CN109682909A - 一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志物及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志物及其检测试剂盒，具体用血清样品中小分子代谢物半乳糖、5,8,11,14,17‑二十碳五烯酸、8,11,14‑二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯作为组合标志物在制备用于评价受试者的格列齐特适用性的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中对格列齐特显著应答患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样品中上述组合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否适于格列齐特治疗。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好和诊断灵敏度高的特点。

Description

一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志 物及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志物及其检测试剂盒。属于分析化学及临床医学及医学领域。
背景技术
磺脲类药物，主要通过结合胰腺β-细胞中的磺脲类受体刺激内源性的胰岛素分泌，是目前2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)治疗的主要口服抗糖药物之一。磺脲类单药治疗相对于安慰剂组糖化血红蛋白(glycated hemoglobin,HbA1c(％))降低1.51[参考文献1：Hirst J.A.,Farmer A.J.,Dyar A.,Lung T.W.C.,StevensR.J.Diabetologia,2013,56(5):973-984]。格列齐特缓释片(gliclazide modified-release,gliclazide MR)，是磺脲类药物的一种，其血糖控制效果好，低血糖事件少。在临床实践中，大多数T2DM病人使用磺脲类药物能得到良好的血糖控制，仍有一部分人群治疗失败。据前期文献报道，磺脲类单药治疗1年失败率在20％左右[参考文献2：Wright A.,Burden A.C.F.,Paisey R.B.,Cull C.A.,Holman R.R.,Grp U.K.P.D.S.Diabetes Care,2002,25(2):330-336]，5年的失败率达34％[参考文献3：Kahn S.E.,Haffner S.M.,HeiseM.A.,Herman W.H.,Holman R.R.,Jones N.P.,Kravitz B.G.,Lachin J.M.,O'NeillM.C.,Zinman B.,Viberti G.,Grp A.S.New England Journal of Medicine,2006,355(23):2427-2443]。然而，目前临床上缺乏评价磺脲类药物治疗2型糖尿病适用性的有效手段。因此，为了实现2型糖尿病患者的个性化治疗，开发新的有效的适用性评价方法具有非常重要的现实意义。
代谢组学是研究机体在各种病理生理条件下应答机制的有力手段，在疾病干预方式的适用性评价方面已有案例报道。如采用组合标志物色氨酸、胆红素和硫酸吲哚酚预测2型糖尿病胃旁路术的适用性[参考文献4：Luo,P.；Yu,H.；Zhao,X.；Bao,Y.；Hong,C.S.；Zhang,P.；Tu,Y.；Yin,P.；Gao,P.；Wei,L.；Zhuang,Z.；Jia,W.；Xu,G.Journal of ProteomeResearch 2016,15(4),1288-1299]，组合标志物乳酸、谷氨酸和天冬氨酸预测口腔癌诱导化疗疗效[参考文献5：Ye,G.；Liu,Y.；Yin,P.；Zeng,Z.；Huang,Q.；Kong,H.；Lu,X.；Zhong,L.；Zhang,Z.；Xu,G.J Proteome Res 2014,13(4),1994-2004]等。鉴于此，本发明采用色谱质谱联用技术检测血清样品中的代谢物，并通过化学计量学分析筛选出组合标志物，有望为磺脲类药物治疗2型糖尿病的适用性评价提供有效手段。
本发明涉及的组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯参与人体多种病理生理过程。有研究发现半乳糖处理的小鼠表现出高的糖基化终端产物水平、活性氧产生和炎症[参考文献6：Lu J,Wu DM,Zheng YL,etal.Cerebral cortex,2010,20:2540-2548；参考文献7：Ali T,Badshah H,Kim TH,KimMO.Journal of Pineal Research,2015,58:71-85]。5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬酯酸甲酯参与脂质分子代谢，脂质从头合成作用使饱和的偶数碳链脂质分子水平升高，并增加了T2DM风险[参考文献8：Lodhi I.J.,Wei X.,Semenkovich C.F.Trends in Endocrinology and Metabolism,2011,22(1):1-8]。过量的脂肪酸及脂质代谢对胰腺β细胞造成脂毒性，还会引起炎症反应，进而使胰岛素敏感性受损[参考文献9：Liang H.,Tantiwong P.,Sriwijitkamol A.,Shanmugasundaram K.,MohanS.,Espinoza S.,DeFronzo R.A.,Dube J.J.,Musi N.Journal of Physiology-London,2013,591(11):2897-2909]。目前为止，尚无研究将半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯作为组合标志物应用于格列齐特治疗2型糖尿病的适用性评价。
发明内容
本发明的目的是针对磺脲类药物治疗2型糖尿病部分人群非应答，且缺乏有效的药物适用性评价的临床问题，提供一种新的血清代谢物组合在格列齐特治疗2型糖尿病的适用性评价中的应用。该血清代谢物组合包括半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，并提供了可用于检测上述组合标志物的方法。方法如下：
(1)采用气相色谱-质谱联用仪对格列齐特治疗2型糖尿病显著应答和非应答患者的基线血清样品进行代谢轮廓分析，对代谢物进行筛选，保留显著差异的代谢物(p<0.05)；
(2)对(1)中保留的差异代谢物，采用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，回归为组合标志物变量，采用ROC(receiver operating characteristic)曲线来评价组合标志物的诊断灵敏性和特异性；
(3)组合标志物的使用：在格列齐特显著应答组中半乳糖的含量显著上调，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的含量显著下调，如图1所示。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，将半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯回归为组合标志物变量P，二元逻辑回归方程为：
P＝1/(1+e-X)
X＝3.974-3.342*8,11,14-二十碳三烯酸甲酯*10-3-3.127*5,8,11,14,17-二十碳五烯酸*10-4+8.052*半乳糖*10-6-9.945*棕榈酸甲酯*10-5。
其中P为受试者对格列齐特显著应答的概率，当P值大于0.584时，指示所述受试者对格列齐特显著应答，适用于格列齐特治疗。
(4)应用另一批独立的样本对(3)中发现的组合标志物进行验证，确定半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯可作为辅助评价受试者的格列齐特适用性的组合标志物；
(5)诊断系统所包括的装置：色谱柱为安捷伦DB-5MS色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；检测仪器为气相色谱-质谱联用仪；
(6)确定试剂盒组成：
a.血清样品前处理试剂包括：
标准化学品：半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，所述标准品分别用于对应的血清样品代谢物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的定性；
含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，即含内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的甲醇溶液，用于血清样品的蛋白沉淀和代谢物提取；
衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品，包括溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液，用于对含羰基的代谢物进行肟化反应，以防止其开环闭环；以及N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，用于代谢物的硅烷化衍生，以增加代谢物的挥发性，利于气相色谱-质谱联用仪检测；
b.仪器分析条件：
所述的气相色谱条件：DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,AgilentTechnologies,USA)；柱温采用程序升温，70℃保持3min，以5℃/min的速度升至300℃，保持10min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，柱内流速为1.19mL/min，保持恒速模式。
所述质谱条件：EI源，70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃；采用全扫描模式采集数据，扫描范围为m/z 33-600；采用选择离子模式采集数据，半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的特征离子分别是m/z319、91、80和87，内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的特征离子分别是m/z247、271和135；扫描速度为0.25s/scan，起始数据采集时间为5.7min，检测电压参考调谐文件的电压值；
根据对血清样品全扫描模式采集的数据进行处理，选择代谢物的特征离子，对样本进行选择离子扫描采集数据，灵敏度高，重复性好，可提高数据质量。其中半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的特征离子分别是m/z319、91、80和87，内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的特征离子分别是m/z247、271和135；其中半乳糖采用富马酸-2,3-d2校正，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸和8,11,14-二十碳三烯酸甲酯采用葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7校正，棕榈酸甲酯采用十三酸校正；获得半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯相对各自内标的相对浓度；以上述半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算组合标志物变量P。所述气相色谱-质谱联用仪检测时，根据全扫描模式的数据对代谢物定性，将质谱图与NIST11质谱库里半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的标准质谱图进行比对，匹配程度达到65％以上时认为是半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，并采用标准品验证。
(7)采用血清样品测试本发明的应用效果。分别采用两批次对格列齐特显著应答和非应答的2型糖尿病患者的血清样品，使用组合标志物对格列齐特显著应答和非应答的2型糖尿病患者可得到良好的区分：在发现阶段，其AUC值分别为0.821，灵敏度89.4％，特异度62.5％，预测准确率82.2％，见图2所示；在独立样本验证阶段，其AUC值分别为0.852，灵敏度81.8％，特异度75.0％，预测准确率80.8％，见图3所示。
本发明优点在于：
1.本发明所涉及的检测试剂盒，对组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性好等优点；
2.本发明所涉及的组合标志物，在发现阶段和独立样本验证阶段均能很好的评价受试者的格列齐特适用性，诊断准确率高。
附图说明
图1实施例1中组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯在受试者对格列齐特显著应答组和非应答组中的相对浓度值。
图2实施例1中组合标志物用于评价格列齐特对受试者是否适用的ROC曲线图，AUC值、灵敏度、特异性值和诊断准确率。
图3实施例2中组合标志物用于评价格列齐特对受试者是否适用的ROC曲线图，AUC值、灵敏度、特异性值和诊断准确率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1、血清样品采集
血清样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
包括100名新诊断2型糖尿病患者，2型糖尿病诊断参考世界卫生组织的标准[参考文献10：Alberti,K.；Zimmet,P.Z.；Consultation,W.H.O.1998,15(7),539-553]。排除1型糖尿病、线粒体糖尿病或服用过抗糖药物的患者，还排除怀孕、癌症、心力衰竭或肾衰竭患者。经过2周的导入期(仅饮食和锻炼治疗)后，100个病人开始格列齐特缓释片治疗(基线)，分别于第2、4、8、12、16周随访并进行临床评估。在此期间，10个病人因未完成整个疗程而被排除，最终共有90个病人完成16周的格列齐特治疗。采集病人基线血清样品，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
2、分析方法
2.1血清样品预处理
样品在4℃条件下解冻，取50μL血清，加入200μL含内标化合物的甲醇提取液(内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的浓度分别为0.1μg/mL、5μg/mL和200μg/mL)，用涡旋混合仪震荡混匀30s，在高速离心机中离心(14000rpm、15min、4℃)，吸取上清液冻干。于冻干样本中，加入50μL本溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液，室温超声1min，再涡旋混合仪震荡混匀30s，放置于37℃下水浴90min。然后加入40μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋混合仪震荡混匀10s，于37℃下水浴60min。高速离心机离心(14000rpm、10min、4℃)，取上清液进样分析。
2.2气相色谱-质谱联用仪分析
色谱条件：DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)；柱温采用程序升温，70℃保持3min，以5℃/min的速度升至300℃，保持10min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，柱内流速为1.19mL/min，保持恒速模式。
所述质谱条件：EI源，70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃。采用选择离子模式采集数据(组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的特征离子分别是m/z 319、91、80和87，内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的特征离子分别是m/z 247、271和135)，扫描速度为0.25s/scan，起始数据采集时间为5.7min，检测电压参考调谐文件的电压值。
3、血清测试结果及辅助预测分析
提取组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的峰面积，对代谢物的峰面积进行内标校正得到相应的相对浓度(其中半乳糖采用富马酸-2,3-d2校正，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸和8,11,14-二十碳三烯酸甲酯采用葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7校正，棕榈酸甲酯采用十三酸校正)。定量分析组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯在受试者对格列齐特显著应答和非应答组中的血清含量，结果如图1所示，与非应答组相比，对格列齐特显著应答组中半乳糖的血清含量显著上调，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的血清含量显著下调。
使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，将半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯回归为组合标志物变量P，二元逻辑回归方程为：
P＝1/(1+e-X)
X＝3.974-3.342*8,11,14-二十碳三烯酸甲酯*10-3-3.127*5,8,11,14,17-二十碳五烯酸*10-4+8.052*半乳糖*10-6-9.945*棕榈酸甲酯*10-5。
其中P为受试者对格列齐特显著应答的概率，P值在受试者对格列齐特显著应答组增高，该变量可用于评价受试者对格列齐特是否显著应答。
图2中，该组合标志物通过判断变量P用于评价受试者的格列齐特适用性，得到ROC曲线的曲线下面积AUC值0.821，当灵敏度和特异性之和最大时，对应的灵敏度为89.4％，特异性为62.5％，截点值为0.584，诊断准确率为82.2％。以上结果表明该组合标志物能够较好的评价受试者的格列齐特适用性。
实施例2
1、血清样品采集
血清样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
包括26名新诊断2型糖尿病患者，2型糖尿病诊断参考世界卫生组织的标准[参考文献10：Alberti,K.；Zimmet,P.Z.；Consultation,W.H.O.1998,15(7),539-553]。排除1型糖尿病、线粒体糖尿病或服用过抗糖药物的患者，还排除怀孕、癌症、心力衰竭或肾衰竭患者。经过2周的导入期(仅饮食和锻炼治疗)后，26例病人开始格列齐特缓释片治疗(基线)，分别于第2、4、8、12、16周随访并进行临床评估。采集病人基线血清样品，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
2、分析方法
同实施例1。
3、血清测试结果及辅助预测分析
采用同实施例1相同的方法，得到组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的血清相对浓度。将半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的相对浓度值带入到实施例1得到的二元逻辑回归方程，计算判断变量P，验证组合标志物的评价效果。结果如图3所示，通过判断变量P得到ROC曲线的曲线下面积AUC值0.852，截点值为0.584时，灵敏度为81.8％，特异性为75.0％，诊断准确率为80.8％。
以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (4)

1.用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的血清组合标志物，其特征在于：所述组合标志物由半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯组成。
2.一种用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性诊断试剂或试剂盒，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒包括半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯。
3.根据权利要求2所述的用于评价2型糖尿病的格列齐特适用性的诊断试剂或试剂盒，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒包括：
(1)标准化学品：半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，所述标准品分别用于对应的血清样品代谢物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的定性；
(2)含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，即含内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的甲醇溶液；
(3)衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品，即溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。
4.一种非诊断目的的计算受试者的血清样品中组合标志物变量的方法，其特征在于：所述组合标志物包括半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯，采用气相色谱-质谱联用仪检测受试者血清样品中半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的含量，所述方法包括以下步骤：
(1)使用含内标化合物的提取液预处理来自受试者的血清样品，沉淀血清样品中的蛋白并提取代谢物，将上清液冷冻干燥后，用溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺分别对冻干样品进行衍生化反应，取上清液，采用气相色谱-质谱联用仪检测；
(2)所述气相色谱-质谱联用仪检测，其特征在于，所述的气相色谱条件：DB-5MS色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；柱温采用程序升温，70℃保持3min，以5℃/min的速度升至300℃，保持10min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:10；以纯度为99.9995％的氦气作为载气，柱流量为1.19mL/min，保持恒流模式；
所述质谱条件：EI源，70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃；采用全扫描模式采集数据，扫描范围为m/z 33-600；采用选择离子模式采集数据，半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的特征离子分别是m/z 319、91、80和87，内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的特征离子分别是m/z247、271和135；扫描速度为0.25s/scan，起始数据采集时间为5.7min，检测电压参考调谐文件的电压值；
(3)在气相色谱-质谱联用仪检测获得的总离子流图上，提取所述组合标志物半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯以及内标化合物富马酸-2,3-d2、十三酸和葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7的峰面积；
(4)对每一个受试者血清样品中所述组合标志物的峰面积分别与内标化合物的峰面积比较，其中半乳糖采用富马酸-2,3-d2校正，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸和8,11,14-二十碳三烯酸甲酯采用葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7校正，棕榈酸甲酯采用十三酸校正；获得半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯相对各自内标的相对浓度；
(5)以上述半乳糖、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸甲酯和棕榈酸甲酯的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算组合标志物变量P。
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