CN112924692A - 一种基于多肽定量测定的糖尿病诊断试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学生物检测领域，具体为多肽组合标志物在制备糖尿病诊断试剂或试剂盒中的新用途。本发明提供了一种利用液相色谱‑质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)定量检测血清中内源多肽的方法及试剂盒，通过本发明中的试剂及方法，可以定量测定人血清中内源3个多肽标志物的含量，进而基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，用于糖尿病的预警和/或诊断。本发明的试剂盒和检测方法稳定性好，特异性高，具有临床推广的潜力。

Description

一种基于多肽定量测定的糖尿病诊断试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术及代谢性疾病的诊断、预防和治疗领域，具体地说，是基于定量测定人血浆内源多肽的方法及多肽组合标志物在制备糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒和方法。
背景技术
据2017年国际糖尿病联盟数据显示，全球糖尿病患者已有4.15亿，其中2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)占95％以上。预计到2030年，全球糖尿病患病人数将增至5.52亿。糖尿病是继心血管疾病和肿瘤后危害人类健康的第3大疾病。目前，虽然2型糖尿病的诊断标准已明确，具有口服葡萄糖耐量试验(OGTT)等金标准，但因其糖尿病初期无明显症状且潜伏期长，至症状出现或临床确诊后再干预治疗，病情往往已不可逆转，错失去了最佳干预时期，寻找用于早期预警及诊断的生物标志物对于研究糖尿病的病理、分类、早期诊断、延缓及预防糖尿病的发生具有重要意义。
采用多组学技术发现新的诊断标志物是当前研究的热点。多肽在糖尿病的发病过程及干预治疗中具有重要地位，如诸多的多肽药物如胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide 1,GLP-1)类似物、度拉鲁肽(dulaglutide)、脑钠肽(brain natriureticpeptide，BNP)等肽类制剂。多肽可以体现不同生理病理条件下蛋白的合成、加工和降解过程，同时，对基因的表达、物质代谢等过程又有调节作用，因此，采用多肽组学技术发现新型多肽生物标志物用于糖尿病的早期预警/诊断具有巨大潜力。
标志物验证：目前已发现的2型糖尿病潜在生物标志物包括基因变异、RNA转录子、多肽、蛋白质、脂质和小分子代谢产物(支链氨基酸/芳香氨基酸)等，但多为来自并发症样本，如糖尿病肾病，糖尿病伴高血压及高血糖样本,妊娠糖尿病等(中国专利CN106645757A；医学综述,2019,(20),4080-4086；Mol Cell Proteomics，2010，9(10)，2099-2108；中华实用诊断与治疗杂志,2018,32(01),1-4)，一般出现并发症，糖尿病已处于确诊且不可逆转的后期阶段，缺少针对糖尿病本身及用于早期诊断的生物标志物；此外，采用多组学技术筛选出差异标志物后缺少进一步的临床样本验证工作，因此导致临床应用价值有限；或采用ELISA或Western blot验证，实验成本高且通量不足(中国专利CN108957011；色谱，2019，37(8)：853-862；中国全科医学,2014,(21),2524-2527)。
基于以上研究中存在的问题，本发明采用非靶向多肽组学和靶向定量多肽组学结合的方法，该方法具有通量高、数据重复性好、灵敏度高的特点。采用从发现到验证的策略筛选潜在的诊断标志物，从糖尿病前期临床样本(无并发症)中成功筛选并验证人血清中内源多肽的组合标志物，可用于糖尿病的早期预警及/或诊断，该组合标志物的诊断灵敏度和特异性均良好，并制备了一种可用于定量测定目标多肽含量及用于糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒，该试剂盒目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对糖尿病早期预警诊断标志物匮乏及灵敏度低、特异性低等问题，采用非靶向多肽组学发现差异多肽及靶向多肽组学验证的策略，提供一种组合多肽标志物在糖尿病早期预警/诊断中的应用及试剂盒，同时提供了可用于上述组合多肽标志物定量分析检测的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)采用非靶向多肽组学的方法，对正常人、糖尿病初期患者、糖尿病患者(无高血压、高血脂等并发症)血清内源多肽进行非靶向分析，用无标定量的方法对差异多肽进行筛选，筛选条件包括P值、可信的置信区间等，保留满足条件的差异多肽。
(2)对(1)中差异多肽，通过合成标肽及二甲基标记，采用靶向多肽组学的方法，在另批次健康人/糖尿病患者(无高血压、高血脂等并发症)临床样本中，对上述差异多肽进行验证。并考察多肽的稳定性，初步评估用于制备开发糖尿病早期预警/诊断试剂盒的潜力。
(3)采用SPSS统计软件，通过二元逻辑回归分析，回归为组合标志物变量，采用ROC(receiver operating characteristic)曲线来评价组合标志物的灵敏性和特异性。
(4)组合标志物的使用：在糖尿病患者中，多肽GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(245)，GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAA(244)，GSEMVVAGKLQ(261)的含量发生明显变化。3条多肽回归为组合标志物变量X,二元逻辑回归方程为：
X＝1.818+5.525×C(245)+6.974×C(244)-13.743×C(261)
Prob(糖尿病)＝1/[1+e-X]
其中C表示血浆多肽的浓度；e为欧拉数，自然对数函数的底数；Prob为组合标志物变量值，当P值大于等于0.55时，诊断为糖尿病患者，否则为无糖尿病人群。
(5)诊断系统所包括的装置：色谱柱，检测仪器为液相色谱-质谱联用仪。
(6)确定试剂盒组成，共包括A,B,C,D,E,F,G七种试剂或溶液，具体为：
二甲基标记试剂：A,PBS缓冲液(PH＝8.0～8.4)；B,体积浓度4％甲醛(轻标处理试剂)和/或体积浓度4％氘代甲醛(中标处理试剂)；C,0.6M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)；D,质量浓度1％氨水；E,体积浓度5％甲酸溶液；
标准品溶液F：多肽(245，244，261)经二甲基轻标试剂处理得到的轻标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为10-40μg/mL；
含稳定同位素的内标溶液G：多肽(245，244，261)经二甲基标记中标试剂处理得到的中标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为0.3-10μg/mL。
具体步骤为：
1)超滤：取10-50μL血浆样品,10K Da超滤管离心提取内源多肽；干燥即得内源多肽样品；
2)轻标标记：将内源多肽样品采用上述二甲基标记轻标试剂A、B、C、D、E依次处理，得内源多肽二甲基标记样品(轻标)，干燥；
3)除盐：采用C18填料的TIP头或固相萃取小柱除盐，干燥；-80℃冰箱冷藏备用；
4)供试品溶液制备：将内源多肽轻标标记样品用10-50μL0.1％-1％的甲酸溶液反溶，20000g离心5-8分钟，取上清液10-40μL，加入10-40μL内标溶液G即得待测供试品溶液；
5)标准曲线的制备：标准品溶液F用0.1％-1％的甲酸溶液稀释为系列标准品溶液，取1-10μL标准品溶液，加入10-40μL空白血浆样品及10-40μL内标溶液G即可得系列标准曲线样品，其终浓度范围为5ng/mL-1000ng/mL；其中空白血浆样品为经超滤提取的内源多肽，依次用A、D、E处理并进行除盐、干燥后溶于0.1％-1％的甲酸溶液而得；采用液相色谱-质谱多反应监测(LC-MS/MRM)测定多肽的轻标及中标离子峰的强度，以二者峰面积之比对样品浓度拟合标准曲线；
6)多肽含量测定：将制备的标准曲线样品、临床样本供试品溶液分别采用LC-MS/MRM分析，以外标法计算目标多肽的含量。
(7)仪器分析条件
所述液相色谱操作条件：Waters UPLC液相色谱仪，色谱柱，Acquity UPLC@HSS,T3,1.8μm；流动相，乙腈-0.1％甲酸(A),0.1％甲酸水溶液(B)。梯度条件如下：
表1液相色谱条件
流速，ml/min 时间，分钟 流动相A％ 流动相B％
0.2 0 95 5
0.2 0.5 95 5
0.2 7.5 50 50
0.2 8 10 90
0.2 9 10 90
0.2 9.5 95 5
0.2 12 95 5
所述的质谱条件，Qtrap 5500质谱仪，质谱多反应监测(multiple reactionmonitoring,MRM)，目标3个多肽的MRM定量离子对及质谱参数如表2所示,质谱图如图1所示。
表2目标多肽的定量离子对
Figure BDA0002305577120000031
(7)采用血清样本测试本发明的应用效果。使用组合标志物正常人与糖尿病患者可得到良好的区分，如图2所示，其AUC值为0.852，灵敏度为1，特异性为0.56。最佳临界点(cut-off)为0.55。大于该临界点值诊断为糖尿病。
(8)多肽标志物的稳定性考察：本专利涉及的3条多肽在4℃冰箱中可保存2月，无论轻标样品还是中标样品，均未出现明显降解，说明本试剂盒稳定性较好。
本发明的优点在于：
1)本发明生物标志物的发现过程包括采用非靶向代谢组学方法筛选差异多肽，进而通过多肽合成确证结构，以及采用质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)的靶向定量多肽组学方法对不同批次的临床样本进行验证三个过程，其临床参考价值和可信度较高。
2)本发明提供了一种早期预警/诊断糖尿病的试剂盒，通过应用该试剂盒，可方便实现对待检临床样本中目标多肽的精确定量测定，进而应用基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量Prob以及判断截点值(cut-off)，对待检样本罹患糖尿病的风险及诊断作出初步判断。所述试剂盒具有稳定性好、诊断特异性高和灵敏度高的特点，应用于辅助早起诊断，具有较高的开发应用的价值。
附图说明
图1多肽的MRM检测图谱
图2ROC诊断模型；图注：AUC曲线下面积；sensitivity灵敏度,specificity特异性,criterion(cut-off值)界值
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：无标定量法筛选差异多肽
临床样本：23例人血清样品(包括7例健康者血清样本，7例糖尿病前期患者血清样本和9例2型糖尿病患者血清样本)来自上海第六人民医院。糖尿病前期患者和2型糖尿病患者由专家确诊或排除，三组受试人群的年龄、体重指数(BMI)、血糖等指标均相匹配。血液样品获得当地医院伦理委员会的批准，所有受试者都签署知情同意书。血液样品采集后保存于-80℃冰箱。
血清内源性多肽的提取：采用超滤离心法。具体操作流程：从-80℃冰箱中取出血样并在冰浴中解冻，涡旋混匀，20000g离心5min弃脂质。每例血清样本取25μL，加入125μL去离子水并煮沸变性5min。冷却至室温后，加入150μL体积浓度40％乙腈-0.1％甲酸的水溶液，涡旋混匀并于冰浴中静置40min。然后将样品转移到截留分子量为10kDa超滤管中，在6000g，4℃条件下离心20min，并用300μL体积浓度20％乙腈-0.1％甲酸的水溶液清洗滤饼两次。收集滤液，冷冻干燥，经除盐后，储存在-80℃冰箱中备用。进样分析前，样品复溶到25μL体积浓度0.1％FA溶液中，涡旋混匀2min，20000g，4℃离心5min，取上清液用于nano-LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS数据采集：Nano-RPLC-MS/MS系统，包括含四元梯度泵的高效液相色谱(Ultimate 3000)、自动进样器和线性离子阱-静态轨道阱(LTQ-Orbitrap Elite)，trap柱(3cm×200μm,C18)；分析柱(12cm×150μm,C18)。流动相组成：A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为80％乙腈含0.1％甲酸溶液。分离梯度设为：0-2％B，10min；2-5％B，3min；5-28％B，60min；28-45％B，15min；45-95％B，1min；95％B，5min。流速为0.5μL/min。质谱条件：LTQ离子传输管的温度设为275℃，电喷雾电压设为2.7kV。所有的数据采集模式均为数据依赖模式(data-dependent mode,DDA)，质谱全扫描在Orbitrap中采集，扫描范围为200-2000Da，分辨率设为12000。二级质谱扫描在LTQ中采集，采用碰撞诱导解离(CID)碎裂方式。利用Xcalibur软件(2.1版本，Thermo公司)进行系统控制和数据收集。
质谱数据检索分析：质谱数据利用Mascot软件进行数据检索，检索数据库为人源库(UniProt，约17万蛋白)。检索参数设为：甲硫氨酸残基(+15.9949Da)为可变修饰，无酶切，母离子质量误差为20ppm，二级碎片离子误差为0.8Da。多肽筛选门槛设定为，得分值高于20，假阳性率(FDR)小于1％。多肽定量采用MaxQuant软件进行数据分析。假阳性率(falsediscovery rate，FDR)为0.01。
差异多肽筛选:共筛选到163条差异多肽。进一步选择其中差异倍数变化较大的21条用于进一步临床样本验证，差异多肽信息如表3所示：
表3拟进一步验证的差异多肽信息
Figure BDA0002305577120000051
Figure BDA0002305577120000061
注：上调，下调的含义为，PRE组(初期糖尿病组)或T2D组(糖尿病组)多肽的含量与对照组相应多肽含量的比值，大于1则为上调；小于1则为下调。
实施例2：二甲基标记多肽及靶向MRM验证
临床样本：18例人血清样品(包括9例健康者血清样本，9例2型糖尿病患者血清样本)来自上海第六人民医院。2型糖尿病患者由专家确诊或排除，三组受试人群的年龄、体重指数(BMI)、血糖等指标均相匹配。糖尿病患者均无高血压、高血糖等并发症。血液样品获得当地医院伦理委员会的批准，所有受试者都签署知情同意书。血液样品采集后保存于-80℃冰箱。
血清内源多肽的提取：参考实施例1。
多肽的合成：根据上述表3信息，合成标肽通过比较其MS图谱进行结构的再次确证。
二甲基标记：采用下述试剂盒，制备中标内标溶液及制备标准曲线样品和临床样本供试品溶液。试剂盒组成：
二甲基标记试剂：A,PBS缓冲液(PH＝8.0)；B,体积浓度4％甲醛(轻标处理试剂)和/或体积浓度4％氘代甲醛(中标处理试剂)；C,0.6M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)；D,质量浓度1％氨水；E,体积浓度5％甲酸溶液；
标准品溶液F：多肽(245，244，261)经二甲基轻标试剂处理得到的轻标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％的甲酸，多肽的终浓度分别为40μg/mL；
含稳定同位素的内标溶液G：多肽(245，244，261)经二甲基标记中标试剂处理得到的中标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％的甲酸，多肽的终浓度分别为10μg/mL。
具体步骤为：
1)超滤：取25μL血浆样品,10K Da超滤管离心提取内源多肽；干燥即得内源多肽样品；
2)轻标标记：将内源多肽样品采用上述二甲基标记轻标试剂A、B、C、D、E依次处理，得内源多肽二甲基标记样品(轻标)，干燥；
3)除盐：采用C18填料的TIP头或固相萃取小柱除盐，干燥；-80℃冰箱冷藏备用；
4)供试品溶液制备：将内源多肽轻标标记样品用30μL0.1％的甲酸溶液反溶，20000g离心8分钟，取上清液20μL，加入10μL内标溶液G即得待测供试品溶液；
5)标准曲线的制备：标准品溶液F用0.1％的甲酸溶液稀释为系列标准品溶液，取10μL标准品溶液，加入20μL空白血浆样品及10μL内标溶液G即可得系列标准曲线样品，其终浓度范围为5ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL；其中空白血浆样品为经超滤提取的内源多肽，依次用A、D、E处理并进行除盐、干燥后溶于0.1％的甲酸溶液而得；采用液相色谱-质谱多反应监测(LC-MS/MRM)测定多肽的轻标及中标离子峰的强度，以二者峰面积之比对样品浓度拟合标准曲线；
6)多肽含量测定：将制备的标准曲线样品、临床样本供试品溶液分别采用LC-MS/MRM分析，以外标法计算目标多肽的含量。
仪器分析条件
所述液相色谱操作条件：Waters UPLC液相色谱仪，色谱柱，Acquity UPLC@HSS,T3,1.8μm；流动相，乙腈-0.1％甲酸(A),0.1％甲酸水溶液(B)。梯度条件如表1所示。
所述的质谱条件，Qtrap 5500质谱仪，质谱多反应监测(multiple reactionmonitoring,MRM)，目标21条多肽的MRM定性、定量离子对及质谱参数如表4所示。
表4 21条多肽的定性、定量离子对
Figure BDA0002305577120000071
Figure BDA0002305577120000081
Figure BDA0002305577120000091
注：L表示轻标，M表示中标。
靶向验证：定量结果表明，其中的3条多肽在正常人和糖尿病样本中出现明显差异，可用于变量回归诊断模型。从而进一步优化3条多肽的定量离子对，如表2所示。
稳定性评价：进一步评价了目标多肽的稳定性，结果表明3条多肽在4℃冰箱中放置2个月，未发现明显降解，具备用于诊断标志物的潜力。
实施例3：早期预警/诊断标志物的确定
由上述定量结果可知，在健康人和糖尿病患者两组样本中，多肽GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(245)，GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAA(244)，GSEMVVAGKLQ(261)的含量发生明显变化。
采用SPSS统计软件，通过二元逻辑回归分析，将3条多肽回归为组合标志物变量，采用ROC(receiver operating characteristic)曲线来评价组合标志物的灵敏性和特异性。以AUC大于0.8确定候选标志物。
3条多肽回归为组合标志物变量X,二元逻辑回归方程为：
X＝1.818+5.525×C(245)+6.974×C(244)-13.743×C(261)
Prob(糖尿病)＝1/[1+e-X]
其中C表示血浆多肽的浓度；e为欧拉数，自然对数函数的底数；Prob为组合标志物变量值，当P值大于等于0.55时，诊断为糖尿病患者，否则为无糖尿病人群。
截点值的确定依据为根据联合标志物变量P值作受试者工作特征曲线(ROC曲线)，取灵敏度及特异度之和最大的P值作为最佳截点值。
采用血清样本测试本发明的应用效果。使用组合标志物正常人与糖尿病患者可得到良好的区分，如图2所示，其AUC值为0.852，灵敏度为1，特异性为0.56。说明本发明的诊断模型具有较好的临床应用效果。

Claims (6)

1.多肽GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(245)，GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAA(244)，GSEMVVAGKLQ(261)组合标志物在制备糖尿病预警和/或诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的多肽组合标志物在制备糖尿病早期预警/诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中多肽245，244，261的含量。
3.根据权利要求1所述的组合标志物在制备用于诊断受试者中的糖尿病患者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒为采用液相色谱-质谱检测多肽(245，244，261)的含量的试剂的组合。
4.一种早期预警/诊断糖尿病的检测试剂盒，其特征在于，所述诊断或试剂盒包括：
(1)二甲基标记试剂：A,PBS缓冲液(PH＝8.0～8.4)；B,体积浓度4％甲醛(轻标处理试剂)和/或体积浓度4％氘代甲醛(中标处理试剂)；C,0.6M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)；D,质量浓度1％氨水；E,体积浓度5％甲酸溶液；
(2)标准品溶液F：多肽(245，244，261)经二甲基轻标试剂处理得到的轻标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为10-40μg/mL；
(3)含稳定同位素的内标溶液G：多肽(245，244，261)经二甲基标记中标试剂处理得到的中标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为0.3-10μg/mL。
5.一种采用权利要求4检测试剂盒对血清中多肽(245，244，261)的检测方法，包括以下步骤：
(1)超滤：取10-50μL血浆样品,10K Da超滤管离心提取内源多肽；干燥即得内源多肽样品；
(2)轻标标记：将内源多肽样品采用上述二甲基标记轻标试剂A、B、C、D、E依次处理，得内源多肽二甲基标记样品(轻标)，干燥；
(3)除盐：采用C18填料的TIP头或固相萃取小柱除盐，干燥；-80℃冰箱冷藏备用；
(4)供试品溶液制备：将内源多肽轻标标记样品用10-50μL0.1％-1％的甲酸溶液反溶，20000g离心5-8分钟，取上清液10-40μL，加入10-40μL内标溶液G即得待测供试品溶液；
(5)标准曲线的制备：标准品溶液F用0.1％-1％的甲酸溶液稀释为系列标准品溶液，取1-10μL标准品溶液，加入10-40μL空白血浆样品及10-40μL内标溶液G即可得系列标准曲线样品，其终浓度范围为5ng/mL-1000ng/mL；其中空白血浆样品为经超滤提取的内源多肽，依次用A、D、E处理并进行除盐、干燥后溶于0.1％-1％的甲酸溶液而得；采用液相色谱-质谱多反应监测(LC-MS/MRM)测定多肽的轻标及中标离子峰的强度，以二者峰面积之比对样品浓度拟合标准曲线；
(6)多肽含量测定：将制备的标准曲线样品、临床样本供试品溶液分别采用LC-MS/MRM分析，以外标法计算目标多肽的含量。
6.根据权利要求1所述的组合标志物在制备用于诊断受试者中的糖尿病患者的试剂盒中的应用，其特征在于，采用组合标志物变量及截点值，用于糖尿病的早期诊断及预警；可以定量测定人血清中内源多肽标志物的含量，进而基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，用于糖尿病的预警和/或诊断。
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