PT1585836E - Método para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente numa amostra - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA DETERMINAR A QUANTIDADE DE ÁCIDO NUCLEICO MATRIZ PRESENTE NUMA AMOSTRA" A invenção refere-se a um método para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente numa amostra, compreendendo os passos de: i) colocar em associação com a amostra todos os componentes necessários para a amplificação do ácido nucleico, e todos os componentes necessários para o teste de bioluminescência para a amplificação do ácido nucleico e subsequentemente: ii) realização de uma reacção de amplificação do ácido nucleico do ácido nucleico alvo envolvendo mais do que um ciclo de amplificação; iii) monitorização da intensidade da luz produzida no teste de bioluminescência; e iv) determinação da quantidade do ácido nucleico matriz presente na amostra.

Antecedentes A amplificação do ácido nucleico pode ser utilizada para determinar se um ácido nucleico matriz particular está presente numa amostra. Se for produzido um produto de amplificação, isto indica que o ácido nucleico matriz estava presente na amostra. Ao contrário, a ausência de qualquer produto de amplificação indica a ausência do ácido nucleico matriz na amostra. Tais técnicas são de grande importância em aplicações de diagnóstico, por exemplo, para determinar se está presente um patogéneo na amostra. 1

Os ácidos nucleicos podem ser amplificados através de uma variedade de técnicas de termociclização e isotérmicas. As técnicas de termociclização, tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilização da ciclização por temperatura para conduzir a ciclos repetidos da síntese de ADN, dando origem a grandes quantidades de novo ADN sendo sintetizado em proporção à quantidade original de ADN matriz. Recentemente foi também desenvolvido um número de técnicas isotérmicas que não se baseiam na termociclização para conduzir a reacção de amplificação. As técnicas isotérmicas que utilizam polimerases de ADN com actividade de deslocamento da cadeia foram desenvolvidas para reacções de amplificação que não envolvem um passo de síntese de ARN. De um modo semelhante, para reacções de amplificação que envolvem um passo de sintese de ARN, foram desenvolvidas técnicas isotérmicas que utilizam a transcriptase inversa, RNase H e uma polimerase de ARN dependente do ADN.

Os produtos das reacções de amplificação de ácido nucleico têm sido tradicionalmente analisados utilizando electroforese em gel (com base em agarose ou em acrilamida) utilizando um pigmento fluorescente (tal como o brometo de etidio) para formar uma mancha na presença de ADN. Este método pode ser utilizado para indicar o número, quantidade e dimensão dos produtos amplificados. Contudo, a preparação, desenvolvimento e análise das reacções de amplificação utilizando electroforese em gel requerem uma intervenção manual extensa, reagentes perigosos e demoram tempo (tipicamente demora cerca de 1 hora no total). Adicionalmente, são requeridos ciclos de PCR múltiplos (tipicamente 30) para produzir um produto detectável. Mais recentemente, foram desenvolvidos métodos com uma sensibilidade aumentada em relação à electroforese em gel que se baseiam em técnicas baseadas em fluorescência ou num teste de turvação para 2 monitorizar os produtos das reacções de amplificação de ácido nucleico em tempo real.

Uma caracteristica das polimerases de ADN e ARN é o facto de estes libertarem o composto pirofosfato (PPi) de cada vez que estes incorporam uma nova base na molécula de ADN/ARN crescente. Deste modo, o PPi é produzido como um produto secundário numa quantidade estequiométrica à medida que são adicionados nucleótidos a uma cadeia crescente de nucleótidos pela polimerase. Deste modo, acontece que a concentração de PPi é proporcional à quantidade da síntese de ácido nucleico que ocorreu e por isso à acumulação de produto de amplificação (amplicão). Para um polímero de comprimento n, a reacção pode ser mostrada como: polimerase ADN/ARN(n) + dNTP/NTP -► ADN/ARN (n+u + PPi

Um teste de sensibilidade para PPi é conhecido como o Teste de Detecção de Pirofosfato Inorgânico Luminométrico Enzimático (ELIDA) (ver Nyren, P. e Lundin, A., Anal. Biochem. 151: (2) 504-509 (1985)). Este teste tem dois passos: (1) conversão de pirofosfato (PPi) em ATP pelo enzima sulfurilase de ATP, e (2) utilização de ATP para produzir luz na presença da luciferina e oxigénio, catalizada pela luciferase: 1.

Sulfurilase de ATP PPi + APS -► ATP 2.

Luciferase de pirilampo ATP + Luciferina + Oxigénio -► Oxiluciferina + Luz 3 A utilização de testes do tipo ELIDA é vantajosa pelo facto de as leituras da luz poderem ser rapidamente obtidas a partir de pequenos volumes de amostra e as leituras podem ser feitas utilizando dispositivos de monitorização simples e baratos, tais como câmaras de filme fotográfico ou de dispositivo de acoplamento de carga (CCD).

Os documentos US 5534424, US 5498523, WO 98/28440, WO 98/13523 e WO 02/20836 descrevem a utilização de métodos baseados em ELIDA para a sequenciação de regiões curtas de ADN. O teste ELIDA foi utilizado para seguir a incorporação de nucleótidos únicos numa molécula de ADN através de uma polimerase durante uma única sessão de polimerização durante a pirossequenciação. A pirossequenciação é uma técnica iterativa apenas um dos quatro desoxinucleótidos trifosfato ("dNTP") está presente em cada ensaio iterativo para permitir que seja testado cada desoxinucleótido trifosfato ("dNTP") seja testado em cada posição da sequência. Deste modo, todos os componentes necessários para a sintese do ADN nunca estão presentes simultaneamente. A utilização de um teste do tipo ELIDA de ponto final designado "H3PIM", para monitorizar uma reacção em cadeia de polimerase de termociclização ("PCR") foi também descrita (ver documento WO 92/16654 e Tarbary et al., J. Immunological Methods, 156 (1992) 55-60). Aliquotas da mistura reaccional foram tomadas em intervalos de tempo regulares pré-determinados ao longo do processo de reacção e/ou no final do processo de amplificação. Deste modo, é descrito um teste passo a passo longo envolvendo a adição múltipla de reagentes. 4 0 documento WO 02/064830 descreve a utilização de um teste ELIDA para realizar um teste de ponto final para monitorizar uma reacção PCR de termociclização. No documento WO 02/064830, o teste ELIDA pode ser realizado num único passo, enquanto no documento WO 92/16654 são requeridas adições múltiplas e um passo de incubação para monitorizar a PCR de termociclização como um teste de ponto final.

Os documentos WO 01/42496 e Nygren et al. (Analytical Biochemistry, vol. 288, n° 1, (2001), 28-38) descrevem métodos para avaliar a quantidade de um ácido nucleico matriz numa amostra. Os métodos envolvem a co-amplificação do ácido nucleico alvo com, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico competidor que contém uma sequência descriminatória única. A seguir à amplificação, as quantidades relativas dos respectivos amplicões são, então, determinadas utilizando um teste de extensão primário possuindo os produtos de amplificação alvo e competidores como matrizes. Deste modo, os métodos são métodos em dois passos em que i) o alvo é amplificado; e ii) a quantidade de amplicão é detectada. É utilizado um teste de bioluminescência num passo de detecção a seguir à amplificação.

Existe um certo número de problemas associados aos testes de ponto final descritos acima. Em primeiro lugar estes requerem os componentes do teste de bioluminescência a ser adicionados à mistura reaccional a seguir à reacção de amplificação. A abertura do tubo pode conduzir à contaminação da amostra e, além disso, à contaminação do laboratório. Se a própria amostra ficar contaminada, então tal pode resultar na geração de falsos positivos ou falsos negativos. Para além disso, se o laboratório ficar contaminado com o ácido nucleico matriz amplificado, aumenta a probabilidade de as amostras futuras ficarem 5 contaminadas e serem obtidos falsos positivos ou falsos negativos (por exemplo, ver Victor, T. et al., "Laboratory experience and guidelines for avoiding false-positive polymerase chain-reactions results", Eur. J. Clin. Chem. & Clin. Biochem., 31(8): 531-535 (1993)). Deste modo, a possibilidade de contaminação representa uma grande desvantagem na utilização da análise de ponto final deste tipo de métodos de diagnóstico.

Um outro problema com a utilização da análise de ponto final, tal como descrita atrás, é a de que o dATP também actua como um substrato para a luciferase. Deste modo, quando o dATP é utilizado como substrato para a polimerase, a interferência espectral resulta do dATP em vez do dATP reagir com a luciferase. 0 documento wo 02/064830 descreve que quando é utilizado dATP como substrato na reacção de amplificação, o sinal de luz do ELIDA decai rapidamente. Este decaimento seria um sério obstáculo à utilidade de um teste de ponto final dado que a leitura da luz medida não seria apenas função da concentração de PPi mas também do tempo. Assim, se não forem realizados testes de ponto final num tempo restrito, estes não serão quantitativos.

Uma alternativa aos testes de ponto final são os testes que são capazes de monitorizar a síntese do ácido nucleico durante uma reacção de amplificação em "tempo real", i. e., à medida que a síntese de ácido nucleico está em progressão. Testes em tempo real existentes incluem técnicas com base em fluorescência e testes de turvação.

As técnicas com base na fluorescência trabalham monitorizando a alteração da fluorescência que está associada à acumulação de um produto de amplificação através de alguns 6 meios. Por exemplo, métodos para monitorizar a amplificação do ADN durante a PCR utilizando corantes de ligação ao ADN de cadeia dupla (especificamente sondas de hibridação contendo fluoróforos dadores e receptores) são descritos nos documentos US 5994056, WO 97/44486, WO 99/42611 e US 6174670. Estas técnicas com base em fluorescência em tempo real tornam possível seguir a PCR sem amostragem líquida evitando, deste modo, a necessidade do tubo de reacção ser aberto e diminuindo assim os riscos de contaminação.

Contudo, técnicas baseadas na fluorescência possuem desvantagens significativas. Em particular, o custo dos reagentes fluorescentes, particularmente iniciadores marcados de forma fluorescente, é elevado e a preparação da amostra pode ser incómoda. Além disso, a aplicação de sistemas baseados em fluorescência pode ser dificultada pela capacidade limitada do equipamento e pelo seu alto custo. Normalmente, é requerido um termociclador-fluorímetro integrado, controlado por computador dado que os métodos seguem, frequentemente, a PCR em tempo real em vez de serem empregues nas análises de ponto final. Como resultado, a acessibilidade (custo) e a portabilidade de tais sistemas estão comprometidas. Uma vez que a detecção é realizada dentro do equipamento de PCR, tais métodos estão apenas disponíveis em laboratórios adequadamente equipados.

Os testes de turvação em tempo real envolvem a monitorização da presença ou da ausência de um precipitado branco de pirofosfato de magnésio na mistura reaccional de amplificação como método para determinar se o PPi foi produzido. Isto foi descrito como um método para determinar se tinha ou não ocorrido uma reacção de amplificação mediada pelo ciclo isotérmico (ver Mori, Y. et al., "Detection of loop-mediated 7 isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation", Biochem. and Biophys. Res. Comm., 289, 150-154 (2001)). Contudo, este método não é muito sensível e requer concentrações de PPi à volta de 0,6 mM antes de se observar uma turvação significativa.

Sumário da invenção A invenção proporciona um método para determinar a quantidade do ácido nucleico matriz presente numa amostra compreendendo os passos de: i) associar à amostra todos os componentes necessários para a amplificação de ácido nucleico e todos os componentes necessários para um teste de bioluminescência da amplificação de ácido nucleico, incluindo: a) uma polimerase de ácido nucleico, b) os substratos da polimerase de ácido nucleico, c) pelo menos dois iniciadores, d) uma luciferase termoestável, e) luciferina,

f) opcionalmente, sulfurilase de ATP g) opcionalmente, fosfossulfato 5' de adenosina, e subsequentemente: ii) realização de uma reacção de amplificação de ácido nucleico do ácido nucleico alvo envolvendo mais do que um ciclo de amplificação; iii) monitorização da intensidade da luz produzida no teste de bioluminescência, e iv) determinação da quantidade de ácido nucleico matriz na amostra. 0 PPi é produzido como consequência da polimerização de ácido nucleico durante a reacção de amplificação. Um método da invenção envolve a ligação desta produção de PPi à luz produzida no teste de bioluminescência. De um modo preferido, o PPi é convertido em ATP. 0 ATP é, então, detectado através de um teste de bioluminescência catalisado por uma luciferase que utiliza ATP como um substrato para a produção de luz na presença de luciferina e oxigénio. Deste modo, a luciferase é utilizada para seguir as alterações de concentração de ATP. De um modo preferido, isto é conseguido utilizando um teste do tipo ELIDA em que o PPi é convertido em ATP através da sulfurilase de ATP e então o ATP é utilizado pela luciferase para produzir luz. Alternativamente, o PPi é directamente detectado pela luciferase. Ao monitorizar a intensidade da luz produzida no teste de bioluminescência, é possível determinar quanto PPi está presente na mistura reaccional e determinar, deste modo, a quantidade do ácido nucleico matriz presente na amostra. Deste modo, o método testa a síntese enzimática in vitro do ácido nucleico e torna possivel quantificar a extensão em que o ácido nucleico foi amplificado como resultado da polimerização de novo durante a reacção de amplificação. A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser equacionada com uma reacção de polimerase de ácido nucleico "progressiva" dado que é realizado mais do que um ciclo 9 de adição de nucleótido sem mais adições ou manipulação dos componentes tampão. A presença de luciferase e de outros componentes do teste da bioluminescência durante a reacção de amplificação do passo ii) simplifica grandemente a análise da amostra dado que obvia o requisito de mais manipulação da mistura reaccional uma vez que a reacção de amplificação tenha começado. Por exemplo, não é necessário tomar aliquotas da amostra de modo a determinar quanto PPi é que foi produzido. Na vez disso, o teste de bioluminescência é realizado directamente na mistura reaccional utilizada para a reacção enzimática de amplificação do ácido nucleico na presença de todos os componentes necessários para a reacção de amplificação do ácido nucleico, i. e. na mistura reaccional que é formada no passo i) . Nem é necessário adicionar os componentes do teste de bioluminescência à mistura reaccional durante ou a seguir à reacção de amplificação.

Os componentes do teste de bioluminescência (também conhecido como o "teste do pirofosfato" ou "teste do PPi") e a reacção de amplificação devem ser capazes de suportar as condições da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) . Por exemplo, pode ser utilizada uma sulfurilase de ATP termoestável e/ou uma luciferase termoestável e/ou uma polimerase de ácido nucleico termoestável. 0 termo "termoestável", tal como aqui utilizado em relação a um enzima, refere-se a um enzima que é estável dentro da gama de temperaturas em que é realizada a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii).

Os componentes do passo i) são, de um modo preferido, estabilizados por liofilização ou através da presença de 10 factores de estabilização. Estes estabilizadores são também, de um modo preferido, associados à amostra no passo i). Por exemplo, um ou mais de BSA, trealose, polivinilpirrolidona e ditiotreitol (DTT), podem ser associados à amostra no passo i) . De um modo preferido, todos os estabilizadores são associados à amostra no passo i). A temperatura e o tempo requerido para as reacções de amplificação do ácido nucleico são consideravelmente diferentes dos requeridos para as reacções de polimerização do ácido nucleico.

As reacções de amplificação de ácido nucleico requerem quer uma alta temperatura, um longo tempo de duração (e. g. 15 minutos a 24 horas) quer ambos. Ao contrário, as reacções de polimerização do ácido nucleico podem ser rapidamente realizadas a baixas temperaturas (e. g. 37 °C). As luciferases são conhecidas como sendo instáveis. Por exemplo, a luciferase dos pirilampos selvagens inactiva-se rapidamente a 37 °C. As luciferases são também conhecidas como sendo facilmente inibidas, por exemplo, através da oxiluciferina, o produto da sua própria reacção à luz. Contudo, verificou-se surpreendentemente que as luciferase podem permanecer estáveis durante a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) . Além disso, verificou-se que as luciferases podem permanecer estáveis durante todo 0 decurso da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii). Isto é surpreendente devido à longa duração requerida para certas reacções de amplificação do ácido nucleico. A luciferase termoestável que é associada à amostra no passo i) é um enzima luciferase que é estável na gama de 11 temperaturas em que é realizado a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) . A luciferase particular utilizada dependerá das condições sob as quais ocorre a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) . 0 termo "luciferase", tal como aqui utilizado, refere-se a um enzima que catalisa uma reacção bioluminescente. As luciferases que são adequadas para utilização nos métodos da invenção incluem quer as luciferases do tipo selvaqem quer a luciferases mutantes ou variantes, desde que estas sejam estáveis dentro da gama de temperaturas em que se realiza a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii). Um exemplo de uma luciferase termoestável que é adequada para utilização num método da presente invenção é a luciferase Ultra-Glow da Promega. A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode, ou não envolver, um passo de síntese de ARN. Nos métodos em que a reacção de amplificação do passo ii) não envolve um passo de síntese de ARN, os substratos da polimerase incluem cada um dos quatro dNTP: dATP, dTTP, dCTP e dGTP. Um ou mais dos dNTP pode ser substituído com um análogo adequado deste. Nestas formas de realização, a luciferase utiliza, de um modo preferido, ATP como substrato para a produção de luz. Exemplos de luciferases que utilizam ATP como substrato para a produção de luz são a luciferase dos pirilampos (de Photinus pyralis) e os seus mutantes. De um modo preferido, a luciferase que utiliza ATP como substrato para a produção de luz é a luciferase termoestável Ultra-Glow da Promega. Em formas de realização em que a luciferase é utilizada para seguir as alterações de concentração de ATP, a sulfurilase de ATP está presente na mistura reaccional. De um modo preferido, as formas de realização em que a luciferase é utilizada para seguir as alterações na concentração de ATP são aquelas formas de 12 realização em que a reacção de amplificação do passo ii) não envolve o passo de síntese de ARN. Alternativamente, pode ser utilizada uma luciferase que se comporte ela mesmo como uma sulfurilase de ATP adicionalmente à catálise do teste de bioluminescência. Em tais casos, não é necessário adicionar sulfurilase de ATP à mistura reaccional no passo i). 0 fosfosulfato de adenosina 5' é requerido para que a sulfurilase de ATP produza ATP a partir de PPi e seja adicionado à mistura reaccional no passo i) quando a sulfurilase de ATP está presente e quando a luciferase utilizada se comporta ela própria como uma sulfurilase de ATP adicionalmente à catálise do teste de bioluminescência.

Para reacções de amplificação que envolvem um passo de síntese de ARN, os substratos da polimerase incluem cada um dos quatro dNTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) e cada um dos quatro trifosfatos nucleótidos ("NTP") (ATP, UTP, CTP e GTP). Um ou mais dos dNTP e/ou NTP podem ser substituídos por um análogo adequado. Deste modo, quando a reacção de amplificação envolve um passo de síntese de ARN, o ATP endógeno está presente na mistura reaccional como um dos substratos para a polimerase, a menos que seja utilizado um análogo de ATP que possa ser utilizado pela polimerase de ARN mas que não reage com a luciferase.

Quantidades significativas de ATP endógeno na mistura reaccional comprometerão gravemente a utilização de um método da invenção em que se requer que a luciferase associada à amostra no passo i) seja sensível a pequenas alterações na concentração de ATP. De modo a ultrapassar este problema, uma luciferase inversamente inibida é, de um modo preferido, utilizada em 13 formas de realização em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) envolve um passo de síntese de ARN e está presente ATP endógeno na mistura reaccional. 0 termo "luciferase inversamente inibida", tal como aqui utilizado, refere-se a luciferase que ficou inibida por um componente que não o PPi, mas cuja inibição é atenuada através de baixas concentrações de PPi. Por exemplo, as luciferases são conhecidas como sendo inibidas pela oxiluciferina, o produto da sua própria reacção. Verificou-se que esta inibição era atenuada por baixas concentrações de PPi. Deste modo, a utilização de uma luciferase inversamente inibida permite que o PPi seja detectado directamente pela luciferase uma vez que o PPi tem efeitos directos numa luciferase inibida. Pode ser realizada uma série de reacções de controlo utilizando diferentes concentrações do ácido nucleico matriz para determinar o tempo que demora a inibição da luciferase inversamente inibida a ser atenuada pelo PPi para concentrações particulares do ácido nucleico matriz. A luciferase inversamente inibida pode ser inibida por um componente que não o PPi antes da adição da luciferase à mistura reaccional no passo i) . Alternativamente, a luciferase inversamente inibida pode ser formada in situ devido à presença do inibidor na mistura reaccional. De um modo preferido, a luciferase inversamente inibida é uma luciferase que no seu estado inibido utiliza ATP para produzir luz. Em particular, a luciferase é, de um modo preferido uma luciferase de escaravelho e é, de um modo preferido, uma luciferase de pirilampo.

Em formas de realização em que a luciferase em associação com a amostra no passo i) de um método da invenção é uma luciferase inversamente inibida, a sulfurilase de ATP e o fosfosulfato de adenosina 5'não são associados à amostra no 14 passo i) . Contudo, em formas de realização em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) envolve um passo de sintese de ARN e um análogo de ATP adequado que é um substrato da polimerase de ADN mas não para a luciferase (ou, pelo menos, é um substrato muito pobre para a luciferase) é associado à amostra no passo i) em vez do próprio ATP, então a luciferase que é associada à amostra no passo i) pode ser uma luciferase que utiliza ATP para a produção de luz e então sulfurilase de ATP e, de um modo preferido, fosfosulfato de adenosina 5' será então associado à amostra no passo i).

Uma luciferase inversamente inibida pode ser também utilizada em formas de realização da invenção em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) não envolve um passo de sintese de ARN. Em tais casos, a sulfurilase de ATP e o fosfosulfato de adenosina 5' não serão, então, associados à amostra no passo i).

Uma outra vantagem do método da invenção é a facilidade com que a luz produzida no passo iii) pode ser detectada. De um modo preferido, a intensidade da luz produzida no passo iii) é monitorizada visualmente. Métodos adequados para monitorizar a intensidade de luz produzida incluem a utilização de câmaras de filme fotográfico ou dispositivo de carga acoplada (CCD). Alternativamente, a monitorização da intensidade da luz produzida no teste de bioluminescência utilizando uma câmara CCD. A luz produzida pode ser amplificada para visualização quando necessário. Deste modo, a capacidade de detectar a luz produzida utilizando apenas filme fotográfico ou uma câmara CCD tem vantagem em relação a técnicas que empregam análise de fluorescência ou análise com base em gel pelo facto de não ser requerido equipamento informático ou óptico complexo. Além 15 disso, a intensidade da luz produzida pode ser monitorizada sem necessitar irradiar de qualquer modo a amostra (tal como requerido com técnicas que envolvem fluorescência ou absorvância), sem a necessidade de qualquer interface electroquimica com a amostra (e. g. tal como nas aproximações com base em semi-condutores: wilding, P. et al., (1994) "PCR in a Silicon microstructure", Clinicai Chemistry, 40(9): 1815-1818) ou sem a necessidade de irradiação indirecta (e. g. tal como em Surface Plasmon Resonance approaches: Bianchi, N. et al., (1997) "Biosensor technology and surface plasmon resonance for real time detection of HIV-1 genomic sequences amplified by polymerase chain reaction", Clinicai and Diagnostic Virology, 8(3): 199-208).

Além disso, um ou mais do que um (por exemplo, milhares) de amostras podem ser monitorizadas simultaneamente, por exemplo, através de uma única câmara de CCD. Deste modo; um método da invenção pode utilizar equipamento informático simples e barato com a possibilidade de portabilidade e miniaturização e fácil integração em sistemas de elevada produtividade. O passo i) de um método da invenção também inclui, de um modo preferido, a associação de um tampão adequado à amostra. Tampões que são adequados para utilizar com o método da invenção incluem tampões que permitem que a reacção de amplificação prossiga e também que permitam que o teste de bioluminescência prossiga. De um modo preferido, o tampão compreende uma fonte de iões magnésio. Estes estão, de um modo preferido na forma de MgCl2 ou MgS04. Por exemplo, um tampão adequado pode conter Tris-acetato, cloreto de potássio, sulfato de amónio, sulfato de magnésio e triton X-100 a pH 8,8 a 25 °C. 16

Com vantagem, pelo menos, os passos ii) e iii) de um método de acordo com a presente invenção são realizados num vaso fechado. Isto é de grande utilidade uma vez que a capacidade de realizar quer a reacção de amplificação quer o teste de bioluminescência num vaso fechado reduz, ou mesmo elimina, a possibilidade de a amostra ficar contaminada, , Além disso, isto reduz, ou mesmo evita, a possibilidade do laboratório ficar contaminado. Isto é particularmente importante dado que se mesmo uma cópia do ácido nucleico matriz escapar para o laboratório, esta pode contaminar potencialmente outras amostras a serem testadas e originar resultados positivos falsos. Deste modo, a capacidade de evitar a contaminação é de particular importância quando um método da invenção é utilizado numa aplicação de diagnóstico.

De modo a evitar ainda mais a contaminação, a seguir ao passo iv) o vaso é, de um modo preferido, sujeito a um tratamento adequado de modo a destruir o ácido nucleico ai contido, em particular para destruir o ácido nucleico matriz. 0 vaso é ele próprio também, de um modo preferido, destruído a seguir ao passo iv) ou a seguir à destruição do ácido nucleico aí contido. Isto minimiza a possibilidade do laboratório e/ou outras amostras serem contaminados.

De um modo preferido, no passo iii) de um método da invenção, a intensidade da luz produzida é monitorizada durante a reacção de amplificação do ácido nucleico. Isto é apenas possível como resultado dos componentes para o teste de bioluminescência estarem presentes ao longo da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii). De um modo preferido, a intensidade da luz produzida é monitorizada ao longo do tempo da reacção de amplificação do ácido nucleico, 17 i. e. desde o início até ao final da reacção de amplificação do ácido nucleico. Alternativamente, a intensidade da luz produzida pode ser monitorizada durante, pelo menos, parte da reacção de amplificação do ácido nucleico. Alternativamente e/ou adicionalmente, a intensidade da luz produzida pode ser monitorizada após a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) ter acabado e/ou antes da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) começar, por exemplo, de modo a fazer uma leitura de controlo. A capacidade de monitorizar a intensidade da luz produzida durante a reacção de amplificação do passo ii) simplifica o manuseamento do vaso reaccional e permite também uma rápida determinação da quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra. Uma outra vantagem de monitorizar a intensidade da luz produzida durante o decurso da reacção de amplificação é a de que nenhum sinal de base que é produzido pelo dATP que reage com a luciferase interfere com o método da invenção. Isto torna-se apenas um problema com a análise de ponto final.

De um modo preferido, o passo iii) de um método da invenção inclui ainda a produção de um conjunto de dados da intensidade da luz produzida em função do tempo. 0 conjunto de dados é utilizado para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra. De um modo preferido, o conjunto de dados é analisado através de um programa informático e/ou é representado sob a forma de um gráfico ou uma lista de figuras. Por exemplo, o conjunto de dados pode ser representado como um registo da intensidade da luz ao longo do tempo ou um registo da taxa de variação da intensidade da luz ao longo do tempo (i. e. a primeira derivada). 18 A intensidade da luz produzida pode ser monitorizada num, ou mais, tempos pré-determinados. Estes tempos pré-determinados são, de um modo preferido, tempos pré-determinados a seguir ao tempo em que todas as condições necessárias para que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) estejam presentes, no tempo (t) = 0 min. Tais condições são as de que uma mistura reaccional se formou, tal como no passo i), e de que a mistura reaccional está a uma temperatura adequada para que a amplificação prossiga, sendo a referida temperatura também uma temperatura à qual os componentes da reacção de amplificação e do teste de bioluminescência são estáveis. Por exemplo, a intensidade da luz produzida pode ser monitorizada e ajustada a intervalos de tempo pré-determinados durante toda a reacção de amplificação. Por exemplo, estes intervalos podem ser a cada 30 segundos, a cada 1 minuto, a cada 1 minuto e 30 segundos, etc. Alternativamente, os intervalos entre tempos pré-determinados podem variar. De um modo preferido, uma, duas ou mais leituras de luz podem ser feitas por minuto. Quantas mais leituras são feitas por minuto, maior será a confiança dos resultados e é preferido fazer tantas leituras por minuto quanto possível. De um modo preferido, a luz produzida é primeiro monitorizada ao tempo = 0 min. Em certas formas de realização, a intensidade de luz produzida pode ser também monitorizada após a reacção de amplificação ter acabado.

Quanto maior a sensibilidade do sistema de detecção de luz que é utilizado, mais pontos de tempo por minuto são possíveis, uma vez que quando se utiliza uma câmara mais sensível, cada dado provém da integração da emissão de luz num tempo mais curto do que com uma câmara CCD menos sensível. Deste modo, é vantajoso utilizar uma câmara tão sensível quanto possível. 19

Com vantagem, no passo iii) de um método da invenção, a intensidade da luz produzida é monitorizada continuamente. De um modo preferido, a luz produzida é monitorizada continuamente durante, pelo menos, parte da reacção de amplificação do passo ii) . De um modo mais preferido, a luz produzida é monitorizada continuamente durante toda a reacção de amplificação do passo ii) . 0 passo iii) engloba também alternativamente, ou adicionalmente, a monitorização da intensidade da luz produzida continuamente após a reacção de amplificação do passo ii) ter acabado.

Um método de acordo com a invenção pode ser utilizado para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente numa amostra de um modo quantitativo e/ou de um modo qualitativo. A utilização num modo quantitativo inclui a utilização de um método da invenção para determinar a quantidade de matriz presente numa amostra antes da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) ocorrer. Também inclui a utilização de um método da invenção para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente numa amostra como resultado da reacção de amplificação do passo ii); que pode ser determinada quer durante quer a seguir à reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii); í. e., a quantificação de quanto produto de amplificação do ácido nucleico ("amplicão") foi produzido. Isto torna possível quantificar a extensão da reacção de amplificação de ácido nucleico. Quando se utiliza um modo quantitativo, o termo "determina" inclui quer uma determinação precisa da quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra quer uma estimativa da quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra. 20

Verificou-se, surpreendentemente, que de modo a determinar a quantidade ácido nucleico matriz presente numa amostra num modo quantitativo, o tempo da alteração da intensidade de luz produzida é um factor proporcionado adicionalmente à intensidade de per se da luz produzida. Por exemplo, para um particular conjunto de condições reaccionais (e. g. um ácido nucleico matriz particular, uma concentração particular de componentes para a reacção de amplificação e o teste de bioluminescência e uma(s) temperatura(s) particulares para a reacção de amplificação), se estiver presente na amostra uma concentração mais alta de ácido nucleico de matriz no inicio da reacção de amplificação do ácido nucleico, as alterações na intensidade da luz produzida ocorrerão após um período de tempo mais curto a seguir ao início da reacção de amplificação, quando comparado com uma reacção em que está presente uma concentração inferior do ácido nucleico matriz na amostra. Deste modo, para um conjunto particular de condições reaccionais, é possível determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra monitorizando a alteração de intensidade da luz produzida em função do tempo.

De um modo preferido, é realizada uma série de reacções de controlo utilizando diferentes concentrações conhecidas do ácido nucleico matriz particular, sob um conjunto particular de condições reaccionais e os resultados obtidos a partir da amostra sob análise através de um método da invenção são comparados com os resultados obtidos a partir desta série de reacções de controlo. Pode ser também realizado um controlo em que a quantidade de ácido nucleico matriz que foi produzido durante a reacção de amplificação em pontos de tempo pré-determinados é avaliada utilizando electroforese em gel ou outro método quantitativo adequado. Isto permitirá que a 21 quantidade de ácido nucleico matriz na amostra de controlo num ponto de tempo pré-determinado seja calculado e correlacionado com os pontos de tempo respectivos no conjunto de dados.

Quando utilizada num modo qualitativo pode ser utilizado um modo da invenção para avaliar se uma reacção de amplificação de ácido nucleico produz ou não qualquer produto de amplificação e determinar assim se algum ácido nucleico matriz está presente na amostra. Em muitas aplicações em que as condições de amplificação estão já suficientemente optimizadas (e. g. detecção rápida do ácido nucleico (de um modo preferido ADN) associado a patogéneos), a única informação requerida para estabelecer que a sequência de ADN alvo estava presente numa amostra é a ocorrência da reacção de amplificação. Quando está presente ácido nucleico matriz na amostra, isto resultará na produção de um produto da amplificação como resultado da reacção de amplificação de ácido nucleico do passo ii) . Consequentemente, isto resultará numa alteração do padrão da intensidade da luz produzida em função do tempo quando comparado com uma reacção de controlo em que não ocorreu amplificação. Quando não está presente ácido nucleico matriz na amostra, não ocorrerá reacção de amplificação no passo ii) e, deste modo, não será produzido produto de amplificação como resultado. Consequentemente, o padrão de alteração da intensidade da luz produzida em função do tempo será semelhante se não a mesma que a do controlo em que não ocorreu amplificação. Deste modo, a expressão "realização da reacção de amplificação do ácido nucleico", tal como usada no passo ii) inclui quer "realização da reacção de amplificação do ácido nucleico" quer também "criação de condições adequadas para que ocorra a reacção de amplificação", uma vez que nas formas de realização em que não está presente ácido nucleico matriz na amostra, não ocorrerá 22 reacção de amplificação do ácido nucleico. De um modo preferido, a presença ou a ausência da esperada alteração da luz é monitorizada com um período de tempo pré-determinado a seguir a início da reacção.

Tal como mencionado atrás, verificou-se também que o PPi pode, por si só, ter efeitos directos na luciferase com elevadas concentrações. Isto aplica-se a ambas as luciferases que utilizam ATP como substrato para a produção de luz e também luciferases inversamente inibidas. Ao realizar um certo número de experiências de controlo utilizando diferentes concentrações de um particular ácido nucleico de matriz de partida sob um conjunto particular de condições reaccionais, um especialista na matéria será capaz de determinar, a partir do conjunto de dados, o tempo ao qual o PPi tem, por si só, um efeito directo sobre a luciferase. Estes resultados de controlo podem ser então utilizados para extrapolar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra.

Por exemplo, verificou-se que o PPi pode, por si próprio, inibir a luciferase com altas concentrações. 0 ponto em que a intensidade de luz produzida começa rapidamente a diminuir correlaciona-se com o ponto em que a luciferase ficou inibida por uma concentração particular de PPi. Isto pode corresponder ao ponto em que a intensidade de luz produzida está no máximo, i. e. o ponto que marca a transição entre o aumento da luz produzida e a diminuição da luz produzida. Alternativamente, isto pode representar o ponto em que a taxa de diminuição da intensidade da luz produzida aumenta significativamente, e. g., a partir de uma diminuição gradual até uma diminuição rápida. Ao realizar um certo número de experiências de controlo utilizando diferentes concentrações de ácido nucleico matriz, pode ser 23 determinado o tempo em que a intensidade de luz produzida começa a diminuir rapidamente para cada concentração do ácido nucleico matriz de partida particular sob um particular conjunto de condições reaccionais. Estes resultados de controlo podem ser então utilizados para extrapolar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra.

Alternativamente, o PPi pode provocar um aumento na emissão de luz a partir de uma luciferase inibida por uma substância que não o PPi, tal como na forma de realização de luciferase inversamente inibida mencionada acima.

Deste modo, quer o PPi estimule ou iniba, o teste de bioluminescência catalisado pela luciferase depende de um certo número de factores incluindo o tipo preciso de luciferase utilizada, a temperatura da reacção, a concentração do PPi e a presença de outros compostos que podem afectar a actividade da luciferase. Ao realizar um certo número de experiência de controlo utilizando diferentes concentrações de um particular ácido nucleico matriz de partida sob um conjunto particular de condições reaccionais, um especialista na matéria será capaz de determinar, a partir do conjunto de dados, o tempo em que o próprio PPi possui um efeito directo sobre a luciferase e a natureza deste efeito. Estes resultados de controlo podem ser então utilizados para extrapolar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra. 0 conjunto de dados da intensidade da luz produzida em função do tempo pode ser interpretado através de um certo número de diferentes maneiras de modo a determinar a quantidade do ácido nucleico matriz presente na amostra. Pontos particulares no conjunto de dados representam pontos de tempo nos quais estão 24 presentes concentrações específicas de PPi. Estes podem estar correlacionados com a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra. Por exemplo, um ou mais dos pontos seguintes do conjunto de dados são, de um modo preferido, monitorizados: i) o tempo que demora a atingir o ponto em que a intensidade da luz produzida começa a aumentar; ii) o tempo que demora a atingir o ponto em que a taxa de alteração do aumento de intensidade de luz produzida aumenta ou diminui; iii) o tempo que demora a atingir o ponto em que a taxa de alteração da intensidade da luz produzida varia de um aumento a uma diminuição (este é, de um modo preferido, o ponto de intensidade máxima de luz produzida ou "pico" de intensidade da luz produzida) ou de uma diminuição a um aumento; iv) o tempo que demora a atingir o ponto em que a taxa de alteração da diminuição da intensidade de luz produzida aumenta ou diminui, e/ou v) o tempo que demora a atingir o ponto em que a intensidade da luz produzida atinge ou atravessa um nível pré-determinado.

Para a determinação da quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra de modo quantitativo, os pontos no conjunto de dados que são monitorizados são, de um modo preferido, aqueles pontos em que a taxa de alteração da intensidade da luz produzida se altera significativamente. Quando se interpreta o conjunto de dados, os pontos em que a taxa de variação da intensidade de luz produzida se altera significativamente será evidente para um especialista na matéria.

De um modo muito preferido, um ponto em que a taxa de alteração da intensidade da luz produzida se altera significativamente será um ponto que representa uma transição entre a intensidade da luz produzida que aumenta e a intensidade 25 da luz produzida que diminui. Um ponto que representa uma transição entre a intensidade da luz produzida que diminui e a intensidade da luz produzida que aumenta é também um ponto em que a taxa de alteração na intensidade da luz produzida se altera siqnificativamente. Um ponto que marca uma transição entre a intensidade da luz produzida que aumenta e a que diminui ou a que diminui e a que aumenta será, de um modo preferido, representada como um ponto de inflexão quando os resultados são apresentados num gráfico de intensidade da luz produzida em função do tempo. Um ponto em que a intensidade da luz produzida varia de uma intensidade constante até um aumento ou uma diminuição da intensidade, ou um ponto em que a intensidade da luz produzida varia de um aumento ou de uma diminuição da intensidade até uma intensidade constante, representa também um ponto em que a taxa de alteração da intensidade da luz produzida varia significativamente.

Alternativamente, um ponto em que a intensidade da luz produzida varia significativamente pode ser um ponto em que a taxa de aumento da intensidade da luz produzida ou a taxa de diminuição da intensidade da luz produzida aumenta ou diminui significativamente. Deste modo, a expressão "um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida varia significativamente" refere-se, de um modo preferido, a um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida num intervalo de tempo pré-determinado antes desses pontos diferirem em, pelo menos, 30% da taxa de variação da intensidade da luz produzida no mesmo intervalo de tempo pré-determinado após esse ponto. De um modo mais preferido, "um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida varia significativamente" refere-se a um ponto a taxa de variação da intensidade da luz produzida num intervalo de tempo 26 pré-determinado antes desses pontos difere em, pelo menos, 50% da taxa de variação da intensidade da luz produzida no mesmo intervalo de tempo pré-determinado após esse ponto. De um modo ainda mais preferido, "um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida varia significativamente" refere-se a um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida num intervalo de tempo pré-determinado antes desses pontos difere em, pelo menos, 70% da taxa de variação da intensidade da luz produzida no mesmo intervalo de tempo pré-determinado após esse ponto. Alternativamente, "um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida varia significativamente" refere-se a um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida num intervalo de tempo pré-determinado antes desses pontos difere em, pelo menos, 10%, 20%, 40%, 60% ou 80% da taxa de variação da intensidade da luz produzida no mesmo intervalo de tempo pré-determinado após esse ponto. O intervalo de tempo pré-determinado é, de um modo preferido, 30 segundos, mas pode, alternativamente, ser de 1 minuto, 1 minuto e 30 segundos ou mais. Alternativamente, o intervalo de tempo pré-determinado pode ser inferior a 30 segundos. O intervalo de tempo pré-determinado escolhido dependerá dos intervalos de tempo em que a intensidade da luz produzida é monitorizada e dependerá da cinética da reacção de amplificação particular que está a ser estudada.

Deste modo, para determinação quantitativa, um ou mais dos pontos seguintes do conjunto de dados é, de um modo preferido, monitorizado: i) o ponto em que a intensidade da luz produzida começa a aumentar; ii) o ponto em que a taxa de variação do aumento da intensidade da luz produzida aumenta ou diminui significativamente; iii) o ponto em que a taxa de variação do aumento da intensidade da luz produzida varia de um aumento até 27 uma diminuição (de um modo preferido o ponto de intensidade máxima da luz produzida) ou de uma diminuição até um aumento e/ou iv) o ponto em que a taxa de variação da diminuição de intensidade da luz produzida aumenta ou diminui significativamente. 0 tempo em que a intensidade da luz produzida atinge ou ultrapassa um nivel pré-determinado pode ser também monitorizado.

Em formas de realização em que uma luciferase inversamente inibida não é utilizada, a quantidade de ácido nucleico presente na amostra é, de um modo preferido, determinada de modo quantitativo monitorizando um ou mais dos pontos seguintes: i) o tempo que demora a atingir um ponto em que a intensidade da luz produzida começa a aumentar; ii) o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida se altera de um aumento para uma diminuição; iii) o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de diminuição da intensidade da luz produzida aumenta significativamente; iv) o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de alteração da diminuição da intensidade da luz produzida diminui significativamente; e v) o tempo que demora para que a intensidade da luz produzida atinja ou ultrapasse um nível pré-determinado.

Em formas de realização em que é utilizada uma luciferase inversamente inibida, embora a luciferase seja inibida pelo produto da sua reacção, a intensidade da luz produzida diminui gradualmente. Então, uma vez que uma certa quantidade de PPi é produzida como resultado da reacção de amplificação, a luciferase torna-se sensível ao PPi e é, deste modo, inibida e a intensidade da luz produzida aumenta. A intensidade da luz produzida diminui então gradualmente até uma certa quantidade de 28 PPi ter sido produzido, ponto em que a taxa de variação da diminuição da intensidade da luz produzida aumenta e a intensidade da luz produzida então diminui até um nível que é inferior à intensidade da luz produzida de uma reacção de controlo em que não ocorre amplificação de ácido nucleico. A taxa de variação da diminuição da intensidade da luz produzida diminui então. Deste modo, em formas de realização em que uma luciferase inversamente inibida é associada à mistura reaccional no passo i), a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra é, de um modo preferido, determinado de modo quantitativo monitorizando um ou mais dos seguintes pontos: i) o tempo que demora a atingir um ponto em que a intensidade de luz produzida varia de uma diminuição gradual até um aumento (i. e., o ponto em que a intensidade de luz produzida começa a aumentar); ii) o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de diminuição da intensidade de luz produzida aumenta significativamente (de um modo preferido de uma diminuição gradual até uma diminuição rápida); e iii) o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de diminuição da intensidade de luz produzida diminui significativamente (de um modo preferido de uma diminuição rápida até uma diminuição gradual).

Tal como mencionado atrás, o tempo que demora a atingir um ponto particular para um ácido nucleico matriz particular depende da concentração do ácido nucleico matriz presente na amostra no início da reacção de amplificação. Deste modo, o passo iv) de um método da invenção compreende ainda, de um modo preferido, a comparação da intensidade de luz produzida com a intensidade de luz produzida a partir de uma curva padrão formada pelos resultados de um certo número de controlos em que as amostras compreendem quantidades conhecidas de ácido nucleico 29 matriz de modo a determinar a quantidade de ácido nucleico matriz na amostra.

Para a determinação da quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra de modo qualitativo, i. e. quer ou não o ácido nucleico matriz esteja presente na amostra, o ponto no conjunto de dados que é monitorizado é, de um modo preferido, o ponto em que a intensidade de luz produzida atinge ou ultrapassa um nivel pré-determinado.

Em formas de realização em que não é utilizada uma luciferase inversamente inibida, um aumento na intensidade de luz produzida indicará a presença do ácido nucleico matriz na amostra. De um modo preferido, o aumento da intensidade da luz produzida é relativo a uma reacção de controlo em que não ocorre amplificação. Por exemplo, uma tal reacção de controlo será, de um modo preferido, uma em que não esteja presente ácido nucleico matriz ou em que não esteja presente polimerase. Deste modo, nestas formas de realização, a quantidade de ácido nucleico presente na amostra pode ser determinada, de modo qualitativo, monitorizando se a intensidade de luz produzida atinge ou ultrapassa a de um controlo no qual não se realiza amplificação. De um modo mais preferido, nestas formas de realização, a quantidade de ácido nucleico presente na amostra pode ser determinada, de um modo qualitativo, monitorizando se a intensidade de luz produzida atinge ou ultrapassa um nivel pré-determinado. Por exemplo, o nivel pré-determinado pode ser ajustado a 125% ou 150% da luz produzida no inicio da reacção de amplificação no ponto em que a taxa de diminuição da intensidade de luz produzida está num mínimo. Se a intensidade de luz produzida atinge este nível pré-determinado ou aumenta para lá deste, isto indicará a presença de ácido nucleico matriz na 30 amostra. Contudo, se a intensidade de luz produzida não atinge este nivel pré-determinado, isto indicará a ausência de ácido nucleico matriz na amostra. 0 nivel pré-determinado pode variar dependendo de um ou mais factores, incluindo: o ácido nucleico matriz utilizado, a concentração dos componentes utilizados na reacção de amplificação do ácido nucleico e a temperatura utilizada para a reacção de amplificação do ácido nucleico. Ao realizar experiências de controlo, em que o ácido nucleico matriz está presente ou o ácido nucleico matriz não está presente, um especialista na matéria será rapidamente capaz de determinar um nível pré-determinado adequado.

De um modo preferido, a presença do aumento da intensidade de luz produzida dentro de um determinado período de tempo a seguir ao início da reacção de amplificação do passo ii) indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra e a ausência do aumento da intensidade de luz produzida dentro de um determinado período de tempo a seguir ao inicio da reacção de amplificação do passo ii) indica a ausência de ácido nucleico matriz na amostra. Por exemplo, quando um método da invenção é utilizado para genotipagem, em que uma certa quantidade de material de teste conterá sempre uma certa quantidade de matriz alvo, então se o ácido nucleico matriz estiver presente, pode-se constatar, com confiança, que se a intensidade da luz produzida não tiver aumentado dentro de um tempo pré-determinado, então o alvo está ausente.

De um modo preferido, o período de tempo pré-determinado será um tempo que decorre durante a reacção de amplificação do passo ii) . Quanto menos ácido nucleico matriz estiver presente 31 no início da reacção, mais tempo demora a ocorrer a reacção de amplificação do passo o < -H -H realizar um certo número de experiências de controlo para um ácido nucleico matriz particular, sob um conjunto de condições reaccionais particulares em que o ácido nucleico matriz está presente em várias concentrações ou em que o ácido nucleico matriz não está presente, um especialista na matéria será rapidamente capaz de determinar um tempo pré-determinado adequado no qual o aumento pode ou não ocorrer para esse ácido nucleico matriz particular, sob esse conjunto particular de condições reaccionais. Por exemplo, o período de tempo pré-determinado pode ser até 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais minutos desde o início da reacção de amplificação do ácido nucleico.

Alternativamente, ou adicionalmente, num método de acordo com a invenção, uma diminuição na intensidade da luz produzida relativa a um nível pré-determinado, indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra. Existe a hipótese de esta diminuição ocorrer quando a luciferase fica inibida pelo PPi. Por exemplo, o nível pré-determinado pode ser ajustado a 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% da luz produzida no início da reacção de amplificação no ponto em que a taxa de diminuição da intensidade da luz está num mínimo. Se a intensidade da luz produzida diminuir até este nível pré-determinado ou diminuir para lá disso, isto indicará a presença de ácido nucleico matriz na amostra. Contudo se a intensidade da luz não atingir este nível pré-determinado, isto indicará a ausência do ácido nucleico matriz na amostra. O nível pré-determinado pode variar dependendo de um ou mais factores incluindo: o ácido nucleico matriz utilizado, a concentração de componentes utilizados na reacção de amplificação do ácido nucleico e a temperatura da reacção de 32 amplificação do ácido nucleico. Ao realizar experiências de controlo em que o ácido nucleico matriz está presente ou o ácido nucleico matriz não está presente, um especialista na matéria será rapidamente capaz de determinar um nível pré-determinado. 0 passo iv) de um método da invenção compreende ainda, de um modo preferido, a comparação da intensidade de luz produzida com a intensidade da luz produzida a partir de um controlo em que não ocorre amplificação. Por exemplo, um tal controlo pode ser um em que os mesmos passos são realizados tal como num método de acordo com a invenção, excepto que o ácido nucleico matriz e/ou um dos outros componentes necessários para a reacção de amplificação (e. g. a polimerase) é/são omitidos. Isto permite que o decaimento da bioluminescência ao longo do tempo seja tomado em linha de conta.

Num método de acordo com a invenção embora seja, de um modo preferido, realizado um controlo simultaneamente com a amostra em teste, não é necessário que este seja o caso. Por exemplo, o controlo pode ser um controlo que foi realizado previamente e os dados obtidos deste podem ser utilizados para comparação com numerosas outras amostras.

Num método de acordo com a invenção, uma diminuição na intensidade da luz produzida em relação a uma reacção de controlo em que não ocorreu amplificação indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra. Esta diminuição em relação ao controlo ocorrerá subsequentemente a outras alterações de intensidade da luz produzida em relação ao controlo que são descritas atrás. A verificação de que a intensidade da luz produzida diminui eventualmente até um nível que é inferior ao de uma reacção de controlo em que não ocorre amplificação é 33 surpreendente dado que um perito na matéria esperaria que a intensidade da luz produzida continuasse a aumentar à medida que mais PPi fosse produzido. Existe a hipótese de que a intensidade da luz produzida diminui até um nível inferior ao do controlo porque a luciferase fica inibida pelo PPi. Embora a monitorização da intensidade da luz produzida determine se é inferior à do controlo em que não ocorreu amplificação, é preferido que seja efectuada durante a reacção de amplificação do passo ii), esta pode ser alternativamente realizada a sequir à reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) . De um modo preferido, a intensidade da luz produzida diminui até um nível que é 30%, ou menos, da intensidade da luz produzida na reacção de controlo. De um modo mais preferido, a intensidade da luz produzida diminui até um nível que é 20%, ou menos, da intensidade da luz produzida na reacção de controlo. Ainda de um modo mais preferido, a intensidade da luz produzida diminui até um nível que é 10%, ou menos, da intensidade da luz produzida na reacção de controlo. Alternativamente, a intensidade da luz produzida pode diminuir até um nível que é 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 50% ou menos ou 40% ou menos da intensidade da luz produzida na reacção de controlo.

De um modo preferido, a presença da diminuição na intensidade da luz produzida em relação ao nível pré-determinado ou à reacção de controlo dentro de um período de tempo pré-determinado a seguir ao início da reacção de amplificação do ácido nucleico indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra e a ausência da diminuição da intensidade da luz produzida em relação ao nível pré-determinado ou à reacção de controlo dentro do período de tempo pré-determinado a seguir ao início da reacção de amplificação indica a ausência de ácido nucleico matriz na amostra. O período de tempo pré-determinado 34 é, de um modo preferido, até 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais minutos a partir do inicio da reacção de amplificação do ácido nucleico. Ao realizar experiências de controlo em que diferentes concentrações de ácido nucleico matriz estão presentes ou em que o ácido nucleico não está presente, o especialista na matéria será rapidamente capaz de determinar um tempo pré-determinado adequado através do qual a diminuição deve ter ou não ocorrido. A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada, de um modo preferido, dentro de uma gama de temperatura em que a luciferase é suficientemente activa e estável para originar uma luz suficiente e estável ao longo da duração da reacção de amplificação. Além disso, a reacção de amplificação do passo ii) é, de um modo preferido, um que possa ser realizado a uma temperatura suficientemente baixa e que seja suficientemente rápida para a luciferase permanecer estável durante a reacção de amplificação. A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) de um método da invenção pode ser realizada isotermicamente ou pode ser um método de termociclização. De um modo preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) de um método da invenção é realizada isotermicamente. As reacções de amplificação do ácido nucleico que são realizadas isotermicamente são as reacções de amplificação do ácido nucleico que não se baseiam na termociclização para que a reacção de amplificação prossiga.

Exemplos de reacções de amplificação do ácido nucleico que não envolvem um passo de síntese do ARN e que são adequadas para monitorizar através de um método de acordo com a invenção incluem quer métodos isotérmicos quer também métodos de termociclização, tal como a PCR. 35 Métodos isotérmicos que não envolvem um passo de síntese do ARN prosseguem através do deslocamento da cadeia. Tais métodos incluem: amplificação de círculo rolante (ver Fire, A. E Xu, S.-Q. (1995) "Rolling replication of short DNA circles", proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 92 4641-4645), tecnologia de amplificação de círculo rolante (ver http://www.molecularstaging.com/Pages/RCATdetails_.html; Amersham's Phi29-based amplification Kit, product codes: 25-6400-10 and 25-6400-50), amplificação de ramificação isotérmica (Zhang, W. et al., "Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasability study", J. Clin. Microbiol., Jan 2002, 128-132), amplificação por deslocamento de cordão dependente de endonuclease de restrição (Walker, G.T. "isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme /DNA polymerase System", PNAS, (1992), 89, 392-396), amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) (Notomi, T., "Loop-mediated isothermal amplification of DNA", Nucl. Acids Res., 2000, 28(12), e63, i-vii) e variantes destes métodos. As técnicas de amplificação isotérmica de ácido nucleico que não envolvem um passo de síntese de ARN e que prosseguem através de mecanismos de deslocamento da cadeia são também conhecidos como técnicas de "PCR isotérmicas". A verificação de que um teste de bioluminescência com base num teste ELIDA pode ser utilizado para monitorizar reacções de amplificação que prosseguem através de um deslocamento de cordão é surpreendente dado o número de reacções que ocorrem devido à baixa temperatura da reacção de amplificação.

Alternativamente, métodos de termociclização que não envolvem uma síntese de ARN podem ser utilizadas num método da invenção desde que todos os componentes da reacção de 36 amplificação e o teste de bioluminescência sejam estáveis às temperaturas a que o PCR cicliza. De um modo preferido, a reacção de termociclização é um método de termociclização de baixa temperatura em que a extensão do iniciador é realizada a uma gama de temperatura de ciclização que não excede 75 °C e que, de um modo preferido, não excede 70 °C e que utiliza uma polimerase de ADN moderadamente termoestável. Um tal método é o LoTemp® PCR que utiliza uma polimerase HiFi® DNA e é descrito em www.hifidna.com/FQAall.htm. Alternativamente, a reacção de termociclização é um método de termociclização de baixa temperatura que utiliza o fragmento Klenow da polimerase Ie ADN na presença de prolina (ver Nucleic Acid Research, (1999), 27(6), 1566-1568) .

Exemplos de reacções de amplificação isotérmicas que envolvem o passo de síntese de ARN e que podem ser monitorizadas através de um método da invenção incluem a amplificação mediada por transcrição (TMA) ou a amplificação com base na sequência do ácido nucleico (NASBA) (Guatelli, J.C. et al., "Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled after retroviral application", PNAS, (1990), 87, 1874-1878) e variantes destes métodos. A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas em que os componentes da reacção de amplificação e do teste de bioluminescência permanecem estáveis. De um modo preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não excedam 75 °C. De um modo mais preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não excedam 65 °C. De um modo muito preferido, 37 a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não excedam 60 °C, i. e. uma gama de temperaturas dentro da qual a luciferase termoestável Ultra-Glow da Promega seja suficientemente activa e estável para originar uma suficiente e estável produção de luz ao longo da duração da reacção de amplificação. Alternativamente, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser realizada dentro de uma gama de temperaturas que não excedam, 55 °C, 50 °C, 45 °C ou 40 °C.

De um modo preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não vão abaixo de 20 °C. De um modo mais preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não vão abaixo de 30 °C. De um modo ainda mais preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não vão abaixo de 40 °C. Alternativamente, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser realizada dentro de uma gama de temperaturas que não vão abaixo de 25 °C, 35 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C ou 60 °C.

De um modo preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas de 30 °C a 75 °C. De um modo mais preferido, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas de 30 °C a 65 °C. Por exemplo, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser realizada dentro de uma gama de temperaturas de 45 °C a 65 °C ou 35 °C a 40 °C. 38 A reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser realizada a uma temperatura constante dentro da gama de temperaturas especificada atrás. Numa forma de realização preferida a reacção de amplificação do ácido nucleico é

realizada a 37 °C. Por exemplo, ao utilizar um enzima de luciferase de pirilampo mutante que seja estável a 37 °C (o enzima tipo selvagem inactiva-se rapidamente a esta temperatura), pode-se monitorizar a formação de PPi durante a reacção de amplificação do ácido nucleico isotérmica utilizando uma reacção elida corrente. Um exemplo de um enzima de luciferase de pirilampo mutante que é estável a 37 °C e que é adequado para utilização num método da presente invenção é descrito por Tisi, L. et al. (Tisi, L. C. et al., (2002) "Development of a thermostable firefly luciferase", Analytica Chimica acta, Vol. 457, 115-123).

Alternativamente, a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) pode ser realizada a mais do que uma temperatura dentro da gama de temperatura preferida.

Quando se verifica que a luciferase que é utilizada produz uma intensidade global inferior da luz produzida a partir do teste de bioluminescência (quer a amplificação ocorra quer não) quando a temperatura a que a reacção de amplificação do ácido nucleico é realizada é aumentada, é vantajoso que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) seja realizada a uma temperatura baixa. Isto possui a vantagem dupla de a intensidade da luz produzida ser aumentada e de a reacção de amplificação ocorrer mais lentamente. Uma reacção de amplificação mais lenta é particularmente benéfica para análise quantitativa uma vez que os pontos de dados que correspondem aos vários pontos em que existe uma variação na taxa de alteração da intensidade da luz 39 com o tempo para amostras possuindo diferentes quantidades do ácido nucleico matriz ocorrem durante um período de tempo superior ao de quando a reacção de amplificação é monitorizada à temperatura mais elevada e são, deste modo, mais facilmente monitorizados.

Contudo, ao realizar a reacção de amplificação do ácido nucleico a uma temperatura inferior pode-se afectar potencialmente a especificidade da reacção de amplificação. Por exemplo, pode haver uma maior oportunidade de um resultado positivo falso dado que a temperatura da reacção de amplificação é reduzida dado que a possibilidade dos iniciadores se liqarem com as sequências que não as sequências alvo desejadas aumenta à medida que a temperatura da reacção de amplificação do ácido nucleico é reduzida. Deste modo, a invenção proporciona também um método em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é iniciada a uma temperatura mais elevada e, subsequentemente, deixada cair para uma temperatura inferior. De um modo preferido, estas temperaturas superior e inferior estão dentro da gama de temperaturas preferidas, tal como discutido atrás. Isto possui a vantagem de a reacção de amplificação do ácido nucleico poder ser iniciada a uma temperatura superior em que a especificidade é maior e então, antes da amplificação entrar numa fase exponencial detectável, podendo a temperatura ser baixada para aumentar a intensidade da luz e abrandar o progresso dos resultados. A temperatura relativamente baixa dos métodos isotérmicos e a baixa temperatura dos métodos de termociclização em comparação com métodos que utilizam PCR de termociclização convencional em que a temperatura é elevada a 95 °C permite que sejam analisados volumes menores de amostra. Em particular, nas formas de 40 realização em que a gama de temperatura não excede 55 °C, volumes de amostra especialmente pequenos podem ser analisados através de um método da invenção. Por exemplo, volumes de amostra inferiores a 10 μΐ e mesmo volumes de amostra inferiores a 1 μΐ podem ser analisados através de um método da invenção.

As altas temperaturas requeridas em PCR convencional tornam os volumes de amostra muito pequenos um desafio técnico. A capacidade de analisar volumes de amostra muito pequenos possui também a vantagem de cortar nos custos dos reagentes.

Deste modo, numa forma de realização preferida, um método da invenção requer que na reacção de amplificação do passo ii), a reacção da polimerase seja conduzida isotermicamente e que a luciferase que é utilizada seja estável a essa temperatura. Isto oferece as vantagens seguintes: i) a reacção isotérmica de amplificação do ácido nucleico pode ser monitorizada continuamente em tempo real; ii) a reacção isotérmica de amplificação do ácido nucleico pode ser monitorizada num sistema completamente fechado sem necessitar da adição de mais reagente; iii) a temperatura relativamente baixa do teste permitirá que volumes de amostras especialmente pequenos sejam analisados (a alta temperatura da PCR convencional torna os volumes de amostra muito pequenos um desafio técnico, cortando deste modo em custos de reagentes; e 41 iv) uma simples câmara CCD pode ser empregue para monitorizar simultaneamente milhares de reacções PCR isotérmicas. É uma caracteristica da invenção que o PPi da síntese do ácido nucleico durante a amplificação do ácido nucleico possa ser detectado quando o ácido nucleico que foi sintetizado seria indetectável por electroforese em gel, resultando numa sensibilidade acrescida e num tempo de amplificação reduzido. Além disso, enquanto o método da turvação de Mori et al., (Mori, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., (2001) 289, 150-154) requer concentrações de PPi de ~0,6 mM antes de se observar uma turvação significativa, ao utilizar um teste de pirofosfato em que o PPi é convertido em ATP através da sulfurilase de ATP e através do qual o ATP é produzido por uma luciferase para produzir luz, concentrações de PPi inferiores a 0,5 μΜ resultam numa relação linear entre a concentração de PPi e a bioluminescência (Nyren & Lundin, Analytical Biochemistry, 151(2), 405-409 (1985)). Isto representa um aumento na sensibilidade do método da invenção para detectar PPi de, pelo menos, 1200 vezes mais do que o teste da turvação. Os métodos da invenção são também mais sensíveis do que os métodos baseados na fluorescência.

Um método de acordo com a invenção pode ser utilizado em aplicações de diagnóstico médico. Actualmente, a maior parte dos centros de diagnóstico necessitam enviar os seus testes para análise dado que os métodos convencionais para analisar as reacções de amplificação de ácido nucleico, tal como a PCR, requerem equipamento complicado e óptico. A utilização de um método, tal como o descrito, atrás permitirá que os resultados dos testes sejam analisados no local. Por exemplo, pode ser 42 utilizado em clinicas de saúde sexual, por exemplo, para verificar se um patogéneo, tal como uma bactéria ou um vírus, particular está presente na amostra. Pode ser também utilizado para determinar a quantidade de bactérias ou vírus presente na amostra, para determinar a extensão de uma infecção.

Uma outra aplicação de um método de acordo com a invenção é para determinar se uma particular sequência de ácido nucleico está presente num código genético de um organismo. Por exemplo, este pode ser utilizado para determinar se quer o ácido nucleico que o ácido nucleico matriz origina foi geneticamente modificado, para a detecção de ADN associado a um particular género não modificado geneticamente de planta ou a uma planta geneticamente modificada, para a detecção de ADN associado a um género de linhagem de animais ou para aplicações de diagnóstico médico ou veterinário tais como testes genéticos ou forenses.

Um método de acordo com a invenção pode ser utilizado para detectar a presença de um organismo numa amostra. Tal como mencionado atrás, este organismo pode ser um patogéneo. Contudo, o método pode ser também utilizado para detectar um organismo não patogénico.

Um método de acordo com a invenção pode ser também utilizado numa tecnologia de imuno-amplificação de ácido nucleico (por exemplo, ver Sano, T. et al., (1992) Science, vol. 258, 120-122) (e. g. para identificação de um particular ácido nucleico matriz ligado a um anticorpo) . O método é também adequado para utilização in situ em que várias técnicas, tais como a fluorescência ou a absorvância seriam tecnicamente difíceis de utilizar. Por exemplo, um método da invenção pode ser utilizado numa superfície metálica. Deste modo, um método da 43 invenção pode ser utilizado, por exemplo, para pesquisar priões num bisturi.

Embora os kits não sejam especificamente englobados no domínio da presente invenção, um kit para utilização num método de acordo com a invenção pode compreender uma polimerase de ácido nucleico, os substratos para a polimerase do ácido nucleico, pelo menos dois iniciadores, uma luciferase termoestável, luciferina e, opcionalmente, sulfurilase de ATP e fosfosulfato de adenosina 5'. De um modo mais preferido, o kit compreende ainda reagentes tampão, tal como uma fonte de iões magnésio. Alternativamente, um kit para utilização num método de acordo com a invenção pode compreender apenas alguns destes componentes e/ou componentes adicionais. A amostra e quaisquer outros componentes que tenham sido omitidos no kit podem ser então adicionados ao kit durante a utilização.

Por exemplo, um kit para utilização num método da invenção pode compreender recipientes contendo, respectivamente: a) uma mistura tamponada de polimerase de ácido nucleico, uma fonte de Mg e dNTP; e

b) uma luciferase, luciferina e sulfurilase de ATP

De um modo preferido, pelo menos um dos componentes do kit é liofilizado ou está noutra forma que é adequada para armazenamento no kit. De um modo mais preferido, todos os componentes do kit são liofilizados ou estão em uma ou mais formas adequadas para armazenamento. Essas tais outras formas incluem componentes a que foram adicionados factores estabilizantes e/ou uma mistura de partida refrigerada ou congelada contendo os componentes do kit. 44

Uma forma preferida de kit é um circuito "liquido" miniatura. De um modo preferido, um kit para utilização da presente invenção será da dimensão de um cartão de crédito para facilidade de manuseamento.

Um kit para utilização num método de acordo com a invenção pode ser utilizado para analisar uma amostra num tempo ou mais de uma amostra num tempo. Por exemplo, um kit para utilização num método de acordo com a invenção pode ser utilizado para monitorizar 2, 3, ..., 50, ..., 100, ... 200 até lOOOs de amostras num tempo.

Em formas de realização em que um método da presente invenção é utilizado para monitorizar mais do que uma amostra num tempo, o método pode ser para detectar a presença de um ácido nucleico matriz da mesma sequência em cada amostra ou pode ser para detectar a presença de ácidos nucleicos matriz possuindo sequências diferentes em amostras diferentes.

Os resultados podem ser apresentados num cartão de teste que apresenta os resultados de uma amostra ou mais do que uma amostra. De um modo preferido, o cartão de teste é de cerca da dimensão de um cartão de crédito para facilidade de manuseamento. A invenção será agora descrita ainda através de exemplos apenas com referência às figuras seguintes, em que: A Figura 1 mostra uma montagem para seguir uma reacção LAMP; 45 A Figura 2 mostra os resultados da LAMP na presença de ADN alvo e num controlo sem polimerase de ADN Bst; A Figura 3 mostra os resultados de amostras de LAMP duplicados e controlos duplicados; A Figura 4 mostra os resultados de amostras preparadas tal como na Figura 2 & 3 mas mostrando diferenças na intensidade de luz absoluta; A Figura 5 mostra os perfis de emissão de luz para LAMP utilizando quantidades diferentes de matriz alvo (duplicados) a 55 °C; A Figura 6 mostra o tempo para se atingir o pico de emissão de luz; A Figura 7 mostra o registo dos resultados em bruto de uma reacção LAMP em triplicado; A Figura 8 mostra os registos da Ia derivada das curvas mostradas na Figura 7; A Figura 9 mostra a comparação de controlos com amostras; A Figura 10 mostra uma reacção LAMP em que a temperatura é diminuída de 55 °C até 50 °C após 10 minutos; A Figura 11 mostra um registo da intensidade de luz em relação ao tempo para LAMP sem sulfurilase de ATP com diferentes quantidades de matriz de partida; e A Figura 12 mostra um registo diferencial (controlo subtraído) da produção de luz normalizada para LAMP sem sulfurilase de ATP de amostras contendo diferentes quantidades de matriz alvo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Demonstração de um método da presente invenção A reacção de amplificação de ácido nucleico isotérmico conhecida como Amplificação Mediada por Ciclo (LAMP) foi seleccionada para exemplificar o potencial para utilizar um ensaio bioluminescente simples para seguir a amplificação do ácido nucleico em tempo real. A manifestação actual mais rápida do método LAMP utiliza seis iniciadores. Foi demonstrado que esta manifestação detecta 105 cópias do ADN alvo em apenas 15 minutos (Nagamine et al. 2002 Molecular and Cellular Probes, 16, p. 223-229). As reacções LAMP ocorrem normalmente a 60-65 °C e requerem, pelo menos, 4 mM de iões magnésio.

De modo a demonstrar o resultado de bioluminescência em tempo real de uma reacção LAMP em particular, foi necessário encontrar meios para baixar a temperatura à qual a reacção LAMP ocorre. Isto é devido ao facto de a temperaturas tão elevadas como 65 °C mesmo a luciferase de escaravelho mais termoestável conhecida até à data (a luciferase termoestável Ultra Glow da Promega) não é suficientemente activa e/ou estável para originar uma produção de luz suficiente e estável ao longo da duração de uma amplificação LAMP (cerca de 45 minutos ou mais podem ser 47 requeridos para confirmar que uma amostra não contém qualquer molécula de ADN alvo particular).

Foi reconhecido que baixar as concentrações dos iões magnésio de 4 mM até 2 mM permite que as reacções LAMP se dêem com sucesso a temperaturas baixas. Além disso, altas concentrações de Betaina podem reduzir a capacidade das reacções LAMP se darem reprodutivelmente com sucesso a temperaturas inferiores. Finalmente, agentes de estabilização adequados que não interferem com a reacção LAMP foram seleccionados e incluídos nas formulações. Como resultado, foi possível formular condições em que um teste de bioluminescência pode ocorrer simultaneamente com uma reacção LAMP ao longo de todo o período de amplificação.

Materiais de partida:

1) Mistura reaccional (menos polimerase Bst-ADN ou ADN alvo)

Quantidade Reagente Fornecedor 20 mM Tris-acetato Sigma 10 mM KC1 a 10 mM Sulfato de amónio ii 2 mM Sulfato de magnésio ii 0,10% v/v Triton X-100 H 0,5% p/v BSA ii 5% p/v Tre-halose ii 0, 4 mg/mL Polivinilpirrolidona ii 9 mM Ditiotreitol Melford 48 (continuação)

Quantidade Reagente Fornecedor 100 pg/mL D-luciferina (sal de potássio) Europa 54 ng/mL rluciferase Ultra Glow Promega 100 μΜ Fosfosulfato de adenosina 5' Sigma 0,5 U/mL Sulfurilase de ATP ií 250 μΜ Cada um dos quatro dNTP Amersham Biosci. 0,8 μΜ Iniciador Lamp BlcB2 "PNAC Cambridge 0,8 μΜ Iniciador Lamp FlF2c ií 0,4 μΜ Iniciador Lamp loop B ii 0,4 μΜ Iniciador Lamp loop F ii 0,2 μΜ Iniciador Lamp B3 ii 0,2 μΜ Iniciador Lamp F3c ii ρΗ 8,8 θ 25 °C (ver abaixo para sequências iniciadoras) 2) Polimerase de ADN 8 U/pL polimerase Bst DNA New England Biolabs 49 3) ADN matriz catgaattcgtcaagtctacgataacttagcgcttaggatgtcagatacttatgatgat aagctgatagactatcttgccggaagcttacttcataatggatgacgtatgccatgatagatac cattgtctagacataagactttcaatctgcatagtcatgatcgatccatgctcgagtccaagct agtcatagtcttatcatcaacttagtaagtcattgaattctag

Sequências iniciadoras

Lamp BlcB2 tat cat ggc ata cgt cat cca ttt tta taa gct gat aga cta tet tgc Lamp FlF2c tca ate tgc ata gtc atg ate gtt ttt tga tga taa get atg act age Lamp Loop B: tat gaa gta age ttc cag Lamp Loop F: ate cat gct cga gtc caa Iniciador Lamp B3: atg tca gat act tat gat g

Iniciador Lamp F3c: aat gac tta cta gat tca g Método A um tubo PCR de 200 pL, foi adicionado 16 pL da mistura reaccional seguido de 1 pL de ADN matriz 0,4 ng/pL e 0,4 pL de polimerase Bst ADN. Como controlo num outro tubo de PCR de 200 pL, foi adicionado 16 pL da mistura reaccional, 18,6 pL de ADN matriz 0,4 ng/pL mas não polimerase Bst DNA.

As amostras foram colocadas numa placa de aquecimento a 50 °C que foi colocada dentro de uma cabine de luz Syngene GeneGenius (www.syngene.co.uk). Utilizando o programa informático Syngene Genesnap (www.syngene.co.uk), foi registada 50 a emissão de luz das amostras (através das tampas fechadas dos tubos PCR) numa série de fotos registadas com uma câmara CCD dentro da cabine de luz Syngene (Figura 1) . Cada foto representava a emissão de luz integrada a partir da amostra ao longo de um período de 1 minuto.

Um total de 40 fotos foi registado, uma vez que a reacção LAMP foi observada durante 40 minutos no total.

Resultados

Utilizando do programa informático Syngene, a luz produzida por cada uma das amostras foi quantificada em função do tempo. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 2.

Utilizando electroforese em gel de agarose foi confirmado que a "amostra" (com o ácido nucleico matriz) tinha na verdade amplificado quantidades significativas de ADN enquanto que o controlo não tinha sintetizado nenhum.

Foi verificado um certo número de características acerca da emissão de luz que resultaram no caso da amplificação: i) Inicialmente a taxa de diminuição de luz para a amostra e o controlo foram semelhantes; ii) Após um período, a intensidade de luz a partir da amostra começou a aumentar, enquanto que o controlo continuava a diminuir gradualmente; 51 iii) A taxa de aumento da emissão de luz da amostra aumentou, atingiu um máximo, e então diminuiu até se atingir um ponto em que a maior magnitude da emissão de luz durante a reacção LAMP foi registada; iv) A seguir a este máximo de emissão de luz a partir da amostra, foi observada uma diminuição da emissão de luz; v) A taxa de diminuição da emissão de luz aumentou a seguir à emissão máxima de luz e a magnitude da emissão de luz tornou-se menor do que a do controlo; vi) A taxa de diminuição da emissão de luz diminuiu e eventualmente tornou-se semelhante à do controlo; vii) No final dos 40 minutos, a magnitude da emissão de luz da amostra era consideravelmente inferior à do controlo, mesmo embora, neste caso, o início da intensidade de luz da amostra fosse ligeiramente maior (o que está relacionado com o facto de a emissão de luz a partir das amostras não prosseguir de modo a ter em linha de conta a posição relativa das amostras em relação à câmara).

Existe a hipótese de a diminuição da intensidade da luz a seguir ao pico da intensidade de luz ser um resultado da luciferase de tornar inibida pelo pirofosfato. Como tal, na reacção LAMP, o pico da intensidade de luz representa um ponto de tempo quando uma quantidade específica de pirofosfato se acumulou. Por isso, o pico da intensidade de luz representa um ponto de tempo quando uma quantidade específica de ADN foi sintetizada. 52

Exemplo 2: Reprodutibilidade do método da invenção

utilizando uma reacção de amplificação LAMP

Foi realizado o mesmo procedimento que no exemplo 1 excepto que foram utilizadas amostras múltiplas para avaliar a reprodutibilidade dos resultados obtidos na reacção LAMP.

Materiais de partida e métodos

Tal como no exemplo 1, excepto que a amostra e o controlo foram realizadas em duplicado ou triplicado e a temperatura da reacção foi elevada até 55 °C.

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 3. Viu-se neste caso o mesmo progresso da curva padrão que no Exemplo 1.

Neste exemplo quer a taxa de alteração da emissão de luz quer o tempo para se atingir a emissão máxima de luz são extremamente semelhantes para ambas as amostras. Novamente, a geração de ADN amplificado nas amostras foi confirmada por electroforese em gel de agarose. Para os controlos, embora a taxa de alteração da emissão de luz para ambos os casos seja semelhante, existe uma pequena diferença em valor absoluto. Novamente, pensa-se que isto é devido aos efeitos associados à captura de luz pelo sistema utilizado em vez de qualquer aspecto bioquímico. Apesar disso, mesmo sem manipulação de dados, podem ser obtidos resultados bem definidos. 53

Nalguns casos, a intensidade de luz absoluta observada, e. g. em amostras em triplicado pode variar devido a efeitos de captura de luz. Apesar disso, a taxa de alteração da luz e o tempo para a emissão máxima de luz é semelhante (Figura 4).

Exemplo 3: Utilização de um método da invenção num modo quantitativo

Materiais de partida e métodos

Foi repetido o mesmo procedimento do exemplo 1, mas com diferentes quantidades de ADN alvo nas amostras. Amostras em duplicado foram feitas tendo um total de 0,4 ng, 40 pg, 4 pg ou 0,4 pg de ácido nucleico matriz. A temperatura da reacção LAMP foi de 55 °C.

Resultados

Os perfis da emissão de luz resultantes para cada uma das amostras são mostrados na Figura 5. Os resultados obtidos na Figura 5 demonstram uma propriedade chave dos métodos da invenção. Embora não exista uma correlação convincente entre a quantidade de matriz alvo e a emissão de luz absoluta, existe uma clara relação entre o tempo para se atingir o pico da emissão de luz ou o tempo para ocorrerem alterações na taxa de alterações da emissão de luz.

Um registo do tempo para se atingir o pico da emissão de luz em função do ADN alvo demonstra que a correlação é quantitativa (ver Figura 6a em que o tempo para se atingir o 54 pico da emissão de luz tem uma correlação linear com o log 10 da concentração de matriz alvo de ADN na amostra) . Na Figura 6b, o tempo para produzir 25% da quantidade total final de produto de amplificação é registado em função do tempo para se atingir o pico da emissão de luz e pode ser visto que os dois parâmetros estão correlacionados. Deste modo, a comparação de tempos para se atingir o pico da emissão de luz contra os resultados obtidos com a electroforese em gel de agarose demonstra que o tempo para se atingir o pico da emissão de luz reflecte a acumulação do produto de amplificação e, deste modo, a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra.

Exemplo 4: Manipulação de dados de resultados obtidos a partir de um método da invenção em que a reacção de amplificação do ácido nucleico é uma reacção LAMP

Foi realizado o mesmo procedimento que no exemplo 1 utilizando novamente amostras múltiplas para avaliar a reprodutibilidade dos resultados obtidos na reacção LAMP após ter sido realizada alguma manipulação simples de dados em bruto. Especificamente, a Ia derivada dos resultados foi registada.

Materiais de partida e métodos

Estes foram tal como no Exemplo 1 excepto que a amostra e o controlo foram realizados em triplicado, a temperatura foi de 50 °C e foi utilizado um total de 1 ng de matriz em cada amostra. A Figura 7 mostra um registo dos dados em bruto de um método da invenção com estas amostras. Ao registar a taxa de 55 alteração da emissão de luz ao longo do tempo em oposição à intensidade de luz ao longo do tempo (i. e. registando a Ia derivada), os pontos de inflexão são evidenciados. Em particular, as regiões das curvas mostradas na Figura 7 que vão desde mínimos ou máximos intersectam o eixo Y a zero quando a Ia derivada da curva é registada (Figura 7). Embora a magnitude das intensidades mostre uma variância considerável, os pontos de inflexão dentro de conjuntos de curvas são semelhantes.

As curvas na Figura 8 para as amostras em que ocorreu uma reacção de amplificação LAMP mostraram dois pontos que atravessam o eixo Y. 0 primeiro representa o primeiro ponto de inflexão na Figura 7 e o segundo representa o ponto de máxima intensidade de luz. Os mínimos e os máximos vistos na Figura 8 evidenciam os pontos de tempo associados às taxas máximas de alteração na emissão de luz. Todos os quatro pontos de dados (as duas intersecções do eixo Y e os mínimos e máximos) mostram uma boa sobreposição entre os triplicados das amostras. Note-se que a primeira intersecção do eixo Y ocorre quase dez minutos antes da segunda. A Figura 9 mostra uma vista expandida das curvas da Figura 8 e evidencia como é que o registo da Ia derivada diferencia a amostra do controlo.

Deste modo, devido ao teor de informação inerente dos dados em bruto obtidos a partir de um método da invenção utilizando uma reacção LAMP, mesmo manipulações de dados muito simples, tais como tomando a Ia derivada, não apenas permite que pontos claros nas curvas resultantes sejam identificados (intersecções do eixo Y e os mínimos e máximos) mas também torna os resultados menos sensíveis à magnitude dos sinais de luz (e. g. compara a 56 na Figura 8 a sobreposição das curvas nas Figuras 7 e 8 sobreposição é mais semelhante).

Exemplo 5: Alteração da temperatura da reacção de amplificação durante a amplificação 0 método LAMP pode ser desenvolvido ao longo de uma gama de temperaturas de, aproximadamente, 45 °C a 65 °C. Contudo, quanto mais alta temperatura a que a reacção LAMP ocorre, mais baixa é a intensidade de luz global obtida a partir de um método da invenção (quer a amplificação ocorra ou não). Isto é devido à particular luciferase termoestável utilizada (a luciferase Ultra-Glow da Promega) catalisando aparentemente a reacção da luz com uma taxa mais baixa para temperaturas superiores. Deste modo, a taxa de emissão de luz observada para a luciferase Ultra-Glow a 55 °C, é consideravelmente inferior à observada a 50 °C. Contudo, ao arrefecer, e. g. de 55 °C para 50 °C, observa-se um aumento na taxa de emissão de luz catalisada pela luciferase Ultra-Glow, por conseguinte o efeito é claramente irreversível. A reversibilidade implica que a diminuição de emissão de luz observada a alta temperatura não é somente o resultado da desnaturação da luciferase. O desenvolvimento da reacção LAMP a uma baixa temperatura aumenta, por conseguinte, a emissão de luz num teste. Além disso, o desenvolvimento de LAMP a baixas temperaturas pode abrandar a própria reacção. Isto pode ser benéfico em certas circunstâncias. Por exemplo, quando se utiliza um método da invenção quantitativamente, pode haver benefícios em abrandar a amplificação de modo a que o tempo que demora a, e. g. atingir o pico da emissão de luz para amostras com diferentes quantidades 57 de matriz alvo, é mais separado em tempo quando a reacção LAMP ocorre a uma temperatura superior.

Contudo, ao desenvolver reacções LAMP a baixas temperaturas pode-se afectar potencialmente a especificidade do processo, ou seja, pode haver maior probabilidade de um resultado positivo falso à medida que a temperatura da LAMP é reduzida. Por outras palavras, as hipóteses dos iniciadores se emparelharem com sequências que não a sequência alvo desejada, aumenta à medida que a temperatura da reacção LAMP é reduzida.

Um compromisso possível para beneficiar dos benefícios de desenvolver a reacção LAMP a baixas temperaturas e ainda assim manter a especificidade máxima é o de alterar a temperatura durante a reacção LAMP. Especificamente, a reacção LAMP pode ser iniciada a uma temperatura mais elevada em que a especificidade é maior, e então, antes da amplificação, entrar numa fase exponencial, a temperatura pode ser baixada para aumentar a intensidade da luz e abrandar o progresso dos resultados.

Materiais de partida e métodos

Tal como no Exemplo 1 excepto que foi testada uma variedade de amostras com diferentes quantidades de matriz alvo, tal como no Exemplo 3 (ao longo da gama de 0,02 pg/pL a 20 pg/pL, i. e., 0,4 pg amostra total a 0,4 ng amostra total). A reacção LAMP foi iniciada a 55 °C e então a temperatura foi baixada até 50 °C após 10 minutos. 58

Resultados

Os dados em bruto obtidos a partir dos dados da mudança de temperatura são mostrados na Figura 10. Os dados mostrados na Figura 10 mostram que o método de mudança de temperatura resulta na verdade num aumento da intensidade da emissão de luz na queda da temperatura. Além disso, a LAMP permanece quantitativa, pelo facto de o tempo para se atingir o pico da emissão de luz permanecer uma função da quantidade de partida do ADN matriz. A comparação da Figura 10 com a Figura 5, em que quantidades equivalentes de matriz alvo são testadas com LAMP mas a uma única temperatura de 55 °C, pode ser visto que a diferença de tempo entre a amostra com mais matriz (0,4 ng/ total/20 pg/pL) e a amostra com menos matriz (0,4 pg/ total/0,02 pg/pL) é de aproximadamente, 8 minutos, enquanto que no método da alteração de temperatura mostrado na Figura 10, a diferença de tempo é de aproximadamente 14 minutos.

De facto, temperaturas superiores a 55 °C podem ser inicialmente utilizadas, uma vez que, embora a luciferase Ultra-Glow comece a tornar-se instável acima de 60 °C, esta pode tolerar estar a temperaturas mais elevadas durante períodos curtos. Esta aproximação aumenta, por isso, as gamas de temperatura disponíveis.

Além disso, esta aproximação pode permitir que luciferases menos estáveis possam ser empregues quando a reacção de amplificação não requer períodos longos a temperaturas que podem inactivar a luciferase irreversivelmente.

Finalmente, embora falsos positivos possam ainda ocorrer utilizando o método de alteração da temperatura, estes devem ser 59 menos comuns devido à maior acção das temperaturas superiores na fase chave inicial da amplificação (í. e. imediatamente antes da fase exponencial).

Exemplo 6: método com base na luciferase reversivelmente inibida

Tal como discutido atrás, o pirofosfato possui efeitos directos na luciferase. Em primeiro lugar, sob certas circunstâncias, o pirofosfato pode diminuir a inibição que a luciferase sofre na presença de certos inibidores incluindo oxiluciferina, o produto da reacção da luz. Em segundo lugar, o pirofosfato pode ele próprio inibir a luciferase com altas concentrações. Quer ou não o pirofosfato estimule ou iniba a reacção de emissão de luz catalisada pela luciferase depende de um certo número de factores incluindo o tipo preciso de luciferase, a temperatura, a concentração do pirofosfato, a presença de outros componentes que podem afectar a actividade da luciferase. Este exemplo demonstra que o efeito inibidor do pirofosfato pode ser utilizado para seguir uma reacção LAMP. Um aspecto vital desta aproximação é o de que a presença de ATP na amostra pode ser tolerada: em métodos em que o teste de bioluminescência se baseia na detecção de ATP pela luciferase para produção de luz, quantidades significativas de ATP endógeno na amostra comprometerão gravemente a utilização do teste. 0 facto de o método sem Sulfurilase de ATP tolerar ATP (de facto este trabalha melhor na presença de ATP) significa que este pode ser potencialmente utilizado para testar o pirofosfato em reacções de amplificação que incluem o passo de síntese do ARN, tal como a Amplificação Mediada por Transcrição (TMA). 60

Ao realizar experiências de controlo sob um conjunto particular de condições reaccionais, um especialista na matéria será capaz de determinar a razão particular de luciferase em relação à luciferina em relação ao ATP em relação ao pirofosfato (luciferase:luciferina:ATP:PPi) que é requerida para utilização num método da invenção.

Materiais de partida e métodos 1) Mistura reaccional sem sulfurilase de ATP (menos polimerase Bst-ADN ou ADN alvo)

Quantidade Reagente Fornecedor 20 mM Tris-acetato Sigma 10 mM KC1 ii 10 mM Sulfato de amónio ii 2 mM Sulfato de magnésio ii 0,10% v/v Triton X-100 ii 0,5% p/v BSA ii 5% p/v Tre-halose H 0,4 mg/mL Polivinilpirrolidona ii 9 mM Ditiotreitol Melford 1 pg/mL D-luciferina (sal de potássio) Europa 36 ng/mL rluciferase Ultra Glow Promega 1 mM Trifosfato de adenosina (ATP) Sigma 61 (continuação)

Quantidade Reagente Fornecedor 250 μΜ Cada um dos quatro Amersham Biosci. dNTP 0,8 μΜ Iniciador Lamp BlcB2 PNAC Cambridge UK 0,8 μΜ Iniciador Lamp FlF2c JJ 0,4 μΜ Iniciador Lamp loop JJ B 0,4 μΜ Iniciador π1 Lamp loop jj 0,2 μΜ Iniciador Lamp B3 jj 0,2 μΜ Iniciador Lamp F3c jj ρΗ 8,8 @ 25 °C (ver abaixo para sequências iniciadoras) Método

Foram preparadas amostras, tal como no Exemplo 1 excepto utilizando a mistura reaccional descrita atrás. Foi testada uma gama de concentrações de ADN matriz alvo, de 1 pg a 1 ng. A LAMP sem sulfurilase de ATP foi realizada a 55 °C. Foi utilizada como controlo uma amostra sem polimerase Bst ADN.

Resultados

Os dados em bruto resultantes da LAMP sem sulfurilase de ATP são mostrados na Figura 11. Os dados em bruto mostrados na Figura 11 mostram que as amostras contendo ácido nucleico matriz apresentam uma diminuição súbita caracteristica da intensidade da luz ao longo do tempo, não verificada no controlo. Acredita-se que esta diminuição seja o resultado do pirofosfato produzido pela reacção LAMP inibir a luciferase. Assim a diminuição súbita 62 é um marcador para a amplificação do ácido nucleico. Aquela síntese de ADN estava a ocorrer na verdade o que foi confirmado por electroforese em gel de agarose das amostras. A manipulação dos dados em bruto permitiu mais interpretação dos resultados. Em primeiro lugar os dados foram normalizados às suas intensidades de luz de partida, e então os valores obtidos a partir da polimerase que faltava no controlo foram subtraídos do das amostras contendo ácido nucleico matriz (Figura 12) .

Um exame da Figura 12 indica que a LAMP sem sulfurilase de ATP é também quantitativa, dado que o tempo que demora a atingir os pontos em que a taxa de alteração da intensidade da luz se altera significativamente, parece ser proporcional à concentração da matriz alvo nas amostras.

Uma vez que está presente ATP 1 mM durante a LAMP sem sulfurilase de ATP, a mesma aproximação pode, em consequência, ser utilizada para seguir métodos de amplificação com base em ARN.

Será apreciado que a invenção foi descrita apenas através de exemplos e que podem ser feitas mais modificações em detalhe que permanecem no domínio da invenção tal como definido pelas reivindicações.

Lisboa, 3 de Dezembro de 2007 63

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente numa amostra compreendendo os passos de i) colocar em associação com a amostra todos os componentes necessários para a amplificação do ácido nucleico, e todos os componentes necessários para o teste de bioluminescência para a amplificação do ácido nucleico, incluindo: a) uma polimerase de ácido nucleico, b) os substratos para a polimerase do ácido nucleico, c) pelo menos dois iniciadores, d) uma luciferase termoestável, e) luciferina, f) opcionalmente, sulfurilase de ATP, e g) opcionalmente, fosfosulfato de adenosina 5', e subsequentemente: ii) realização de uma reacção de amplificação de ácido nucleico do ácido nucleico alvo, envolvendo mais do que um ciclo de amplificação; iii) monitorização da intensidade da luz do teste da reacção de bioluminescência; e iv) determinação da quantidade do ácido nucleico matriz presente na amostra. 1
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, os passos ii) e iii) são realizados num vaso selado.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que no passo iii) a intensidade de luz produzida é monitorizada durante a reacção de amplificação do ácido nucleico.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o passo iii) inclui, ainda, a produção de um conjunto de dados de intensidade de luz produzida como uma função do tempo.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada medindo, num conjunto de dados, o tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de variação da intensidade da luz produzida varia significativamente.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra no inicio da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) .
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para determinar a quantidade de ácido nucleico matriz presente na amostra como resultado da reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii).
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada por medição de um conjunto de dados do tempo 2 que demora a atingir um ponto em que a intensidade da luz produzida começa a aumentar.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada por medição de um conjunto de dados do tempo que demora a atingir um ponto em que a intensidade da luz produzida está num máximo.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada por medição de um conjunto de dados do tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de diminuição da intensidade da luz produzida aumenta.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada por medição de um conjunto de dados do tempo que demora a atingir um ponto em que a taxa de diminuição da intensidade da luz produzida diminui.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a quantidade de ácido nucleico matriz presente é determinada por medição de um conjunto de dados do tempo que demora a atingir um ponto que em que a intensidade da luz produzida atinge ou ultrapassa um nível pré-determinado.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, em que a luciferase termoestável que é associada à amostra no passo i) é uma luciferase reversivelmente inibida. 3
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo iv) compreende ainda a comparação da intensidade da luz produzida com a intensidade da luz produzida a partir de um controlo em que a amostra compreende uma quantidade conhecida de ácido nucleico matriz.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, para determinar se o ácido nucleico matriz está presente na amostra.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que se o ácido nucleico matriz está presente na amostra este é determinado por medição de um conjunto de dados quando a intensidade de luz produzida atinge ou ultrapassa um nivel pré-determinado.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que um aumento na intensidade da luz produzida em relação ao nivel pré-determinado indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 15, em que uma diminuição na intensidade da luz produzida em relação ao nivel pré-determinado, indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, em que se o ácido nucleico matriz está presente na amostra este é determinado através da medição do conjunto de dados quando a intensidade de luz produzida atinge ou 4 ultrapassa o nível pré-determinado dentro de um período de tempo pré-determinado a seguir ao início da reacção de amplificação do passo ii) .
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo iv) compreende ainda a comparação da intensidade da luz produzida com a intensidade de luz produzida a partir de um controlo em que não ocorreu amplificação.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que uma diminuição da intensidade de luz produzida em relação a uma reacção de controlo em que não ocorreu amplificação indica a presença de ácido nucleico matriz na amostra.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é um método de amplificação de termociclização de baixa temperatura em que a temperatura de ciclização não excede 75 °C.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada isotermicamente.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada dentro de uma gama de temperaturas que não excede 75 °C.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada a uma temperatura constante a que os 5 componentes da reacção de amplificação e do teste de bioluminescência são estáveis.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é realizada a mais do que uma temperatura dentro da gama de temperaturas em que os componentes da reacção de amplificação e do teste de bioluminescência são estáveis.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a reacção de amplificação do ácido nucleico do passo ii) é iniciada a uma temperatura superior e, subsequentemente, diminuída para uma temperatura inferior.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização em diagnósticos médicos.
29. 29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização na determinação da presença de um patogéneo numa amostra.
30. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para determinar se uma sequência particular de ácido nucleico está presente num código genético de um organismo.
31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, para determinar se o ácido nucleico que o ácido nucleico matriz origina foi geneticamente modificado.
32. 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 para determinar se um organismo está presente numa amostra. 6
33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 para utilizar na tecnologia de imuno-amplificação de ácido nucleico. Lisboa, 3 de Dezembro de 2007 7