CN112041341A - Ccl14的抗体和检测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了CCL14抗体。

Description

CCL14的抗体和检测

本申请要求于2017年12月28日提交的美国临时申请No.62/611,510的优先权，享有其权益，并且通过引用将其全部内容合并于此，包括所有表格、附图和权利要求。

背景

以下对本发明背景的讨论仅是为了帮助读者理解本发明，不被允许描述或构成本发明的现有技术。

C-C基序趋化因子14(CCL14；SWISS-PROT条目Q16627，也称为HCC-1、NCC-2和SCYA14)是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。它也被称为HCC-1。它是作为93个残基的蛋白质前体产生的，该前体被加工以生成包含74个氨基酸(残基20-93)的成熟活性蛋白，其在氨基酸组成上与CCL3和CCL4有46％相同。这种趋化因子在各种组织中表达，包括脾脏、骨髓、肝脏、肌肉和肠道。CCL14激活单核细胞，但不诱导其趋化性。人CCL14位于第17号染色体上，属于CC家族的其他趋化因子的簇中。

概述

本发明的一个目的是提供结合CCL14的抗体。这样的抗体可用于具有改善的临床性能的免疫测定中，尤其是当用于评估肾损伤时，以及在需要CCL14结合的治疗方法中。

在第一方面，本发明涉及与人CCL14结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

(i)重链可变区，其包含：

来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列；

和

(ii)轻链可变区，其包含：

来自SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含以下重链CDR/轻链CDR对之一：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，或

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)。

在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包括：

(i)选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的重链可变区，或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区；

和

(ii)选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的轻链可变区，或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区。

在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含以下重链/轻链对之一：

SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)；

SEQ ID NO：3的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：4的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(3H1/3K1)；

SEQ ID NO：5的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：6的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(4H1/4K3)，

SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)，

SEQ ID NO：9的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：10的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(12H2/12K1)，

SEQ ID NO：11的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：12的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(17H2/17K1)，

SEQ ID NO：13的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：14的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(18H1/18K1)，

SEQ ID NO：15的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：16的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(19H2/19K3)，

SEQ ID NO：17的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：18的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(25H2/25K1)，或

SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

在本发明的描述中，至少90％序列相似性应理解为包括至少95％，更优选至少99％序列相似性。在这种情况下，“序列相似性”是基于同一性的程度与保守变化的程度的组合。“序列相似性”百分比是相同或保守改变的氨基酸或核苷酸的百分比，即“序列相似性”＝序列同一性百分比+保守变化百分比。因此，出于本发明的目的，“保守改变”和“同一性”被认为是广义的“相似性”的种类。因此，每当使用术语序列“相似性”时，它都包含序列“同一性”和“保守变化”。根据某些实施方案，保守变化不考虑在内，序列相似性百分比是指序列同一性百分比。在某些实施方案中，提到的序列同一性百分比所允许的序列内的变化都是或几乎都是保守性变化。也就是说，当一个序列90％相同时，其余10％都是或几乎都是保守变化。在本文中，术语“几乎都是”是指至少75％的允许序列改变是保守改变，更优选至少85％，还更优选至少90％，最优选至少95％。

用于所要求保护的方法的抗体可以从多种物种获得。例如，本发明的抗体可以包含免疫球蛋白序列，其是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物的序列，或这些序列的组合(所谓的嵌合抗体)。这样的抗体也可以是单克隆或多克隆的。可通过其在免疫测定中的性能来鉴定用于本发明的抗体，然后进一步通过表位作图来表征，以了解与该性能相关的表位。优选的是兔抗体或衍生自兔抗体的人源化形式。

这样的抗体可以与信号产生元件缀合或固定在固体支持物上。另外，此类抗体可以多种竞争性和夹心测定形式使用。在夹心测定的一个例子中，第一抗体(可检测地标记)和第二抗体(固定在测试装置的预定区域)与样品中的CCL14在测试装置的预定区域形成夹心复合物。在夹心测定中，第一抗体和第二抗体可以相同(特别是在使用多克隆抗体时)或不同。因此，本发明的抗体可以以夹心对的形式使用，或者可以与不是单克隆抗体的另一结合实体例如多克隆抗体或适体单独使用。

本发明的抗体可以在用于检测生物样品中的CCL14的测试试剂盒中用作试剂。这样的测试试剂盒可以例如包含一次性测试装置，所述测试装置被配置为产生与生物样品中人CCL14的存在或量相关的可检测信号。或者，可以配制这样的测试试剂盒以在不利用一次性测试装置的临床分析仪中进行测定。优选地，所述测试试剂盒是体外诊断剂。如本文所用，术语“体外诊断”是指医疗器械，其是试剂、试剂产品、校准品、对照材料、试剂盒、仪器、装置、设备或系统，无论是单独使用还是组合使用，制造商意图用于体外检查来自人体的标本(包括血液和组织捐赠)，专门提供或注意用于提供有关生理或病理状态或有关先天性异常的信息或确定安全性与潜在接受者的相容性，或监测治疗措施。

在某些实施方案中，所述免疫测定以侧向流形式进行。侧向流测试是免疫测定的一种形式，其中测试样品以色谱的方式沿吸水或非吸水的多孔固体基质流动。侧向流测试可以作为竞争性或夹心形式的测定进行操作。优选的侧向流装置是一次性的单应用测试装置。样品在施加区域被施加到测试设备，并穿过基板，在该处遇到已经用抗体或抗原预处理的线条或区域。如本文所用，术语“测试区”是指侧向流测试条上的离散位置，其被询问以便产生与所关注的分析物的存在或量有关的信号。可检测信号可以目视读取，或者通过将一次性测试设备插入分析仪器(例如反射计，荧光计或透射光度计)中获得。该列表并非限制性的。样品可以不经过预处理而直接施加到施加区域，或者可以在施加之前与一种或多种测定试剂预混合。在后一种情况下，可以将抗体与一次性测试装置放在单独的容器中。

本发明的抗体可以扩散地固定在一次性测试装置内的表面上，使得当样品接触表面时该抗体溶解到样品中。在夹心测定法形式中，该扩散结合的抗体可以与样品中的同源抗原结合，然后当抗原被在检测区域非扩散结合的第二抗体结合时，将其固定在检测区域。在竞争形式中，样品中的其同源抗原可以与作为分析试剂提供的标记抗原竞争与所述非扩散结合的抗体的结合。

本发明的试剂盒可以进一步包括将可检测信号与CCL14浓度相关联的校准。举例来说，可以在电子存储设备上提供校准曲线，该电子存储设备由接收一次性测试设备的分析仪器读取，例如ROM芯片，闪存驱动器，RFID标签等。或者，可以在诸如二维条形码之类的光学读取的或通过网络连接传输的编码标签上提供校准曲线。然后，分析仪器可以使用该校准曲线将来自测定的可检测信号与CCL14浓度相关联。

在某些实施方案中，使用本发明的一种或多种抗体进行的测定方法提供了与生物样品中人CCL14的存在或含量有关的信号，其中所述测定方法中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低，更优选1ng/mL或更低，最优选0.1ng/mL或更低。

在相关方面，本发明提供了确定生物样品中人CCL14的存在或含量的方法，包括：

用与人CCL14一起形成夹心复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定提供了与结合在夹心复合物中的生物样品内人CCL14的存在或数量有关的可检测信号；和

将可检测信号与生物样品中的人CCL14的存在或含量相关联。优选地，免疫测定中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低，更优选为1ng/mL或更低，并且最优选为0.1ng/mL或更低。

在特别优选的实施方案中，所述免疫测定法是夹心免疫测定法，其中第一抗体和第二抗体中的每一个都是本发明的抗体(可以是抗原结合片段)。举例来说，夹心对中的第一抗体包含以下重链CDR/轻链CDR对中的一组，并且夹心对中的第二抗体包含以下重链CDR/轻链CDR对中的另一组：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，或

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)。

在某些实施方案中，夹心对中的第一抗体包含以下重链CDR/轻链CDR对中的一组，并且夹心对中的第二抗体包含以下重链/轻链对中的另一组：

SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)，

SEQ ID NO：3的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：4的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(3H1/3K1)，

SEQ ID NO：5的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：6的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(4H1/4K3)，

SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)，

SEQ ID NO：9的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：10的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(12H2/12K1)，

SEQ ID NO：11的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：12的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(17H2/17K1)，

SEQ ID NO：13的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：14的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(18H1/18K1)，

SEQ ID NO：15的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：16的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(19H2/19K3)，

SEQ ID NO：17的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：18的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(25H2/25K1)，或

SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

优选的夹心对的实例包括2H3/2K1与31H1/31K1的配对；2H3/2K1与10H3/10K1的配对；和31H1/31K1与10H3/10K1的配对。该列表仅是示例性的。

在相关方面，本发明涉及与本发明的抗体的表位结合的抗体，或与本发明的抗体竞争与CCL14的结合的抗体。如本文所述，此类抗体可用于试剂盒，抗体对，方法和测定装置中。

在优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO:23),CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO:24),DKWVQDYIKDMK(SEQID NO:25),MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO:26),ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO:27),TNSQCSKPG(SEQ ID NO:28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO:29)的全部或部分的表位结合，并且最优选是兔单克隆抗体。

在某些实施方案中，本发明的抗体进一步包含特异性结合人CCL14的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其结合人CCL14上包含CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO:24),DKWVQDYIKDMK(SEQ ID NO:25),MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO:26),ECCFTYTTYKIPR(SEQ IDNO:27),TNSQCSKPG(SEQ ID NO:28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO:29)的全部或部分的表位，其中所述单克隆抗体和第二抗体与人CCL14形成夹心复合物。

优选的测定方法包括进行检测人CCL14的免疫测定。这样的免疫测定可以包括使所述体液样品与检测标记的抗体接触，并检测与该抗体的结合。尽管一般就免疫测定法描述了本发明，但在这种方法中，可以使用不基于免疫球蛋白支架的其他结合实体(例如适体)代替抗体。优选地，体液样品选自尿、唾液、血液、血清和血浆，最优选为尿。

在附图和以下描述中阐述了本公开的一个或多个实施方式的细节。根据说明书和附图以及根据权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1显示了本发明的2H3、3H1、4H1、10H3、12H2、17H2、18H1、19H2、25H2和31H1兔IgG重链的蛋白质序列的可变区比对。指示了其中的三个互补决定区(CDR)。

图2显示了2K1、3K1、4K3、10K1、12K1、17K1、18K1、19K3、25K1和31K1兔轻链的蛋白质序列的可变区比对。指示了其中的三个互补决定区(CDR)。

图3显示了使用2H3/2K1、31H1/31K1、18H1/18K1和10H3/10K1抗体的夹心测定的结果。

详细描述

定义

以下是本说明书中提及的序列的列表(表1)：

如本文所用，术语“C-C基序趋化因子14”和“CCL14”是指存在于生物样品中的衍生自CCL14前体(人前体：Swiss-Prot Q16627(SEQ ID NO：21))的一种或多种多肽。

在CCL14中鉴定到以下结构域:

除非本文另外特别指出，否则所用术语的定义是药物科学领域中使用的标准定义。如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“药物载体”包括两种或更多种这样的载体的混合物，等等。

如本文所用，术语“受试者”是指人类或非人类生物。因此，本文描述的方法和组合物适用于人类和兽类疾病。此外，尽管受试者优选是活的生物体，但是本文所述的发明也可以用于验尸分析中。优选的受试者是人类，并且最优选地是“患者”，如本文所用，其是指正在接受疾病或状况的医疗护理的活着的人。这包括没有明确疾病、正在接受病理检查的人。

优选地，在样品中测量分析物。这样的样品可以从受试者获得，或者可以从旨在提供给受试者的生物材料获得。例如，可以从正在评估是否可能移植到受试者体内的肾脏中获取样品，并使用分析物测量来评估肾脏是否存在已有的损伤。优选的样品是体液样品。

如本文所用，术语“体液样品”是指出于诊断、预后、分类或评估感兴趣受试者例如患者或移植供体的目的而获得的体液样品。在某些实施方案中，可以出于确定进行中病症的结果或治疗方案对病症的影响的目的而获得这种样品。优选的体液样品包括血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰和胸腔积液。另外，本领域的技术人员将认识到，在分级或纯化程序之后，例如将全血分离成血清或血浆成分之后，某些体液样品将更容易分析。

如本文所用，术语“诊断”是指技术人员可以通过其估计和/或确定患者是否患有给定疾病或状况的概率(“可能性”)的方法。在本发明的情况下，“诊断”包括使用本发明的肾损伤标记物的测定结果，最优选地是免疫测定结果，任选地连同其他临床特征一起来对从其获得样品并测定的受试者进行急性肾损伤或ARF的诊断(即发生或不发生)。“确定”了这样的诊断并不意味着暗示该诊断是100％准确的。许多生物标志物指示多种情况。熟练的临床医生不会在信息真空中使用生物标志物结果，而是将测试结果与其他临床指标一起使用以进行诊断。因此，相对于预定的诊断阈值另一侧的测量水平，在预定的诊断阈值一侧的测量的生物标志物水平指示受试者中疾病发生的可能性更大。

类似地，预后风险表示将发生给定过程或结果的概率(“可能性”)。预后指标的水平或水平的改变与发病率增加(例如，肾功能恶化，未来的ARF或死亡)相关，被称为“预示(患者中不良后果)的可能性增加”。

如本文所用，术语“侧向流”是指试剂在纵向方向上通过基本平坦的多孔材料的流动。如果材料的厚度不超过长度和宽度尺寸的10％，则这种多孔材料是“基本上平坦的”。

如本文相对于装置的第一区域所使用的术语“下游区域”是指在流体已经到达第一区域之后接收流体流的区域。

如本文所用，术语“样品施加区域”是指向其中引入感兴趣的流体样品以确定其组分的分析装置部分。

标志物分析

通常，免疫测定法包括使含有或怀疑含有目的生物标志物的样品与至少一种特异性结合该生物标志物的抗体接触。然后产生信号，该信号指示通过样品中的多肽与抗体的结合形成的复合物的存在或数量。然后将信号与样品中生物标志物的存在或数量相关联。用于检测和分析生物标志物的多种方法和装置是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792,以及TheImmunoassay Handbook,David Wild,编，Stockton Press,New York,1994，其全部内容通过引用并入本文包括所有表、图和权利要求。

本领域已知的测定装置和方法可以利用各种夹心、竞争或非竞争测定形式的被标记分子，以产生与感兴趣生物标志物的存在或量有关的信号。合适的测定形式还包括色谱法，质谱法和蛋白质“印迹”法。另外，某些方法和装置，例如生物传感器和光学免疫测定法，可以用于确定分析物的存在或数量，而无需被标记分子。参见例如美国专利5,631,171和5,955,377，其每一个均通过引用整体并入本文，包括所有表、图和权利要求。本领域技术人员还认识到，机器人仪器，包括但不限于Beckman

Abbott

Roche

Dade Behring

系统都属于能够进行免疫分析的免疫分析仪。但是可以使用任何合适的免疫测定，例如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定等。

可以将抗体或其他多肽固定在各种固体支持物上以用于测定。可以用于固定特异性结合成员的固相包括在固相结合测定中开发和/或用作固相的那些。合适固相的例子包括膜滤器、纤维素纸、珠(包括聚合物、胶乳和顺磁性颗粒)、玻璃、硅片、微粒、纳米颗粒、TentaGels、AgroGels、PEGA凝胶、SPOCC凝胶和多孔板。可以通过将抗体或多种抗体以阵列形式涂覆在固体支持物上来制备测定条。然后可以将该条带浸入测试样品中，然后通过清洗和检测步骤快速处理以生成可测量的信号，例如色斑。抗体或其他多肽可通过直接缀合至测定装置表面或通过间接结合而结合至测定装置的特定区域。在后一种情况的例子中，可以将抗体或其他多肽固定在颗粒或其他固体支持物上，并且将该固体支持物固定在装置表面上。

生物测定需要检测方法，最常见的结果定量方法之一是将可检测的标记缀合至对所研究的生物系统中的一种组分具有亲和力的蛋白质或核酸。可检测标记可包括本身可检测的分子(例如，荧光部分，电化学标记，金属螯合物等)，以及可通过产生可检测的反应产物(例如酶，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)间接检测的分子或通过本身可检测的特异性结合分子(例如生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡组氨酸、2,4-二硝基苯、苯砷酸根、ssDNA、dsDNA等)检测的分子。

固相和可检测标记结合物的制备通常包括使用化学交联剂。交联剂包含至少两个反应性基团，并且通常分为同功能性交联剂(包含相同的反应性基团)和异功能性交联剂(包含不同的反应性基团)。通过胺、巯基偶联或非特异性反应的同双功能交联剂可从许多商业来源获得。马来酰亚胺，烷基和芳基卤化物，α-卤代酰基和吡啶基二硫化物是硫醇反应性基团。马来酰亚胺，烷基和芳基卤化物以及α-卤代酰基与巯基反应形成硫醇醚键，而吡啶基二硫化物与巯基反应生成混合的二硫化物。吡啶基二硫化物产物是可裂解的。亚氨基酯对于蛋白质-蛋白质交联也是非常有用的。多种异双功能交联剂是商业上可获得的，其各自结合了不同的特征以成功进行缀合。

在某些方面，本发明提供了用于分析所述标志物的试剂盒。试剂盒包含用于分析至少一种测试样品的试剂，所述试剂包含至少一种特异性结合所述标志物的抗体。试剂盒还可包含用于执行本文所述的诊断和/或预后相关性中的一种或多种的装置和说明书。优选的试剂盒将包含用于对分析物进行夹心测定的抗体对或用于进行竞争性测定的标记物质。优选地，抗体对包括缀合至固相的第一抗体和缀合至可检测标记的第二抗体，其中所述第一抗体和第二抗体各自结合肾损伤标志物。最优选地，每种抗体是单克隆抗体。使用试剂盒和实现关联性的说明书可以是标签形式，指的是在试剂盒的制造，运输，销售或使用过程中随时附上或附带着试剂盒的任何书面或记录材料。例如，标签一词包括广告传单和小册子、包装材料、说明书、录音带或录像带，计算机光盘以及直接印在试剂盒上的文字。

在某些实施方案中，使用一次性使用的一次性测试装置进行标志物测定。这样的测试装置通常采取侧向流装置的形式，现在通过非处方妊娠测试的普遍使用已经很熟悉这种形式。通常，这些测定装置具有延伸的基础层，可以在其上在样品添加区域和评估区域之间进行区分。在典型的使用中，样品被施加到样品添加区域，沿着平行于基层的液体传输路径流动，然后流入评估区域。捕获试剂存在于评估区域中，可以通过多种检测与捕获的分析物相关的可见部分来检测被捕获的分析物。例如，当指示生物样品中分析物的存在或不存在时，该测定可以产生视觉信号，例如颜色变化、荧光、发光等。

样品添加区域例如可以以设置在壳体中的开放腔室形式、以吸收剂垫的形式提供。样品添加区域可以是各种构造的端口，即圆形、长方形、正方形等，或者该区域可以是装置中的槽。

可以将过滤器元件放置在样本添加区域中、之上或附近，以过滤样本中的颗粒，例如从血液中去除或阻滞血细胞，从而使血浆可以进一步穿过该装置。然后滤液可以移动到与过滤器流体连接的多孔部件中。用于去除或延迟血液中存在的细胞物质的合适的过滤器是本领域众所周知的。参见例如美国专利4,477,575、5,166,051、6,391,265和7,125,493，其中每一个通过引用整体并入本文。许多合适的材料是技术人员已知的，并且可以包括玻璃纤维、合成树脂纤维、各种类型的膜，包括孔径在约65至约15μm之间变化的不对称膜过滤器，以及这些材料的组合。另外，过滤器元件可包含一种或多种化学物质以促进红细胞与血浆的分离。这种化学物质的实例是凝血酶，凝集素，阳离子聚合物，针对一种或多种红细胞表面抗原的抗体等。可以通过共价手段，非特异性吸收等在过滤器元件中提供促进红细胞与血浆分离的这种化学物质。

在某些实施方案中，标记区位于样品接收区的下游，并且包含扩散定位的标记试剂，该标记试剂与目标分析物结合或与目标分析物竞争与结合物质的结合。或者，如果在将标记试剂应用于样品接收区之前将其与样品预混合，则可以取消标记区。检测区位于标记区的下游，并包含与目标分析物结合的固定化捕获试剂。

用于本发明的膜的最佳孔径为约10至约50μm。膜的厚度通常为约1mil至约15mil，通常为5或10mil，但可以高达200mil或更厚。该膜可以具有通常不透水的层例如Mylar聚酯薄膜(DuPont Teijin Films)的背衬。当使用时，通常通过诸如3M 444双面胶带之类的粘合剂将背衬固定至膜。通常，不透水的背衬用于低厚度的膜。可以使用各种各样的聚合物，只要它们不与测定成分非特异性结合并且不干扰样品的流动即可。示例性的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。或者，膜可以是自支撑的。也可以使用其他非吸水膜，例如聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在各种实施方案中，可以用包含封闭剂和稳定剂的溶液预处理标签区域材料。封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甲基化BSA、酪蛋白、脱脂奶粉。该装置还可以包含其他成分，包括例如缓冲剂、HAMA抑制剂、去污剂、盐(例如钙、镁、钾等的氯化物和/或硫酸盐)和蛋白质成分(例如血清白蛋白、明胶、牛奶蛋白等)。此列表并非限制性的。

该设备可以进一步包括各种控制位置，这些控制位置被读取以确定测试设备已经被正确地运行。举例来说，可以将程序控制区与测定检测区分开提供，以验证样品流量是否如预期的那样。控制区优选是在空间上不同的区域，在该区域可以产生指示试剂正确流动的信号。程序控制区可包含目标分析物或其片段，分析物测定中使用的过量被标记抗体可与之结合。在操作中，即使当测试样品中不存在目标分析物时，被标记试剂也会与对照区结合。使用对照线会有所帮助，因为对照线中信号的出现指示可以读取测试结果的时间，即使对于阴性结果也如此。因此，当期望的信号出现在对照线中时，可以注意到捕获区域中信号的存在或不存在。该设备可以进一步包括负对照区。该对照区域的目的是提醒用户测试设备不在正常工作。如果在正常工作，在阴性对照区域中应该看不到任何信号或标记。

这种测定装置的外壳或壳体可以采用各种形式。通常，它将包括细长的壳体并且可以具有多个相互配合的部分。在一个特别优选的实施例中，壳体包括顶盖和底部支撑件。顶盖包含一个应用孔和一个观察口。在一个优选的实施方式中，壳体由不透湿的固体材料制成，例如塑料材料。可以想到，可以使用各种可商购的塑料来构成壳体，包括但不限于乙烯基、尼龙、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚硫烷、聚酯、氨基甲酸乙酯和环氧树脂。壳体可以通过常规方法来制备，例如本领域中众所周知的标准模制技术。可以通过模制技术来制造壳体，所述模制技术包括但不限于注射模制、压缩模制、传递模制、吹塑、挤出模制、泡沫模制和热成型模制。前述模制技术在本领域中是众所周知的，因此在此不详细讨论。参见例如Processes And Materials Of Manufacture,第三版，R.A.Lindsberg(1983)Allyn和Baron，第393-431页。

如果需要，可以使用适合该标记的仪器评估所用可检测标记的比色、发光或荧光强度。举例来说，荧光计可以用来检测荧光标记。可以使用反射计来检测吸收光等的标记。可以通过将测得的响应与样品流体中分析物的量相关联来确定样品中目标分析物的浓度。

测定关联

如本文中针对测定中生物标志物的测量所用的术语“相关”和“关联”是指基于从测定中获得的信号确定样品中生物标志物的存在，或更优选地，确定生物标志物的量。通常，这采取以下形式：比较从参与测定的一种物种上的可检测标记产生的信号与预定的标准曲线，该预定的标准曲线可用于将信号转换为生物标志物的浓度或阈值量。

如本文中针对生物标志物用于诊断或预后所用的术语“相关”和“关联”是指将将患者中生物标志物的存在或量与已知患有该疾病、或已知有特定状况的风险的人或已知无特定疾病的人中的存在或量进行比较。通常，这采取将生物标志物浓度形式的测定结果与预定阈值进行比较的形式，该预定阈值被选择为指示疾病的发生或不发生或者某些未来结果的可能性。

除其他事项外，选择诊断阈值还应考虑疾病的可能性，在不同测试阈值下正确和错误诊断的分布以及基于诊断的治疗后果(或治疗失败)的估计。例如，当考虑使用高效且风险低的特定疗法时，几乎不需要测试，因为临床医生可以接受实质性的诊断不确定性。另一方面，在治疗选择无效且风险较高的情况下，临床医生通常需要更高程度的诊断确定性。因此，成本/效益分析涉及选择诊断阈值。

可以以各种方式确定合适的阈值。例如，使用心肌肌钙蛋白诊断急性心肌梗死的一个推荐诊断阈值是正常人群中浓度的第97.5百分位。另一种方法可能是查看来自同一患者的连续样本，其中先前的“基线”结果用于监测生物标志物水平的时间变化。

人口研究也可用于选择决策阈值。接收器工作特性(Receiver OperatingCharacteristic，“ROC”)源自二战期间开发的用于雷达图像分析的信号检测理论领域，ROC分析通常用于选择能够最佳地区分“病态”亚人群和“不患病”亚人群的阈值。在这种情况下，当人测试呈阳性但实际上没有疾病时，就会出现假阳性。另一方面，当患者测试阴性、表明他们是健康的、然而他们事实上患有该病时，就会出现假阴性。为了绘制ROC曲线，当判定阈值连续变化时，确定真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)。由于TPR等于灵敏度，而FPR等于1-特异性，因此ROC图有时称为灵敏度对比(1-特异性)图。完美测试的ROC曲线下面积应为1.0；随机测试的ROC曲线下面积为0.5。选择阈值以提供可接受水平的特异性和敏感性。

在本文中，“患病”是指具有一种特征(疾病或病状的存在或某些结果的发生)的人群，而“未患病”是指缺乏该特征的人群。尽管单个决策阈值是这种方法的最简单应用，但是可以使用多个决策阈值。例如，在第一阈值以下，疾病的不存在可以以相对高的置信度确定，而在第二阈值以上，疾病的存在也可以以相对高的置信度确定。在两个阈值之间可以认为是不确定的。这意味着性质上仅仅是示例性的。

除了阈值比较之外，将测定结果与患者分类(疾病的发生与否，结果的可能性等)相关联的其他方法包括决策树，规则集，贝叶斯方法和神经网络方法。这些方法可以产生表示受试者属于多个分类中的一个分类的程度的概率值。

可以如Fischer等人，Intensive Care Med.29:1043-51,2003中所述获得测试准确性的量度，用于确定给定生物标志物的有效性。这些措施包括灵敏度和特异性，预测值，似然比，诊断比值比和ROC曲线面积。ROC图的曲线下面积(“AUC”)等于分类器将随机选择的正实例的排名高于随机选择的负实例的概率。可以认为ROC曲线下面积等同于Mann-Whitney U检验，该检验用于检验在考虑两组均具有连续数据的情况下在两组中获得的得分之间的中位数差异，或等同于Wilcoxon秩检验。

如上所述，合适的测试可以在这些各种测量上显示出以下结果中的一项或多项：特异性大于0.5，优选至少0.6，更优选至少0.7，还更优选至少0.8，甚至更优选至少0.9，最优选至少0.95，相应的灵敏度大于0.2，优选大于0.3，更优选大于0.4，还更优选至少0.5，甚至更优选0.6，再更优选大于0.7，再更优选更大大于0.8，更优选大于0.9，最优选大于0.95；灵敏度大于0.5，优选至少0.6，更优选至少0.7，再更优选至少0.8，甚至更优选至少0.9，最优选至少0.95，相应的特异性大于0.2，优选大于0.3；更优选大于0.4，还更优选至少0.5，甚至更优选0.6，再更优选大于0.7，还更优选大于0.8，更优选大于0.9，最优选大于0.95；至少75％的灵敏度，结合至少75％的特异性；ROC曲线面积大于0.5，优选至少0.6，更优选0.7，再更优选至少0.8，甚至更优选至少0.9，最优选至少0.95；比值比不同于1，优选至少约2或更大或者约0.5或更小，更优选至少约3或更大或者约0.33或更小，甚至更优选至少约4或更大或者约0.25或更小，甚至更优选至少约5或更大或者约0.2或更小，最优选至少约10或更大或者约0.1或更小；阳性概然比(以灵敏度/(1-特异性)计算)大于1，至少2，更优选至少3，还更优选至少5，最优选至少10；或阴性概然比(以(1-灵敏度)/特异性计算)小于1，小于或等于0.5，更优选小于或等于0.3，最优选小于或等于0.1。

抗体

如本文所用，术语“抗体”是指能够特异性结合抗原或表位的、由免疫球蛋白基因或其片段衍生、建模或基本上由其编码的肽或多肽。参见例如Fundamental Immunology,第三版,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即“抗原结合位点”，例如保留结合抗原的能力的片段、子序列、互补决定区(CDR)，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，是一个二价片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，由VH域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括在术语“抗体”中。

优选的治疗性抗体是IgG抗体。如本文所用，术语“IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG类别抗体中已知的Ig域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。出于多种实际原因，IgG是治疗性抗体的首选类别。IgG抗体稳定，易于纯化，并且能够在药物供应链适用的条件下储存。在体内，它们具有长的生物学半衰期，这不仅是其大小的函数，而且是它们与所谓的Fc受体(或FcRn)相互作用的结果。该受体似乎可以保护IgG免受细胞内的分解代谢，并将其再循环回血浆。

抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠在内的大多数哺乳动物中，抗体都是由成对的重和轻多肽链组成。轻链和重链可变区在抗体之间显示出显著的序列多样性，并负责结合靶抗原。每条链由单个免疫球蛋白(Ig)结构域组成，因此通用术语“免疫球蛋白”用于此类蛋白质。

术语“特异性结合”并非意在表示抗体仅与其预期的靶标结合，因为如上所述，抗体能够与展示该抗体所结合的表位的任何多肽结合。相反，如果抗体对其预期靶标的亲和力比对不显示适当表位的非靶标分子的亲和力高约5倍，则该抗体“特异性结合”。优选地，抗体对靶分子的亲和力比其对非靶分子的亲和力大至少约5倍，优选10倍，更优选25倍，甚至更优选50倍，最优选100倍或更多。非目标分子。在优选的实施方案中，优选的抗体以至少约10⁷M^-1，优选在约10⁸M^-1至约10⁹M^-1，约10⁹M^-1至约10¹⁰M^-1或约10¹⁰M^-1至约10¹²M^-1之间的亲和力结合。

亲和力的计算公式为K_d＝k_off/k_on(k_off是解离速率常数，K_on是缔合速率常数，K_d是平衡常数)。亲和力可以通过在各种浓度(c)下测量标记配体的结合分数(r)来确定平衡。使用Scatchard方程绘制数据：r/c＝K(n-r)，其中r＝平衡时结合的配体的摩尔数/受体的摩尔数；c＝平衡时游离配体的浓度；K＝平衡缔合常数；n＝每个受体分子的配体结合位点数。通过图形分析，将r/c绘制在Y轴上，而r绘制在X轴上，从而生成Scatchard图。通过Scatchard分析的抗体亲和力测量是本领域众所周知的。参见，例如van Erp等人,J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson和Griswold,Comput.Methods ProgramsBiomed.27:65-8,1988。

本发明的抗体可以通过表位作图进一步表征，从而可以选择在本文所述的免疫测定中具有最大临床效用的抗体和表位。术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的抗原决定簇。表位通常由分子的化学活性表面分组组成，例如氨基酸或糖侧链，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，丧失与前者的结合而不丧失与后者的结合。优选地，靶向存在于靶分子上、但部分或完全不存在于非靶分子上的表位。

在一些实施方案中，抗体支架可以是来自不同物种的序列的混合物。这样，如果抗体是抗体，则该抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”均指结合来自一个以上物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常是指已将可变域框架区交换为在人抗体中发现的序列的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除CDR外的整个抗体由人源的多核苷酸编码或除其CDR外与该抗体相同。将其一部分或全部由起源于非人有机体的核酸编码的CDR移植到人类抗体可变区的β-片框架中以生成抗体，该抗体的特异性取决于移植的CDR。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018，Jones，1986，Nature 321：522-525，Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-1536。通常需要将所选择的受体框架残基“回复突变”为相应的供体残基，以恢复在初始移植的构建体中丧失的亲和力(U.S.Pat.No.5,530,101；U.S.Pat.No.5,585,089；U.S.Pat.No.5,693,761；U.S.Pat.No.5,693,762；U.S.Pat.No.6,180,370；U.S.Pat.No.5,859,205；U.S.Pat.No.5,821,337；U.S.Pat.No.6,054,297；U.S.Pat.No.6,407,213)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区，因此通常将包含人Fc区。人源化抗体也可以使用具有基因工程免疫系统的小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。用于使非人抗体人源化和重塑的多种技术和方法是本领域众所周知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of BCells,533-545,Elsevier Science(USA)，以及其中引用的参考文献)。人源化方法包括但不限于下述文献中描述的方法：Jones等人,1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9,Presta et al.,1997,CancerRes.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O'Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8。人源化或降低非人抗体可变区的免疫原性的其他方法可包括表面重铺方法，例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述。在一个实施方案中，如本领域已知，亲本抗体已经亲和力成熟。基于结构的方法可以用于人源化和亲和力成熟，例如如美国专利申请第11/004,590号所述。可以采用基于选择的方法来对抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，包括但不限于下述文献中描述的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759。其他人源化方法可包括仅部分CDR的移植，包括但不限于下述中描述的方法：U.S.Ser.No.09/810,502；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084。

在一个实施方案中，该抗体是完全人抗体。“完全人的抗体”或“完全人抗体”是指具有源自人染色体的抗体基因序列的人抗体。可以例如使用转基因小鼠(Bruggemann等人，1997，Curr Opin Biotechnol 8：455-458)或人抗体文库结合选择方法(Griffiths等人,1998,Curr Opin Biotechnol 9:102-108)来获得完全人抗体。

抗体生产

可以使用本领域已知的多种技术来生产单克隆抗体制剂，包括使用杂交瘤，重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的以及在例如下述文献中教导的技术：Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版，1988)；Hammerling等人,MONOCLONALANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS,第563-681页(Elsevier,N.Y.,1981)(均通过引用将其全部内容并入本文)。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是其产生方法。

源自除大鼠和小鼠以外的动物的单克隆抗体具有独特的优势。与信号转导和疾病相关的许多蛋白质靶标在小鼠、大鼠和人类之间高度保守，因此可以被小鼠或大鼠宿主识别为自身抗原，从而使其免疫原性降低。当使用兔子作为宿主动物时，可以避免这个问题。参见例如Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。在一个非限制性实例中，可用目的抗原或表达该抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对所述抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合。选择杂交瘤并通过有限稀释来克隆。然后通过本领域已知的方法对杂交瘤克隆进行测定，以选择分泌能够结合上述抗原的抗体的细胞。腹水通常含有高水平的抗体，可通过向小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤细胞克隆产生。

可以用于抗体产生方法的佐剂包括但不限于蛋白质佐剂；细菌佐剂，例如完整细菌(BCG，小棒杆菌(Corynebacterium parvum)，明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota))和细菌成分，包括细胞壁骨架，海藻糖二霉菌酸酯，单磷酰脂质A，结核杆菌的甲醇可提取残留物(MER)，完全或不完全的弗氏佐剂；病毒佐剂；化学助剂，例如氢氧化铝，碘乙酸盐/酯和胆固醇半琥珀酸酯；或裸DNA佐剂。可以在本发明的方法中使用的其他佐剂包括霍乱毒素，paropox蛋白，MF-59(Chiron Corporation；也参见Bieg等人(1999)“GAD65And Insulin B Chain Peptide(9-23)Are Not Primary Autoantigens In The Type1Diabetes Syndrome Of The BB Rat,”Autoimmunity,31(1):15-24，通过引用并入本文)，

(Corixa Corporation；也参见Lodmell等人(2000)“DNA Vaccination Of MiceAgainst Rabies Virus:Effects Of The Route Of Vaccination And The AdjuvantMonophosphoryl Lipid A(MPL),”Vaccine,18:1059-1066；Johnson等人(1999)“3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives:Synthesis And ImmunostimulantActivities,”Journal of Medicinal Chemistry,42:4640-4649；Baldridge等人(1999)“Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation OfVaccines,”Methods,19:103-107,均通过引用并入本文),RC-529佐剂(CorixaCorporation；Corixa的氨基烷基葡萄糖胺4-磷酸(AGP)化学文库的前导化合物，另请参见www.corixa.com),以及DETOX^TM佐剂(Corixa公司；DETOX^TM佐剂包括

佐剂(单磷酰脂质A)和分枝杆菌细胞壁骨架；也参见Eton等人(1998)“Active Immunotherapy WithUltraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX InPatients With Metastatic Melanoma,”Clin.Cancer Res.4(3):619-627；以及Gupta等人(1995)“Adjuvants For Human Vaccines—Current Status,Problems And FutureProspects,”Vaccine,13(14):1263-1276,两者均通过引用并入本文)。

许多出版物讨论了使用噬菌体展示技术来产生多肽文库并针对与选定分析物的结合进行筛选。参见例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott and Smith,Science 249,386-88,1990；以及Ladner等人,U.S.Pat.No.5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码要筛选的多肽的DNA与多肽之间建立物理缔合。这种物理缔合是由噬菌体颗粒提供的，该噬菌体颗粒将多肽展示为包围编码该多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。在多肽及其遗传物质之间建立物理缔合可以同时大量筛选带有不同多肽的噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体与靶标结合，并且这些噬菌体通过对靶标的亲和力筛选而富集。从这些噬菌体展示的多肽的身份可以从它们各自的基因组中确定。使用这些方法，可以通过常规方法大量合成被鉴定为对所需靶具有结合亲和力的多肽。参见例如美国专利号6,057,098，其全部内容结合于此，包括所有表、图和权利要求。

然后可以通过以下方法选择通过这些方法生成的抗体：首先筛选与目的纯化多肽的亲和力和特异性，如果需要，将结果与抗体和希望排除结合的多肽的亲和力和特异性进行比较。筛选过程可涉及将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液放入各个微量滴定孔中，并孵育约30分钟至2小时。然后洗涤微量滴定孔，并将标记的第二抗体(例如，如果产生的抗体是小鼠抗体，则与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加到孔中，孵育约30分钟，然后洗涤。将底物添加到孔中，在存在针对固定多肽的抗体的地方将发生显色反应。

然后可以在选择的测定设计中对如此鉴定的抗体进一步分析亲和力和特异性。在针对靶蛋白的免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白充当标准，使用该标准，利用已选择的抗体来判断免疫测定的灵敏度和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能不同；某些抗体对(例如，在夹心测定中)可能在空间等方面相互干扰，抗体的测定性能可能比抗体的绝对亲和力和特异性更为重要。

抗体也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组分别或与引入人免疫球蛋白基因座同时失去功能。特别地，JH区的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。使用常规方法，用选定的抗原，例如本发明的全部或部分多肽，免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中会重排，然后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关利用这项技术产生人抗体的概述，请参见Lonberg等(1995)“Human AntibodiesFrom Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol.13:65-93，将其全部内容并入本文作为参考。关于利用这项技术产生人抗体和人单克隆抗体的详细讨论以及生产这种抗体的方案参见例如国际公开号WO 98/24893，WO 96/34096和WO 96/33735，以及美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，通过引用整体并入本文。另外，诸如Abgenix公司(Freemont,Calif.)和Medarex公司(Princeton,N.J.)的公司可以使用与上述相似的技术来提供针对所选抗原的人抗体。

抗体的重组表达

一旦获得了编码本发明抗体的核酸序列，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生所述抗体的载体。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建包含抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。(例如参见Sambrook等人,1990,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.以及Ausubel等人(编),1998,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NY中描述的技术)。

可以通过常规技术(例如电穿孔，脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的抗体。在特定的实施方案中，抗体的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。

本文公开的抗CCL14抗体也可以重组产生(例如，在大肠杆菌/T7表达系统，哺乳动物细胞表达系统或低等真核细胞表达系统中)。在该实施方案中，可以将编码本发明的抗体免疫球蛋白分子的核酸(例如，VH或VL)插入基于pET的质粒中，并在大肠杆菌/T7系统中表达。例如，本发明包括在宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，诸如BL21或BL21DE3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，其包括在所述细胞中表达T7 RNA聚合酶，该细胞还包含编码与T7启动子可操作连接的免疫球蛋白链的多核苷酸。例如，在本发明的一个实施方案中，细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，包含编码可操作地连接至lac启动子的T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸，并且该聚合酶和链的表达是通过将宿主细胞与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)引起孵育来诱导的。

因此，本发明包括用于制备本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，其包括引入编码该抗体或片段的一个或多个免疫球蛋白链的多核苷酸(例如，重和/或轻免疫球蛋白链)；在有利于这种表达的条件下培养宿主细胞(例如CHO或毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母)，并任选地从宿主细胞和/或生长宿主细胞的培养基中分离所述抗体或片段或链。

抗CCL14抗体也可以通过美国专利号6,331,415中阐述的任何方法来合成。

真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)作为表达本文公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的宿主是本领域众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞、两栖细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)，海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)，小克氏毕赤酵母(Pichia koclamae)，膜状毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，小毕赤酵母(Pichiaminuta)(Ogataea minuta，Pichia lindneri)，仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)，盐沼毕赤酵母(Pichia thermotolerans)，Pichia salictaria，Pichia guercuum，Pichiapijperi，Pichia stiptis，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，毕赤酵母属的种(Pichiasp)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，酵母属的种(Saccharomyces sp)，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces sp)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，白色念珠菌(Candida albicans)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，Chrysosporium lucknowense，镰孢属的种(Fusarium sp)，禾谷镰孢(Fusarium gramineum)，Fusarium venenatum，小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉胞霉(Neurospora crassa)。毕赤酵母属的种(Pichia sp)，任何酵母属的种，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，任何克鲁维酵母属的种，白色念珠菌，任何曲霉属的种，里氏木霉，勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)，任何镰孢属的种，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉胞霉。当将编码重链或其抗原结合部分或其片段，轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够的时间，以允许抗体或片段或链在宿主细胞中表达或分泌到其中生长宿主细胞的培养基中，由此产生抗体。

可以使用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体。这样的宿主表达系统代表可以通过其产生并随后纯化抗体的编码序列的载体，还代表了当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明抗体的细胞。这些包括但不限于用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces pichia))；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的植物细胞系统或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或带有含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，BHK，293、293T，3T3细胞，淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)，Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞))。

在细菌系统中，取决于表达的抗体的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白质用于产生抗体的药物组合物时，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones,”EMBO J.2:1791-1794)，其中抗体编码序列可以单个地与lac Z编码区阅读框一致地连接在载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等人(1985)“Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene OfEscherichia coli,”Nucleic Acids Res.13:3101-3110；Van Heeke等人(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli,”J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠上、然后在游离的谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，因此可以从GST部分释放克隆的靶基因产物。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus，AcNPV)被用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。可以将抗体编码序列单个克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将目的抗体编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三方前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区域)将产生重组病毒，该重组病毒是活的并且能够在被感染的宿主中表达免疫球蛋白分子。(参见例如Logan等人(1984)“AdenovirusTripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late AfterInfection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。为了有效翻译插入的抗体编码序列，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见Bitter等(1987)“Expression And SecretionVectors For Yeast,”Methods in Enzymol.153:516-544)。

另外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当加工基因产物的初级转录物，糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

为了长期、高产量地生产重组蛋白，优选稳定表达。例如，可以工程化稳定表达本发明抗体的细胞系。可以使用由适当的表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)和选择标记控制的DNA转化宿主细胞，而不是使用包含病毒复制起点的表达载体。引入外源DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换至选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并使细胞将质粒稳定整合到其染色体中并生长以形成病灶，然后可以将其克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于工程化表达本发明抗体的细胞系。这样的工程化细胞系在筛选和评估与本发明的抗体直接或间接相互作用的化合物时可能特别有用。

可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To CulturedMouse Cells”,Cell 11:223-232),次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等人(1962)“Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable TransformationOf A Biochemical Trait”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034),和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人(1980)“Isolation Of Transforming DNA:Cloning The HamsterAprt Gene”,Cell 22:817-823)基因可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物的抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570；O'Hare等人(1981)“Transformation OfMouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant PlasmidExpressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531)；gpt,赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等人(1981)“Selection For AnimalCells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076)；neo,赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Tachibana等人(1991)“Altered Reactivity OfImmunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene”,Cytotechnology 6(3):219-226；Tolstoshev(1993)“Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions”,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy”，Science 260:926-932；和Morgan等人(1993)“Human gene therapy”，Ann.Rev.Biochem.62:191-217)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编),1993,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,GENE TRANSFER ANDEXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY；第12和13章,Dracopoli等人(编),1994,CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS,John Wiley&Sons,NY.；Colbere-Garapin等人(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For HigherEukaryotic Cells”，J.Mol.Biol.150:1-14；以及hygro,赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 ResistanceAs Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells”，Gene 30:147-156)。

可以通过载体扩增来提高本发明抗体的表达水平(有关综述参见Bebbington和Hentschel,“The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The ExpressionOf Cloned Genes In Mammaian Cells”，DNA CLONING,第3卷(Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人(1983)“Expression And Amplification Of EngineeredMouse Dihydrofolate Reductase Minigenes”，Mol.Cell.Biol.3:257-266)。

宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。这两个载体可以包含相同的选择标记，其使得重链和轻链多肽能够相等表达。或者，可以使用编码重链和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况下，应将轻链置于重链之前，以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot(1986)“Expression AndAmplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Nature322:562-565；Kohler(1980)“Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。

通常，在具体的细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在该细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特征性的糖基化模式。因此，抗体的具体糖基化模式将取决于用于产生所述抗体的具体细胞系或转基因动物。但是，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体均构成本发明，而不依赖于抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在具体的实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体在体外和体内通常都显示出比其岩藻糖基化的对应物更强的效力(参见例如Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利6,946,292和7,214,775)。这些具有非岩藻糖基化N聚糖的抗体不太可能具有免疫原性，因为它们的碳水化合物结构是人类血清IgG中存在的种群的正常组成部分。

一旦本发明的抗体已经重组表达，就可以通过本领域已知的用于纯化抗体的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换，亲和力，特别是蛋白A后通过对特定抗原的亲和力，以及尺寸柱层析)，离心，差异溶解度或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术。

抗体缀合物

本文公开的抗CCL14抗体及其抗原结合片段也可以缀合至化学部分。化学部分尤其可以是聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。在特定的实施方案中，化学部分是增加抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于亲水聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa，5kDa，10kDa，12kDa，20kDa，30kDa或40kDa的PEG)，右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等，(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等人，(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)公开了将抗体与PEG缀合，所述PEG与放射性金属螯合剂(二亚乙三胺五乙酸(diethylenetriaminpentaacetic acid，DTPA))连接。

本文公开的抗体及其抗原结合片段也可以与诸如下述的标记缀合：⁹⁹Tc,⁹⁰Y,¹¹¹In,³²P,¹⁴C,¹²⁵I,³H,¹³¹I,¹¹C,¹⁵O,¹³N,¹⁸F,³⁵S,⁵¹Cr,⁵⁷To,²²⁶Ra,⁶⁰Co,⁵⁹Fe,⁵⁷Se,¹⁵²Eu,⁶⁷CU,²¹⁷Ci,²¹¹At,²¹²Pb,⁴⁷Sc,¹⁰⁹Pd,²³⁴Th,and ⁴⁰K,¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,⁵²Tr和⁵⁶Fe。

本文公开的抗体和抗原结合片段也可以被PEG化，例如以增加其生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体或片段聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团连接到所述抗体或抗体片段的条件下，使该抗体或片段与聚乙二醇(PEG)的反应性形式(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。在特定的实施方案中，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待PEG化的抗体或片段是无糖基化的抗体或片段。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。参见例如EP 0 154 316和EP 0 401 384。

本文公开的抗体和抗原结合片段也可以与荧光或化学发光标记物缀合，包括荧光团，例如稀土螯合物，荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，异硫氰酸盐/酯，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二甲醛，荧光胺，152Eu，丹磺酰基(dansyl)，伞形酮，萤光素，管腔标记(luminal label)，等腔标记(isoluminal label)，芳族吖啶酯标记，咪唑标记，吖啶盐标记，草酸酯标记，水母发光蛋白标记，2,3-二氢邻苯二嗪二酮，生物素/亲和素，旋转标签和稳定的自由基。

本发明的抗体及其抗原结合片段也可以与细胞毒性因子例如白喉毒素，铜绿假单胞菌外毒素A链，蓖麻毒蛋白A链，阿布林(abrin)A链，modeccin A链，α-sarcin，Aleuritesfordii蛋白和化合物(例如脂肪酸)，石黄素蛋白(dianthin)，美洲植物疫霉菌(Phytoiaccaamericana)蛋白PAPI，PAPII和PAP-S，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，姜黄素(curcin)，巴豆丁(crotin)，皂角皂苷(saponaria officinalis)抑制剂，米托吉林(mitogellin)，限缩酶(restrictocin)，苯霉素(phenomycin)和依诺霉素(neomycin)。

可以采用本领域已知用于将本发明的抗体及其抗原结合片段缀合至各种部分的任何方法，包括由Hunter等人(1962)Nature 144:945；David等人(1974)Biochemistry 13:1014；Pain,et al.,(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.andCytochem.30:407描述的方法。缀合抗体和片段的方法是常规的，并且在本领域中是众所周知的。

抗CCL14抗体的治疗用途

还提供了用于治疗需要用本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段进行治疗的受试者(包括人类受试者)的方法。

为了制备本发明的抗CCL14抗体和抗原结合片段(例如抗体131A及其人源化形式)的药物或无菌组合物，将所述抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:NationalFormulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。

治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉剂、浆剂、水溶液或悬浮液的形式混合来制备(参见例如Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(编)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定单独或与另一种治疗剂组合施用的本发明抗体的毒性和治疗功效，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中具有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。从这些细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在循环浓度范围内，包括几乎没有毒性或无毒性的ED50。剂量可以根据所采用的剂型和给药途径在该范围内变化。

在另一个实施方案中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；第57版(2002年11月1日))将另外的治疗剂与本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)联合施用于受试者。

给药方式可以变化。给药途径包括口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。

在特定的实施方案中，本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可以通过侵入性途径例如通过注射来施用。在本发明的其他实施方案中，抗CCL14抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气雾剂递送而施用。通过非侵入性途径(例如口服；例如以丸剂、胶囊或片剂的形式)施用也在本发明的范围内。

本发明提供了包含本发明的任何抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)或其药物组合物的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱，空心针或注射器筒)。本发明还提供了一种注射装置，其包含本发明的任何抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)或其药物组合物。注射装置是通过肠胃外途径例如肌肉内、皮下或静脉内将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，例如自动注射器)，该注射器例如包括用于容纳要注射的流体(例如抗体或片段或其药物组合物)的圆筒或针筒，用于将皮肤和/或血管穿刺以注射流体的针；用于将流体推出气缸并通过针孔的柱塞。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这样的装置在插管或套管针/针中包括抗体或片段或其药物组合物，该插管或套管针/针可以附接至管，该管可以附接至用于容纳流体(例如盐水；或包含NaCl的乳酸林格液，乳酸钠，氯化钾，氯化钙和可选地包括葡萄糖)通过套管或套管针/针头引入患者体内。在本发明的一个实施方案中，一旦将套管针和套管插入受试者的静脉中并且从所插入的套管取出套管针，就可以将抗体或其片段或其药物组合物引入装置中。IV设备可以例如被插入到外周静脉中(例如，在手或手臂中)。上腔静脉或下腔静脉，或心脏右心房内(例如中枢静脉)；或进入锁骨下静脉，颈内静脉或股静脉，例如，向心脏前进直至到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线)。在本发明的一个实施方案中，注射装置是自动注射器、喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用高压窄液体射流穿透表皮，将抗体或片段或其药物组合物引入患者体内。外部输液泵是将抗体或片段或其药物组合物以受控量输送到患者体内的医疗设备。外部输液泵可以电动或机械方式供电。不同的泵以不同的方式运行，例如，注射泵将流体保持在注射器的储液器中，可移动的活塞控制流体的输送，弹性泵将流体保持在可拉伸的球囊储器中，以及来自球囊弹性壁的压力驱动流体输送。在蠕动泵中，一组滚子在一段挠性管上向下挤压，将流体向前推动。在多通道泵中，流体可以多种速率从多个储器中递送出来。

本文公开的药物组合物还可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含所述药物组合物的这种无针装置也是本发明的一部分。本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块的实例包括如下美国专利中公开的那些：美国专利号4,487,603，其中公开了可植入的微输液泵，用于以受控的速率分配药物；美国专利第4,447,233号，其中公开了一种药物输注泵，用于以精确的输注速率输送药物；美国专利第4,447,224号，其中公开了一种可变流量可植入输注设备，用于连续药物输送；美国专利第4,439,196号，其中公开了一种渗透药物输送系统，具有多腔室。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的，并且包含本发明的药物组合物的那些植入物、递送系统和模块在本发明的范围内。

或者，可以以局部而非全身的方式，例如通过将抗体或片段直接注射到肿瘤(例如CCL14+肿瘤)中来施用本发明的抗CCL14抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)。此外，可以在靶向药物递送系统中，例如在用组织特异性抗体包被的脂质体中施用所述抗体或片段，以靶向例如肿瘤(例如以免疫病理学为特征的CCL14+肿瘤)。脂质体将靶向患病组织并被其选择性吸收。这样的方法和脂质体是本发明的一部分。

给药方案取决于几个因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织周转率，症状水平，治疗性抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。优选地，给药方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现靶疾病状态的改善，同时不希望的副作用最小化。因此，所递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重性。有选择合适剂量的治疗性抗体或片段的指南可供利用(参见例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

临床医生可以例如使用本领域已知会或怀疑会影响治疗的参数或因素来确定合适的剂量。通常，剂量以比最佳剂量稍小的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用达到所需或最佳效果为止。重要的诊断措施包括症状，例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平。通常，期望将要使用的生物制品源于与用于治疗的动物相同的物种，从而使对该试剂的任何免疫应答减至最小。在人类受试者的情况下，例如，人源化和完全人类抗体可能是理想的。

本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可以通过连续输注或通过例如每天一次，每周1-7次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两月一次，每季度一次，每半年一次或每年一次等施用的剂量来提供。可以例如静脉内，皮下，局部，口服，经鼻，经直肠，肌肉内，脑内，脊髓内或通过吸入来提供药剂。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重,更通常为至少0.2μg/kg,0.5μg/kg,1μg/kg,10μg/kg,100μg/kg,0.25mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/ml,10mg/kg,25mg/kg,50mg/kg或更多(参见例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。也可以提供剂量以达到受试者血清中抗CCL14抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更高。在其他实施方案中，本发明的抗CCL14抗体以例如每周一次、每两周一次、“每四周一次”、每月一次、每两月一次或每季度一次以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者通过皮下或静脉内施用。

如本文所用，术语“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，本发明的抗CCL14或其抗原结合片段(例如抗体131A及其人源化形式)能够有效地引起疾病(例如癌症或癌症进展)的一种或多种症状的可测量改善的量。有效剂量还指抗体或片段的足以导致症状至少部分改善(例如肿瘤缩小或消除、缺乏肿瘤生长、增加生存时间)的量。当应用于单独给药的单个活性成分时，有效剂量是指该单独的该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断措施或参数改善至少10％；通常至少增加20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观测量评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以改善主观测量。

实验和诊断用途

本文公开的抗CCL14抗体及其抗原结合片段可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域熟知的方法将抗CCL14抗体及其抗原结合片段固定在固相上，例如Sephadex、玻璃或琼脂糖树脂或滤纸。使固定的抗体或片段与含有要纯化的CCL14蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物，该溶剂将除去样品中除与固定化的抗体或片段结合的CCL14蛋白以外的基本上所有物质。最后，用洗脱结合的CCL14的溶剂(例如蛋白A)洗涤载体。这种固定化的抗体和片段构成本发明的一部分。

还提供了用于产生二抗的抗原，其例如可用于进行蛋白质印迹和本文讨论的其他免疫测定。

抗CCL14抗体(例如人源化抗体)及其抗原结合片段也可用于CCL14蛋白的诊断检测，例如检测其在特定细胞、组织或血清(例如肿瘤细胞如黑素瘤细胞)中的表达。这样的诊断方法在各种疾病诊断中可能是有用的。

本发明包括结合使用本文公开的抗CCL14抗体或其抗原结合片段(例如抗体131A或其人源化形式)的ELISA测定法(酶联免疫吸附测定法)。

例如，这种方法包括以下步骤：

(a)用抗CCL14抗体或其抗原结合片段涂覆基底(例如，微量滴定板孔的表面，例如塑料板)；

(b)将要针对CCL14的存在进行测试的样品施加到基底上；

(c)清洗板，以除去样品中未结合的材料；

(d)施加对CCL14抗原也具有特异性的可检测标记的抗体(例如酶联抗体)；

(e)洗涤基底，以除去所述未结合的标记抗体；

(f)如果标记的抗体是酶连接的，则施加能够被该酶转化为荧光信号的化学物质；和

(g)检测所述标记的抗体的存在。

检测到与基底结合的标记表明存在CCL14蛋白。

在另一个实施方案中，所述标记的抗体或其抗原结合片段用过氧化物酶标记，其可与ABTS(例如2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应，产生可检测的颜色变化。或者，所述标记的抗体或片段用可检测的放射性同位素(例如3H)标记，其可在闪烁剂存在下通过闪烁计数器检测。

本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段可以用于蛋白质印迹法或免疫蛋白印迹法中。这样的程序构成本发明的一部分，并且包括例如使用本领域已知的方法的(例如，半干印迹或桶印迹)，任选地将蛋白质从待测试CCL14存在情况的样品中转移(例如从样品中蛋白质的PAGE或SDS-PAGE电泳分离)到膜或其他固体基底上；使待针对结合的CCL14或其片段的存在情况进行测试的膜或其他固体基底与本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段接触；清洗所述膜一次或多次以除去未结合的抗CCL14抗体或片段以及其他未结合的物质；并检测结合的抗CCL14抗体或片段。

这种膜可以采取基于硝酸纤维素或乙烯基(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))的膜的形式，向其转移了要在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中检测所述蛋白质以确定CCL14的存在情况(例如，在凝胶中进行电泳分离之后)。在使膜与抗CCL14抗体或片段接触之前，任选地将膜封闭(例如采用脱脂奶粉等)，以结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。

检测到结合的抗体或片段表明CCL14蛋白存在于所述膜或基底上以及样品中。结合的抗体或片段的检测可以通过将抗体或片段与被可检测地标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合、然后检测第二抗体的存在来进行。

本文公开的抗CCL14抗体及其抗原结合片段也可以用于免疫组织化学。这样的方法构成本发明的一部分，并且包括例如使要针对CCL14蛋白的存在情况进行的测试的细胞(例如，肿瘤细胞，例如黑素瘤细胞)与本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段接触；并检测所述细胞上或细胞内的抗体或片段。

如果抗体或片段本身被可检测地标记，则可以直接检测。或者，抗体或片段可以与被检测的可检测地标记的第二抗体结合。

本文公开的某些抗CCL14抗体及其抗原结合片段也可以用于体内肿瘤成像。这样的方法可以包括将放射性标记的抗CCL14抗体或其抗原结合片段注射到待测试的患者体内，以检查是否存在与CCL14表达相关的肿瘤(例如在肿瘤细胞表面上表达CCL14的肿瘤)，然后对患者身体进行核显像，以检测标记抗体或片段的存在，例如在包含高浓度的结合至肿瘤的抗体或片段的位点。检测到这样的位点表明存在CCL14+肿瘤和肿瘤细胞。

成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描)或PET成像(正电子发射断层扫描)。标签包括例如碘123(¹²³I)和锝99m(^99mTc)，例如结合SPECT成像，或者¹¹C、¹³N、¹⁵O或¹⁸F，例如结合PET成像或铟111(参见，例如Gordon等人，(2005)InternationalRev.Neurobiol.67：385-440)。

药物组合物和施用

为了制备本发明的抗CCL14抗体和抗原结合片段的药物或无菌组合物，将该抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)。

治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉剂、浆剂、水溶液或悬浮液的形式混合来制备(参见例如Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(eds.)(编)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定单独或与另一种治疗剂组合施用的本发明抗体的毒性和治疗功效，例如，用于确定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中具有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。从这些细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在循环浓度范围内，包括几乎没有毒性或无毒性的ED₅₀。剂量可以根据所采用的剂型和给药途径在该范围内变化。

在另一个实施方案中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；第57版(11月1日)，与本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段联合其他治疗剂向受试者施用。

给药方式可以变化。给药途径包括经口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮、瘤内或动脉内。

在特定的实施方案中，本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段可以通过侵入性途径例如通过注射来施用。在本发明的其他实施方案中，抗CCL14抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气雾剂递送来施用。通过非侵入性途径(例如口服，例如以丸剂、胶囊或片剂的形式)的给药也在本发明的范围内。

本发明提供了包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱，空心针或注射器筒)。本发明还提供了一种注射装置，其包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物。注射装置是通过肠胃外途径例如肌肉内、皮下或静脉内将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，例如自动注射器)，该注射器例如包括用于容纳要注射的流体(例如抗体或片段或其药物组合物)的圆筒或针筒，用于将皮肤和/或血管穿刺以注射流体的针；用于将流体推出气缸并通过针孔的柱塞。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这样的装置在插管或套管针/针中包括抗体或片段或其药物组合物，该插管或套管针/针可以附接至管，该管可以附接至用于容纳流体(例如盐水；或包含NaCl的乳酸林格液，乳酸钠，氯化钾，氯化钙和可选地包括葡萄糖)通过套管或套管针/针头引入患者体内。在本发明的一个实施方案中，一旦将套管针和套管插入受试者的静脉中并且从所插入的套管取出套管针，就可以将抗体或其片段或其药物组合物引入装置中。IV设备可以例如被插入到外周静脉中(例如，在手或手臂中)。上腔静脉或下腔静脉，或心脏右心房内(例如中枢静脉)；或进入锁骨下静脉，颈内静脉或股静脉，例如，向心脏前进直至到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线)。在本发明的一个实施方案中，注射装置是自动注射器、喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用高压窄液体射流穿透表皮，将抗体或片段或其药物组合物引入患者体内。外部输液泵是将抗体或片段或其药物组合物以受控量输送到患者体内的医疗设备。外部输液泵可以电动或机械方式供电。不同的泵以不同的方式运行，例如，注射泵将流体保持在注射器的储液器中，可移动的活塞控制流体的输送，弹性泵将流体保持在可拉伸的球囊储器中，以及来自球囊弹性壁的压力驱动流体输送。在蠕动泵中，一组滚子在一段挠性管上向下挤压，将流体向前推动。在多通道泵中，流体可以多种速率从多个储器中递送出来。

本文公开的药物组合物还可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含所述药物组合物的这种无针装置也是本发明的一部分。本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块的实例包括如下美国专利中公开的那些：美国专利号4,487,603，其中公开了可植入的微输液泵，用于以受控的速率分配药物；美国专利第4,447,233号，其中公开了一种药物输注泵，用于以精确的输注速率输送药物；美国专利第4,447,224号，其中公开了一种可变流量可植入输注设备，用于连续药物输送；美国专利第4,439,196号，其中公开了一种渗透药物输送系统，具有多腔室。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的，并且包含本发明的药物组合物的那些植入物、递送系统和模块在本发明的范围内。

或者，可以以局部而非全身的方式，例如通过将抗体或片段直接注射到肿瘤(例如CCL14⁺肿瘤)中来施用本发明的抗CCL14抗体或抗原结合片段。此外，可以在靶向药物递送系统中，例如在用组织特异性抗体包被的脂质体中施用所述抗体或片段，以靶向例如肿瘤(例如以免疫病理学为特征的CCL14⁺肿瘤)。脂质体将靶向患病组织并被其选择性吸收。这样的方法和脂质体是本发明的一部分。

给药方案取决于几个因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织周转率，症状水平，治疗性抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。优选地，给药方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现靶疾病状态的改善，同时不希望的副作用最小化。因此，所递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重性。有选择合适剂量的治疗性抗体或片段的指南可供利用(参见例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

临床医生可以例如使用本领域已知会或怀疑会影响治疗的参数或因素来确定合适的剂量。通常，剂量以比最佳剂量稍小的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用达到所需或最佳效果为止。重要的诊断措施包括症状，例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平。通常，期望将要使用的生物制品源于与用于治疗的动物相同的物种，从而使对该试剂的任何免疫应答减至最小。在人类受试者的情况下，例如，人源化和完全人类抗体可能是理想的。

本文公开的抗体或其抗原结合片段可以通过连续输注或通过例如每天一次，每周1-7次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两月一次，每季度一次，每半年一次或每年一次等施用的剂量来提供。可以例如静脉内，皮下，局部，口服，经鼻，经直肠，肌肉内，脑内，脊髓内或通过吸入来提供药剂。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重,更通常为至少0.2μg/kg,0.5μg/kg,1μg/kg,10μg/kg,100μg/kg,0.25mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/ml,10mg/kg,25mg/kg,50mg/kg或更多(参见例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(2003)CancerImmunol.Immunother.52:151-144)。也可以提供剂量以达到受试者血清中抗CCL14抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更高。在其他实施方案中，本发明的抗CCL14抗体以例如每周一次、每两周一次、“每四周一次”、每月一次、每两月一次或每季度一次以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者通过皮下或静脉内施用。

如本文所用，术语“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，本发明的抗CCL14或其抗原结合片段能够有效地引起疾病(例如癌症或癌症进展)的一种或多种症状的可测量改善的量。有效剂量还指抗体或片段的足以导致症状至少部分改善(例如肿瘤缩小或消除、缺乏肿瘤生长、增加生存时间)的量。当应用于单独给药的单个活性成分时，有效剂量是指该单独的该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断措施或参数改善至少10％；通常至少增加20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观测量评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以改善主观测量。

试剂盒

还提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述组分包括但不限于本文所讨论的抗CCL14抗体或抗原结合片段，以及一种或多种其他组分，包括但不限于药学上可接受的载体和/或治疗剂，如本文所述。所述抗体或片段和/或治疗剂可以配制为纯组合物，或者与药学上可接受的载体组合配制在药物组合物中。

在一个实施方案中，试剂盒在一个容器中(例如在无菌玻璃或塑料小瓶中)包括本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段或其药物组合物，及在另一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)包含其药物组合物和/或治疗剂。

在另一个实施方案中，所述试剂盒包含本发明的组合，包括本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体，任选地与一种或多种配制在一起的治疗剂组合，任选地在药物组合物，放在一个共同的容器中。

如果试剂盒包括用于肠胃外给药于受试者的药物组合物，则试剂盒可以包括用于进行这种给药的装置。例如，试剂盒可包括一个或多个皮下注射针头或如上所述的其他注射装置。

试剂盒可以包括包装插页，该包装插页包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息帮助患者和医生有效且安全地使用其中包装的药物组合物和剂型。例如，可以在插页中提供以下有关本发明组合的信息：药代动力学，药效学，临床研究，功效参数，适应症和用法，禁忌症，警告，注意事项，不良反应，过量，适当的剂量和给药方式，如何提供，适当的存储条件，参考文献，制造商/分销商信息和专利信息。

为了方便起见，本发明的抗CCL14抗体或其抗原结合片段可以在试剂盒中提供，即，以预定量的试剂的包装组合与进行诊断或检测测定的说明一起提供。如果抗体或片段被酶标记，则试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂，缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以无水粉末的形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。

还提供了诊断或检测试剂和试剂盒，其包含一种或多种这样的试剂，用于多种检测测定法，包括例如免疫测定法，如ELISA(夹心型或竞争形式)。试剂盒的组件可以预先连接到固体支持物上，或者可以在使用该试剂盒时应用到固体支持物的表面上。在本发明的一些实施方案中，信号产生装置可以与本发明的抗体或片段预先关联，或者可能需要在使用之前与一种或多种组分例如缓冲剂、抗体-酶缀合物、酶底物等组合。试剂盒还可包括其他试剂，例如用于减少与固相表面的非特异性结合的封闭剂，洗涤试剂，酶底物等。固相表面可以是管，珠，微量滴定板，微球或适合于固定蛋白质、肽或多肽的其他材料的形式。在特定方面，催化化学发光或生色产物的形成或者化学发光或生色底物的还原的酶是信号产生装置的组分。这样的酶是本领域众所周知的。试剂盒可包含本文所述的任何捕获剂和检测试剂。任选地，所述试剂盒还可包含用于实施本发明方法的说明书。

还提供了试剂盒，其包含包装在诸如小瓶或瓶的容器中的抗CCL14抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，并且还包括附着于或包装于该容器的标签，该标签描述容器的内容物，并提供有关使用容器的内容物治疗本文所述的一种或多种疾病状态的指示和/或说明。

在一个方面，该试剂盒用于治疗癌症，并且包含抗CCL14抗体(例如人源化抗体)或其抗原结合片段以及另外的治疗剂或疫苗。该试剂盒可以任选地进一步包括用于肠胃外例如静脉内施用的注射器。在另一方面，该试剂盒包含抗CCL14抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段以及附接到容器或包装于容器的标签，其描述抗体或片段与疫苗或其他治疗剂的用途。在另一方面，试剂盒包含疫苗或其他治疗剂和附接到容器或包装在容器上的标签，其描述疫苗或其他治疗剂与抗CCL14抗体或片段的用途。在某些实施方案中，抗CCL14抗体和疫苗或其他治疗剂位于分开的小瓶中，或在同一药物组合物中组合在一起。

如上文在组合疗法部分中所讨论的，只要在药物发挥其治疗作用的时间段内有重叠，则两种药物的同时给药不需要在同一时间或以相同途径给药。涵盖它们的同时或顺序给药，如在不同天或周给药。

还可以制备本文公开的治疗和检测试剂盒，其包含本文公开的抗体、肽、抗原结合片段或多核苷酸中的至少一种，以及使用该组合物作为检测试剂或治疗剂的说明。用于此类试剂盒的容器通常可包括至少一个小瓶，试管，烧瓶，瓶子，注射器或其他合适的容器，其中可以放置检测和/或治疗组合物中的一种或多种，并且优选适当地合适等分。在还提供第二治疗剂的情况下，试剂盒还可包含第二不同的容器，该第二检测和/或治疗组合物可置于其中。或者，可以在单一药物组合物中制备多种化合物，并且可以将其包装在单个容器中，例如小瓶，烧瓶，注射器，瓶子或其他合适的单个容器中。本文公开的试剂盒通常还将包括用于紧密封闭地容纳小瓶以进行商业销售的工具，例如将所需小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。如果试剂盒中包含放射性标记，发色，荧光或其他类型的可检测标记或检测手段，则标记试剂可以与检测或治疗组合物本身放在同一容器中，或者也可以放在第二个不同的容器中，其中可以放置第二组合物并适当等分。或者，检测试剂和标记物可以在单个容器中制备，并且在大多数情况下，试剂盒通常还将包括用于密闭容纳小瓶以用于商业销售和/或方便包装和运输的工具。

还提供了用于执行本文描述的检测或监测方法的设备或装置。这种设备可包括可将样品输入其中的腔室或管，可选地包括阀或泵以引导样品流通过该装置的流体处理系统，可选地从血液中分离血浆或血清的过滤器，混合腔室以用于添加捕获剂或检测试剂，以及可选地用于检测与捕获剂免疫复合物结合的可检测标记的量的检测装置。样品流可以是被动的(例如，通过施加样品后无需进一步操作设备的毛细管力、静液压或其他力)或主动的(例如，通过施加通过机械泵，电渗泵，离心力或增加的气压产生的力)，或通过主动力和被动力的组合。

在进一步的实施方案中，还提供了处理器，计算机可读存储器以及存储在计算机可读存储器上并且适于在处理器上执行以执行本文描述的任何方法的例程。合适的计算系统，环境和/或配置的示例包括个人计算机，服务器计算机，手持式或膝上型设备，多处理器系统，基于微处理器的系统，机顶盒，可编程消费电子产品，网络PC，小型计算机，大型计算机，分布式计算环境，其包括以上任何系统或设备，或本领域已知的任何其他系统。

一般方法

分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch和Maniatis(1982&1989 2ndEdition,2001，第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)。标准方法也记载于Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wileyand Sons,Inc.New York,NY,其中描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白的糖基化(参见例如Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人(2001)Current Protcolsin Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlowand Lane,出处同上)。表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见例如Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York)。

能够制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(编)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(编)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205；He等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6,329,511)。

人源化的替代方法是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。

描述了单链抗体和双抗体(参见例如Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods231:177-189；和美国专利号4,946,778)。提供了双功能抗体(参见例如Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods248:1-6；Brennan等人(1985)Science 229:81-83；Raso,等人(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10:3655-3659；以及美国专利号5,932,448,5,532,210和6,129,914).

还提供了多特异性抗体(参见例如Azzoni等人(1998)J.Immunol.161:3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74:9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)；Labrijin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:5145-50,2013；de Jong等人,PLOS Biol 14(1):e1002344,2016(doi:10.1371/journal.pbio.1002344)。

抗原的纯化对于产生抗体不是必需的。可以用带有目的抗原的细胞免疫动物。然后可以从免疫的动物中分离脾细胞，并且可以将脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人，出处同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。

抗体可以缀合至例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其他目的，并且包括例如偶联至染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶体金)的抗体(参见例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。

可以使用流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选(FACS)(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wileyand Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以用作诊断试剂的荧光试剂是可获得的(Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。

描述了免疫系统组织学的标准方法(参见例如Muller-Harmelink(编)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。

提供了用于确定例如抗原性片段，前导序列，蛋白质折叠，功能域，糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(参见例如GenBank,Vector

Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；

(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。

以下是本发明的优选实施方式：

1.特异性结合人CCL14的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含：

(i)重链可变区，其包含

来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列；

和

(ii)轻链可变区，其包含

来自SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列。

2.根据实施方式1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，或

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)。

3.根据实施方式1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：

SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)，

SEQ ID NO：3的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：4的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(3H1/3K1)，

SEQ ID NO：5的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：6的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(4H1/4K3)，

SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)，

SEQ ID NO：9的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：10的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(12H2/12K1)，

SEQ ID NO：11的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：12的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(17H2/17K1)，

SEQ ID NO：13的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：14的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(18H1/18K1)，

SEQ ID NO：15的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：16的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(19H2/19K3)，

SEQ ID NO：17的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：18的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(25H2/25K1)，或

SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

4.根据实施方式1-3之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合至信号产生元件。

5.根据实施方式1-3之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体被固定在固体支持物上。

6.根据实施方式1-5之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其为F(ab)和F(ab')2片段。

7.试剂盒，包括：

根据实施方式1-5中任一项所述的第一单克隆抗体或抗原结合片段，和特异性结合人CCL14的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述第一抗体或抗原结合片段和所述第二抗体或抗原结合片段与人类CCL14形成夹心复合物。

8.根据实施方式7所述的试剂盒，其中所述第二抗体或抗原结合片段是与所述第一单克隆抗体或抗原结合片段不同的根据实施方式1-5之一的分离的单克隆抗体或抗原结合片段。

9.根据实施方式7或8中任一项所述的试剂盒，其进一步包括一次性测试装置，所述测试装置被配置为产生与生物样品中人CCL14的存在或量有关的可检测信号，其中所述第一抗体或抗原结合片段或者所述第二抗体或抗原结合片段被固定在一次性测试装置内的表面上。

10.根据实施方式9所述的试剂盒，其中所述一次性测试装置是侧向流测试装置。

11.根据实施方式9或10中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体或抗原结合片段被固定在所述一次性测试装置内的表面上，并且所述第二抗体或抗原结合片段被缀合到可检测的标记上。

12.根据实施方式7或8中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体或抗原结合片段被固定在所述一次性测试装置内的表面上，并且所述第二抗体或抗原结合片段被缀合到可检测的标记上并被提供在与所述一次性测试装置分开的容器内。

13.根据实施方式7-10中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含将可检测信号与CCL14的浓度相关联的校准。

14.根据实施方式13所述的试剂盒，其中所述校准是在电子存储设备上提供的校准曲线。

15.根据实施方式7-14中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配置为执行测定方法，所述测定方法提供与生物样品中人CCL14的存在或量有关的信号，并且其中所述测定方法中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低。

16.根据实施方式7至15中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒中的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自以下的对：10H3/10K1-2H2/2K1对、10H3/10K1-31H1/31K1对、18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，在每种情况下所述抗体可以是其对应的抗原结合片段。

17.根据实施方式7-16中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合；并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)，TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)的全部或部分的表位结合。

18.根据实施方式6-17中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段；并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段是31H1/31K1或2H3/2K1或其抗原结合片段。

19.根据实施方式6-18中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)和F(ab')₂片段。

20.根据实施方式6-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段为兔抗体或其抗原结合片段。

21.根据实施方式1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段是兔抗体或其抗原结合片段。

22.一种确定生物样品中人CCL14的存在或含量的方法，包括：

用与人CCL14一起形成夹心复合物的第一单克隆抗体或其抗原结合片段和第二单克隆抗体或其抗原结合片段对生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述夹心复合物中结合的生物样品中的人CCL14的存在或量相关的可检测信号；和

将所述可检测信号与生物样品中人CCL14的存在或量相关联，其中所述第一单克隆抗体或抗原结合片段以及可选地所述第二单克隆抗体或抗原结合片段是根据实施方式1-6或21中任一项所述的抗体。

23.根据实施方式22所述的方法，其中所述免疫测定中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低。

24.根据实施方式22或23所述的方法，其中所述免疫测定以侧向流形式进行。

25.根据实施方式22-24中任一项所述的方法，其中所述免疫测定是体外诊断。

26.根据实施方式22-25中任一项所述的方法，其中通过将所述人类患者样品施加到一次性测试装置上来进行所述免疫测定，并且通过将所述一次性测试装置插入到分析仪器中来获得所述可检测信号，其中将包含第一抗体和第二抗体或抗原结合片段的夹心复合物固定在所述一次性测试装置的预定区域中以进行检测，并且其中分析仪器检测所述固定的夹心复合物以提供所述可检测的信号。

27.根据实施方式22-26中任一项所述的方法，其中所述第一抗体或抗原结合片段缀合于信号产生元件。

28.根据实施方式27所述的方法，其中所述第一抗体或抗原结合片段与所述人类患者样品形成反应混合物，并且通过将所述反应混合物施加至所述一次性测试设备而将所述人类患者样品施加至所述一次性测试设备。

29.根据实施方式27或28所述的方法，其中所述第二抗体或抗原结合片段被固定在固体支持物的预定区域。

30.根据实施方式22-29中任一项所述的方法，其中所述第一抗体和第二抗体中的每一种或抗原结合片段是兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物抗体或其抗原结合片段。

31.根据实施方式30所述的方法，其中所述第一和第二抗体中的至少一个或抗原结合片段是兔抗体或抗体片段。

32.根据实施方式22-31中任一项所述的方法，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)和F(ab')2片段。

33.根据实施方式22-32中任一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)、CCFTYTTYKIPRQR(SEQID NO：24)、DKWVQDYIKDMK(SEQ ID NO：25)、MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)、ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)中的全部或部分的表位结合，并且所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)、CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)、DKWVQDYIKDMK(SEQID NO：25)、MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)、ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)的全部或部分的表位结合，并与CCL14和所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段形成夹心复合物。

34.根据实施方式22-33中任一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合；并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)的全部或部分的表位结合。

35.根据实施方式22-34中任一项所述的方法，其中所述第一和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H2/2K1对，在每种情况下所述抗体可以是其对应的抗原结合片段。

36.根据实施方式22-35中任一项所述的方法，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段是31H1/31K1或其抗原结合片段或者2H3/2K1或其抗原结合片段。

37.一种确定生物样品中人CCL14的存在或含量的方法，其中包括：

用与人CCL14结合的单克隆抗体或其抗原结合片段对生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述生物样品中人CCL14的存在或含量相关的可检测信号；和

将所述可检测信号与生物样品中人CCL14的存在或含量相关联，其中所述测定是竞争测定，并且所述单克隆抗体或抗原结合片段是根据实施方式1-6或21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

38.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：1的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：2的框架序列具有至少90％序列相似性。

39.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：3的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：4的框架序列具有至少90％序列相似性。

40.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：5的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：6的框架序列具有至少90％序列相似性。

41.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：7的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：8的框架序列具有至少90％序列相似性。

42.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：9的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：10的框架序列具有至少90％序列相似性。

43.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：11的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：12的框架序列具有至少90％序列相似性。

44.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：13的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：14的框架序列具有至少90％序列相似性。

45.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：15的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：16的框架序列具有至少90％序列相似性。

46.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：17的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：18的框架序列具有至少90％序列相似性。

47.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ IDNO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：19的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：20的框架序列具有至少90％序列相似性。

48.单克隆抗体或抗原结合片段对，其中包含：

根据实施方式38-47中任一项所述的第一单克隆抗体或抗原结合片段；以及根据实施方式38-47中任一项所述的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其不同于所述第一单克隆抗体或抗原结合片段。

49.单克隆抗体对，其选自下述中：10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，在每种情况下所述抗体可以其对应的抗原结合片段。

50.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其特异性结合人CCL14并结合人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位。

51.根据实施方式50所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)。

52.根据实施方式51所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体为10H3/10K1、其抗原结合片段、其F(ab)片段或其F(ab')2片段。

53.一种试剂盒，其包含实施方式50-52中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及特异性结合人CCL14并与人CCL14上包含序列CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)，DKWVQDYIKDMK(SEQ ID NO：25)，MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)，ECCFTYTTYKIPR(SEQ IDNO：27)，TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)的全部或部分的表位结合的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段与人CCL14形成夹心复合物。

54.根据实施方式50-53中任一项所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段结合人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ IDNO：24)的全部或部分的表位。

55.根据实施方式50-54中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自下述的抗体对：10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，在每种情况下所述抗体可以是其对应的抗原结合片段。

56.根据实施方式55所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段之一是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个是31H1/31K1或2H3/2K1或其抗原结合片段。

57.根据实施方式53所述的试剂盒，其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

58.根据实施方式58所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段是31H1/31K1或其抗原结合片段。

59.根据实施方式53所述的试剂盒，其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)。

60.根据实施方式59所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段是2H3/2K1或其抗原结合片段。

61.根据实施方式53-60中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)或F(ab')2片段。

实施例

实施例1：兔中单克隆抗体的产生

用抗原/佐剂乳剂通过皮下注射(SQ)免疫雌性新西兰兔。使用完全弗氏佐剂进行初次免疫，随后使用不完全弗氏佐剂进行免疫。每三周以每只兔子250μg CCL14抗原(两个部位臀部和肩胛骨交替进行)向兔子SQ注射。第二次加强免疫后7天，从耳缘静脉抽取一份测试血液。通过间接ELISA测定法测试该测试血液(免疫血清)，以确定兔子的免疫应答是否足以用于单克隆抗体的开发。对反应的兔子给与最后的SQ增强，四天后通过放血安乐死。通过心脏穿刺收集全血。通过针对靶抗原的间接ELISA鉴定产生目的抗体的B细胞，并分离免疫球蛋白基因。将重链和轻链克隆到分开的哺乳动物表达载体中，转染到HEK细胞中(瞬时转染)，并收集含有兔单克隆抗体的组织培养上清液。通过DNA测序获得重链和轻链序列。

实施例2：针对CCL14的单克隆抗体的表位作图

使用线性、构象和不连续作图方法对本发明的各种单克隆抗体以及可商购的抗体AF324和MAB3241(R&D Systems)的表位进行作图。AF324是多克隆山羊抗体，而MAB3241是小鼠单克隆抗体。

Geysen和Meloen(PNAS 81：3998-4002，1984)首次提出了使用重叠的合成肽文库绘制线性表位的概念。直接在覆盖有专有水凝胶制剂的固体支持物上合成线性肽。

为了产生第一肽文库，首先在计算机上将CCL14蛋白的氨基酸序列拆分为15个残基的重叠片段，偏离一个残基，然后在固体支持物上合成。

在衍生自第一文库的肽的第二文库中，片段中第10位和第11位的每个残基都被丙氨酸取代(除非天然残基是丙氨酸，在这种情况下它被甘氨酸取代)。

在衍生自第一文库的肽的第三文库中，每个半胱氨酸被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于肽的第四文库，首先在计算机上将CCL14蛋白的氨基酸序列拆分为25个残基的重叠片段，偏离一个残基，然后在固体支持物上合成。

对于第五文库，产生了长度为17的受约束肽。第2-16位是源自CCL14靶序列的15聚体肽，偏离一个残基。将Cys残基插入位置1和17，并通过mP2 CLIPS连接以创建环状模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第六文库，产生了长度为21的受约束肽。第2-16位是源自CCL14靶序列的19聚体肽，偏离一个残基。将Cys残基插入位置1和21，并通过mP2 CLIPS连接以创建环模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第七文库，产生了长度为27的受约束的肽。第2-26位是源自CCL14靶序列的25聚体，偏离一个残基。将Cys残基插入位置1和27，并通过mP2 CLIPS连接以创建环模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第八文库，产生了长度为22的β-转角表位模拟物。第2-21位是源自CCL14靶序列的20聚体肽，偏离一个残基。第11位和12位上的残基被“PG”基序取代，以诱导β转角形成。将Cys残基插入位置1和22，并通过mP2 CLIPS连接以稳定该模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第九文库，产生了长度为22的α-螺旋表位模拟物。将Cys残基插入位置1和5，以使用mP2 CLIPS使a螺旋转角成核。将Cys残基插入位置1和22，并通过mP2 CLIPS连接以稳定模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第十文库，产生了源自CCL14的长度为25的肽。每个25聚体肽均包含半胱氨酸残基对，根据UniProt有关CCL14翻译后修饰的信息，这些半胱氨酸残基会形成二硫键。不参与二硫键形成的Cys残基被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第十一文库，产生了来自CCL14的长度为27的肽。每个27聚体由两个11聚体肽通过“GGSGG”接头连接组成。两个组合的11聚体包含一对半胱氨酸残基，根据UniProt有关CCL14翻译后修饰的信息，提示它们形成二硫键。不参与二硫键形成的Cys残基被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第十二文库，产生了长度为27的双环肽。在第2-13位和第15-26位是来自CCL14序列的12聚体肽。将Cys残基插入位置1、14和27，以便通过T3 CLIPS创建不连续的模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

对于第十三文库，产生了长度为33的双环肽。在第2-16位和第18-32位是来自CCL14序列的15聚体肽。将Cys残基插入位置1、17和33，以便通过T3 CLIPS创建不连续的模拟物。天然Cys被Cys-乙酰氨基甲基残基取代。

将抗体在缓冲液中稀释并应用于肽文库阵列。通过测试不同的封闭条件和样品浓度，针对阵列优化了每种测试的抗体。分析结果并记录结合事件，该事件至少为中值的三倍。对于在整个阵列中显示高结合信号的抗体的情况下，排除了表位作图。

基于与阵列的结合，针对本发明的抗体鉴定出以下CCL14表位：

实施例3.抗体配对

测试了本发明的各种抗体在侧向流形式中形成夹心复合物的能力。尿液用作CCL14抗原标准品的样品基质。将抗体对的一个成员(“条带”抗体)固定在硝酸纤维素膜上，并将抗体对的另一成员制备为带有标记的标记结合物，该标记可以通过ASTUTE

测量仪系统检测到以读取试纸。

使用R&D Systems目录号324-HC将CCL14标准品制备为以下目标浓度(全部为ng/mL)：20、5、2、0.5和0.2。测试的抗体为2H3/2K1、31H1/31K1、18H1/18K1和10H3/10K1。配对结果如图3所示。

为了进一步理解本发明的抗体进行配对的能力，在100μL样品体积中，以5ng/mL的单一CCL14浓度分析了各种抗体的基质。将固相“条带”抗体应用于处于3μL 0.25μg/mL溶液中的硝酸纤维素。将缀合物与样品体积混合至浓度为10μg/mL。观察到以下配对：

尽管已经对本发明进行了足够详细的描述和例示，以使本领域技术人员能够制造和使用本发明，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种替代、修改和改进应当是显而易见的。本文提供的实施例代表优选实施方案，是示例性的，并不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改包含在本发明的精神内，并由权利要求的范围限定。

除非另有说明，否则本文中“或”的使用表示“和/或”。类似地，“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“有”是可互换的，而不是限制性的。

将进一步理解的是，在各种实施方式的描述使用术语“包括”/”包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以可替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述这样的实施方式。”

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和试剂都可以用于所公开的方法和组合物的实践中，但是现在描述示例性的方法和材料。

本文中提及的所有出版物均通过引用全文并入本文，以描述和公开在出版物中描述的方法，该方法可与本文的描述结合使用。说明书中提到的所有专利和出版物都指示了在公开日之前本发明所属领域的普通技术人员的水平。本文中的任何内容均不应解释为承认发明人无权凭借在先公开而早于该公开。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。

本文说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素，一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”，“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用另外两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不意图在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，而是应当认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型，并且认为这样的修改和变型落入由所附权利要求书限定的本发明的范围内。

在所附权利要求书内阐述了其他实施方式。

Claims (61)

1.特异性结合人CCL14的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含：

(i)重链可变区，其包含:

来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列；

和

(ii)轻链可变区，其包含:

来自SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列，

来自SEQ ID NO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列,

来自SEQ ID NO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

来自SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，或

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：

SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)，

SEQ ID NO：3的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：4的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(3H1/3K1)，

SEQ ID NO：5的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：6的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(4H1/4K3)，

SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)，

SEQ ID NO：9的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：10的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(12H2/12K1)，

SEQ ID NO：11的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：12的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(17H2/17K1)，

SEQ ID NO：13的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：14的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(18H1/18K1)，

SEQ ID NO：15的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：16的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(19H2/19K3)，

SEQ ID NO：17的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：18的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(25H2/25K1)，或

SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

4.根据权利要求1-3之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合至信号产生元件。

5.根据权利要求1-3之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体被固定在固体支持物上。

6.根据权利要求1-5之一的单克隆抗体或抗原结合片段，其为F(ab)和F(ab')2片段。

7.试剂盒，包括：

根据权利要求1-5中任一项所述的第一单克隆抗体或抗原结合片段，和特异性结合人CCL14的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述第一抗体或抗原结合片段和所述第二抗体或抗原结合片段与人类CCL14形成夹心复合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述第二抗体或抗原结合片段是与所述第一单克隆抗体或抗原结合片段不同的根据权利要求1-5之一的分离的单克隆抗体或抗原结合片段。

9.根据权利要求7或8中任一项所述的试剂盒，其进一步包括一次性测试装置，所述测试装置被配置为产生与生物样品中人CCL14的存在或量有关的可检测信号，其中所述第一抗体或抗原结合片段或者所述第二抗体或抗原结合片段被固定在一次性测试装置内的表面上。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述一次性测试装置是侧向流测试装置。

11.根据权利要求9或10中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体或抗原结合片段被固定在所述一次性测试装置内的表面上，并且所述第二抗体或抗原结合片段被缀合到可检测的标记上。

12.根据权利要求7或8中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体或抗原结合片段被固定在所述一次性测试装置内的表面上，并且所述第二抗体或抗原结合片段被缀合到可检测的标记上并被提供在与所述一次性测试装置分开的容器内。

13.根据权利要求7-10中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含将可检测信号与CCL14的浓度相关联的校准。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述校准是在电子存储设备上提供的校准曲线。

15.根据权利要求7-14中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配置为执行测定方法，所述测定方法提供与生物样品中人CCL14的存在或量有关的信号，并且其中所述测定方法中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低。

16.根据权利要求7-15中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒中的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自以下的对：10H3/10K1-2H2/2K1对、10H3/10K1-31H1/31K1对、18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，或在每种情况下其对应的抗原结合片段。

17.根据权利要求7-16中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合；并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)，TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)的全部或部分的表位结合。

18.根据权利要求6-17中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段；并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段是31H1/31K1或2H3/2K1或其抗原结合片段。

19.根据权利要求6-18中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)和F(ab')₂片段。

20.根据权利要求6-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段为兔抗体或其抗原结合片段。

21.根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段是兔抗体或其抗原结合片段。

22.一种确定生物样品中人CCL14的存在或含量的方法，包括：

用与人CCL14一起形成夹心复合物的第一单克隆抗体或其抗原结合片段和第二单克隆抗体或其抗原结合片段对生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述夹心复合物中结合的生物样品中的人CCL14的存在或量相关的可检测信号；和

将所述可检测信号与生物样品中人CCL14的存在或量相关联，其中所述第一单克隆抗体或抗原结合片段以及可选地所述第二单克隆抗体或抗原结合片段是根据权利要求1-6或21中任一项所述的抗体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述免疫测定中CCL14的最小可检测浓度为10ng/mL或更低。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述免疫测定以侧向流形式进行。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述免疫测定是体外诊断。

26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中通过将所述人类患者样品施加到一次性测试装置上来进行所述免疫测定，并且通过将所述一次性测试装置插入到分析仪器中来获得所述可检测信号，其中将包含第一抗体和第二抗体或抗原结合片段的夹心复合物固定在所述一次性测试装置的预定区域中以进行检测，并且其中分析仪器检测所述固定的夹心复合物以提供所述可检测的信号。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述第一抗体或抗原结合片段缀合于信号产生元件。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一抗体或抗原结合片段与所述人类患者样品形成反应混合物，并且通过将所述反应混合物施加至所述一次性测试设备而将所述人类患者样品施加至所述一次性测试设备。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述第二抗体或抗原结合片段被固定在固体支持物的预定区域。

30.根据权利要求22-29中任一项所述的方法，其中所述第一抗体和第二抗体中的每一种或抗原结合片段是兔、小鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物抗体或其抗原结合片段。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一和第二抗体中的至少一个或抗原结合片段是兔抗体或抗体片段。

32.根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)和F(ab')2片段。

33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)、CCFTYTTYKIPRQR(SEQ IDNO：24)、DKWVQDYIKDMK(SEQ ID NO：25)、MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)、ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)中的全部或部分的表位结合，并且所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)、CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)、DKWVQDYIKDMK(SEQID NO：25)、MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)、ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)的全部或部分的表位结合，并与CCL14和所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段形成夹心复合物。

34.根据权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合；并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)的全部或部分的表位结合。

35.根据权利要求22-34中任一项所述的方法，其中所述第一和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H2/2K1对，或在每种情况下其对应的抗原结合片段。

36.根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个或其抗原结合片段是31H1/31K1或其抗原结合片段或者2H3/2K1或其抗原结合片段。

37.一种确定生物样品中人CCL14的存在或含量的方法，其中包括：

用与人CCL14结合的单克隆抗体或其抗原结合片段对生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定提供与所述生物样品中人CCL14的存在或含量相关的可检测信号；和

将所述可检测信号与生物样品中人CCL14的存在或含量相关联，其中所述测定是竞争测定，并且所述单克隆抗体或抗原结合片段是根据权利要求1-6或21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

38.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：1的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(2H3/2K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：1的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：2的框架序列具有至少90％序列相似性。

39.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(3H1/3K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：3的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：4的框架序列具有至少90％序列相似性。

40.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(4H1/4K3)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：5的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：6的框架序列具有至少90％序列相似性。

41.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：8的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(10H3/10K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：7的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：8的框架序列具有至少90％序列相似性。

42.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(12H2/12K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：9的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：10的框架序列具有至少90％序列相似性。

43.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(17H2/17K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：11的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：12的框架序列具有至少90％序列相似性。

44.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：13的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：14的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(18H1/18K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：13的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：14的框架序列具有至少90％序列相似性。

45.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：16的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(19H2/19K3)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：15的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：16的框架序列具有至少90％序列相似性。

46.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：17的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(25H2/25K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：17的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：18的框架序列具有至少90％序列相似性。

47.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

包含来自SEQ ID NO：19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含来自SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(31H1/31K1)，其中所述重链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：19的框架序列具有至少90％序列相似性，并且所述轻链可变区在框架序列内与SEQ ID NO：20的框架序列具有至少90％序列相似性。

48.单克隆抗体或抗原结合片段对，其中包含：

根据权利要求38-47中任一项所述的第一单克隆抗体或抗原结合片段；以及根据权利要求38-47中任一项所述的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其不同于所述第一单克隆抗体或抗原结合片段。

49.单克隆抗体对，其选自下述中：10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，或在每种情况下其对应的抗原结合片段。

50.一种单克隆抗体或抗原结合片段，其特异性结合人CCL14并结合人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位。

51.根据权利要求50所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：7的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：8的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(10H3/10K1)。

52.根据权利要求51所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体为10H3/10K1、其抗原结合片段、其F(ab)片段或其F(ab')2片段。

53.一种试剂盒，其包含权利要求50-52中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及特异性结合人CCL14并与人CCL14上包含序列CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)，DKWVQDYIKDMK(SEQ ID NO：25)，MDYYETNSQCSK(SEQ ID NO：26)，ECCFTYTTYKIPR(SEQ IDNO：27)，TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或ETNSQCSKP(SEQ ID NO：29)的全部或部分的表位结合的第二单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段与人CCL14形成夹心复合物。

54.根据权利要求50-53中任一项所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与人CCL14上包含序列HSVCTNPSDKWVQDYI(SEQ ID NO：23)的全部或部分的表位结合，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段结合人CCL14上包含序列ECCFTYTTYKIPR(SEQ ID NO：27)、TNSQCSKPG(SEQ ID NO：28)或CCFTYTTYKIPRQR(SEQ ID NO：24)的全部或部分的表位。

55.根据权利要求50-54中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二单克隆抗体或其抗原结合片段是选自下述的抗体对：10H3/10K1-2H3/2K1对，10H3/10K1-31H1/31K1对，18H1/18K1-31H1/31K1对和18H1/18K1-2H3/2K1对，或在每种情况下其对应的抗原结合片段。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或其抗原结合片段之一是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第一或第二单克隆抗体中的另一个是31H1/31K1或2H3/2K1或其抗原结合片段。

57.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：19的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：20的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(31H1/31K1)。

58.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段是31H1/31K1或其抗原结合片段。

59.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的重链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应重链可变区，以及SEQ ID NO：2的轻链可变区或与其框架区具有至少90％序列相似性的相应轻链可变区(2H3/2K1)。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是10H3/10K1或其抗原结合片段，并且其中所述第二单克隆抗体或其抗原结合片段是2H3/2K1或其抗原结合片段。

61.根据权利要求53-60中任一项所述的试剂盒，其中所述第一或第二单克隆抗体中的一个或两个或者其抗原结合片段是F(ab)或F(ab')2片段。

Images