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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Amplifizierung oder
zum Nachweis von HIV-1-RNA in klinischen Tests und Diagnosen.
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Das
menschliche Immunschwächevirus
(HIV) ist der Krankheitserreger des erworbenen Immunschwächesyndroms
(AIDS). Zwei Unterarten von HIV sind bekannt: HIV-1, das auf der
ganzen Welt verbreitet ist, und HIV-2, das hauptsächlich an
der afrikanischen Westküste
epidemieartig auftritt. Die Ähnlichkeit
zwischen HIV-2 und dem Affen-Immunschwächevirus (SIV) in der Basensequenz
lässt vermuten,
dass HIV-2 zoonotisch sein kann. Jedoch sind die klinischen Bedingungen
einer HIV-2-Infektion
weniger ernst als jene einer HIV-1-Infektion. Eine HIV-1-Infektion
bewirkt die Produktion von Antikörpern
gegen strukturelle Proteine und regulatorische Proteine von HIV-1.
HIV-1 greift die T-Zellen, die als CD4+-Lymphocyten klassifiziert sind, als hauptsächliche
Zielimmunocyten an und führt
somit dazu, dass das Immunsystem in verschiedener Hinsicht abnormal
wird. In fortgeschrittenen Stadien einer HIV-1-Infektion werden
B-Zellen stimuliert, um eine Hypergammaglobulinämie auszulösen, und Autoantikörper und
Immunkomplexe treten mit einer signifikanten Verringerung an Lymphocyten
und Blutplättchen
auf. Komplikationen wie Tuberkulose, Pneumocystis carinii pneumonia
und andere opportunistische Infektionen bei einem hohen Level der
durch eine HIV-1-Infektion hervorgerufenen Immunschwäche dienen
der Diagnose des Einsetzens von AIDS.
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Für die Diagnose
einer HIV-1-Infektion ist ein EIA (Enzymimmuntest), der auf dem
colorimetrischen Nachweis der Reaktion eines Antikörpers gegen
ein virales Antigen basiert, verbunden mit einer Western-Blot-Bestätigung der
vermutlich positiven Serumproben durch das Vorhandensein von Antikörpern in
den Serumproben verfügbar,
die auf ein spezifisches Virusantigen in einem Blot von elektrophoretisch
aufgetrennten verschiedenen Viruspartikelantigenen reagieren. Jedoch
sind Testverfahren, die Antikörper
wie diese nachweisen, zur Diagnose einer Infektion im frühen Stadium
vor der Produktion von Antikörpern
nicht erhältlich.
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Wie
vorstehend diskutiert, können
herkömmliche
Testverfahren HIV-1 oft nicht im frühen Stadium einer Infektion
erkennen und erfordern komplizierte Arbeisschritte, dauern lang
und können
Spuren von HIV-1 in einer Probe kaum nachweisen.
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Somit
ist die Entwicklung eines schnellen und empfindlichen Nachweisverfahrens
erforderlich. Insbesondere die Quantifizierung von HIV-1-RNA ist
für den
Erhalt von Information über
das pathologische Fortschreiten und die Wirksamkeit von anti-HIV-Wirkstoffen
entscheidend. Weiterhin ist die Entwicklung von automatischen Analysegeräten erforderlich,
um die klinischen Tests zu erleichtern.
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Für den hochempfindlichen
Nachweis wird bevorzugt eine spezifische Sequenz in einem nachzuweisenden
oder zu identifizierenden Gen oder einer RNA, die von einem derartigen
Gen stammt, amplifiziert.
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Die
reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) ist als
Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Sequenz in RNAs wie
der genomischen HIV-1-RNA bekannt. Bei diesem Verfahren folgen auf den
reversen Transkriptionsschritt zur Synthese der cDNA der Ziel-RNA
wiederholte Zyklen von Hitzedenaturierung, Primer-Anlagerung und
Verlängerungsreaktion
in Anwesenheit eines Primerpaars, wobei einer zu einem Ende der
spezifischen Sequenz komplementär
und der andere zu dem anderen Ende der spezifischen Sequenz homolog
ist (der Antisense-Primer kann der gleiche Primer wie der im reversen
Transkriptionsschritt verwendete Primer sein), und einer themostabilen
DNA-Polymerase,
um eine DNA als Amplifikationsprodukt der spezifischen Sequenz herzustellen.
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Jedoch
verhindert die Notwendigkeit, das Verfahren in zwei Schritten (der
reverse Transkriptionsschritt und der PCR-Schritt) durchzuführen und
die mühsamen
Arbeitsschritte wie schnelles Erhitzen und Abkühlen zu wiederholen, die Automatisierung
der RT-PCR.
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NASBA
oder 3SR ist als Technik zur Amplifikation einer spezifischen RNA-Sequenz durch das
gemeinsame Wirken einer reversen Transkriptase und einer RNA-Polymerase bekannt.
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Diese
Technik schließt
eine Kettenreaktion ein, die die Synthese einer doppelsträngigen DNA
von der Ziel-RNA umfasst. Durch die Verwendung eines Primers, der
Promotorsequenzen enthält,
wird die Ziel-RNA durch die Verwendung einer reversen Transkriptase
revers transkribiert, gefolgt von der Hydrolyse des RNA Anteils
durch die Verwendung von Ribonuclease H.
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Dank
der Hilfe eines zweiten Primers und der DNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität der reversen Transkriptase
wird ein DNA-Strang hergestellt, der zu dem ersten DNA-Strang komplementär ist. Unter
Verwendung der resultierenden doppelsträngigen DNA, die die Promotorsequenz
als eine Matrize enthält,
produziert eine RNA-Polymerase eine RNA mit der spezifischen Sequenz.
NASBA oder 3SR erlaubt die relativ isothermische Amplifikation von
Ribonucleinsäuren
und wird als für
die Automatisierung geeignet betrachtet.
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Da
jedoch die an dieser Amplifikationstechnik beteiligten Reaktionen
bei relativ niedrigen Temperaturen erfolgen (z.B. 41°C), kann
die Bildung einer intramolekularen Sekundarstruktur der Ziel-RNA
auftreten, wodurch die Bindung der Primer verhindert und die Wirksamkeit
der Reaktion verringert wird. Somit ist es notwendig, die Wirksamkeit
der Bindung der Primer vor der Amplifikationsrekation zu erhöhen. Dies
wird durch die Auflösung
der intramolekularen Sekundärstruktur
der Ziel-RNA zum Beispiel durch Hitzedenaturierung der Ziel-RNA
erreicht.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles
und empfindliches Verfahren zur Amplifikation oder zum Nachweis
von HIV-RNA bereitzustellen.
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Das
vorliegende Verfahren wurde geschaffen, um die vorstehend erwähnte Aufgabe
durch die Bereitstellung eines Oligonucleotids zu erreichen, das
an eine Region der genomsichen RNA von HIV-1 binden kann, die keine
RNA-Sekundärstruktur
hat.
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Somit
kann das Oligonucleotid als Primer bei relativ niedrigen und konstanten
Temperaturen (bei 35°C bis
50°C, bevorzugt
bei 41°C)
für die
Amplifikation einer Nucleinsäure
verwendet werden.
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Die
Erfindung, die in den Patentansprüchen der vorliegenden Anmeldung
definiert ist, stellt spezifisch ein Verfahren zum Amplifizieren
von RNA von HIV-1 bereit, das in einer Probe als Matrize vermutet
wird, umfassend die Schritte
- (a) das Synthetisieren
einer cDNA durch die Wirkung einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung eines ersten
Primers, der eine zu einer spezifischen Sequenz der RNA komplementäre Sequenz enthält;
- (b) das Freilegen der cDNA zu einer einzelsträngigen DNA
durch Abbau der RNA in dem entstehenden RNA-DNA-Doppelstrang durch
Ribonuclease H-Aktivität;
- (c) das Erzeugen einer doppelsträngigen DNA mit einer Promotorsequenz,
die in eine RNA transkribiert werden kann, die aus der spezifischen
Sequenz oder einer zu der spezifischen Sequenz komplementären Sequenz
besteht, unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als Matrize und
durch die Wirkung einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase;
- (d) das Transkribieren eines Strangs der doppelsträngigen DNA
in ein RNA-Transkript
unter Verwendung einer RNA-Polymerase; und
- (e) das Synthetisieren einer cDNA des RNA-Transkripts von Schritt
(c) durch die RNA-abhängige
DNA-Polymerase in Anwesenheit der RNA-Polymerase,
wobei
entweder der erste oder der zweite Primer zusätzlich eine Promotorsequenz
für die
RNA-Polymerase am 5'-Ende
enthält
und wobei der erste Primer ein Oligonucleotid ist, das die Sequenz
von SEQ ID NO: 2 umfasst, und der zweite Primer ein Oligonucleotid
ist, das die Sequenz von SEQ ID NO: 13 umfasst.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst bevorzugt weiterhin das Zugeben eines dritten Oligonucleotids,
das komplementär
zu einer Region der RNA von HIV-1 ist, die das 5'-Ende der spezifischen Sequenz mit einer Überlappung
von einer bis 10 Base(n) mit der spezifischen Sequenz flankiert,
um durch Schneiden der von HIV-1 stammenden RNA am 5'-Ende der spezifischen
Sequenz durch die Wirkung der Ribonuclease H-Aktivität eine Matrize
zu erzeugen, die in der Anfangsphase der Amplifikation verwendet
wird, wobei der erste Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 2
ist, der zweite Primer ein Olignucleotid von SEQ ID NO: 13 ist und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 26 ist.
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Weiterhin
wird zu dem vorstehend Genannten hier ebenfalls offenbart, dass
der erste Primer ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID NO: 1 bis
7 ist und
- (1) der zweite Primer ein Oligonucleotid
von SEQ ID NO: 8 und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von
einer der SEQ ID NO: 21 und 2 ist,
- (2) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 9 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 26 ist,
- (3) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 10 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 28 ist,
- (4) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 11 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 29 ist,
- (5) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 12 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 29 ist,
- (6) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 13 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 23 bis 30 ist,
- (7) der zweite Primer ein Oligonucleotid von der SEQ ID NO:
14 und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der
SEQ ID NO: 23 bis 30 ist,
- (8) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 15 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 24 bis 30 ist,
- (9) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 16 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 25 bis 30 ist,
- (10) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 17
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 27 bis 30 ist,
- (11) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 18
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 31 und 32 ist,
- (12) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 19
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 32 und 33 ist, oder
- (13) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 20
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von SEQ ID NO:
33 ist.
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Weiterhin
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von HIV-1 bereit,
das das Durchführen
des vorstehend genannten Verfahren der Amplifikation von HIV-1-RNA
in Anwesenheit einer Oligonucleotidsonde mit einer Sequenz, die
unterschiedlich ist zu der des ersten Primers und des zweiten Primers
und die spezifisch an das RNA-Transkript binden kann, das aus der
Amplifikation entsteht, und die mit einem fluoreszierenden, interkalierenden
Farbstoff markiert ist, und das Messen der Änderung in der Fluoreszenz
der Reaktionslösung umfasst,
wobei die Oligonucleotidsonde konzipiert ist, um mit zumindest einem
Teil des RNA-Transkripts zu hybridisieren und seine Fluorenszenz
nach Hybridisierung zu ändern,
und eine Sequenz umfasst, bestehend aus oder komplementär zu zumindest
10 aufeinander folgenden Nucleotiden in SEQ ID NO: 34.
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Weiterhin
stellt die Erfindung die Verwendung eines Oligonucleotids von SEQ
ID NO: 2 und 13 für
die Amplifikation von HIV-1-RNA bereit. Weiterhin wird hier die
Verwendung eines Oligonucleotids von einer der SEQ ID NO: 1 bis
35 für
die Amplifikation oder den Nachweis von HIV-1-RNA offenbart.
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Ebenfalls
wird durch die Erfindung die Verwendung eines Oligonucleotids von
SEQ ID NO: 2, 13 und 34 für
den Nachweis von HIV-1 in einer Probe bereitgestellt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung einen Kit bereit, der zumindest ein Oligonucleotid
von einer der SEQ ID NO: 2, 13 und 34 in einem oder mehreren Behälter(n)
umfasst. Bevorzugt wird der Kit für eines der vorstehend genannten
Verfahren und/oder eine der vorstehend genannten Verwendungen angewandt
und kann daher zusätzlich
weitere geeignete Zutaten wie die benötigten Enzyme, Puffer und ähnliches
sowie ein entsprechendes Handbuch umfassen, das das Verfahren oder
die Verwendung dem Benutzer des Kits beschreibt.
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Die
Figuren zeigen:
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1 ist
die chemische Formel der fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffeinheit
des mit dem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff markierten
Oligonucleotids, das in Beispiel 2 verwendet wird. B1 bis
B3 sind die Nucleinsäurebasen.
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2 ist
eine Graphik, die die Reaktionszeit und die Zunahme der Fluoreszenz,
die die RNA-Synthese begleitet, bei Anfangsmengen an RNA von 105 Kopien/30 μl bis 10 Kopien/30 μl in Beispiel
1 in Beziehung setzt. „Nega" steht für eine Probe,
die durch die Verwendung eines Verdünnungsmittels anstelle einer DNA-Probe
hergestellt wurde.
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3 ist
eine Kalibrierungskurve, die durch Auftragen der Nachweiszeit, die
als Zeit bei einem Verhältnis
der Fluoreszenzintensität
von 1.2 definiert ist, als Ordinate und der anfänglichen RNA-Konzentration als
Abszisse erhalten wird.
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4 ist
eine Graphik, die die Reaktionszeit und die Zunahme der Fluoreszenz
beim Nachweis von HIV-RNA in Nucleinsäure, die von HIV-positivem
Serum extrahiert wurde, in Beispiel 2 in Beziehung setzt.
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Die
vorliegenden Erfindung stellt ein Nucleinsäureamplifikationsverfahren
zur Amplifizierung von HIV-RNA in einer Probe und ein Verfahren
zum Nachweis des RNA-Transkripts bereit, das durch das Verfahren
zur Nucleinsäureamplifikation
hergestellt wird. Das Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung kann
jegliche Amplifikationsverfahren wie PCR, NASBA oder 3SR abdecken.
Jedoch ist die isothermische Nucleinsäureamplifikation durch die
gemeinsame Wirkung einer reversen Transkriptase und einer RNA-Polymerase
wie zum Beispiel in NASBA oder 3SR für die Amplifizierung einer
spezifischen RNA-Sequenz in HIV-1 bevorzugt.
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Zum
Beispiel umfasst die NASBA-Amplifizierung von HIV-1-RNA, die in
einer Probe vorhanden ist, das Synthetisieren einer cDNA durch die
Wirkung einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase
unter Verwendung einer spezifischen Sequenz in der HIV-1-RNA als
Matrize. Anschließend
wird die cDNA durch die Wirkung von Ribonuclease H zu einer einzelsträngigen DNA
durch den Abbau der RNA in dem RNA-DNA-Doppelstrang der cDNA freigelegt.
Die NASBA-Amplifizierung umfasst weiterhin die Bildung einer doppelsträngigen DNA,
umfassend eine Promotorsequenz, die in eine RNA transkribiert werden
kann, die aus der spezifischen Nucleotidsequenz von HIV-1 oder einer
Sequenz besteht, die zu der spezifischen Nucleotidsequenz komplementär ist. Die
Bildung der doppelsträngigen
DNA erfolgt durch die Verwendung der einzelsträngigen DNA als Matrize und
durch die Wirkung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase.
Das Transkribieren der doppelsträngigen DNA
in ein RNA-Transkript erzeugt weiterhin Matrizen zur nachfolgenden
cDNA-Synthese durch die RNA-abhängige
DNA-Polymerase. Die vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch
die Verwendung eines Oligonucleotidprimers, umfassend eine Sequenz
von einer der SEQ ID NO: 1 bis 7 als ersten Primer, der an eine spezifische
Stelle der HIV-1-RNA binden kann, und ein Oligonucleotid, umfassend
eine Sequenz von einer der SEQ ID NO: 8 bis 20 als zweiten Primer,
der zu dem zu amplifizierenden Teil der HIV-1-RNA komplementär ist. Weiterhin
besitzt einer der Primer am 5'-Ende
eine Promotorsequenz für
die RNA-Polymerase.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das vorstehend genannte Amplifikationsverfahren,
wobei der erste Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 2 ist und
der zweite Primer eine Oligonucleotid von SEQ ID NO: 13 ist, wobei
entweder der erste oder der zweite Primer zusätzlich eine Promotorsequenz
für die
RNA-Polymerase am 5'-Ende
enthält.
Die RNA-abhängige
DNA-Polymerase, die DNA-abhängige DNA-Polymerase
und die Ribonuclease H sind nicht speziell eingeschränkt, jedoch
wird die reverse AMV-Transkriptase bevorzugt, da sie die Aktivitäten von
allen besitzt. Als RNA-Polymerase wird die RNA-Polymerase des T7-Phagen
oder die RNA-Polymerase
des SP6-Phagen bevorzugt, obwohl es keine spezielle Einschränkung gibt.
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Bei
dem vorstehend genannten Amplifikationsverfahren kann die HIV-1-RNA
amplifiziert werden, auch wenn die spezifische Sequenz nicht am
5'-Ende vorhanden
ist. Vor der Verwendung der HIV-1-RNA als Matrize im Anfangsstadium
der Nucleinsäureamplifikation
wird das 5'-Ende
abgespalten. Dies wird durch Zugabe eines Oligonucleotids erreicht,
das zu einer Region der HIV-1-RNA komplementär ist, die das 5'-Ende der spezifischen
Sequenz flankiert und mit 1 bis 10 Basen mit der spezifischen Sequenz überlappt.
Das Schneiden erfolgt durch die Ribonuclease H-Aktivität.
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Ein
Oligonucleotid, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 26, kann als
Vermittler der Spaltung verwendet werden. Das die Spaltung vermittelnde
Oligonucleotid besitzt bevorzugt eine chemisch modifizierte Hydroxylgruppe
(zum Beispiel eine aminierte Hydroxylgruppe) am 3'-Ende, die nicht
von dem 3'-Ende
verlängert werden
kann.
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Andere
die Spaltung vermittelnden Oligonucleotide sind diejenigen, die
in SEQ ID NO: 21 bis 25 und 27 bis 33 gezeigt sind.
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Das
dritte Oligonucleotid ist zu einer Region komplementär, die das
5'-Ende der spezifischen HIV-1-Sequenz
flankiert und mit dieser Region mit 1 bis 10 Basen überlappt.
Dieses Oligonucleotid wird zugegeben, um die Spaltung der HIV-1-RNA
am 5'-Ende durch
die Wirkung einer Ribonuclease H-Aktivität zu vermitteln. Wenn dieses
Oligonucleotid im Anfangsstadium der Nucleinsäureamplifikation zugegeben
wird, bevorzugt bevor die RNA als Matrize verwendet wird, ist es
bevorzugt, dass der erste Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO:
2 und der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 13 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 26 ist.
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Zusätzlich zu
dem vorstehend Genannten wird hierin ebenfalls offenbart, dass der
erste Primer ein Oligonucleotid von einer von SEQ ID NO: 1 bis 7
ist,
- (1) der zweite Primer ein Oligonucleotid
von SEQ ID NO: 8 und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von
einer der SEQ ID NO: 21 und 22 ist,
- (2) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 9 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 26 ist,
- (3) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 10 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 28 ist,
- (4) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 11 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 29 ist,
- (5) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 12 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 22 bis 29 ist,
- (6) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 13 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 23 bis 30 ist,
- (7) der zweite Primer ein Oligonucleotid von der SEQ ID NO:
14 und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der
SEQ ID NO: 23 bis 30 ist,
- (8) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 15 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 24 bis 30 ist,
- (9) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 16 und
das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ ID
NO: 25 bis 30 ist,
- (10) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 17
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 27 bis 31 ist,
- (11) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 18
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 31 und 32 ist,
- (12) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 19
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von einer der SEQ
ID NO: 32 und 33 ist, oder
- (13) der zweite Primer ein Oligonucleotid von SEQ ID NO: 20
und das dritte Oligonucleotid ein Oligonucleotid von SEQ ID NO:
33 ist.
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In
diesem Fall besitzt das dritte Oligonucleotid (das die Spaltung
vermittelnde Oligonucleotid) bevorzugt eine chemisch modifizierte
Hydroxylgruppe (zum Beispiel eine aminierte Hydroxylgruppe) am 3'-Ende, die ebenfalls
nicht von dem 3'-Ende
verlängert
werden kann.
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Der
Nachweis des in dem Nucleinsäureamplifikationsschritt
erhaltenen Amplifikationsprodukts erfolgt bevorzugt durch Messen
der Veränderung
der Fluoreszenz der Reaktionslösung
während
des Amplifikationsschritts. Bevorzugt wird dies durch die Durchführung der
Amplifikationsreaktion in Anwesenheit einer mit einem fluoreszierenden,
interkalierenden Farbstoff markierten Oligonucleotidsonde erreicht.
Jedoch kann die Sonde auch mit anderen Verfahren zum Nachweis von
Nucleinsäuren
nachgewiesen werden. Die Oligonucleotidsonde kann zum Beispiel ein
Oligonucleotid sein, das einen fluoreszierenden, interkalierenden
Farbstoff ergibt, der an ein Phosphoratom über einen Linker gebunden ist.
Solch eine bevorzugte Sonde verändert
ihre Fluoreszenz bei der Bildung eines Doppelstrangs mit der komplementären Zielnucleinsäure durch
Interkalierung der interkalierenden Einheit in den Doppelstrang
(Ishiguro, T. et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24 (24) 4992-4997).
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Die
Sequenz der Sonde ist nicht speziell eingeschränkt, so lang sie eine Sequenz
enthält,
die zu mindestens einem Teil des RNA-Transkripts komplementär ist. Wenn
zum Beispiel die Kombination eines ersten Primers, der eine Sequenz
von SEQ ID NO: 2 umfasst, und eines zweiten Primers, der eine Sequenz
von SEQ ID NO: 13 umfasst, in dem RNA-Amplifikationsschritt verwendet
wird, umfasst die Oligonucleotidsonde bevorzugt eine Sequenz, die
aus mindestens 10 aufeinander folgenden Basen in SEQ ID NO: 34 besteht
oder zu diesen komplementär
ist.
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Weiterhin
sind die anderen, hierin offenbarten Beispiele eine Kombination
aus einem ersten Primer von einer von SEQ ID NO: 1 bis 7 und einem
zweiten Primer von einer von SEQ ID NO: 8 bis 20 und einer Oligonucleotidsonde,
die eine Sequenz umfasst, die aus mindestens 10 aufeinander folgenden
Basen in SEQ ID NO: 34 besteht oder zu diesen komplementär ist.
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In
diesem Fall ist es ebenso bevorzugt, dass die Hydroxylgruppe am
3'-Ende der Sonde
(zum Beispiel durch Zugabe von Glycolsäure) chemisch modifiziert wird,
um eine Verlängerungsreaktion
ausgehend von dieser Sonde zu starten.
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Durch
die Durchführung
des Amplifikationsverfahrens in Anwesenheit der vorstehend genannten
Sonde, kann die Amplifikation und der Nachweis von HIV-1-RNA bei einer konstanten
Temperatur in einem Röhrchen
in einem Schritt ausgeführt
werden und kann leicht automatisiert werden.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter durch Bezugnahme
auf die Beispiele beschrieben. Jedoch wird die vorliegende Erfindung
unter keinen Umständen
auf diese spezifischen Beispiele eingeschränkt. Die Beispiele veranschaulichen
die Erfindung:
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BEISPIEL 1
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Die
von verschiedenen Zahlen von anfänglichen
Kopien stammende Ziel-HIV-RNA
wurde unter Verwendung der Kombinationen von Oligonucleotiden in
der vorliegenden Erfindung nachgewiesen.
- (1)
Eine 1628nt-RNA-Sequenz von HIV-1, die das strukturelle Gen des
Kernproteins (gag) enthält,
wurde als Standard-RNA verwendet. Die Standard-RNA wurde von der
HIV-1-RNA mit ACCRUNTM 315 (Produktname),
positive HIV-1-RNA-Kontrolie,
Serie 400 (BBI (Boston Biomedia, Inc.) durch herkömmliche
Extraktion erhalten. Die Synthese und nachfolgende Reinigung einer
doppelsträngigen
DNA, die die Sequenz der gag-Region enthält, wurde mittels RT-PCR und
in-vitro-Transkription unter Verwendung der DNA als Matrize durchgeführt.
- (2) Die Standard-RNA wurde mit einem RNA-Verdünnungsmittel
(10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 E/μl RNase-Inhibitor
(Takara Shuzo Co., Ltd.)) bis 105 Kopien/5 μl, 104 Kopien/5 μl, 103 Kopien/5 μl, 102 Kopien/5 μl und 10 Kopien/5 μl verdünnt und
durch UV-Absorption bei 260 nm quantifiziert. Das Verdünnungsmittel
allein wurde als Kontrollprobe (Nega) verwendet.
- (3) 20,8 μl-Portionen
einer Reaktionslösung
der folgenden Zusammensetzung wurden in 0,5 ml-PCR-Röhrchen verteilt
(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer), und 5 μl der RNA-Probe
wurden bei den vorstehend genannten Konzentrationen zugegeben.
Die
Zusammensetzung der Reaktionslösung
(in Bezug auf die Konzentrationen des Endvolumens von 30 μl)
60
mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,6)
13 mM Magnesiumchlorid
115
mM Kaliumchlorid
39 E RNase-Inhibitor
1 mM DTT
jeweils
0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
3,6 mM ITP
jeweils 3,0
mM ATP, CTP, GTP und UTP
1,0 μM erster Primer (SEQ ID NO:
1)
1,0 μM
zweiter Primer (SEQ ID NO: 15) (der zusätzlich die Nucleotidsequenz
von SEQ ID NO: 35 enthält, die
die T7-Promotor-Sequenz am 5'-Ende
einschließt
(SEQ ID NO: 35 umfasst die T7-Promotorsequenz von „A" an Position 1 vom
5'-Ende bis „A" an Position 22 und
die nachfolgende Enhancersequenz von „G" an Position 23 bis „A" and Position 28).
0,16 μM drittes
Olignucleotid (SEQ ID NO: 27)
25 nM Oligonucleotid (SEQ ID
NO: 34), markiert mit einem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff (1)
(das den fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff zwischen „T" an Position 14 vom
5'-Ende und „T" an Position 15 besitzt
und eine Hydroxylgruppe, die mit Glycolsäure modifiziert wurde, am 3'-Ende besitzt)
13 % DMSO und
destilliertes
Wasser zur Anpassung des Volumens
- (4) Die Reaktionslösungen
wurden bei 41°C
5 Minuten lang inkubiert und 4,2 μl
einer Enzymlösung
der folgenden Zusammensetzung, die bei 41°C 2 Minuten lang vorinkubiert
wurde, wurden zugegeben. Die Zusammensetzung der Enzymlösung (in
Bezug auf die Konzentration im Endvolumen von 30 μl) lautete
wie folgt:
1,7 % Sorbit
3 μg Rinderserumalbumin
142
E T7-RNA-Polymerase (GIBCO)
8 E reverse AMV-Transkriptase (Takara
Shuzo Co., Ltd.) und
destilliertes Wasser zur Anpassung des
Volumens
- (5) Die Intensität
der Fluoreszenz der Reaktionslösungen
in den PCR-Röhrchen
wurde direkt bei 41°C
in einem thermostatischen Fluoreszenzspektrometer bei einer Anregungswellenlänge von
470 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm aufgezeichnet.
Der zeitliche Verlauf des Verhältnisses
der Fluoreszenzintensität
der Proben (Fluoreszenzintensität
zu einem bestimmten Zeitpunkt/Hintergrund-Fluoreszenzintensität) ab Zugabe
der Enzymlösung
bei 0 Minuten ist in 2 gezeigt. Die anfänglichen
Mengen an RNA lagen im Bereich von 10 Kopien/30 μl bis 105 Kopien/30 μl.
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Wie
in 2 gezeigt, war das Fluoreszenzprofil abhängig von
der anfänglichen
Konzentration an Standard-RNA, und es war möglich, 10 Kopien innerhalb
von etwa 10 Minuten nachzuweisen. Wenn die Nachweiszeit, die als
die Zeit bei einem Verhältnis
der Fluoreszenzintensität
von 1,2 definiert wird, als Ordinate aufgetragen wurde und die anfängliche
RNA-Konzentration als Abszisse aufgetragen wurde, konnte eine lineare Beziehung
zwischen beiden gefunden werden (3). Dieses
Ergebnis zeigt, dass es möglich
ist, HIV-1-RNA in einer unbekannten Probe unter Verwendung von 3 als
Kalibrierungskurve zu quantifizieren. Somit ist bewiesen, dass die
vorliegende Erfindung einen schnellen und empfindlichen quantitativen
Nachweis von HIV-1-RNA erlaubt.
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BEISPIEL 2
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HIV-1-RNA
in der Nucleinsäure,
die von HIV-positivem Serum extrahiert wurde, wurde unter Verwendung
von Kombinationen von Oligonucleotiden, die in Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, nachgewiesen.
- (1) Als HIV-positives Serum wurde ACCRUNTM 315 (Produktname), positive HIV-1-RNA-Kontrolle, Serie 400
(BBI Boston Biomedica, Inc.) verwendet. HIV-1-RNA wurde von 30 μl des positiven
Serums durch herkömmliche
Extraktion erhalten und mit einem RNA-Verdünnungsmittel (10 mM Tris-HCl
(pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 E/μl RNase-Inhibitor (Takara Shuzo
Co., Ltd.)) zu einer geschätzten
RNA-Menge von 103 Kopien/5 ml verdünnt. Es
wurde die gleiche Standard-RNA wie in Beispiel 1 bei einer Konzentration
von 103 Kopien/5 μl verwendet.
- (2) Ein 20,8 μl-Anteil
der Reaktionslösung
mit der folgenden Zusammensetzung wurde in ein 0,5 ml-PCR-Röhrchen gegeben
(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer), und 5 μl der RNA-Probe
wurde bei der vorstehend genannten Konzentration zugegeben.
Die
Zusammensetzung der Reaktionslösung
(in Bezug auf die Konzentrationen in dem Endvolumen von 30 μl) lautete
wie folgt:
60 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,6)
13 mM Magnesium-Chlorid
115
mM Kalium-Chlorid
39 E RNase-Inhibitor
1 mM DTT
je
0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
3,6 mM ITP
je 3,0 mM
ATP, CTP, GTP und UTP
1,0 μM
Erster Primer (SEQ ID NO: 2)
1,0 μM Zweiter Primer (SEQ ID NO:
13)
(zusätzlich
enthaltend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 35, einschließlich der
T7-Promotorsequenz am 5'-Ende
(SEQ ID NO: 35 umfasst die T7-Promotorsequenz
von „A" an Position 1 vom
5'-Ende bis „A" an Position 22 und
die nachfolgende Enhancersequenz von „G" an Position 23 bis „A" an Position 28))
0,16 μM Drittes
Oligonucleotid (SEQ ID NO: 26)
25 nM Oligonucleotid (SEQ ID
NO: 34), markiert mit einem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff (11) (mit dem fluoreszierenden, interkalierenden
Farbstoff zwischen „T" an Position 14 vom
5'-Ende und „T" an Position 15 und
mit einer Hydroxylgruppe, die mit Glycolsäure modifiziert wurde, am 3'-Ende).
13 %
DMSO und
destilliertes Wasser zur Anpassung des Volumens
- (3) Die Reaktionslösung
wurde bei 41°C
5 Minuten lang inkubiert und 4,2 μl
einer Enzymlösung
mit der folgenden Zusammensetzung, die bei 41°C 2 Minuten lang vorinkubiert
wurde, wurden zugegeben.
Die Zusammensetzung der Enzymlösung (in
Bezug auf die Konzentrationen in dem Endvolumen von 30 μl) lautete
wie folgt:
1,7 % Sorbit
3 μg Rinderserumalbumin
142
E T7-RNA-Polymerase (Gibco)
8 E reverse AMV-Transkriptase (Takara
Shuzo Co., Ltd.) und destilliertes Wasser zur Anpassung des Volumens
- (4) Die Fluoreszenzintensität
der Reaktionslösung
in dem PCR-Röhrchen
wurde direkt bei 41°C
in einem thermostatischen Fluoreszenzspektrometer bei einer Anregungswellenlänge von
470 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm aufgezeichnet.
Der zeitliche Verlauf des Verhältnisses
der Fluoreszenzintensität
der Probe (Fluoreszenzintensität
zu einem bestimmten Zeitpunkt/Hintergrund-Fluoreszenzintensität) ab Zugabe der Enzymlösung bei
0 Minuten ist in 4 gezeigt.
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4 zeigt,
dass es möglich
war, die RNA (bei einer geschätzten
Konzentration von 103 Kopien/30 μl), die von
dem HIV-positiven Serum extrahiert wurde, zum gleichen Nachweiszeitpunkt
wie die Standard-RNA (RNA-Konzentration: 103 Kopien/30 μl) der Kontrolle
nachzuweisen.
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Somit
ist bewiesen, dass die vorliegende Erfindung den schnellen und empfindlichen
Nachweis von HIV-1-RNA, die von HIV-positivem Serum extrahiert wurde,
erlaubt.
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Wie
vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches,
schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis von HIV-RNA durch
die Bereitstellung eines Oligonucleotids bereit. Dieses Oligonucleotid
kann an eine Region der genomischen RNA von HIV-1 binden, die keine
Sekundärstruktur
besitzt. Somit wird die Bindung bei relativ niedrigen und konstanten
Temperaturen (bei 35°C
bis 50°C,
bevorzugt 41°C) und
die Verwendung des Oligonucleotidprimers für die Amplifikation einer Nucleinsäure ermöglicht.
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Die
gesamte Offenbarung der
japanischen
Patentanmeldung Nr. 2001-129210 , eingereicht am 26. April
2001, einschließlich
der Beschreibung, der Patentansprüche, der Zeichnungen und der
Zusammenfassung, sind hierin in Gänze durch Bezugnahme eingeschlossen.
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