correlaciona con el punto en el que la luciferasa ha sido inhibida mediante una concentración concreta de PPi. Este puede corresponderse con el punto en el que la intensidad de la producción de luz está en un máximo, esto es, el punto que señala la transición entre el aumento de producción de luz y la disminución de producción de luz. Alternativamente, puede representar el punto en el que la velocidad de disminución de la intensidad de la producción de luz aumenta significativamente, por ejemplo, desde una disminución gradual hasta un rápido aumento. Llevando a cabo varios experimentos de control utilizando diferentes concentraciones de ácido nucleico molde, se puede determinar el momento en el que la intensidad de la producción de luz empieza a decrecer rápidamente para cada concentración concreta de ácido nucleico molde de partida, bajo un conjunto concreto de condiciones de reacción. Estos resultados de control pueden ser utilizados después para extrapolar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

Alternativamente, el PPI puede originar un aumento en la emisión de luz a partir de una luciferasa inhibida por una sustancia que no sea PPi, como en la forma de realización de la luciferasa inhibida reversiblemente mencionada antes.

De este modo, si el PPi estimula o inhibe, o no, el ensayo de bioluminiscencia catalizado por luciferasa depende de algunos factores que incluyen el tipo preciso de luciferasa utilizada, la temperatura de la reacción, la concentración de PPi y la presencia de otros compuestos que puedan afectar a la actividad de la luciferasa. Llevando a cabo varios experimentos de control que utilizan concentraciones diferentes de un ácido nucleico molde de partida concreto, bajo un conjunto concreto de condiciones de reacción, la persona especializada será capaz de determinar, a partir del conjunto de datos, el momento en el que el mismo PPi tiene un efecto directo sobre la luciferasa, y la naturaleza de este efecto. Estos resultados de control pueden ser utilizados después para extrapolar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

El conjunto de datos de intensidad de la producción de luz en función del tiempo se pueden interpretar de varias maneras diferentes para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra. Los puntos concretos en el conjunto de datos representan puntos en el tiempo en los que están presentes concentraciones específicas de PPi. Estos pueden ser después correlacionados con la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra. Por ejemplo, preferentemente se monitorizan uno o más de los siguientes puntos en el conjunto de datos: i) el tiempo tardado en alcanzar el punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a aumentar; ii) el tiempo tardado en alcanzar el punto en el que la velocidad de cambio de incremento de la intensidad de la producción de luz aumenta o disminuye; iii) el tiempo tardado en alcanzar el punto en el que la velocidad de cambio de la intensidad de la producción de luz cambia desde un aumento a una disminución (este es preferentemente el punto de máxima intensidad de producción de luz o intensidad "pico" de producción de luz), o desde una disminución hasta un aumento; iv) el tiempo tardado en alcanzar el punto en el que la velocidad de cambio de la disminución en intensidad de la producción de luz aumenta o disminuye; y/o v) el tiempo tardado en alcanzar el punto en el que la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza un nivel predeterminado.

Para la determinación de la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra de una manera cuantitativa, los puntos en el conjunto de datos que se monitorizan son preferentemente aquellos puntos en los que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente. Cuando se interpreta el conjunto de datos, para una persona especializada serán evidentes los puntos en los que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente.

Muy preferentemente, un punto en el que la velocidad de cambio en la intensidad de la producción de luz cambie significativamente será un punto que represente una transición entre la intensidad de la producción de luz creciente y la intensidad de la producción de luz decreciente. Un punto que represente una transición entre la intensidad de la producción de luz decreciente y la intensidad de la producción de luz creciente es también un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente. Un punto que señale una transición entre la intensidad de la producción de luz creciente y decreciente, o decreciente y creciente, será representado, preferentemente, como un punto de inflexión cuando los resultados sean mostrados en un gráfico de intensidad de la producción de luz en función del tiempo. Un punto en el que la intensidad de la producción de luz cambie desde una intensidad constante hacia un incremento o disminución en la intensidad, o un punto en el que la intensidad de la producción de luz cambie desde un incremento o disminución en intensidad hacia una intensidad constante, también representa un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia
significativamente.

Alternativamente, un punto en el que la intensidad de la producción de luz cambia significativamente puede ser un punto en el que la velocidad de aumento en intensidad de la producción de luz, o la velocidad de disminución en intensidad de la producción de luz, aumenta o disminuye significativamente. De este modo, la expresión "un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente" se refiere, preferentemente, a un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en un intervalo de tiempo predeterminado antes de esos puntos, difiere al menos el 30% de la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en el mismo intervalo de tiempo predeterminado después de ese punto. Más preferentemente, "un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente" se refiere a un punto en el que la velocidad de cambio en la intensidad de la producción de luz, en un intervalo de tiempo predeterminado antes de esos puntos, difiere al menos el 50% de la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz en el mismo intervalo de tiempo predeterminado después de ese punto. Incluso más preferentemente, "un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambia significativamente" se refiere a un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en un intervalo de tiempo predeterminado antes de esos puntos, difiere al menos el 70% de la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en el mismo intervalo de tiempo predeterminado después de ese punto. Alternativamente, "un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz cambie significativamente" se refiere a un punto en el que la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en un intervalo de tiempo predeterminado antes de ese punto, difiere al menos el 10%, 20%, 40%, 60% u 80% de la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz, en el mismo intervalo de tiempo predeterminado después de ese punto. El intervalo de tiempo predeterminado es preferentemente 30 segundos pero puede ser, alternativamente, 1 minuto, 1 minuto y 30 segundos o más. Alternativamente, el intervalo de tiempo predeterminado puede ser menor de 30 segundos. El intervalo de tiempo predeterminado escogido dependerá de los intervalos de tiempo en los que la intensidad de la producción de luz es monitorizada, y dependerá de la cinética de la reacción de amplificación concreta que se está estudiando.

Así, para una determinación cuantitativa, se monitorizan preferentemente uno o más de los siguientes puntos en el conjunto de datos: i) el punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a aumentar; ii) el punto en el que la velocidad de cambio de aumento de intensidad de la producción de luz aumenta o disminuye significativamente; iii) el punto en el que la velocidad de cambio de intensidad de la producción de luz cambia desde un aumento a una disminución (preferentemente el punto de máxima intensidad de la producción de luz) o desde una disminución a un aumento; y/o iv) el punto en el que la velocidad de cambio de disminución en intensidad de la producción de luz aumenta o disminuye significativamente. También puede ser monitorizado el tiempo en el que la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza un nivel predeterminado.

En formas de realización en las que no se utiliza una luciferasa inhibida reversiblemente, la cantidad de ácido nucleico presente en la muestra se determina preferentemente de una manera cuantitativa, monitorizando uno o más de los siguientes puntos: i) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a aumentar; ii) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de cambio de intensidad de la producción de luz cambia desde un aumento a una disminución; iii) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de cambio de disminución en intensidad de la producción de luz aumenta significativamente; iv) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de cambio de disminución en intensidad de la producción de luz disminuye significativamente; y v) el tiempo tardado para que la intensidad de la producción de luz alcance o cruce un nivel predeterminado.

En formas de realización en las que se utiliza una luciferasa inhibida reversiblemente, mientras la luciferasa es inhibida por el producto de su reacción, la intensidad de la producción de luz disminuye gradualmente. Después, una vez que se produce una cierta cantidad de PPi como resultado de la reacción de amplificación, la luciferasa se vuelve sensible al PPi y así desinhibida, y aumenta la intensidad de la producción de luz. Entonces, la intensidad de la producción de luz disminuye gradualmente hasta que en ese punto se haya producido una cierta cantidad de PPi, aumenta la velocidad de cambio en intensidad de la producción de luz y entonces disminuye la intensidad de la producción de luz hasta un nivel que es menor que la intensidad de la producción de luz de una reacción de control en la que no ha tenido lugar la amplificación de ácido nucleico. Entonces, disminuye la velocidad de cambio de disminución de intensidad de la producción de luz. De este modo, en formas de realización en las que una luciferasa inhibida reversiblemente sea puesta en contacto con la mezcla de reacción en la etapa i), la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra es determinada preferentemente de una manera cuantitativa, monitorizando uno o más de los siguientes puntos: i) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la intensidad de la producción de luz cambia desde una disminución gradual hacia un aumento (esto es, el punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a aumentar); ii) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de disminución en la intensidad de la producción de luz aumenta significativamente (preferentemente desde una disminución gradual a una disminución rápida); y iii) el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de disminución en la intensidad de la producción de luz disminuye significativamente (preferentemente desde una disminución rápida a una disminución gradual).

Como se mencionó antes, el tiempo que se tarda en alcanzar un punto concreto para un ácido nucleico molde concreto depende de la concentración de ácido nucleico molde presente en la muestra en el comienzo de la reacción de amplificación. Así, la etapa iv) de un método de la invención preferentemente comprende, además, el comparar la intensidad de la producción de luz con la intensidad de la producción de luz a partir de una curva estándar formada por los resultados de varios controles en los que las muestras constan de cantidades conocidas de ácido nucleico molde para determinar la cantidad de ácido nucleico molde en la muestra.

Para la determinación de una manera cualitativa de la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra, esto es, si el ácido nucleico molde está presente o no en la muestra, el punto en el conjunto de datos que es monitorizado es, preferentemente, el punto en el que la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza un nivel predeterminado.

En formas de realización en las que no se utilice una luciferasa inhibida reversiblemente, un aumento en la intensidad de la producción de luz indicará la presencia de ácido nucleico molde en la muestra. Preferentemente, el aumento en intensidad de la producción de luz es con respecto a una reacción de control en la que no haya tenido lugar amplificación. Por ejemplo, tal reacción de control será preferentemente una en la que no esté presente ácido nucleico molde o una en la que no esté presente polimerasa. De este modo, en estas formas de realización, la cantidad de ácido nucleico presente en la muestra puede ser determinada, de una manera cualitativa, monitorizando si la intensidad de la producción de luz sube por encima de la de un control en el que no ha tenido lugar amplificación. Más preferentemente, en estas formas de realización, la cantidad de ácido nucleico presente en la muestra puede ser determinada, de una manera cualitativa, monitorizando si la intensidad de la producción de luz alcanza o sube por encima de un nivel predeterminado. Por ejemplo, el nivel predeterminado podría ser establecido al 125% ó 150% de la producción de luz en el comienzo de la reacción de amplificación, en el punto en el que la velocidad de disminución en la intensidad de la luz esté en un mínimo. Si la intensidad de la producción de luz alcanza este nivel predeterminado o aumenta más allá, esto indicará la presencia de ácido nucleico molde en la muestra. Sin embargo, si la intensidad de la producción de luz no alcanza este nivel predeterminado, esto indicará la ausencia de ácido nucleico molde en la muestra.

El nivel predeterminado puede variar dependiendo de uno o más factores que abarcan: el ácido nucleico molde utilizado, la concentración de los componentes utilizados en la reacción de amplificación de ácido nucleico, y la temperatura utilizada para la reacción de amplificación de ácido nucleico. Llevando a cabo experimentos de control en los que esté presente ácido nucleico molde o no esté presente ácido nucleico molde, la persona especializada será capaz fácilmente de determinar un nivel predeterminado apropiado.

Preferentemente, la presencia de aumento en la intensidad de la producción de luz en un espacio de tiempo predeterminado, después del inicio de la reacción de amplificación de la etapa ii), indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra, y la ausencia de aumento en la intensidad de la producción de luz en un espacio de tiempo predeterminado, después del inicio de la reacción de amplificación de la etapa ii), indica la ausencia de ácido nucleico molde en la muestra. Por ejemplo, cuando se utilice un método de la invención para genotipaje, donde una cierta cantidad de materia de ensayo contendría siempre una cierta cantidad de molde diana, entonces, si está presente el ácido nucleico molde diana, se puede afirmar, con confianza, que si la intensidad de la producción de luz no ha aumentado en un tiempo predeterminado, entonces está ausente la diana.

Preferentemente, el espacio de tiempo predeterminado será un tiempo que suceda durante la reacción de amplificación de la etapa ii). Cuanto menos ácido nucleico molde esté presente en el comienzo de la reacción, más tardará la reacción de amplificación de la etapa ii). Llevando a cabo varios experimentos de control para un ácido nucleico molde concreto, bajo un conjunto concreto de condiciones de reacción en el que el ácido nucleico molde está presente a diversas concentraciones o no está presente el ácido nucleico molde, la persona especializada será capaz fácilmente de determinar un tiempo predeterminado adecuado en el que tiene que haber o no haber ocurrido el aumento para ese ácido nucleico molde concreto, bajo ese conjunto concreto de condiciones de reacción. Por ejemplo, el espacio de tiempo predeterminado puede ser antes de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más minutos a partir del inicio de la reacción de amplificación de ácido nucleico.

Alternativa o adicionalmente, en un método conforme a la invención, una disminución en la intensidad de la producción de luz con respecto a un nivel predeterminado indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra. Se hace la hipótesis que esta disminución sucede cuando la luciferasa llega a ser inhibida por el PPi. Por ejemplo, el nivel predeterminado podría ser establecido en el 25%, 20%, 15%, 10% ó 5% de la producción de luz en el comienzo de la reacción de amplificación en el punto en el que la velocidad de disminución en intensidad de luz está en un mínimo. Si la intensidad de la producción de luz disminuye hasta un nivel predeterminado, o disminuye más allá de él, esto indicará la presencia de ácido nucleico molde en la muestra. Sin embargo, si la intensidad de la producción de luz no alcanza este nivel predeterminado, esto indicará la ausencia de ácido nucleico molde en la muestra.

El nivel predeterminado puede variar dependiendo de uno o más factores que abarcan: el ácido nucleico molde utilizado, la concentración de componentes utilizados en la reacción de amplificación de ácido nucleico, y la temperatura de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Llevando a cabo experimentos de control en los que esté presente ácido nucleico molde o no esté presente ácido nucleico molde, la persona especializada será capaz fácilmente de determinar un nivel predeterminado adecuado.

La etapa iv) de un método de la invención preferentemente contiene, además, el comparar la intensidad de la producción de luz con la intensidad de la producción de luz a partir de un control en el que no ha tenido lugar la amplificación. Por ejemplo, tal control puede ser uno en el que las mismas etapas sean llevadas a cabo como en un método conforme a la invención, excepto que el ácido nucleico molde y/o uno de los otros componentes necesarios para la reacción de amplificación (por ejemplo, la polimerasa) sea/sean omitido(s). Esto permite la extinción de la bioluminiscencia con el tiempo a ser tenido en cuenta.

En un método conforme a la invención, aunque preferentemente se aplique un control simultáneamente con la muestra bajo análisis, no es necesario que sea para este caso. Por ejemplo, el control puede ser un control que haya sido aplicado previamente, y los datos obtenidos del mismo podrían ser utilizados para su comparación con otras numerosas muestras.

En un método conforme a la invención, una disminución en la intensidad de la producción de luz con respecto a una reacción de control, en la que no haya tenido lugar la amplificación, indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra. Esta disminución con respecto al control ocurrirá posterior a los otros cambios en intensidad de la producción de luz con respecto al control que está descrito anteriormente. Es sorprendente el descubrimiento de que la intensidad de la producción de luz disminuye finalmente hasta un nivel que es menor que en una reacción de control en la que no haya tenido lugar la amplificación, ya que la persona especializada esperaría que la intensidad de la producción de luz continuase aumentando ya que se produce más PPi. Se hace la hipótesis de que la intensidad de la producción de luz disminuye hasta un nivel menor que el control porque la luciferasa llega a ser inhibida por el PPi. Aunque la monitorización de la intensidad de la producción de luz, para determinar si es menor que la de un control en el que no haya tenido lugar la amplificación, se lleve a cabo, preferentemente, durante la reacción de amplificación de la etapa ii), puede ser alternativamente realizada después de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii). Preferentemente, la intensidad de la producción de luz disminuye hasta un nivel que es el 30% o menos de la intensidad de la producción de luz de la reacción de control. Más preferentemente, la intensidad de la producción de luz disminuye hasta un nivel que es el 20% o menos de la intensidad de la producción de luz de la reacción de control. Incluso más preferentemente, la intensidad de la producción de luz disminuye hasta un nivel que es el 10% o menos de la intensidad de la producción de luz de la reacción de control. Alternativamente, la intensidad de la producción de luz puede disminuir hasta un nivel que sea el 90% o menos, el 80% o menos, el 70% o menos, el 60% o menos, el 50% o menos, o el 40% o menos de la intensidad de la producción de luz de la reacción de control.

Preferentemente, la presencia de disminución en la intensidad de la producción de luz con respecto al nivel predeterminado o a la reacción de control, antes de un espacio de tiempo predeterminado después del inicio de la reacción de amplificación de ácido nucleico, indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra, y la ausencia de disminución en la intensidad de la producción de luz con respecto al nivel predeterminado o a la reacción de control, antes del espacio de tiempo predeterminado después del inicio de la reacción de amplificación, indica la ausencia de ácido nucleico molde en la muestra. El espacio de tiempo predeterminado es, preferentemente, antes de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más minutos desde el inicio de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Llevando a cabo experimentos de control en los que estén presentes o no estén presentes diferentes concentraciones de ácido nucleico molde, la persona especializada será capaz fácilmente de determinar un tiempo predeterminado apropiado mediante el cual tenga que haber ocurrido o no tenga que haber ocurrido la disminución.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo, preferentemente, dentro de un intervalo de temperatura en el que la luciferasa es suficientemente activa y estable para dar una suficiente y estable producción de luz durante la duración de la reacción de amplificación. Además, la reacción de amplificación de la etapa ii) es, preferentemente, una que se pueda realizar a una temperatura lo suficiente baja y que sea lo bastante rápida para que la luciferasa permanezca estable durante la reacción de amplificación. La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) de un método de la invención se puede llevar a cabo isotérmicamente, o puede ser un método de termociclado. Preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) de un método de la invención se lleva a cabo isotérmicamente. Las reacciones de amplificación de ácido nucleico que se realizan isotérmicamente son aquellas reacciones de amplificación de ácido nucleico que no cuentan con el termociclado para que proceda la reacción de amplificación.

Los ejemplos de reacciones de amplificación de ácido nucleico que no impliquen una etapa de síntesis de ARN, y que sean apropiadas para monitorizar mediante un método conforme a la invención, abarcan métodos isotérmicos y también métodos de termociclado tales como PCR.

Los método isotérmicos que no impliquen una etapa de síntesis de ARN proceden vía desplazamiento de banda. Tales métodos abarcan: amplificación por círculo rodante [ver Fire A. y Xu S.-Q. (1995), "Rolling replication of short DNA circles", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4.641-4.645), tecnología de amplificación por círculo rodante [ver http://www.molecularstaging.com/Pag-es/RCATdetails_.html; kit de amplificación basada en Phi 29 de Amersham, códigos de producto: 25-6400-10 y 25-6400-50], amplificación isotérmica por ramificación (Zhang W. y col., "Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study", J. Clin. Microbiol., enero de 2002, 128-132), amplificación por desplazamiento de banda dependiente de endonucleasas de restricción [Walker G. T., "Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system", PNAS, (1992), 89, 392-396], amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) [Notomi T., "Loop-mediated isothermal amplification of DNA", Nucl. Acids. Res., 2000, 28(12), e63, i-vii] y variantes de estos métodos. Las técnicas de amplificación isotérmica de ácido nucleico que no impliquen una etapa de síntesis de ARN, y que procedan vía mecanismos de desplazamiento de banda, son también conocidas como técnicas por "PCR isotérmica". Es sorprendente el descubrimiento de que un ensayo de bioluminiscencia basado en un ensayo ELIDA pueda ser utilizado para monitorizar las reacciones de amplificación que procedan vía desplazamiento de banda, dado el número de reacciones de fondo que ocurren debido a la baja temperatura de la reacción de amplificación.

Alternativamente, los métodos de termociclado que no impliquen una síntesis de ARN pueden ser utilizados en un método de la invención siempre que todos los componentes de la reacción de amplificación y del ensayo de bioluminiscencia sean estables a las temperaturas mediante las que se cicla la PCR. Preferentemente, la reacción de termociclado es un método de termociclado a baja temperatura en el que la extensión del cebador se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas de ciclado que no exceda de 75ºC y que, preferentemente, no exceda de 70ºC, y que utilice una ADN polimerasa moderadamente termoestable. Tal método es LoTemp® PCR, el cual utiliza una ADN polimerasa HiFi® y está descrito en www.hifidna.com/FQall.htm. Alternativamente, la reacción de termociclado es un método de termociclado a baja temperatura que utiliza el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de prolina [ver Nucleic Acid Research, (1999), 27(6), 1.566-1.568].

Los ejemplos de reacciones de amplificación isotérmica que impliquen una etapa de síntesis de ARN, y que puedan ser monitorizadas mediante un método de la invención, abarcan la amplificación mediada por transcripción (TMA) o la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) [Guatelli J. C. y col., "Isothermal in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled alter retroviral replication", PNAS, (1990), 87, 1.874-1.878] y variantes de estos métodos.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura en el que los componentes de la reacción de amplificación y del ensayo de bioluminiscencia permanecen estables. Preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no exceda de 75ºC. Más preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no exceda de 70ºC. Incluso más preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no exceda de 65ºC. Muy preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no exceda de 60ºC, esto es, un intervalo de temperatura dentro del cual la luciferasa termoestable Ultra-Glow de Promega sea lo suficientemente activa y estable para dar una producción de luz suficiente y estable durante la duración de la reacción de amplificación. Alternativamente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede ser llevada a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no exceda de 55ºC, 50ºC, 45ºC ó 40ºC.

Preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no baje de 20ºC. Más preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no baje de 30ºC. Incluso más preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no baje de 40ºC. Alternativamente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede ser llevada a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no baje de 25ºC, 35ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC ó 60ºC.

Preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura de 30ºC a 75ºC. Más preferentemente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura de 30ºC a 65ºC. Por ejemplo, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede ser llevada a cabo dentro de un intervalo de temperatura de 45ºC a 65ºC ó 35ºC a 40ºC.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se puede llevar a cabo a una temperatura constante dentro de los intervalos de temperatura especificados antes. En una forma de realización preferida, la reacción de amplificación de ácido nucleico se lleva a cabo a 37ºC. Por ejemplo, utilizando una enzima luciferasa de luciérnaga mutante que sea estable a 37ºC (la enzima salvaje se inactiva rápidamente a esta temperatura), se puede monitorizar la generación de PPi durante la reacción de amplificación isotérmica de ácido nucleico, utilizando una reacción ELIDA estándar. Un ejemplo de una enzima luciferasa de luciérnaga mutante que sea estable a 37ºC, y que sea adecuada para su uso en un método de la presente invención, está descrito por Tisi L. y col., [Tisi L. C. y col., (2002), "Development of a thermostable firefly luciferase", Analytica Chimica Acta, Vol. 457, 115-123].

Alternativamente, la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) puede ser llevada a cabo a más de una temperatura dentro del intervalo de temperaturas preferido.

Donde se descubra que la luciferasa que se emplea produzca una menor intensidad global de la producción de luz del ensayo de bioluminiscencia (aunque ocurra o no la amplificación) cuando aumente la temperatura a la que se realiza la reacción de amplificación de ácido nucleico, es provechoso para la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) que sea aplicada a menor temperatura. Esto tiene la ventaja dual de que aumenta la intensidad de la producción de luz, y de que la reacción de amplificación ocurre más lentamente. Una reacción de amplificación más lenta es particularmente beneficiosa para el análisis cuantitativo puesto que los puntos de los datos que corresponden con los diversos puntos en los que existe una variación en la velocidad de cambio de la intensidad de la luz con el tiempo, para muestras teniendo cantidades diferentes de ácido nucleico molde, ocurren durante un gran periodo de tiempo que cuando se monitoriza la reacción de amplificación a una temperatura superior, y son, de este modo, más fácilmente monitorizadas.

Sin embargo, aplicando la reacción de amplificación de ácido nucleico a una temperatura inferior podría afectar potencialmente a la especificidad de la reacción de amplificación. Por ejemplo, podría haber una mayor oportunidad de resultados falso-positivos ya que se reduce la temperatura de la reacción de amplificación, puesto que aumenta la ocasión de anillamiento de los cebadores a secuencias que no sean la secuencia diana deseada a medida que se reduce la temperatura de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Así, la invención también proporciona un método en el que la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se inicia a una temperatura superior y después se reduce a una temperatura inferior. Preferentemente, estas temperaturas superior e inferior están dentro de un intervalo de temperatura preferido, como se discutió antes. Esto tiene la ventaja de que la reacción de amplificación de ácido nucleico puede ser iniciada a una temperatura superior donde es mayor la especificidad; después, antes de que la amplificación entre en una fase exponencial detectable, se puede reducir la temperatura para aumentar la intensidad de la luz y ralentizar el progreso de los resultados.

La relativamente baja temperatura de los métodos isotérmicos y el método de termociclado a baja temperatura comparado con los métodos que utilizan PCR por termociclado convencional, en los que se eleva la temperatura a 95ºC, permite que sean analizados volúmenes de muestra menores. En particular, en formas de realización en las que el intervalo de temperatura no exceda de 55ºC, se pueden analizar volúmenes de muestra exquisitamente pequeños mediante un método de la invención. Por ejemplo, mediante un método de la invención se pueden analizar volúmenes de muestra de menos de 10 \mul, e incluso volúmenes de muestra de menos de 1 \mul. Las altas temperaturas requeridas en una PCR convencional hacen de los volúmenes de muestra pequeños un reto técnico. La capacidad de analizar volúmenes de muestra muy pequeños también tiene la ventaja de recortar los costes de reactivos.

De este modo, en una forma de realización preferida, un método de la invención necesita que, en la reacción de amplificación de la etapa ii), la reacción de la polimerasa sea conducida isotérmicamente, y que la luciferasa que se utilice sea estable a esa temperatura. Esto ofrece las ventajas siguientes:

i): se podría monitorizar continuamente, en tiempo real, la reacción de amplificación isotérmica de ácido nucleico;

ii): la reacción de amplificación isotérmica de ácido nucleico podría ser monitorizada en un sistema completamente cerrado, sin la necesidad de una posterior adición de reactivos;

iii): la relativamente baja temperatura del ensayo permitiría analizar volúmenes de muestra exquisitamente pequeños (la alta temperatura de la PCR convencional hace de los volúmenes de muestra pequeños un reto técnico), recortando así los costes de reactivos; y

iv): se podría emplear una sencilla cámara CCD para monitorizar simultáneamente miles de reacciones PCR isotérmicas.

Una característica de la invención es que el PPi de la síntesis de ácidos nucleicos, durante la amplificación de ácidos nucleicos, pueda ser detectado cuando el ácido nucleico que ha sido sintetizado sería indetectable por electroforesis en gel, produciendo una sensibilidad aumentada y un reducido tiempo de amplificación. Además, mientras que el método de turbidez de Mori y col. [Mori Y. y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., (2001), 289, 150-154] requiere concentraciones de PPi de ~0'6mM antes de que se observe una turbidez significativa, utilizando un ensayo de pirofosfato en el que el PPi es transformado en ATP mediante ATP sulfurilasa, y por el que el ATP producido es utilizado por una luciferasa para producir luz. Concentraciones de PPi de menos de 0'5 \muM producen una relación lineal entre la concentración de PPi y la bioluminiscencia [Nyren & Lundin, Analytical Biochemistry, 151(2), 405-409 (1985)]. Esto representa un aumento en la sensibilidad de un método de la invención, para detectar PPi, de al menos 1.200 veces sobre el ensayo
de turbidez. Los métodos de la invención son también más sensibles que los métodos basados en la fluorescencia.

En aplicaciones diagnósticas médicas se puede utilizar un método conforme a la invención. Actualmente, la mayoría de los centros de ensayos diagnósticos necesitan enviar fuera sus ensayos para análisis puesto que analizar las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la PCR, requieren un hardware y una óptica complicados. El empleo de un método como se describió antes permitirá que los resultados de los ensayos sean analizados en el lugar de atención. Por ejemplo, se podría utilizar en clínicas de salud sexual, por ejemplo para ver si un patógeno tal como una bacteria o virus concreto está presente en una muestra. También se puede utilizar para determinar la cantidad de bacterias o virus presentes en una muestra, por ejemplo, para determinar la extensión de una infección.

Una aplicación adicional de un método conforme a la invención es para determinar si una secuencia de ácido nucleico concreta está presente en el código genético de un organismo. Por ejemplo, podría ser utilizado para determinar si ha sido modificado genéticamente el ácido nucleico para el que se crea el ácido nucleico molde, para la detección de ADN asociado con una especie concreta de una planta no modificada genéticamente o de una planta modificada genéticamente, para la detección de ADN asociado con razas con pedigrí de animales, o para aplicaciones diagnósticas médicas o veterinarias tales como pruebas genéticas o ciencia forense.

Se puede utilizar un método conforme a la invención para detectar la presencia de un organismo en una muestra. Como se mencionó antes, este organismo puede ser un patógeno. Sin embargo, el método también puede ser utilizado para detectar un organismo no patogénico.

También se puede utilizar un método de la invención en tecnología de inmunoamplificación de ácido nucleico [por ejemplo, ver Sano T. y col., (1992), Science, vol. 258, 120-122] (por ejemplo, para identificación de un ácido nucleico molde concreto unido a un anticuerpo). El método es también apropiado para su uso in situ donde sería técnicamente difícil utilizar técnicas tales como fluorescencia o absorbancia. Por ejemplo, se podría utilizar un método de la invención sobre una superficie metálica. De este modo, se podría utilizar un método de la invención para, por ejemplo, buscar priones en hojas de escalpelo.

Aunque los kits no están específicamente abarcados por el campo de aplicación de la presente invención, un kit para su uso en un método conforme a la invención puede constar de una ácido nucleico polimerasa, los sustratos para la ácido nucleico polimerasa, al menos dos cebadores, una luciferasa termoestable, luciferina y, opcionalmente, ATP sulfurilasa y adenosina-5'-fosfosulfato. Más preferentemente, el kit comprende además reactivos tampón, tales como una fuente de iones magnesio. Alternativamente, un kit para su uso en un método conforme a la invención puede constar de solamente algunos de estos componentes y/o componentes adicionales. La muestra y cualquier otro componente que hayan sido omitidos en el kit pueden ser añadidos después al kit durante su uso.

Por ejemplo, un kit para su uso en un método de la invención puede comprender recipientes conteniendo, respectivamente:

a): una mezcla tamponada de ácido nucleico polimerasa, una fuente de Mg y dNTPs; y

b): una luciferasa, luciferina y ATP sulfurilasa.

Preferentemente, al menos uno de los componentes del kit está liofilizado o está en otra forma que sea apropiada para su almacenamiento en el kit. Más preferentemente, todos los componentes del kit están liofilizados o en una o más otras formas adecuadas para su almacenamiento. Tales otras formas incluyen componentes a los que se han añadido factores estabilizantes y/o una mezcla magistral, refrigerada o congelada, que contenga los componentes del kit.

Una forma preferida de kit es un circuito "líquido" en miniatura. Preferentemente, un kit para su uso en la presente invención tendrá el tamaño de una tarjeta de crédito para su facilidad de manejo.

Un kit para su uso en un método conforme a la invención puede ser utilizado para analizar una muestra o más de una muestra a la vez. Por ejemplo, se puede utilizar un kit para su uso en un método conforme a la invención para monitorizar 2, 3, ..., 50, ..., 100, ..., 200, ..., hasta miles de muestras a la vez.

En formas de realización en las que se utilice un método de la presente invención para monitorizar más de una muestra a la vez, el método puede ser para detectar la presencia de un ácido nucleico molde de la misma secuencia en cada muestra, o puede ser para detectar la presencia de ácidos nucleicos molde que tengan diferentes secuencias en muestras distintas.

Los resultados se pueden exponer en una tarjeta de ensayo que muestre los resultados de una muestra o de más de una muestra. Preferentemente, para su facilidad de manejo, la tarjeta de ensayo es, aproximadamente, del tamaño de una tarjeta de crédito.

Ahora, la invención será además descrita vía ejemplos solamente, con referencia a las figuras siguientes en las que:

La Figura 1 muestra un equipo utilizado para seguir una reacción LAMP;

la Figura 2 muestra la producción de una LAMP, en presencia de ADN diana, y en un control sin Bst ADN polimerasa;

la Figura 3 muestra los resultados de muestras LAMP duplicadas y controles duplicados;

la Figura 4 muestra los resultados de muestras preparadas como en las Figuras 2 y 3, pero mostrando diferencias en la intensidad absoluta de la luz;

la Figura 5 muestra los perfiles de emisión de luz para la LAMP, utilizando diferentes cantidades de molde diana (duplicados) a 55ºC;

la Figura 6 muestra el tiempo para la emisión máxima de luz;

la Figura 7 muestra un gráfico de la producción bruta de una reacción LAMP por triplicado;

la Figura 8 muestra gráficos de la primera derivada de las curvas mostradas en la Figura 7;

la Figura 9 muestra una comparación de controles con muestras;

la Figura 10 muestra una reacción LAMP donde se reduce la temperatura desde 55ºC hasta 50ºC después de 10 minutos;

la Figura 11 muestra un gráfico de la intensidad de luz, frente al tiempo, para LAMP sin ATP sulfurilasa con diferentes cantidades de molde de partida; y

la Figura 12 muestra un gráfico diferencial (restado el control) de las producciones de luz normalizadas para las reacciones LAMP libres de ATP sulfurilasa de muestras conteniendo diferentes cantidades de molde diana.

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Ejemplos Ejemplo 1 Demostración de un método de la presente invención

La reacción de amplificación isotérmica de ácido nucleico, conocida como Amplificación Mediada por Bucles (LAMP), fue seleccionada para ejemplificar el potencial para utilizar un sencillo ensayo de bioluminiscencia para seguir en tiempo real la amplificación de ácido nucleico.

La manifestación actual más rápida del método LAMP utiliza seis cebadores. Esta manifestación ha sido demostrada para detectar 10^{5} copias de ADN diana en solamente 15 minutos (Nagamine y col., 2002, Molecular and Cellular Probes, 16, págs. 223-229). Las reacciones LAMP normalmente se ejecutan a 60-65ºC, y requieren al menos 4 mM de iones magnesio.

Para demostrar una producción bioluminiscente en tiempo real a partir de una reacción LAMP en particular, fue necesario encontrar medios para disminuir la temperatura a la que se ejecuta la reacción LAMP. Esto es debido al hecho de que, a temperaturas tan altas como 65ºC, incluso la luciferasa más termoestable de escarabajo conocida hasta la fecha (la luciferasa termoestable Ultra-Glow de Promega) no es suficientemente activa y/o estable para dar una suficiente y estable producción de luz durante la duración de una amplificación LAMP (se pueden necesitar alrededor de 45 minutos o más para confirmar que una muestra no contenga ninguna molécula de ADN diana concreto).

Se identificó que disminuyendo las concentraciones de iones magnesio de 4mM a 2mM permitía que las reacciones LAMP funcionasen con éxito a temperaturas inferiores. Además, altas concentraciones de betaína pueden reducir la capacidad de las reacciones LAMP para funcionar reproduciblemente con éxito a temperaturas inferiores. Finalmente, en las formulaciones se seleccionaron e incluyeron agentes estabilizantes apropiados que no interferían con la reacción LAMP. Por consiguiente, fue posible formular unas condiciones donde pudiese ocurrir simultáneamente un ensayo de bioluminiscencia con una reacción LAMP, durante el periodo de amplificación completo.

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Materias de partida

1) Mezcla de reacción (menos Bst ADN polimerasa o ADN diana)

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3

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2) ADN polimerasa

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4

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3) ADN molde

5

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Secuencias de los cebadores:

6

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Método

A un tubo PCR de 200 \mul se añadió 18'6 \mul de la mezcla de reacción, seguido por 1 \mul de ADN molde de 4 ng/\mul y 0'4 \mul de Bst ADN polimerasa. Como control, en un tubo PCR adicional de 200 \mul se añadieron 18'6 \mul de la mezcla de reacción y 0'4 ng/\mul de ADN molde, pero no Bst ADN polimerasa.

Las muestras fueron colocadas en un bloque calefactor mantenido a 50ºC, que había sido puesto dentro de una cabina de luz GeneGenius de Syngene (www.syngene.co.uk). Utilizando el software Genesnap de Syngene (www.syngene.
co.uk), se registró la emisión de luz de las muestras (a través de las tapas cerradas de los tubos PCR) en una serie de fotografías tomadas con una cámara CCD dentro de la cabina de luz de Syngene (Figura 1). Cada fotografía representó la emisión de luz integrada de la muestra, durante un periodo de tiempo de 1 minuto.

Se registraron un total de 40 estructuras puesto que la reacción LAMP fue observada durante 40 minutos en total.

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Resultados

Utilizando el software de Syngene, se cuantificó la producción de luz de cada una de las muestras en función del tiempo. En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos.

Utilizando electroforesis en gel de agarosa se confirmó que la "muestra" (con el ácido nucleico molde) había amplificado verdaderamente cantidades significativas de ADN, mientras que el control no había sintetizado nada.

Se observaron algunas características acerca de la emisión de luz que produjeron la causa de la amplificación:

i) inicialmente, la velocidad de disminución de luz para la muestra y el control fueron similares;

ii) después de un periodo, la intensidad de la luz de la muestra empezó a aumentar, mientras que el control continuó disminuyendo gradualmente;

iii) aumentó la velocidad de aumento en la emisión de luz de la muestra, alcanzó un máximo, después disminuyó hasta que se alcanzó un punto donde se registró la mayor magnitud de emisión de luz durante la reacción LAMP;

iv) después de este máximo en la emisión de luz de la muestra, se observó una disminución en la emisión de luz;

v) la velocidad de disminución en la emisión de luz aumentó después de la emisión máxima de luz, y la magnitud de la emisión de luz llegó a ser menos que la del control;

vi) disminuyó la velocidad de disminución en la emisión de luz y, al final, llegó a ser similar a la del control;

vii) al final de los 40 minutos, a pesar de que la magnitud de la emisión de luz de la muestra fue considera menor que la del control, en este caso, la intensidad de la luz de partida de la muestra fue ligeramente superior (lo cual está relacionado con el hecho de que la emisión de luz de las muestras no fue procesada de ninguna manera para tener en cuenta la posición relativa de las muestras con respecto a la cámara).

Se hizo la hipótesis de que la disminución en intensidad de luz después del pico en la intensidad de luz es a consecuencia de que la luciferasa que está siendo inhibida por el pirofosfato. Tal cual, en la reacción LAMP, el pico en intensidad de luz representa un punto en el tiempo cuando se ha acumulado una cantidad específica de pirofosfato. Por lo tanto, el pico en la intensidad de luz representa un punto en el tiempo cuando haya sido sintetizada una cantidad específica de ADN.

Ejemplo 2 Reproducibilidad del método de la invención utilizando una reacción de amplificación LAMP

Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, excepto que se utilizaron muestras múltiples para evaluar la reproducibilidad de los resultados obtenidos en la reacción LAMP.

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Materias de partida y métodos

Como para el Ejemplo 1, excepto que la muestra y el control fueron realizados por duplicado o triplicado, y la temperatura de la reacción se elevó a 55ºC.

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Resultados

En la Figura 3 se muestran los resultados. Como en el Ejemplo 1, en este caso se ve el mismo progreso de la curva de las muestras.

En este ejemplo, la velocidad de cambio de la emisión de luz y el tiempo para la emisión máxima de luz son sumamente similares para ambas muestras. Nuevamente, mediante electroforesis en gel de agarosa, se confirmó la generación de ADN amplificado en las muestras. Para los controles, aunque la velocidad de cambio de la emisión de luz es similar para ambos casos, existe una pequeña diferencia en valor absoluto. Nuevamente, se cree que esto es debido a los efectos asociados con la captura de luz por el sistema de luz utilizado antes que por cualquier aspecto bioquímico. No obstante, incluso sin manipulación de los datos, se pueden obtener resultados nítidos.

En algunos casos, la intensidad absoluta de la luz observada en, por ejemplo, muestras triplicadas, podría variar debido a los efectos de la captura de luz. No obstante, es similar la velocidad de cambio de la luz y el tiempo para la emisión máxima de luz (Figura 4).

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Ejemplo 3 Empleo de un método de la invención de una manera cuantitativa Materias de partida y métodos

Se repitió el mismo procedimiento perfilado en el Ejemplo 1, pero con diferentes cantidades de ADN diana en las muestras. Se establecieron muestras duplicadas conteniendo un total de 0'4 ng, 40 pg, 4 pg ó 0'4 pg de ácido nucleico molde. La temperatura de la reacción LAMP fue 55ºC.

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Resultados

En la Figura 5 se muestran los perfiles de emisión de luz resultantes para cada una de las muestras. Los resultados obtenidos en la Figura 5 demuestran una propiedad clave de los métodos de la invención. Aunque no existe una correlación convincente entre la cantidad de molde diana y la emisión de luz absoluta, existe una clara relación entre el tiempo para la emisión máxima de luz o el tiempo para cambios en la velocidad de cambio de la emisión de luz.

Un gráfico del tiempo para la emisión máxima de luz frente a la cantidad de ADN diana demuestra que la correlación es cuantitativa (ver la Figura 6a en la que el tiempo para la emisión máxima de luz tiene una correlación lineal con el logaritmo en base 10 de la concentración de molde diana de ADN en la muestra). En la Figura 6b, se traza el gráfico del tiempo para producir el 25% de la cantidad total final de amplicón con el tiempo para la emisión máxima de luz, y se puede ver que los dos parámetros se correlacionan. De este modo, comparando los tiempos para la emisión máxima de luz frente a los resultados obtenidos con electroforesis en gel de agarosa se demuestra que el tiempo para la emisión máxima de luz refleja la acumulación de amplicón y, de este modo, la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

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Ejemplo 4 Manipulación de los datos de resultados de un método de la invención en el que la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción LAMP

Nuevamente, se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, pero utilizando muestras múltiples para evaluar la reproducibilidad de los resultados obtenidos en la reacción LAMP después de que se haya realizado alguna manipulación de datos sencilla, de los datos brutos. Específicamente, se trazaron las primeras derivadas de las producciones.

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Materias de partida y métodos

Estos fueron como para el Ejemplo 1, excepto que la muestra y el control fueron realizados por triplicado, la temperatura fue 50ºC, y se utilizó un total de 1 ng de molde en cada muestra.

La Figura 7 muestra un gráfico de los datos brutos de un método de la invención en estas muestras. Trazando el gráfico de la velocidad de cambio en la emisión de luz con el tiempo en comparación con la intensidad de luz con el tiempo (esto es, trazando la primera derivada), se subrayan los puntos de inflexión. En particular, las regiones de las curvas mostradas en la Figura 7, que van desde mínimos o máximos, cortan el eje Y en el cero cuando se traza la primera derivada de la curva (Figura 7). Aunque la magnitud de las intensidades muestra una varianza considerable, son similares los puntos de inflexión dentro de los conjuntos de las curvas.

Las curvas en la Figura 8, para las muestras donde ha ocurrido una reacción de amplificación LAMP, muestran dos puntos que cruzan el eje Y. El primero representa el primer punto de inflexión de la Figura 7, y el segundo representa el punto de máxima intensidad de luz. El mínimo y el máximo vistos en la Figura 8 subrayan puntos temporales asociados con velocidades máximas de cambio en la emisión de luz. Los cuatro puntos de datos (las dos intersecciones del eje Y y el mínimo y el máximo) muestran una buena superposición entre las muestras por triplicado. Observen que la primera intersección del eje Y sucede casi 10 minutos antes de la segunda.

La Figura 9 muestra una vista ampliada de las curvas de la Figura 8, y subraya cómo trazar la primera derivada que diferencia la muestra del control.

Esto es debido al inherente contenido de información de los datos brutos de un método de la invención que utiliza una reacción LAMP, incluso la manipulación muy sencilla de los datos, tal como tomar la primera derivada, no solamente permite aclarar puntos en las curvas resultantes a identificar (intersecciones del eje Y y máximo y mínimo), sino que también hace los resultados menos sensibles a la magnitud de las señales luminosas (por ejemplo, comparar la superposición de las curvas en las Figuras 7 y 8; en la Figura 8 la superposición es más similar).

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Ejemplo 5 Cambiar la temperatura de la reacción de amplificación durante la amplificación

El método LAMP puede ser construido para trabajar sobre el intervalo de temperatura de aproximadamente 45ºC a 65ºC. Sin embargo, cuanto mayor sea la temperatura a la que se aplique la reacción LAMP, menor será la intensidad global de luz a partir de un método de la invención (aunque ocurra o no amplificación). Esto es debido a la luciferasa termoestable concreta utilizada (la luciferasa Ultra-Glow de Promega), catalizando aparentemente la reacción luminosa a una velocidad menor a altas temperaturas. De este modo, la velocidad de emisión de luz observada para la luciferasa Ultra-Glow a 55ºC es considerablemente menor que la observada a 50ºC. Sin embargo, al enfriarla desde, por ejemplo, 55ºC a 50ºC, se observa un aumento en la velocidad de emisión de luz catalizada por la luciferasa Ultra-Glow, puesto que el efecto es claramente reversible. La reversibilidad supone que la disminución observada en la emisión de luz a alta temperatura no es únicamente el resultado de la luciferasa desnaturalizándose.

Por eso, al aplicar una reacción LAMP a una temperatura inferior, aumenta la emisión de luz del ensayo. Además, al aplicar la LAMP a temperaturas inferiores se puede retardar la reacción misma. Esto puede ser beneficioso en ciertas circunstancias. Por ejemplo, cuando se utiliza un método de la invención cuantitativamente, pueden existir beneficios al retardar la amplificación para que los tiempos tardados, por ejemplo, en alcanzar la emisión máxima de luz para muestras con diferentes cantidades de molde diana, estén mucho más separados en el tiempo que cuando se aplica la reacción LAMP a mayor temperatura.

Sin embargo, aplicando reacciones LAMP a bajas temperaturas podría afectar potencialmente a la especificidad del proceso, esto es, podría haber una mayor oportunidad de un resultado falso-positivo ya que se reduce la temperatura de la LAMP. En otras palabras, aumentan las oportunidades de que los cebadores se anillen a secuencias que no sean la secuencia diana deseada, ya que se reduce la temperatura de la reacción LAMP.

Un posible compromiso para tener la ventaja de los beneficios de aplicar la reacción LAMP a temperaturas bajas, y de mantener todavía la máxima especificidad, es cambiar la temperatura durante la reacción LAMP. Específicamente, se puede iniciar la reacción LAMP a mayor temperatura, donde la especificidad es grande, y después, antes de que la amplificación entre en una fase exponencial detectable, se puede reducir la temperatura para aumentar la intensidad de luz y retardar el progreso de los resultados.

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Materias de partida y métodos

Como para el Ejemplo 1, excepto que se ensayaron varias muestras con diferentes cantidades de molde diana como en el Ejemplo 3 (en el rango 0'02 pg/\mul a 20 pg/\mul, esto es, 0'4 pg de muestra total a 0'4 ng de muestra total). La reacción LAMP fue iniciada a 55ºC, y luego se redujo la temperatura a 50ºC después de 10 minutos.

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Resultados

En la Figura 10 se muestran los datos brutos obtenidos a partir de los datos por cambio de temperatura. Los datos mostrados en la Figura 10 demuestran que el método por cambio de temperatura produce verdaderamente un aumento en la intensidad de la emisión de luz al caer la temperatura. Además, la LAMP permanece cuantitativa porque el tiempo para la emisión máxima de luz sigue siendo función de la cantidad de partida de ADN molde. Comparando la Figura 10 con la Figura 5, donde cantidades equivalentes de molde diana son ensayadas con LAMP pero a una única temperatura de 55ºC, se puede ver que la diferencia de tiempos entre la muestra con más molde (0'4 ng totales/20 pg/\mul) y menos molde (0'4 pg totales/0'02 pg/\mul) es de aproximadamente 8 minutos, mientras que en el método por cambio de temperatura mostrado en la Figura 10, la diferencia de tiempo es de aproximadamente 14 minutos.

De hecho, se pueden utilizar inicialmente temperaturas superiores a 55ºC puesto que, si bien la luciferasa Ultra-Glow empieza a ser inestable por encima de 60ºC, puede tolerar estar a temperaturas superiores durante periodos cortos. Por lo tanto, este enfoque aumenta los intervalos de temperatura disponibles.

Además, este enfoque puede permitir emplear luciferasas menos estables donde la reacción de amplificación no requiera largos periodos a temperaturas que puedan inactivar irreversiblemente la luciferasa.

Finalmente, mientras que todavía pueden ocurrir claramente falsos positivos utilizando el método por cambio de temperatura, deberían ser menos frecuentes debido a la dificultad incrementada de las temperaturas superiores en la fase de amplificación clave inicial (esto es, justo antes de la fase exponencial).

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Ejemplo 6 Método basado en la luciferasa inhibida reversiblemente

Como se discutió antes, el pirofosfato tiene efectos directos sobre la luciferasa. En primer lugar, bajo ciertas circunstancias, el pirofosfato puede suprimir la inhibición que la luciferasa experimenta en presencia de ciertos inhibidores que abarcan la oxiluciferina, el producto de la reacción luminosa. En segundo lugar, el pirofosfato puede por sí mismo inhibir la luciferasa a latas concentraciones. Si el pirofosfato estimula o inhibe, o no, la reacción de emisión de luz catalizada por la luciferasa depende de algunos factores que incluyen el tipo preciso de luciferasa, la temperatura, la concentración de pirofosfato y la presencia de otros compuestos que puedan afectar a la actividad de la luciferasa. Este ejemplo muestra cómo el efecto inhibitorio del pirofosfato puede se utilizado para seguir una reacción LAMP. Un aspecto vital de este enfoque es que se puede tolerar la presencia de ATP en la muestra; en métodos en los que el ensayo de bioluminiscencia cuenta con la detección de ATP mediante la luciferasa para la producción de luz, cantidades significativas de ATP endógeno en la muestra comprometerían gravemente la utilización del ensayo.

El hecho de que el método sin ATP sulfurilasa tolere el ATP (de hecho, funciona mejor en presencia de ATP) quiere decir que se puede utilizar potencialmente para ensayar pirofosfato en reacciones de amplificación que incluyan una etapa de síntesis de ARN, tal como la Amplificación Mediada por Transcripción (TMA).

Llevando a cabo experimentos de control bajo un conjunto concreto de condiciones de reacción, la persona especializada será capaz de determinar la proporción concreta de luciferasa a luciferina a ATP a pirofosfato (luciferasa:luciferina:ATP:pirofosfato) que se necesita para su uso en un método de la invención.

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(Tabla pasa a página siguientr)

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Materias de partida y métodos

1) Mezcla de reacción sin ATP sulfurilasa (menos Bst ADN polimerasa o ADN diana)

7

Método

Se prepararon muestras como en el Ejemplo 1, excepto utilizando la mezcla de reacción descrita arriba. Se ensayaron un rango de concentraciones de ADN molde diana, desde 1 pg hasta 1 ng. La LAMP sin ATP sulfurilasa fue aplicada a 55ºC. Como control se utilizó una muestra sin Bst ADN polimerasa.

Resultados

En la Figura 11 se muestran los datos brutos resultantes de la LAMP sin ATP sulfurilasa. Los datos brutos mostrados en la Figura 11 demuestran que las muestras que contienen ácido nucleico molde muestran una disminución repentina característica en la intensidad de luz con el tiempo, no vista en el control. Se cree que esta disminución es el resultado del pirofosfato, producido por la reacción LAMP, inhibiendo la luciferasa. Tal cual, la disminución repentina es un marcador para la amplificación de ácidos nucleicos. Mediante electroforesis de las muestras en gel de agarosa, se confirmó que esa síntesis de ADN estaba realmente ocurriendo.

La manipulación de datos de los datos brutos permitió una interpretación adicional de los resultados. En primer lugar, los datos fueron normalizados a sus intensidades luminosas de partida, entonces los valores obtenidos del control, que carece de polimerasa, fueron restados de los de las muestras conteniendo ácido nucleico molde (Figura 12).

El examen de la Figura 12 indica que la LAMP sin ATP sulfurilasa es también cuantitativa, ya que el tiempo tardado en alcanzar puntos donde la velocidad de cambio de la intensidad de luz cambie significativamente, parece ser proporcional a la concentración de molde diana en las muestras.

Puesto que está presente ATP 1mM durante la LAMP sin ATP sulfurilasa, por lo tanto se puede tomar el mismo enfoque para seguir métodos de amplificación basados en ARN.

Se apreciará que la invención ha sido descrita antes únicamente a modo de ejemplo, y que se pueden hacer modificaciones adicionales detalladamente que sigan estando dentro del campo de aplicación de la invención definido por las reivindicaciones.

Claims

1. Un método para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en una muestra, comprendiendo las etapas de:

a): una ácido nucleico polimerasa,

b): los sustratos para la ácido nucleico polimerasa,

c): al menos dos cebadores,

d): una luciferasa termoestable,

e): luciferina,

f): opcionalmente ATP sulfurilasa, y

g): opcionalmente adenosina-5'-fosfosulfato;

y posteriormente:

ii) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, del ácido nucleico diana, implicando más de un ciclo de amplificación;

iii) monitorizar la intensidad de la producción de luz de la reacción de bioluminiscencia; y

iv) determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra.

2. Un método conforme a la reivindicación 1, en donde al menos las etapas ii) y iii) se llevan a cabo en un recipiente cerrado.

3. Un método conforme a la reivindicación 1 ó 2 en donde, en la etapa iii), la intensidad de la producción de luz es monitorizada durante la reacción de amplificación de ácido nucleico.

4. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa iii) incluye además el producir un conjunto de datos de la intensidad de la producción de luz en función del tiempo.

5. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la velocidad de cambio de la intensidad de la producción de luz cambia significativamente.

6. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 4, para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra en el comienzo de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii).

7. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 4, para determinar la cantidad de ácido nucleico molde presente en la muestra a consecuencia de la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii).

8. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la intensidad de la producción de luz empieza a aumentar.

9. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la intensidad de la producción de luz está en un máximo.

10. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que aumenta la velocidad de disminución de la intensidad de producción de luz.

11. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el disminuye la velocidad de disminución de la intensidad de la producción de luz.

12. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la cantidad de ácido nucleico molde presente es determinada midiendo, a partir del conjunto de datos, el tiempo tardado en alcanzar un punto en el que la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza un nivel predeterminado.

13. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 8 a 12, en donde la luciferasa termoestable que es puesta en contacto con la muestra en la etapa i) es una luciferasa inhibida reversiblemente.

14. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa iv) comprende además el comparar la intensidad de la producción de luz con la intensidad de la producción de luz de un control en el que la muestra consta de una cantidad conocida de ácido nucleico molde.

15. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 14, para determinar si está presente ácido nucleico molde en la muestra.

16. Un método según la reivindicación 14 en donde, si en la muestra está presente ácido nucleico molde, se determina midiendo, a partir del conjunto de datos, si la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza un nivel predeterminado.

17. Un método según la reivindicación 15, en donde un aumento en la intensidad de la producción de luz, con respecto al nivel predeterminado, indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra.

18. Un método según la reivindicación 15, en donde una disminución en la intensidad de la producción de luz, con respecto al nivel predeterminado, indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra.

19. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 16 a 18 en donde, si en la muestra está presente ácido nucleico molde, se determina midiendo, a partir del conjunto de datos, si la intensidad de la producción de luz alcanza o cruza el nivel predeterminado dentro de un espacio de tiempo predeterminado, después del inicio de la reacción de amplificación de la etapa ii).

20. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa iv) comprende además el comparar la intensidad de la producción de luz con la intensidad de la producción de luz de un control en el que no ha tenido lugar la amplificación.

21. Un método según la reivindicación 20, en donde una disminución en la intensidad de la producción de luz, con respecto a una reacción de control en la que no haya tenido lugar la amplificación, indica la presencia de ácido nucleico molde en la muestra.

22. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) es un método de amplificación por termociclado a baja temperatura, en el que el intervalo de temperaturas de ciclado no excede de 75ºC.

23. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo isotérmicamente.

24. Un método según la reivindicación 23, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo dentro de un intervalo de temperatura que no excede de 75ºC.

25. Un método según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo a una temperatura constante a la que son estables los componentes de la reacción de amplificación y del ensayo de bioluminiscencia.

26. Un método según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se lleva a cabo a más de una temperatura dentro del intervalo de temperatura en el son estables los componentes de la reacción de amplificación y del ensayo de bioluminiscencia.

27. Un método según la reivindicación 26, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico de la etapa ii) se inicia a una temperatura superior, y después se reduce a una temperatura inferior.

28. Un método conforme a alguna reivindicación precedente, para su uso en diagnósticos médicos.

29. Un método conforme a alguna reivindicación precedente, para su uso en determinar si un patógeno está presente en una muestra.

30. Un método conforme a alguna reivindicación precedente, para determinar si una secuencia de ácido nucleico concreta está presente en el código genético de un organismo.

31. Un método según la reivindicación 30, para determinar si ha sido modificado genéticamente el ácido nucleico para el que se crea el ácido nucleico molde.

32. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 27, para determinar si está presente un organismo en una muestra.

33. Un método conforme a alguna de las reivindicaciones 1 a 27, para su uso en tecnología de inmunoamplificación de ácido nucleico.