DE19545965A1 - Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von Polymerasen sowie unmarkierten und markier­ ten Primern.

Ein derartiges Amplifikationsverfahren ist für die molekulare Diagnostik, insbesondere für die Pathogendiagnostik, von großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Techniken ist beschrieben worden, die geringe Mengen an spezifischer Nukleinsäure nachzuweisen vermögen. Dem erfindungsgemäßen Verfahren ähnlich ist der 5′- Nuklease-Assay (die sogenannte TaqMan-Polymerase-Chain-Reaction; Livak et al. in PCR Methods and Applications 4 (1995), 357-362). Die Basis dieser Methode ist ein am 5′-Ende mit einem Reportermolekül (Fluorescein) und am 3′-Ende mit einem Quencher­ molekül (Rhodamin) markiertes Oligonukleotid, welches am 3′-Ende zudem über einen Phosphatrest gegen eine enzymatische Kettenver­ längerung geschützt ist. Im Verlauf der PCR-Reaktion wird die Sonde von der 5′-3′-Exonukleaseaktivität der verwendeten Taq- Polymerase erkannt, wenn sie downstream zu einer primer-gestar­ teten Polymerase-Reaktion an die zu amplifizierende Matrize hybridisiert hat. In der Folge sorgt die 5′-3′-Exonukleaseakti­ vität für die Hydrolyse des 5′-Endes der Sonde, wodurch die Fluoreszenz-Emission des Fluorescein-Reporters ansteigt, da sie nicht länger durch die Nachbarschaft des Rhodamins gelöscht wird. Gravierende Nachteile dieses Verfahrens sind die sehr aufwendige und kostenintensive Präparation der doppeltmarkierten und end­ gruppengeschützten Oligonukleotide, die Beteiligung der enzymati­ schen Hydrolyse und der Einfluß von Medieneffekten auf die Fluo­ reszenzausbeute, d. h. die Quantifizierbarkeit.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein universell einsetzbares, leicht handhabbares und preiswertes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Detektion von klein­ sten Mengen an Nukleinsäure bereitzustellen. Es ist hierbei insbesondere im Hinblick auf die Diagnostik infektiöser Pathogene wünschenswert, daß das gesamte Verfahren in Kompartimenten ablau­ fen kann, die nach der Zugabe der Probe verschlossen werden und im Laufe des Verfahrens nicht wieder geöffnet werden müssen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die Unteran­ sprüche 2 bis 7 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung von Nuklein­ säuremolekülen in niedrigen Konzentrationen in zu untersuchenden Proben. Dabei werden Amplifikationsreaktionen eingesetzt. Diese verwenden Polymerasen sowie unmarkierte Primer (Amplifikations­ primer) und markierte Primer (Detektionsprimer). Die markierten Primer werden durch die Amplifikationsreaktion in die amplifi­ zierte Nukleinsäure eingebaut, wobei die Konzentration der freien Detektionsprimer abnimmt. Die Abnahme dieser Konzentration wird gemessen und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls herangezogen.

Vorzugsweise sind die markierten Primer mit fluoreszierenden Gruppen markiert. Als Amplifikationsreaktionen kommen insbeson­ dere Primer abhängige Reaktionen wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), isothermale 3SR (self-sustained sequence replication) und/oder strand displacement amplification (SDA) in Betracht.

Wird die Abnahme der Konzentration der markierten Primer, wie erfindungsgemäß bevorzugt wird, mittels fluoreszenzmarkierter Primer gemessen, ist die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) eingesetzbar, um ein Maß für das Vorhandensein des zu be­ stimmenden Nukleinsäuremoleküls zu ermitteln. Bei dieser Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Amplifika­ tionstechniken mit der Detektionsmethode Fluoreszenzkorrela­ tionsspektroskopie gekoppelt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Realisierung einer Endpunkttitration, wobei die nachzuweisende Sequenz während der Reaktion stufenweise oder kontinuierlich amplifiziert wird. Der Endpunkt dieser als End­ punkttitration auffaßbaren Reaktion ist erreicht, wenn der erfin­ dungsgemäß zu verwendende Detektionsprimer durch Inkorporation in die neue synthetisierte Nukleinsäure verbraucht ist, bzw. eine weitere Abnahme der Konzentration des Detektionsprimers nicht mehr feststellbar ist oder einen vorher festlegbaren, zweckmäßi­ gen Wert erreicht hat.

Vorzugsweise wird dabei eine Polymerase ohne 5′-3′-Exonukleaseak­ tivität verwendet. Anderenfalls würde die Sonde wie im Ansatz gemäß Livak et al. abgebaut. Die Polymerasen sind kommerziell erhältlich.

Die erfindungsgemäße Maßnahme, die Abnahme der Konzentration der markierten Primer zu messen und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls heranzuziehen, beruht auf der Tatsache, daß zu Beginn der Reaktion der Detektionsprimer sich in einen Zustand hoher Mobilität befindet, während er am Ende der Reaktion durch die Amplifikationsreaktion (Einbau in ein Amplifikationsprodukt) weitgehend bis vollständig in einen Zu­ stand niedriger Mobilität überführt wird. Diese Mobilitätsände­ rung läßt sich in besonders geeigneter Weise durch die Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie messen, wobei die Probe im geschlossenen Kompartiment verbleiben kann. Es kann erfin­ dungsgemäß bevorzugt sein, die Konzentration des Detektionspri­ mers als gering im Verhältnis zur Konzentration des Amplifika­ tionsprimers zu wählen. Insbesondere kann die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5 bis 200-fache der Konzentration des Detektionsprimers betragen.

Aus der vorzugsweise mit der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ermittelten Korrelationskurve lassen sich sowohl die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle, das relative Verhältnis fluoreszenz­ markierter Moleküle unterschiedlicher Größe als auch ihre Dif­ fusionsmobilitäten schnell und zuverlässig ermitteln. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren in Form einer Endpunkttitration weist durch entsprechende Wahl und Konzentration der fluoreszenzmarkierten Primer nur die Anwesenheit der gesuchten Sequenz, welche eine zum Detektionsprimer komplementäre Sequenz aufweist, nach.

Das Verfahren ist unempfindlich gegenüber unspezifischen Amplifi­ kationen. Eine hohe Konzentration an Amplifikationsprimer ist wünschenswert um eine sichere Amplifikation auch geringer Mengen an nachzuweisenden Nukleinsäuren zu gewährleisten. So kann zum Beispiel die Konzentration des Amplifikationsprimers 0,5 µM betragen, während der Detektionsprimer vorzugsweise in einer Kon­ zentration von 1 bis 10 nM vorliegt. Aus der entsprechenden Wahl unterschiedlicher Konzentrationen für Amplifikationsprimer und Detektionsprimer ergeben sich insbesondere die folgenden Vor­ teile. Bei der PCR muß es zu Assoziationsreaktionen zwischen Primer und Template kommen, um die Primer-Elongation zu starten. Diese Reaktionen haben normalerweise Geschwindigkeitskonstanten von k_R = 10⁴-10⁶ M^-1s^-1. Im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten kommt es gemäß der Beziehung 1/τ = k_R (C_primer+C_template) nennens­ wert zu Komplexbildungen, wenn einer der Partner im Bereich 0,1 bis 1 µM vorliegt. Dies gilt nur für bereits hohe Templatekon­ zentrationen bzw. für die Reaktion mit den Amplifikationsprimern. Erst wenn die Konzentration des spezifischen Amplifikates ent­ sprechend hoch ist, kommt es zur gewünschten und spezifischen Hybridisierung mit dem Detektionsprimer, der sich dann in wenigen Amplifikationsschritten in gewünschter Weise verbraucht und nahezu vollständig durch Kettenverlängerung in Amplifikate über­ führt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere in Kom­ bination mit Probenträgern wie z. B. Polycarbonat-Folien, welche sich durch folgende Vorzüge auszeichnen. Sie sind

• a) chemisch inert
• b) fest verschließbar (keine Kontaminationseffekte, keine Verdampfung)
• c) nicht-fluoreszierend
• d) von relativ geringer Dicke (10 bis 20 µm im Bereich der Probenflüssigkeit)
• e) von relativ hoher Wärmeleitung.

Bevorzugt lassen sich Folien mit 96 oder 384 Kompartimenten verwenden. Die Folien werden mit Testflüssigkeit und Probenflüs­ sigkeit in ca. 5 bis 20 µl Portionen befüllt und verschlossen. Die Lösungen werden als kleine Tropfen durch Kapillarkräfte im oberen Teil der Folie fixiert, in der das Kompartiment eine für die FCS-Methode erforderliche Wandstärke von 10 bis 20 µm be­ sitzt. Die Folien lassen sich in einen thermostatisierbaren Rahmen einpassen. Sie werden mit einer dünnen Schicht Immersions­ flüssigkeit für das im FCS-Detektionsverfahren zu verwendende Objektiv benetzt. Die Kompartimente lassen sich insbesondere für Verdünnungsreihen, Screenings oder auch für unterschiedliche Testtypen einsetzen. Die typische Meßzeit für eine Folie mit 96 Kompartimenten liegt im Bereich weniger Minuten bis maximal einer halben Stunde. Durch Mitführung geeigneter Standardverdünnungen des Templates in der gleichen Folie ist die Quantifizierung der zu detektierenden Nukleinsäure in den Testkompartimenten möglich.

Die Fig. 1 betrifft eine schematische Darstellung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens.

Die Fig. 2 beschreibt die Verschiebung der Korrelationskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template-Mengen.

Die Fig. 3 betrifft die Darstellung der invertierten Korrela­ tionsfunktion in der Form (G(t=0)-1)/(G(t)-1).

Die Fig. 1 beschreibt schematisch das erfindungsgemäße Verfah­ ren. Die in der PCR verwendeten Amplifikationsprimer p1 und p2 sind als Pfeile dargestellt, der Detektionsprimer p3 ist mit einem Fluroeszenzfarbstoff (Kreis) gekoppelt. Der linke Teil der Abbildung zeigt amplifizierte Artefakte bei Abwesenheit des Templates. Hierbei kann es sich z. B. um Primerdimere der hoch­ konzentrierten Primer p1 und p2 handeln. Die rechte Seite der Abbildung zeigt p2 in Anwesenheit des Templates. Erst wenn die Amplifikate in genügend hoher Konzentration vorliegen, wirkt das Amplifikat als Template für den niedrigkonzentrierten, fluores­ zenzmarkierten Detektionsprimer. Die Mobilitätsänderung des Primers läßt sich deutlich durch eine Verschiebung der Korrela­ tionskurve erkennen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Ergebnisse an Myco­ bacterium tuberculosis sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Der Nachweis dieses pathogenen Erregers dauerte bislang aufgrund der aufwendigen Zellkulturverfahren ca. 3 bis 4 Wochen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich diese Nachweiszeit stark verkürzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich bei Verwendung geeig­ neter Detektionsprimer auch zum Nachweis von Punktmutationen, Translokationen, Deletionen oder Haplotyp-Differenzierung. Es ist zudem im Sinne einer Multiplex-PCR einsetzbar. Bei erblichen Stoffwechselkrankheiten, wie z. B. der autosomal rezessiven zy­ stischen Fibrose, lassen sich durch Verwendung zweier Detektions­ primer mit unterschiedlichen Farbstoffmarkern heterozygote Pa­ tienten von homozygoten Patienten unterscheiden. Es ist zudem sowohl zum Nachweis von DNA- als auch RNA-Genomen geeignet (letz­ teres z. B. durch Einsatz in einer RT-PCR oder 3SR-Reaktion).

In der Fig. 2 wird die Verschiebung der Korrelationskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template-Mengen ge­ zeigt. Die jeweils angegebene Anzahl von Templatemolekülen wurde zu Beginn der Reaktion in jeweils 50 µl Reaktionsansatz vorge­ legt, durch das erfindungsgemäße Verfahren in 32 PCR-Zyklen amplifiziert und mittels der FCS-Methode analysiert. Es wurde ein für den Tuberkuloseerreger Mycobacterium tuberculosis charak­ teristisches Template verwendet. Die Detektionsgrenze lag hier bei 100 Templatemolekülen pro Ansatz. Das Verfahren ist damit empfindlich genug, um in jeder molekulardiagnostischen Anwendung eingesetzt zu werden.

Die Fig. 3 zeigt die Auftragung der invertierten Korrelations­ funktion in der Form (G(t=0)-1)/(G(t)-1). In dieser Darstellung wurden die gleichen Daten wie in Fig. 2 verwendet. Durch die invertierte Auftragung sind die Kurven im betrachteten Zeitbe­ reich linearisiert, wodurch ihre Interpretation erleichtert wird. Eine Verschiebung von G(t) entlang der t-Achse zeigt sich in dieser Darstellung als Abflachung der Steigung, die durch lineare Regression in einfacher Weise erhalten werden kann. Die Detek­ tionsgrenze läßt sich deutlich als 100 Templatemoleküle pro Reaktionsansatz erkennen.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in nie­ driger Konzentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifikationsreaktionen, unter Verwendung von Polymerasen sowie unmarkierten Primern (Amplifikationsprimer) und markierten Primern (Detektionsprimer), wobei die markierten Primer durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte Nukleinsäure eingebaut werden und die Abnahme der Konzentra­ tion der markierten Primer gemessen wird und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls herangezogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die markierten Primer mit fluoreszierenden Gruppen markiert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei als Amplifika­ tionsreaktion primerabhängige Reaktionen wie Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR), isothermale 3SR (self-sustained­ sequence-replication) und/oder Strand-Displacement-Amplifi­ cation (SDA) eingesetzt werden.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abnahme der Konzentration der markierten Primer mittels der Fluoreszenzkorrelations­ spektroskopie (FCS) gemessen wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase keine 5′-3′- Exonukleaseaktivität aufweist.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Detek­ tionsprimers gering im Verhältnis zur Konzentration des Amplifikationsprimers ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5 bis 200-fache der Konzentration des Detektionsprimers beträgt.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mittels Probenträ­ gern, insbesondere Polycarbonat-Folien, durchgeführt wird.