CN1852990B - 确定样本中核酸数量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种确定样本中核酸数量的方法，包括以下步骤：1)向样本中加入扩增反应所需的所有组分和扩增反应生物发光测定所需的所有成分，然后：2)进行核酸扩增反应。3)监测生物发光体所产生的光强度。4)确定样本中核酸数量。
Description
本发明涉及一种确定样本中核酸数量的方法，包括以下步骤：1)向样本中加入扩增反应所需的所有组分和扩增反应生物发光测定所需的所有成分，然后：2)进行核酸扩增反应。3)监测生物发光体所产生的光强度。4)确定样本中核酸数量。
背景技术：
核酸扩增可用于确定样本中是否具有某一特殊核酸模板，若可扩增出来，则说明样本中存在这个核酸模板，反之，若不产生任何扩增反应则说明核酸在样本中不存在。该技术在诊断应用方面十分重要。例如，可以确定样本中是否存在某一病原体。
核酸可以通过各种热循环技术和恒温技术得到扩增。热循环技术，如多聚酶链反应(PCR)，是运用热循环来驱动周期性的的DNA合成，从而产生与原始DNA模板成比例的大量DNA。近年来，出现了各种恒温技术，他们不依赖热循环而驱动扩增反应。使用有链交联活性的DNA聚合酶的恒温技术，不需要RNA合成的步骤。类似的，对于需要RNA合成的扩增反应，恒温技术用到了逆转录酶、RNA酶H和以DNA为基础的RNA聚合酶。
核酸扩增反应的产物传统是用凝胶电泳进行分析(琼脂糖或丙烯酰胺碱)，借助于荧光染料(比如溴化乙啡啶)给存在的DNA染色。这种方法可以检测出扩增产物的序列号、数量和大小。但是这种使用凝胶电泳扩增反应的准备、运行和分析需要大量的人工干预，不但要使用毒性制剂，而且很费时(一般要大约1小时)。此外需要多重PCR(一般30次)才能产生可以探测到的扩增产物。最近出现了灵敏度更高的凝胶电泳方法。它采用荧光技术或混浊度测定来对核酸扩增产物进行实时监测。
DNA聚合酶和RNA聚合酶的共同特点是每次将一个新的碱基插入扩增的DNA/RNA分子时，都会释放一个焦磷酸盐复合物(PPi)，然后。因此在聚合酶作用下核酸扩增的同时，焦磷酸盐(PPi)作为一个副产物按照一定比例产生。因此Ppi的浓度与合成的核酸数量是成比例的。因此也与扩增子的聚积成比例。用n表示聚合体长度，反应式可以为：
通常对PPi进行测定一个敏感的方法是用ELIDA(见Nyren，P.and Lundina，A.Anal.Biochem.151(2)504-509(1985))。这种测定方法包括两个步骤：(1)利用ATP硫酰酶将PPi转换为ATP，以及(2)在荧光素和氧气存在的情况下，在荧光素酶的催化作用下，用ATP，产生光：
应用ELIDA测序法有其优越性，因为从小样本里也可以快速得到生物发光读数，所用的仪器也很简单，很便宜。比如：胶片或CCD照相机。
美国专利US 5,534,424，US 5,498,523，以及国际专利申请WO 98/28440,WO 98/13523和WO02/20836都描述可使用ELISA方法给短片断DNA测序。在测序的单个范围当中，ELIDA测定法过去是用在聚合酶作用将单个核苷酸插入DNA分子之后。
高温测序是一个重复性技术，每4个dNTP中只有一个出现在每次重复循环中，可以使序列上每一个位点的dNTP都被检测到。因此DNA合成所需的所有组分不可能同时出现。
使用H3PIM，即末端ELIDA法测定，以检测热循环多聚酶链反应。近年来也有报道。(WO 92/16653和Tarbary et al，免疫方法杂志，156(1992)，55-60)。整个反应过程中在预先决定的时间间隔内和(或)扩增反应末期将部分反应混合物取走，再加用多种试剂，可以看到一个长度不等的梯度测序结果。
WO 02/064830报道了使用ELIDA测定法对终末端进行测定以检测热循环PCR反应。在WO 02/064830报道中ELIDA测定可以一步法完成，而在WO92/16654中监测PCR进行末端序列测定还需要添加多种试剂，并进行孵育。
上述有关末端序列测定存在很多问题。首先这种方法要将生物发光的成分添加到反应混合物中，以进行扩增反应。但打开管口有可能导致样本污染，并可能污染实验室。如果样本本身污染了可能导致假阳性或假阴性。(例如，参见Victor，T等，“避免实验室中产生假阳性聚合酶反应结果的经验和指导”，Eur.J.Clin.Chem.&Clin.Biochem 31(8)：513-535(1993))因此易污染就说明将这种终端测序法应用于诊断有严重的缺点。
上述末端序列测定方法的另一个问题是dATP也是荧光素酶的一个基底。因此当dATP作为荧光酶基底时，代替了ATP与荧光素酶进行反应，会干扰光谱。WO 02/064830揭示了当dATP作为扩增反应的基底时，ELIDA法产生的光信号是如何快速减退的，这种衰退对使用终端测定法可能是个严重的障碍。因为监测到的光读数不仅是显示PPi浓度，也可以显示时间。因此如果不对终点测定进行严格的时间限制，这种末端测定方法也就不能定量。
除了终点测定外，还有一种测定方法，可以对扩增反应中的核酸合成进行“实时测定”，也就是在扩增反应进行时测定。目前的实时测定法包括：荧光技术测定和浊度测定。
荧光技术测定的工作原理是通过某些方法监测荧光的改变，从而观察与之相关的扩增产物的积聚情况。例如：US 5,994,056，WO 97/44486，WO 99/42611和US 6,174,670中所揭示的在PCR过程中用双链DNA结合染料(特别)来监测DNA扩增的方法。这种实时荧光技术不需要液体样本，也避免了打开反应管可能造成的污染，从而降低了污染的危险。
然而荧光技术也有很明显的不足，尤其是荧光制剂、主要荧光标记的探针造价高，且样本的准备是烦琐的。此外应用荧光系统也受到仪器本身性能和造价高的影响。一般来讲，需要计算机驱动的集成的热循环荧光计，因为需要实时跟踪PCR中而不是用于末端测定。这样一来，这个系统的可门槛(造价)和轻便性就成为问题。由于检测需在PCR设备内进行，因此这种方法之能在有一定条件的实验室使用。
实时混浊度测定法是通过监测扩增反应混合物中是否有白色的焦磷酸镁沉淀来说明是否有PPi产生，这也是一种测定是否有等温扩增反应出现的方法(见Mori，Y.等，“通过监测混合物中是否有白色的焦磷酸镁沉淀来探测扩增反应”，Biochem.And Biophys.Res.289期，150-154(2001))然而这种方法的灵敏度不是很高，且要看到明显的混浊需要PPi的浓度达到0.6mM左右。
发明目的：
本发明为测定样本中的模板核酸的数量提供了一种方法，包含步骤如下：
1)向样本中加入所有核酸扩增必需的成分和生物发光测定所需要的成分：
a)核酸聚合酶，
b)核酸聚合酶的基底，
c)至少两个引物，
d)一个热稳定的荧光素酶，
e)荧光素，
f)可选的ATP硫酰酶，以及
g)可选的阿糖腺苷5‘磷硫酸盐，然后；
2)进行核酸扩增反应，
3)检测生物发光所产生的光的强度，并且
4)确定样本中的核酸模板的数量。
PPi是扩增反应中核酸反应的产物。本发明的方法可以将PPi的生产与生物发光测定的光强度相联系，更好的是先将PPi转换成ATP，ATP再由荧光素酶催化的生物发光测定法进行检测。这种酶将以ATP作为基底，当有荧光素和氧气存在时产生光。因此应用荧光素酶跟踪ATP浓度的变化。最好使用ELIDA测定法，它使用ATP硫酰酶将PPi转换为ATP，ATP再在荧光素酶的作用下产生光。或者直接用荧光素酶对PPi进行检测。通过测定生物发光体发出的光强度，就可能可以说明反应混合物中有多少PPi，并进而说明样本中的模板核酸的量。因此，这种方法测定了扩增反应过程中体外核酸的酶合成，并给重新聚合反应过程中扩增的核酸定量。
步骤2核酸扩增反应也就是进行性的核酸多聚酶反应，因为有多于一个核苷酸增加循环在无需另加缓冲液组分的情况下进行。
步骤2中核酸扩增反应中用到的荧光素酶和生物发光分析中的其他成分极大地简化了对样本的分析，因为这样一旦扩增反应开始了就无需对反应混合物进一步控制。比如，没有必要取出部分样本来测定产生了多少PPi。相反的，核酸扩增所需要的全部成分备齐后，就可以对步骤1形成的反应混合物直接进行生物发光分析。没有必要在扩增反应之中或之后向反应混合物中添加生物发光分析成分。
生物发光分析(也称叫磷酸盐测定或PPi测定)以及扩增反应中所需的成分都必须要能经受步骤2的反应条件。比如，要用到热稳定的ATP硫酰酶和/或热稳定的荧光素酶和/或热稳定的核酸多聚酶。这里之所以用到“热稳定”这个词是指一种酶，这种酶在第(2)步的核酸扩增反应中在一定的时间范围内性质稳定。
步骤1中的组分，最好用冷冻干燥或其它稳定剂来稳定用到的成分。因此最好也将稳定剂与样本在步骤1中同时加入，例如BSA，海藻糖，聚乙烯吡咯烷酮和DDT的一种或多种在步骤1中与样本同时加入，最好全部加入。
核酸扩增反应所需的温度和时间与核酸多聚酶反应所需的温度和时间明显不同。核酸扩增反应需要高温或者更长的持续时间(比如，15分钟到24小时)或者两者都需要。相比之下，核酸多聚酶反应可以在低温下(37℃)快速进行。众所周知荧光素酶是不稳定的。比如，在37℃时自然型荧光酶会失活。荧光素酶以其氧化荧光素的形式(光反应产物)容易储存。然而，我们意外的发现在步骤2核酸扩增反应中荧光素酶是稳定的。而且可以在整个核酸扩增反应中保持稳定，这主要是因为在某些核酸扩增反应中要求长的持续时间。
在反应步骤1中加入的热稳定的荧光素酶在步骤2中如果温度控制在一定范围内也是稳定的。这种特殊的荧光素酶是否应用取决于步骤2的核酸扩增反应的条件。“荧光素酶”在此处指可以催化生物发光反应的酶。在这个发明中有两种荧光素酶适用：自然型和变异型，只要他们都可以在步骤2中一定的温度范围内保持稳定。一个适用的实例请见Promega的超光热稳定荧光素酶。
步骤2中的核酸扩增反应中可以有RNA的合成，也可以没有。在核酸扩增反应步骤2不涉及RNA合成的方法中，多聚酶的基底包括以下四种的每一种dNTPs：dTTP.，dCTP，dATP，和dGTP，一种或更多的dNTP可以用它们的模拟物所代替。在这些实施例中，荧光素酶最好采用ATP作为基底产生光，实例中使用ATP的荧光素酶使用的是萤火虫荧光素酶(来自Photinus pyralis)和它的变异体。采用ATP作为基底产生光的荧光素酶更好的是Promega的超法光热稳定荧光素酶，在实施例中，荧光素酶根据ATP的浓度的改变而改变，反应混合物中有ATP硫酰酶。更好的，实施例中应用荧光素跟踪ATP浓度是在扩增反应第(2)步中不涉及RNA合成。另外，荧光素酶除了催化生物荧光测定外，也可以作为ATP硫酰酶。在这种情况下，就没有必要在步骤1中加入ATP硫酰酶。
从PPi产生ATP用到ATP硫酰酶，将5‘磷硫腺苷在步骤1中加入到反应混合物中，或者使用荧光素酶在代替ATP硫酰酶。
对涉及RNA合成的扩增反应，多聚酶的基底包括四种dNTP的任一种(dTTP.，dCTP，dATP，和d GTP)和四种NTP的任一种(TTP，CTP，ATP，和GTP)。一个或更多的dNTP//NTP可以用它们的类似物所代替。因此，当扩增反应包含RNA合成步骤时，内源性的ATP是作为多聚酶的基底出现在反应混合物中的，除非可以用于RNA多聚酶作用但与荧光素酶不作用的ATP类似物代替。在本发明的方法中，用到的荧光素酶需要对ATP浓度的微量变化也很敏感，因此，内源性的ATP数量过多会严重削弱该方法的适用性。为了克服这个困难，在实施例种使用了可逆性抑制性荧光素酶，它用在步骤2中的核酸扩增反应的嵌合体中，该反应包括了RNA合成的步骤，反应混合物中也有内内源性ATP.“可逆性抑制性荧光素酶”指的是一种荧光素酶可以被非PPi的物质抑制，但这种抑制可以被低浓度的PPi所缓解。例如，荧光素酶可以被氧化荧光素酶所抑制，这种氧化荧光素酶时他们自身反应的产物。因此，可逆性抑制性荧光素酶的应用，可以使我们直接用荧光素酶监测到PPI，因为PPI对抑制性荧光素酶产生直接效应。因此，我们可以通过一系列不同模板核酸浓度的对照反应来确定由PPI引起的可逆性荧光素酶抑制所耗的时间。
在第(1)步把荧光素酶加入到反应物中前，可逆性荧光素酶就有可能被非PPI成分所抑制。选择性地，可逆性荧光素酶有可能是由于反应混合物中抑制剂的存在而形成的。较为可取的是，可逆性荧光素酶是一种在其未被抑制状态可用ATP产生光的荧光素酶。特别地，这种荧光素被形象地称为萤火虫荧光素酶。
在实施例中，本发明方法中在第(1)步加入到样本中的荧光素酶是一种可逆性荧光素酶，而ATP磺酰酶和5’磷酸腺苷未被加入。然而，在实施例的第(2)步包含RNA合成的核酸扩增反应，合适ATP等价物作为RNA聚合酶而不是荧光素酶基底(或者至少是较差的荧光素酶基底)在第(1)步加入到样本中，而不是ATP本身，然后在第(1)步加入到样本中的荧光素酶是一种可以用ATP产生光的荧光素酶，然后，ATP磺酰酶和5’磷酸腺苷随后加入。
可逆性荧光素酶可应用在不包括RNA合成的核酸扩增反应中，在这些情况下，ATP磺酰酶和5’磷酸腺苷在第(1)步不会加入到样本中。
本发明方法的另一个优点是：在第(3)步可监测到光发射量。更好的是，第(3)步光发射量强度也可以被监测到。合适监测到光发射强度的方法包括：应用摄像机或自行充电的照相机设备，从生物发光体测定那里用CCD照相机监测光发射强度。光发射强度可以被扩大到肉眼能见的程度。因此，仅仅应用摄像机或CCD照相机来监测光发射的能力比因没有多功能硬件或光学系统而被迫应用荧光分析或凝賋分析的技术要优越的多。而且，我们可以不必用任何方式(就像在荧光和吸光度分析中应用的那样)去照射样本来监测光发射强度。也不必应用电化学样本或者间接照射
举例来说，我们有时需用一个简单的CCD照相机同时监测成千上万份样本，因此，本发明方法可用简单廉价，便携的硬件系统做到这些。
本发明方法中第(1)步骤中最好包含合适的缓冲液。这些缓冲液能维持扩增反应和生物发光体化验正常进行。缓冲液中包含一定量的镁离子，以氯化镁或硫酸镁的形式存在。例如，合适的缓冲液可能包含醋酸盐，氯化钾，硫酸铵，硫酸镁和TritonX-100(pH 8.8at25 C)
本发明方法的一个优势是：至少第(2)步骤，第(3)步骤是在密封容器里进行的，这就减少了在做扩增反应和生物发光体测定时对样本的污染，也减少了对实验室的污染。这是非常重要的，因为即使一种少量的核酸“溜进”实验室，都有可能污染其它待测的样本使之产生假阳性的结果。因此，本发明的方法在诊断应用中防止污染的有点时是非常重要的，
为了进一步预防污染，在第(4)步以后就对容器进行了特殊处理，以破坏容器中的核酸，特别是破坏模板核酸。容器自身在第(4)步骤后被破坏，或伴随核酸破坏而被破坏。这就在最大程度地减少了对实验室和样本的污染。
更好地，在本发明方法第(3)步，核酸扩增反应期间，监测光发射强度。这只有在第(2)步核酸扩增反应期间生物发光体测定存在的前提下才有可能实现。更好的是，在整个扩增反应期间都可监测到光发射强度(至少是在部分扩增反应期间)。在第(2)步扩增反应前后都可以监测到光发射强度。例如为了做对照反应，在第(2)步扩增反应监测光发射强度的能力简化了反应容器的搬运并使快速确定样本模板核酸的量成为可能。在扩增反应期间监测光发射强度的优点是：任何由dATP和荧光素酶反应产生的背景信息不会搅乱本发明方法。这只有在终点分析时才会碰到。
更好地，本发明方法的第(3)步会产生一个时间函数光发射强度数据。这个数据用来确定样本中存在的模板核酸的量。更好的是，这个数据可以用软件分析并制作成图表或表格的形式。例如，这个数据可以绘制成光强度图表或光强度改变率图表。
光发射强度可以在一个或更多的预定时间内监测。这些预定时间都是从第(2)步扩增反应条件准备好(此时时间为(t)＝0分钟)之后的时间里确定的。这些条件为步骤1规定地反应混合物形成了，处于扩增反应的合适温度，该温度也是扩增反应的组分以及生物发光测定都处于稳定状态的温度数值。例如，至少在部分扩增反应中，在预定的时间间隔里可监测光发射量的强度。最好是，在整个扩增反应中，也可监测之。例如，该时间间隔可以是每隔30秒，每隔1分钟，每隔1分30秒等。另外，在预定的时间里，时间间隔是可以调整的。
比较理想的是，在一分钟内记录一两个光子计数。每分钟计数越多，结果就越可靠，因此，应该尽可能增加分钟计数次数，另外，第一次光子射出量监测应该定为0秒。在某些实施例中，光发射量也可以在扩增反应后监测。
光探测器越灵敏，每分钟得到的时间点就越多，因为与敏感性较差的照相机相比，应用高敏感性能摄像机可以通过更短的时间来整合光发射量获得相关数据。因此，尽可能用敏感的照相机还是具有优势的。
本发明方法的优点是：在第(3)步，我们可以连续监测部分扩增反应的光发射量的浓度，令人欣慰的是，在第(2)步及第(3)步的整个扩增反应中，也可以连续监测光发射量，甚至在第(2)步扩增反应后，也可以有选择性地监测光发射量。
据此发明，我们可以用这个方法对样本的模板核酸量进行定量或(和)定性分析。
在定性分析中，用这个方法，我们可以在第(2)步核酸扩增反应之前确定模板核算的量。也可以确定扩增反应后的模板核算量，该步骤可以在反应中进行，也可以在之后进行。如：模板核算的量化。扩增产物的产生，使得对核算扩增反应程度的量化成为可能。在定量分析中，其包括确定和估计样本中模板核酸的量。
我们惊奇地发现：要想确定样本中模板核酸的量，除了每秒光发射量的浓度外，光发射量浓度变化的时间选择上也是成比例的。例如，在特定的反应条件下，(如：特殊的模板核酸，特殊的扩增反应成分浓度及生物发光体测定和反应的特定浓度)，与模板核酸浓度底的样本相比，浓度高的样本在扩增反应初期，光发射强度改变要快得多。因此，在特定的反应条件下，我们可以通过监测作为时间函数的光发射强度的改变来测定样本中模板核酸量。我们还可以在一些特定条件下利用特定模板核酸量来操控对照反应，然后将所得的数据与本发明方法获得的数据进行比较，从而确定核酸数量。我们也可以通过凝胶电泳或其他的计量方式来估算扩增反应在预定时间内产生的模板核酸量，以此才控制对照反应。这就使得我们可以在预定的时间点上计算对照样本模板核酸量并分别将其数据记录下来。
本发明方法用于定性分析时，可以评估扩增反应是否正常进行，从而判断样本中是否有模板核酸。在许多应用中，若扩增条件足够乐观(如病原体核苷酸的快速监测)，那么只要有扩增反应出现，样本中就会含有目的DNA序列。同样，样本中含有核酸的话，扩增反应产物也会有核酸。结果，与无扩增反应的对照反应进行对比，就产生了一个时间随着光发射强度改变的函数公式。若样本中无核酸产物，则步骤二中不会有扩增反应发生，也就不会有扩增产物出现。因此，光发射强度改变模式应该是相似的，不然的话，就会与无扩增反应的对照反应相同了。因此，步骤二中的“进行核酸扩增反应”包含两层意思“进行核酸扩增反应”和“创造合适的条件使得扩增反应发生”。因为，在实施例中假若模板中没有核酸，就不会有扩增反应发生。更可取的是，在反应的起始，发射光强度变化的有无可以在预定时间内被监测到。
就像前面提到的，PPI本身对高浓度荧光素酶有直接效应，这不仅使用于荧光素酶(用ATP做基底发光)，也适用于可逆性荧光素酶。通过做一系列不同反应条件的对照实验，有经验的研究人员能够从得到的数据中确定PPI对荧光素酶的作用时间。然后可以利用这些对照实验的结果来确定模板核酸的量。
例如，人们发现PPI其本身可以抑制高浓度的荧光素酶。光发射强度的开始迅速下降与荧光素酶被特定的PPI抑制是互相关联的。这可能与光发射量的最大值是相对应的，即光发射量升降的拐点。也可以说，它代表光发射量下降速率迅速上升的那一点，即由缓慢下降到快速下降。通过做大量的不同浓度模板核酸的对照实验，我们可以计算出特定的反应条件和模板核酸浓度下，光发射量迅速下降的时间点。同样也可以利用这些对照实验的结果来外推模板核酸的量
选择性地，PPI可以引起光发射量的上升，该光发射来自于非PPI基底抑制的荧光素酶，就像上面提到的可逆性荧光素酶。
因此，PPI激活或抑制荧光素酶催化的生物发光体实验取决于一系列因素，诸如荧光素酶的精确类型，反应的温度，PPI的浓度以及影响荧光素酶活性的化合物的存在等。在一系列特定反应条件下。通过做不同浓度的起始模板核酸扩增反应对照实验，熟练的技术人员可以从所得数据中确定PPI对荧光素酶的直接作用时间以及作用本质。
这些对照实验的结果也可以用来外推模板核酸的量
我们可以用不同的方法分析光发射强度的数据，以此来确定样本模板核酸量。一些特殊的数据点代表特定的PPI浓度。然后将这些点与样本中模板核酸的量联系起来。例如，我们特别监测下列的一个或多个数据点：(1)，光发射强度开始上升的时间点。(2)，光发射强度上升改变率升高或降低时间点。(3)光发射强度上升改变率从升高到降低过渡的时间点(即光发射强度的峰值)。(4)光发射强度上升改变率升高或降低时间点。(5)光发射强度到达或越过预定水平的时间点。
要想定量分析样本中模板核酸的量，所要监测的数据点最好是光发射量发生显著改变的点。本领域技术人员会很容易注意到这些点，并解释它们。
最难得的是，光发射量改变率显著变化的点，都将是代表光发射强度增高或降低的过渡点。代表光发射强度增高或降低的过渡点，也是光发射量改变率显著变化的点，在绘制光发射强度单位时间变化图表时，代表光发射强度增高或降低的过渡点将会被清晰地显示出来。那些代表光发射强度从一个恒定值开始上升或下降的点，或者那些代表光发射强度从上升或下降变位恒定值的点也是代表光发射强度显著变化的点。
代表光发射强度显著改变的点可能是代表光发射强度上升率或下降率显著上升或下降的点。因此，关于“光发射强度改变率显著变化的点”的描述是指这样一个点，这个点指在相同的预定时间间隔内，该点前后光发射强度改变至少30％。更好的是，代表光发射强度显著改变的点与这样一个点是相互关联的，这个点指在相同的预定时间间隔里，该点前后光发射强度改变至少50％。甚至，代表光发射强度显著改变的点也与这样一个点是相互关联的，这个点指在相同的预定时间间隔里，该点前后光发射强度改变至少70％，这样以此类推，点前后光强度的改变至少10％，20％，40％，60％，到80％，这个预定时间间隔最好是30s，也可以是60s，90s或更多，或者，预定的时间间隔可以小于30s，预定时间间隔的选择将取决于光发射强度的监测时间间隔，也取决于特定的扩增反应的动力化学特性。
因此，在定量分析中，下列一点或几点是需要监测的：(1)，光发射强度开始上升的点。(2)，光发射强度上升变化率开始显著上升或下降的点。(3)，光强度变化率由上升转为下降的点(光强度最大值)或由下降转为上升的点。(4)，光强度下降变化率显著上升或下降的点。当然，也可以监测光强度达到或超过预定水平的点。
在没有应用可逆性荧光素酶的实施例中，可以通过监测以下几点对样本中核酸量进行定量分析，(1)，达到光发射强度开始上升点的时间。(2)，达到光发射强度从上升转为下降的点的时间。(3)，达到光发射强度下降率显著上升的点的时间。(4)，达到光发射强度下降率显著下降的点的时间。(5)，达到光强度接近或超过预定水平的点的时间。
在应用可逆性荧光素酶的实施例中，荧光素酶会受到反应产物的抑制，发射光强度缓慢下降。然后，一旦PPI由于扩增反应达到一定浓度，荧光素酶就会变得对PPI敏感和反抑制，这样，光强度就会上升。然后，光发射强度会逐渐下降，直到出现一定量的PPI，此时光发射强度下降变化率增高，光发射强度下降到一个比没有扩增反应的对照反应光发射强度还底的一个水平。光发射强度减弱变化率然后下降。
因此，在第(1)步包含可逆性荧光素酶的实施例中，样本中模板核酸量可以通过监测一下几点来进行定量分析：(1)，光发射强度从逐渐下降转为上升的时间点(即光发射强度开始上升的点)。(2)，光发射强度下降率显著上升的时间点(即由缓慢下降转为迅速下降)。(3)，光发射强度下降率显著下降的时间点(即由迅速下降转为缓慢下降)。
就像上面所提到的，特定模板核酸达到特定的监测点所需的时间取决于扩增反应初期模板核酸的浓度。因此，在本发明方法的第(4)步包括光发射强度与对照反应光发射强度的比较，这些对照反应样本中模板核酸量是已知的，以此来确定反应样本中核酸的浓度。
在定性分析中，为确定样本中模板核酸的量，不论样本中是否含有模板核酸，数据中所检测到的那些点最好是光发射浓度达到或超过预定水平的点。
在一些没有应用可逆性荧光素酶的反应中，光发射强度的增加则表明样本模板核酸的存在。
更好地，光发射强度的增加于没有扩增反应的对照试验是相关的。例如，理想的对照试验应是没有样本核酸出现或是未应用多聚酶。因此，在具体情况下，或许可以通过检测光发射强度是否超过无扩增反应的对照试验组来定性分析样本中核酸的量。更理想的是，我们可以通过监测光发射强度是否达到或超过预定水平来定性分析样本中核酸的量。例如预定水平可以设定在扩增反应初期光强度下降率在最小值那个点的光发射强度的125％或150％。如果达到或超过这个预定水平，则表明样本中存在核酸，如果未达到这个预定水平，则表明样本中不存在核酸。
预定水平的界定可能依赖以下几种因素：所应用的模板核酸，核酸扩增反应中成分的浓度及反应温度。通过做一系列的对照试验(有或无模板核酸)，熟练技术人员可以得出一个合适的预定水平。
更好的是，如果伴随第(2)步扩增反应开始规定的时间内，光发射强度出现升高，则表明样本中含有模板核酸，反之亦然。例如，这个新方法用于基因复制时，一定数量的测试原料通常包含一定数量的目标模板，然后若目的模板核酸存在，那我们就可以肯定地说：假如在预定时间内光发射强度没有增加，则不存在目标模板。
更好地，预定的时间长度来自于第(2)步的扩增反应，在反应初期，模板核酸量越少，反应时间就越长。通过改变模板核酸的浓度及模板核酸的有无来做一系列的对照试验，熟练技术人员就可以通过特定反应条件下模板核酸有无增长来确定合适的预定时间。例如，预定时间长度可以是自扩增反应初期20，25，30，35，40，45，50分钟或者更多。另外，针对本发明方法，与预定水平相关的光发射强度的降低表明样本模板核酸的存在。有假说认为，当荧光素酶被PPI抑制时，光发射强度降低。例如，预定水平可以设定在扩增反应初期光强度下降率在最小值时的光强度的25％，20％，15％，10％，5％。如果光发射强度下降到预定水平甚至以下，则表明样本模板核酸的存在。然而，如果光发射强度没有达到预定水平，这就表明样本模板核酸的不存在。
预定水平的界定可能依赖以下几种因素：所应用的模板核酸，核酸扩增反应中成分的浓度及反应温度。通过做一系列的对照试验(有或无模板核酸)，熟练技术人员可以得出一个合适的预定水平。
本发明方法的第(4)步较好地包含了与无扩增反应的对照试验光发射强度的比较。例如，这些对照可能与所提的方法中步骤相同，除了模板核酸和反应中其他成分(如多聚酶)被忽略之外。这需要考虑到生物发光体的衰减的时间延长。
本发明方法中，虽然对照试验与样本试验是同时进行的，但并非必须。对照试验也可以提前做以便将所得到的数据与其他的样本进行比较。
本发明方法中，没有扩增反应的对照试验中光发射强度的降低表明样本模板核酸的存在。该降低是发生在上面所提到的光发射强度的其他变化之后的。有人发现，光发射强度最终会降低到比无扩增反应对照试验还低的一个水平。这个发现令人非常惊讶，因为专家曾期望其能继续上升(当更多PPI产生的时候)。有假说认为光发射强度下降到比对照组水平低，是因为荧光素酶受到PPI抑制的缘故。虽然我们通常在第(2)步扩增反应来通过光发射强度的监测确定其是否比对照组低，但是这也可以在第(2)步以后做较为可取的是，光发射强度下降到对照反应水平的30％甚至更低。更较为可取的是，可以下降到20％甚至更低，下降到10％甚至更低，依次，下降到90％甚至更低，下降到80％甚至更低，下降到70％甚至更低，下降到60％甚至更低，下降到50％甚至更低，下降到40％甚至更低。
与预定水平相关或与对照反应核酸扩增反应开始后预定时间间隔相关的光发射强度降低表明样本中模板核酸的存在，反之，表明不存在。预定时间间隔可以是扩增反应开始后20s，25s，30s，35s，40s，45s，50s或更多。通过做一系列不同反应浓度的对照实验，熟练技术人员就可以根据光发射强度的升降选择合适的预定时间。
第(2)步核酸扩增反应是在一定温度范围内进行的，在此范围内，荧光素酶具足够活性和稳定性，以便在扩增反应期间提供足够和稳定的光发射量。而且，该步骤是在一个足够低的温度范围内进行的而且非常迅速足以使荧光素酶在反应期间保持稳定。该反应可以在以恒定温度下进行，也可用热循环方法进行，前者更好一些。在恒温下进行的核酸扩增反应是不需要热循环的。
举例，那些不包括RNA合成的核酸扩增反应和适合用本发明方法监测的实验就包括恒温法和热循环法(如PCR)。
不包括RNA合成的恒温方法是通过线性置换法进行的。这些方法包括：循环扩增(见Fire，A.and Xu，S.-Q.(1995)′Rolling replication of shortDNA circles′，Proc.Natl Acad.Sci.USA，92，4641-4645))，循环扩增反应技术(见ht tp://www.molecularstaging.com/Pages/RCATde tails.html；Amersham′s Phi29-based amplification Kit，product codes：25-6400-10and 25-6400-50)，恒温支流扩增(见Zhang，W.etal.，′Detection ofChlamydiat rachomatis by isothermal ramification amp lification method：a feasibility study′，J.Clin.Microbiol.，Jan 2002，128-132)依赖限制性核酸内切酶的线性置换扩增(见Walker，G.T.，′Isothermal in vitroamplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system′，PNAS，(1992)，89，392-396)，循环介导恒温扩增(LAMP)(见(Notomi，T.，′Loop-mediated isothermal amplification of DNA′，Nucl.Acids.Res.，2000，28(12)，e63，i-vii))以及有这些方法衍生出来的方法。不包括RNA合成的恒温方法和通过线性置换机理进行的扩增方法也以恒温PCR而出名。在背景反应是在低温扩增下进行的前提下，有一发现令人很惊讶，该发现认为，基于ELIDA化验的生物发光体化验可以用于监测通过线性置换进行的扩增反应。
作为一种选择，不包括RNA合成的热循环方法或许可以应用在该发明方法中，前提是：扩增反应所有成分和生物发光体化验在PCR循环温度下是稳定的。更好地，该热循环反应是在一个低温热循环方法下进行的，在此方法中，引物延长在周期性温度范围不超过75度的情形下进行，不超过70度更好一些，而且所用的是适度热稳定的DNA聚合酶。这个方法叫做LoTempRPCR，其所用的是HiFiRDNA聚合酶，网址www.hifidna.com/FQAall.htm.对此方法作了描述。这种热循环反应是一种低温热循环方法，该方法应用的是在存在脯氨酸时的DNA聚合酶I的Klenow片断，(见Nucleic Acid Research，(1999)，27(6)，1566-1568)。
包括RNA合成步骤和可以被该发明方法监测的恒温扩增反应的例子有：转录介导扩增(TMA)和基于扩增的核苷酸序列(NASBA)(Guatelli，J.C.et al.，′Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids by a multienzymereaction modelled after retroviral replication′，PNAS，(1990)，87，1874-1878)和这些方法的变异体。
第(2)步核酸扩增反应是在一温度范围内进行的，在此范围内，扩增反应成分及生物发光体化验保持稳定。适宜的温度范围不超过75℃，更好的，该温度范围不超过70℃。更加好的情况是该温度范围不超过65℃。最好的，这个温度范围不超过60℃。也就是，在这个温度范围内，超光热的热稳定荧光素酶具有足够的活性和稳定性，在整个扩增反应期间提供足够和稳定的光发射量。作为选择的，第(2)步核酸扩增反应或许可能在不超过55℃，50℃，45℃，或40℃的温度范围内进行。
更好地，第(2)步核酸扩增反应是在不低于20度范围内进行的。不低于30度更好，不低于40度更为可取。选择性地，第(2)步的核酸扩增反应可以在不低于25℃、35℃、45℃、50℃、55℃或者60℃的温度范围内进行。
较为可取的是，第(2)步的核酸扩增反应在30℃到75℃的温度范围内进行。更为可取的是，第(2)步的核酸扩增反应在30℃到65℃的温度范围内进行。例如，第(2)步的核酸扩增反应在45℃到65℃或者35℃到40℃的范围内进行。
第(2)步的核酸扩增反应可以在一个恒定的温度下进行，此恒定温度应在上述温度范围内。在一个较好的实施例中，核酸扩增反应在37℃进行。例如利用在37℃时稳定的突变的荧火虫荧光素酶(在这个温度时，野生型酶很快会失活)，人们可以在恒温核酸扩增反应中利用标准ELIDA反应监测PPi的生成。Tisi，L等描述了一个在37℃时保持稳定的，一种突变的萤火虫荧光素酶，该荧光素酶适合在本发明的的新方法中运用的例子(Tisi，L.C.etal.，(2002)′Development of a thermostable firefly luciferase′，AnalyticChimica Acta，Vol.457，115-123)。
作为替代方法，第(2)步的核酸扩增反应可以在首选温度范围内的一个以上的温度下进行。
研究发现，当核酸扩增反应进行的温度上升时，通过生物发光测定可得知，被使用的荧光素酶产生的光输出整体密度降低。(无论扩增发生与否)。第(2)步的核酸扩增反应在一个较低的温度下进行是有好处的。较低的反应温度有双重优点：一、光输出密度增加；二、扩增反应变慢。较慢的扩增反应对于定量分析尤其有利，因为此时数据点出现的时间较之在更高温度下监测扩增反应时其出现的时间更长，因此也更易于监测。对含有不同量的模板核酸的样本而言，这些数据点对应于不同的点，这些点显示随着时间的变化，光强度改变的速率变化的变量。
然而，在较低温度下进行核酸扩增反应可能会会潜在地影响扩增反应的特异性。例如，当温度降低时很有可能出现假阳性结果。因为在温度降低时，出现优先退火序列而不是目标序列的机会增加了。因此，本发明也提供了一种方法，使第(2)步的核酸扩增反应以较高温度开始进行，随后降至一个较低的温度。较为可取的是，这种较高和较低的温度应在上述的首选反应温度范围之内。这种方法的好处是核酸扩增反应以一个较高温度开始，这样特异性就较高；然后，在反映进入可检测的指数增长阶段，降低反应温度以增加光强度，并且减缓反应的进行。
相对低温的恒温方法和低温热循环方法与将温度升至95℃的传统热循环PC R方法相比，前者可对更小的样本量进行分析。尤其是在温度不超过55℃的实施例中，极度小样本量可用本发明的方法进行分析。例如，样本量低于10ul甚至低于1ul都可用本发明的方法分析。小样本量是传统PCR的一个技术难点，因为传统PCR需要高温。能够分析小样本量也可以减少试剂的消耗。
因此，在首选的实施例中，本发明的方法要求在第(2)步的核酸扩增反应中，聚合酶反应在恒温下进行，并且在这个温度下所用的荧光素酶需要很稳定。这产生以下优点：
1)可以实时连续监测恒温核酸扩增反应；
2)恒温核酸扩增反应可在一个完全封闭的系统内进行监测，不需要另加试剂；
3)相对低温测定可对极度小样本量进行分析(微小样本量分析对于传统PCR来说是一个技术难点)，因此减少了试剂的消耗；
4)一个普通CCD照相机可同时监测上千份恒温PCR反应。
本发明的一个特征是用凝胶电泳可检测到核酸扩增中核酸合成的来的PPi，而检测不到合成的核酸，这增加了检测的敏感性，并减少了扩增的时间。此外，Mori等(Mori，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，(2001)289，150-154)的混浊度法要求，在观察到显著的混浊之前，PPi的浓度为～0.6mM。这个要求通过使用焦磷酸盐测定试验来实现，该实验使PPi经由ATP磺酰酶被转变为ATP，并且通过荧光素酶使这些新产生的ATP产生光。浓度低于0.5uM的PPi与生物发光之间将出现线性关系。(Nyren&Lundin，Analytical Biochemistry，151(2)，405-409(1985))Mori等的方法。这显示本发明的方法的敏感性得到提高，在一次混浊度的测定中检测PPi至少1200次。本发明方法较之基于荧光的方法敏感性更高。
根据本发明的方法可用于医学诊断。目前，大多数诊断试验中心需将其试验结果送出去进行分析，因为传统分析核酸扩增反应的方法，如PCR，需要复杂的硬件和光学仪器。运用上述方法将确保在关心的问题上分析试验结果。例如，它可用于性健康门诊。如弄清楚样本中是否含有诸如细菌或病毒等病原体，它也可用于确定样本中细菌或病毒的总量，如用来确定感染的程度。
此外，根据本发明的方法还可以用于确定在一个有机体的基因编码中是否存在一个特定核酸序列。例如，其可以被用来确定来源于模板核酸链的核酸是否被修改了，或被用来检测与一特定非基因修改的植物或者基因修改的植物相关的DNA，或被用来检测血缘相近的动物的DNA，又或者被用于医学或兽医学诊断，比如基因诊断或辩论。
根据本发明的方法可用于检测样本中是否存在一种有机体。在前面已经说过，这个有机体可以是一种病原体。然而，这个方法也可以被用来检测非病原性有机体。
根据本发明的方法亦可用于免疫-核酸扩增技术中(例如Sano，T.et al.，(1992)Science，vol.258，120-122中所述)(如鉴定与一抗体相连结的一特定模板核酸链)。在难以运用如荧光反应或吸光反应之类技术的地方，也可使用这种方法，本发明的方法可以被用于金属表面。例如，用来检出手术刀片上的朊病毒。
根据本发明的方法使用的工具包中最好有一核酸多聚酶及其基底，至少两个引物s，一热稳定荧光素酶，荧光素和选择性ATP磺酰酶和腺苷5’磷酸硫酸盐。更为可取的是，根据本发明的方法的工具包另外还包括缓冲剂，如镁离子。该工具包可以只包括以上成分的一些并/或加入额外成分。样本和任何其他从工具包省去的成分在工具包的使用过程中都可以加进去。
例如，根据本发明的方法的工具包由一些容器组成。基底这些容器各自包含有：
1)核酸多聚酶、镁离子和dNTPs的混合缓冲剂；
2)荧光素酶，荧光素和ATP磺酰酶
更好的，工具包中应至少有一种成分是冻干状的或以另一种适合储存的形式存在。更进一步优越的是，工具包中所有成分都为冻干状，或都以一种或多种其他适合储存的形式存在。其他形式包括加入了稳定剂的和/或包含工具包成分的冷冻或冰冻的混合体。
一个较好的工具包形式是一个微缩液态循环。更好的，根据本发明的方法的工具包的大小最好能与一枚信用卡差不多，以便易于操作。
根据本发明的方法的工具包可用来一次性分析一个或多个样本。例如一个工具包可用来一次性分析2，3，...，50，...，100，...，200甚至1000份样本。
根据本发明的方法的实施例中，本发明被用来一次性检测1个以上样本，此方法可用于检测每一份样本中是否存在相同序列的模板核酸链，也可用于检测不同样本中是否存在不同序列的模板核酸链。
用一张试验卡可以显示来自于一份或几分样本的结果。更好的，这张试验卡的大小和一张信用卡差不多，以易于操作。
本发明还另外提供了一种操作本发明的方法的设备，它可以合并根据本发明的工具包中的成分。例如，更适宜地，根据本发明的设备合并了核酸多聚酶及其基底，至少两个引物，一热稳定荧光素酶，荧光素和选择性ATP磺酰酶和腺苷5’磷酸硫酸盐。
下面将通过仅以下列图为参考的例子进一步描述本发明。
图1显示跟踪LAMP反应的装置；
图2显示存在目标DNA的LAMP的输出和不含Bst DNA聚合酶的对照物的LAMP输出；
图3显示双倍LAMP样本和双倍对照的结果；
图4显示和图2、图3一样配制的样本的结果，但是绝对光强度有差别。
图5显示关于LAMP在55℃时用不同量的目标模板(双倍数)的光发射模式；
图6显示到达光发射峰值的时间；
图7显示三倍量LAMP反应的原始输出的图；
图8显示从图7的曲线第一次衍变而来的图；
图9显示对照物和样本的对比；
图10显示十分钟后，温度从55℃降至50℃时的LAMP反应；
图11显示含有不同起始模板量的未含ATP磺酰酶的LAMP的光强度随着时间变化的图曲线。横坐标为时间，纵坐标为光强度；
图12显示包含不同目标模板量的样本的不含ATP磺酰酶的LAMP反应的标准化光输出的差别曲线(扣除了对照)。
实施例
例一：本发明方法的示例
选择恒温核酸扩增反应，即被称为环状介导扩增(LAMP)的，来举例说明用一普通生物发光测定来实时监测核酸扩增反应的可能性。
目前，大多数LAMP方法的快速显示使用6个引物。这种显示被示例为在仅仅15分钟内检测了10的五次方拷贝的目标DNA(Nagamine et al.2002Molecular and Cellular Probes，16，p223-229)。LAMP反应通常在60℃～65℃范围内进行，并且需要至少4mM的镁离子。
为了特别地示例LAMP反应中实时生物发光的结果，我们必须找出能降低LAMP反应温度的方法。这是因为温度高于65℃时，在LAMP扩增反应过程中，即使是目前热稳定能力最强的甲虫荧光素酶(来自Promega的Ultra-Glow热稳定荧光素酶)也会缺乏活性和/或不能稳定的发出充足而稳定的光输出(大约需要45分钟或更长时间来确定一个样本中不含有任何一种特定目标DNA的分子)。
把镁离子的浓度从4mM降至2mM将允许LAMP反应在低温下顺利进行。此外，高浓度的甜菜碱会降低LAMP反应在低温下成功的可重复运行的能力。最终，不会影响LAMP反应的合适的稳定剂将被选为并被包含于配方中。结果，在整个扩增过程中，生物发光测定和LAMP反应同时进行成为可能。
起始材料：
1)反应混合物(更少的Bst-DNA多聚酶和目标DNA)
剂量 试剂名 公司
20mM 醋酸盐 Sigma
10mM KC1 Sigma
10mM 硫酸铵 Sigma
2mM 硫酸镁 Sigma
0.10％V/V Triton X-100 Sigma
0.5％W/V BSA Sigma
5％W/V 海藻糖 Sigma
0.4mg/ml 聚维酮 Sigma
9mM 二硫苏糖醇 Melford
100g/ml D-荧光素(钾盐) Europa
54ng/ml Ultra-Glow荧光素酶 Promega
100M 腺苷5’磷酸硫酸盐 Sigma
0.5U/ml ATP磺酰酶 Sigma
250uM 四种dNTPs Amersham Biosci
0.8M LAMPB1cB2引物 PNAC Cambridge UK
0.8pM LAMPF1F2c引物 PNAC Cambridge UK
0.4M LAMP Loop B引物 PNAC Cambridge UK
0.4M LAMP Loop F引物 PNAC Cambridge UK
0.2M LAMP B3引物 PNAC Cambr idge UK
0.2M LAMP F3c引物 PNAC Cambr idge UK
PH8.8@25℃(引物序列见下面)
2)DNA多聚酶
8U/ul Bst DNA多聚酶 New England Biolabs
3)模板DNA
Catgaattcgtcaagtctacgataacttagcgcttaggatgtcagatacttatgatgataagctgatagactatcttgcctggaagcttacttcataatggatgacgtatgccatgatagataccattgtctagacataagactttcaatctgcatagtcatgatcgatccatgctcgagtccaagctagtcatagcttatcatcaactgaatctagtaagtcattgaattctag
引物序列：
LAMPB1cB2：tat cat ggc ata cgt cat cca ttt tta taa get gat agacta tct tgc
LAMPF1F2c：tca atc tgc ata gtc atg atc gtt ttt tga tga taa getatg act age
LAMP Loop B：tat gaa gta agc ttc cag
LAMP Loop F：atc cat get cga gtc caa
LAMP B3引物atg tca gat act tat gat g
LAMP F3c引物aat gac tta cta gat tcag
方法
在一个200ul的PCR管中，继加入1ul的0.4ng/ul模板DNA和0.4ul BstDNA多聚酶后，加入18.6ul的反应混合物。在另一个200ul的PCR管的对照物中，加入18.6ul的反应混合物和0.4ng/ul的模板DNA，但不加Bst DNA多聚酶。
样本被置于Syngene GeneGenius光学厨柜(www.syngene.co.uk)里的50℃恒温器上。利用Syngene Genesnap软件(www.syngene.co.uk)在Syngene光学厨柜里用一个CCD照相机拍一系列照片来记录样本发出的光(透过密封的PCR管)(图1)。每张照片代表1分钟内样本发出的全部的光。一共记录40张画面，因此LAMP反应总共就被观察了40分钟。
结果
利用Syngene软件，每一样本的光输出可被定量为一段时间，结果见于图2。
利用琼脂糖凝胶电泳，可以确认含有核酸模板的样本的确扩增出大量DNA，而对照组则没有合成任何DNA。
以下是扩增中一些光输出的特征：
1)最初，样本与对照物的光输出降低的速率相似；
2)过了一会儿，样本的光强度开始上升，然而对照物的光强度依然逐渐降低；
3)样本的光输出的增长速率一直上升，达到一个最大值，然后下降，直到达到在LAMP反应过程中的有记录的光输出峰值的那一点；
4)继样本光输出达到峰值后，观察到光输出下降；
5)光输出达到峰值后下降的速率逐渐增加，并且光输出的数量小于对照物的。
6)样本光输出下降的速率减慢，最终与对照物相似。
7)40分钟后，样本光输出的量相对来说低于对照物。即使在这个例子中，样本的最初光强度要稍微高一些。(这与样本的光输出根本没有考虑样本和照相机的相对位置有关)。
有一种假设认为光强度在达到峰值后即降低是由于因为荧光素被焦磷酸盐抑制了。这样的话，在LAMP反应中，光强度的峰值代表了在这一点时累积了特定量的焦磷酸盐。因此，光强度峰值也代表了在这一点时，已经合成了特定量的DNA。
例二：本发明方法利用LAMP扩增反应的可重复性。
程序与例一中相同，除了用了多个样本来评价LAMP反应所得结果的可重复性。
起始材料和方法：
除了样本和对照物是例一中的两倍或三倍来实施，以及反应温度升至55℃，其他与例一相同。
结果
结果见图3。这个例子中样本反应曲线与例一相同。
这个例子的两个样本，无论光输出变化的速率还是到达最大光输出的时间均极其相似。此外，用琼脂糖凝胶电泳证实样本中DNA扩增。对于对照组，两例对照的光输出变化速率是相似的，但绝对值有一点小小的差别。人们认为是因为所用系统的光捕捉的不同效果而不是任何生化方面的原因。然而，即使没有数据处理，可以得到清晰的结果。
在一些例子中，例如如三倍数样本的绝对光强度可随光捕捉的效果变化而变化。然而，相互间光输出的速率和到达最大光输出的时间是相似的。
例三：在一中定量方式中利用本发明方法
起始材料和方法
重复例一中相同的过程，但是样本中的目标DNA数量不一样。复制样本是0.4ng，40pg，4pg，0.4pg的模板核苷酸。反应温度是55℃
结果
图5显示了每个样本的光发射数据。图5所获数据表明了本发明方法的关键性质。
如果目标模板量和绝对光发射量之间没有令人信服的相关性，那么达到发光量最高值的时间或发光量改变速度的时间之间的关系就是非常明确的。
发光量达峰值的时间和目标DNA之间的不一致表明其相关性是定量的(图6a表明发光量峰值时间和样本中的log10浓度的DNA模板的是线性相关)。在图6b中显示了产
生25％扩增子的时间和达发光量峰值的时间，可以看到两者的参数相关。对比发光量达峰值的时间和琼脂糖凝胶电泳的数据，可以看到发光量的峰值时间反映的是扩增子的积累和样本中核苷酸的数量。
例四：对根据本发明的方法得到的数据进行处理，本发明中核酸扩增反应
是LAMP反应
在简单的原始数据处理后用多样本再次重复例一中的过程，以估计LAMP反应数据的可重复性。尤其是，设计了第一个衍生物.
起始材料和方法：
除了样本与控制器采用三份以外，与例一相同，温度50摄氏度，全量的1
ng左炔诺孕酮模板运用在每一个样本中。
图7显示了这个试验所获得的大量原始数据，通过描绘发光量对时间和光密度对时间的变化速率，我们可以看到明显的拐点。特别的图7所显示的曲线与y轴相交的最大和最小两点之间的面积，当曲线的起点描绘时。然而强度等级有很大的变化，拐点却是相似的。
图8中显示了样本LAMP扩增反应发生后的曲线与y轴有两个交点，第一个表示图7的的拐点，第二个表示最大光强度的拐点。图8中显示的最大和最小值说明了与光发射量变化最大速率有关的时间点。所有的四个数据点(两个y轴的交点一个最大值一个最小值)表示了三个样本的重叠。值得注意的是第一个y轴的交点是第二个交点的十分钟之前。
图9显示的是放大的曲线8，说明了样本与对照的区别。
因为来自于使用了LAMP反应试验的原始数据的内在信息容量，每一个数据的操作，例如taking thelst derivative，不仅让结果曲线的点可以明晰可见(y轴的交点，最大值最小值)，而且结果可以对光信号不敏感。(与图7的曲线重叠相比，图8的重叠更相似)
例5：扩增反应过程中改变扩增反应的温度
LAMP方法可以在45摄氏度到65摄氏度之间工作。然而反应温度越高，本发明方法所获得的整个光强度就越低(无论是否反应发生)这是由于使用的特定的热稳定的萤光素酶，可以在较高的温度下以较低的速率催化光反应。55摄氏度下的光发射量明显的比50摄氏度下小的多。然而降低温度例如从55摄氏度到50摄氏度，有人观察到了可逆的结果：萤光素酶催化的光发射量是增加的。这个可逆的结果暗示：观察到的高温下发光降低结果并不仅仅是萤光素酶自身特性变化的结果。
因此低温下LAMP反应可以增加光发射量，而且低温也可以减慢反应本身。这在一些条件下这是有利的，比如在定量实施本发明方法时，减慢扩增反应的一些时间，比如说不同数量的目标模板达到发光峰值的时间，较之高温下反应，就可以大大的分离。
但是低温下的LAMP反应可以潜在的影响反应的特异性，如果温度降低的话假阳性的可能性就会增加，也就是说随着反应温度的降低，形成引物序列的机会将比形成目标序列的机会要达的多。
要想既要利用低温反应又想保证反应的特异性，一个可行的办法就是在反应的过程中降低反应的温度，反应开始要用较高的温度，这时特异性是相当高的，在反应进入指数增值阶段就降低反应的温度，结果就是反应的变慢。
开始物和方法
与例一相同，除了应用不同数量的例三中的目标模板(0.02pg/ul至20pg/ul，也就是，整个样本0.4pg到0.4ng)对各种样本进行测试。LAMP反应开始的温度是55度，十分钟后降低到50度。
结果
图10，显示了温度改变后的原始数据。这些数据显示把温度降低确实是导致光发射强度的增加。进一步说，LAMP反应是定量的，表现为达到最高值发射光的时间是起始模板DNA数量的函数。将图10和图5相比教可以看出在模板含量最多的样本和最少的样本其反应时间的差别接近8分钟。在图10显示的数据可以看出降低温度后的时间差别接近14分钟。
事实上高于55度的温度也可以应用，虽然超光萤光素酶在超过60度后就不稳定，但是也可以在高温条件下受短暂的时间，这个方法因此增加了可利用温度的范围。
而且，如果反应的时间不需要很长的话，我们就可以利用足可以让萤光素酶产生不可逆灭活的温度下应用不够稳定的萤光素酶参加反应。
最后，在使用改变温度的方法仍然可能产生假阳性，但是在开始阶段对高温的严格控制可以见少假阳性的发生。
例6：基于可逆性抑制萤光素酶的方法
如前所述，焦磷酸盐对萤光素酶都有直接的影响，首先，在一定的条件下焦磷酸盐可以减弱抑制。在存在包括光作用的产物氧化萤光素在内的一些抑制剂的情况下，萤光素酶也可以又有光反应。
其次，高浓度的焦磷酸盐本身也可以直接抑制萤光素酶。是否焦磷酸盐刺激或是抑制了萤光素酶催化的光反应取决于多种因素，包括萤光素酶亚型，温度，焦磷酸盐浓度，以及其它影响萤光素酶活性的组分等。这个例子告诉我们如何应用焦磷酸盐的抑制效果来跟踪LAMP反应。这个方法的关键点是样本中存在ATP是可以接受的：这个方法中的生物发光检定就是依赖样本中的ATP可以被萤光素酶检测到，进而反应发光，基于检测的目的，ATP还是非常必要的。
ATP硫酸化酶法耐受ATP(事实上在ATP存在的情况下反应效率最高)这个事实证明了ATP硫酸化酶法可以用于检测增值反应中的焦磷酸盐。
通过在特定反应条件下的对照试验，技术熟练的人员可以检测出应用本发明发放的萤光素酶，萤光素，ATP，焦磷酸盐的比率。
起始材料和方法：
1)ATP硫酸化酶反应混合物(聚合酶，靶DNA)
数量 试剂 供应商
20mM 三价醋酸盐， Sigma
10mM KCl “
10mM 硫酸铵 “
2mM 硫酸镁 “
0.10％V/V TritonX-100 “
0.5％W/V BSA “
5％W/V 海藻糖 “
0.4mg/ml 聚乙烯吡咯烷酮 “
9mM Dithiothreitol Melford
11ug/ml 荧光素 Europa
36ng/ml 超光荧光酶 Promega
1mM 三磷酸腺苷 Sigma
250uM 个中任一dNTPs Amersham Biosci.
0.8uM LAMP B1cB2引物 PNAC Cambridge UK
0.8uM LAMPF1F2c引物 “
0.4uM LAMP Loop B引物 “
0.4uM LAMP Loop F引物 “
0.2uM LAMP B3引物 “
0.2uM LAMP F3c引物 “
pH8.8，25摄氏度
方法：
参照例一准备样本，除了应用上述混合反应物外。使用浓度范围在1pg到1ng内的模板DNA浓度测试。ATP硫酸化酶LAMP反应的温度是55度。DNA多聚酶样本作为对照。
结果
图11显示了ATP硫酸化酶反应的数据。这些数据表明含有核酸模板的样本又一个明显的光强度随着时间的突然降低，但是在对照组没有看到。据信这个降低是因为抑制萤光素酶的LAMP产生的焦磷酸盐所致。这个突然的降低就是核酸开始增值的标志。样本琼脂糖凝胶电泳已经证实了DNA的合成。
数据的进一步分析可以让我们明白这个结果，首先，起始光强度标准化，然后从核酸模板样本数据中减去没有多聚酶对照组的数据(图12)仔细研究图12就可以看到ATP硫酸化酶LAMP反应也是数量依赖关系。当时间到达光强度明显改变的时候，好像与模板浓度成比例。既然在ATP硫酸化酶LAMP期间存在1mM的ATP。同样的方法也可以应用与基于RNA的扩增反应中。
上面仅仅通过一些实施例对本发明进行了说明，可以基于此作出进一步的修改和完善，但是这些仍在本发明权利要求所界定的范围内。
Claims (35)
1.一种测定样本中的模板核酸数量的方法，包含如下步骤：
(1)向样本中加入所有核酸扩增必需的成分和生物发光测定所需要的所有成分：
a)核酸聚合酶，
b)核酸聚合酶的基底，
c)至少两个引物，
d)一个热稳定的荧光素酶，
e)荧光素，
f)可选的ATP硫酰酶，以及
g)可选的阿糖腺苷5‘磷硫酸盐，然后；
(2)进行包含多于一个扩增循环的目标核酸的扩增反应，
(3)测定生物发光所产生的光的光强度，并且
(4)确定样本中的核酸模板的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：至少步骤(2)和步骤(3)在密闭容器内进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在核酸扩增反应步骤(3)中测定发射光的强度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)还包括产生一个时间函数光发射光强度数据。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：通过测量达到发射光强度变化率显著变化时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
6.根据权利要求1所述的方法，用于确定核酸扩增反应第(2)步骤开始时样本中模板核酸数量。
7.根据权利要求1所述的方法，用于确定核酸扩增反应第(2)步骤结果的样本中核酸数量。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度开始增加的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度达到最大值的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度增长开始降低时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度降低的开始降低时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度到达或者越过一个预定水平的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所加入的热稳定的荧光素酶是可逆性抑制性荧光素酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)还包括将光发射光强度与包含已知模板核酸数量的对照物的光发射光强度进行比较。
15.根据权利要求1所述的方法，用于确定样本中是否存在模板核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：模板核酸是否存在，通过测量光强度到达或者越过一个预定水平的时间点所需时间的数据集来确定。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：相对于预定水平的光强度增加表示样本中存在模板核酸。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：相对于预定水平的光强度降低表示样本中存在模板核酸。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：样本中是否存在模板核酸，通过测量自步骤(2)扩增反应开始后的一个预定的时间长度内发射光强度是否达到或者越过预定的水平来确定。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)还包括，将光强度与没有扩增反应的控制器内的发射光强度进行比较。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：如果与没有扩增反应的控制器内的发射光强度进行比较，光强度降低，则表明样本中存在模板核酸。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：核酸扩增反应第(2)步骤为低温热循环扩增方法，循环温度幅度不超过75℃。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)的核酸扩增反应是恒温进行的。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于：核酸扩增反应第(2)步骤的温度不超过75℃。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于：步骤(2)的扩增反应在恒温下进行，在此温度下，扩增反应的组分以及发光测定保持稳定。
26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：核酸扩增步骤(2)在扩增反应的组分以及发光测定能保持稳定的温度范围内的多于一个温度数值下进行。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：核酸扩增反应步骤(2)在较高的温度下开始然后降到一个较低的温度。
28.根据权利要求1所述的方法，用于临床诊断。
29.根据权利要求1所述的方法，用于确定样本中是否存在病原体。
30.根据权利要求1所述的方法，用于确定生物体遗传密码中是否存在某一特定核酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法，用于确定模板核酸起源的核酸是否被基因改变。
32.根据权利要求1所述的方法，用于确定在样本中是否存在有机体。
33.根据权利要求1所述的方法，应用于免疫-核酸扩增技术。
34.一种实施权利要求1至33任一项所述方法的设备，其特征在于：所述设备合并了核酸多聚酶、核酸多聚酶基底、至少两个引物、热稳定荧光素酶、荧光素和可选的ATP磺酰酶，以及腺苷5’磷酸硫酸盐。
35.根据权利要求34所述的设备，其特征在于：其含有核酸多聚酶、镁离子源和dNTPs的混合缓冲剂，荧光素酶，荧光素和ATP磺酰酶。
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Effective date of registration: 20080425 Address after: cambridge Applicant after: LUMORA LTD. Address before: Erie Applicant before: Tisi Laurence C. Co-applicant before: Murray James A. H. |
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| CX01 | Expiry of patent term |