CN113155983A - 一种组合标志物及其应用和检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血清样品中小分子代谢物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇作为组合标志物在制备用于诊断糖尿病患者有无视网膜病变的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测糖尿病患者中视网膜病变的试剂盒，通过检测来自糖尿病患者的血清中上述组合标志物的各自相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量Prob值以及判断截点值(cut‑off值)，判断所述糖尿病患者是否患有视网膜并发症。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低、重复性好的特点。本发明可以应用于辅助糖尿病人群中视网膜并发症诊断，且在早期的糖尿病性视网膜病变的诊断中效果同样良好，具有较好的应用前景。

Description

一种组合标志物及其应用和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新的小分子组合标志物在诊断糖尿病患者的视网膜病变中的应用。属于分析化学，生物化学及临床医学领域。
背景技术
糖尿病是最常见的全球性代谢疾病之一，其发病率一直在逐年增长。糖尿病性视网膜病变是糖尿病患者中最常见的微血管并发症之一，也是造成成人视力障碍及失明的主要原因[参考文献1：Nentwich M M,Ulbig M W.Diabetic retinopathy-ocularcomplications of diabetes mellitus[J].World journal of diabetes,2015,6(3):489.]。通过瞳孔扩大(瞳孔散大)后进行眼底检查以使整个视网膜可视化，可以临床评估糖尿病性视网膜病的存在和等级。糖尿病性视网膜病变可分为背景型视网膜突变期和增殖性视网膜病变期，参考1984年中华医学会眼科学分会的糖尿病性视网膜病变的分期标准，背景型视网膜突变期又可分为：1期，出现小的出血点或者微血管瘤；2期，已发现的硬性渗出；3期，软性棉絮状的渗出。在早期糖尿病性视网膜病变中，眼底激光治疗可有效地预防视力丧失。然而，由于早期糖尿病性视网膜病的视力没有丧失，患者可能会并未注意到早期糖尿病性视网膜病。因此对于糖尿病患者，必须定期去医院对视网膜进行检查，以便及时发现威胁视力的变化。目前的临床诊断主要方法为眼底照相检查及眼底荧光造影检查[参考文献2：Kollias A N,Ulbig M W.Diabetic retinopathy:early diagnosis and effectivetreatment[J].Deutsches Arzteblatt International,2010,107(5):75.]，该方法具有成本较高，过程繁琐，检查时需静脉注入造影剂，可能会加重有心脏、肾脏功能不全患者的病情，对荧光素钠过敏的患者不适用的特点，针对早期视网膜病变的确诊较为困难的临床问题，开发新的临床诊断方法具有非常重要的现实意义。
代谢组学是研究机体在各种病理生理条件下应答机制的有力手段，可以通过发现潜在的生物标志物来辅助临床疾病的诊断，指导个性化治疗和研究疾病发病机制。例如，罗萍等人使用基于代谢组学方法对健康对照、慢性乙型肝炎病毒感染和肝硬化和肝细胞性肝癌(HCC)患者血清代谢谱进行表征，筛选出了苯丙氨酰-色氨酸和甘氨胆酸盐的血清代谢HCC生物标志物组合，该组合标记物具有比甲胎蛋白(AFP)更高的诊断性能[参考文献3：LuoP,Yin P,Hua R,et al.A Large-scale,multicenter serum metabolite biomarkeridentification study for the early detection of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2018,67(2):662-675.]。穆英等人基于代谢组学的方法定义了半胱氨酸、丝氨酸和单油酸甘油酯血清组合标志物，该组合标志物可以很好的判别非小细胞肺癌组和健康对照组[参考文献4：Mu Y,Zhou Y,Wang Y,et al.Serum Metabolomics Study ofNonsmoking Female Patients with Non-Small Cell Lung Cancer Using GasChromatography–Mass Spectrometry[J].Journal of proteome research,2019,18(5):2175-2184.]。目前已有多种分析技术应用于代谢组学检测，如核磁共振、气相色谱-质谱、液相色谱-质谱、毛细管电泳色谱-质谱等，其中气相色谱-质谱的应用最为成熟，且应用广泛。
本发明利用气相色谱-质谱联用技术检测糖尿病患者血清代谢谱，并通过二元逻辑回归分析优选出了组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇，以用于判别糖尿病患者中有无视网膜病变的并发症。乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇参与人体多种病理生理过程。乙醇胺是生命必需的物质，它以磷脂酰乙醇胺(和其他脂类)头部基团的形式存在于人体的每个细胞中，同时在体液中以不同浓度的游离乙醇胺的形式存在。据报道乙醇胺可刺激哺乳动物细胞快速生长，因此被称为生长因子，同时乙醇胺和磷酸乙醇胺以剂量依赖的方式通过未知的机制抑制线粒体呼吸[参考文献5：Patel D,Witt S N.Ethanolamineand phosphatidylethanolamine:partners in health and disease[J].Oxidativemedicine and cellular longevity,2017,2017.]。研究报道乙醇胺在胰腺癌组织中升高，并可单独作为诊断标志物[参考文献6：Battini S,Faitot F,Imperiale A,etal.Metabolomics approaches in pancreatic adenocarcinoma:tumor metabolismprofiling predicts clinical outcome of patients[J].BMC medicine,2017,15(1):56.]。延胡索酸是细胞能量代谢的重要中间产物，可能在组织氧化应激中起作用，已有研究表明延胡索酸在增殖性糖尿病性视网膜病变血浆中升高[参考文献6：Zhu X R,Yang F,LuJ,et al.Plasma metabolomic profiling of proliferative diabetic retinopathy[J].Nutrition&metabolism,2019,16(1):37.]。据报道，亚牛磺酸可提高人脑胶质瘤细胞中HIF-1α的稳定性，抑制脯氨酰羟化酶2、5-mC羟化酶和组蛋白脱甲基酶，在胶质瘤组织中含量升高，可能是神经胶质瘤中潜在的代谢物[参考文献7：Gao P,Ji M,Fang X,etal.Capillary electrophoresis–mass spectrometry metabolomics analysis revealedenrichment of hypotaurine in rat glioma tissues[J].Analytical biochemistry,2017,537:1-7.]。肌醇是脑组织中重要的渗透压或细胞体积调节剂，实验表明高渗性脑细胞中的肌醇转运被上调，糖尿病组中肌醇的增加可能与神经胶质增生或渗透压改变有关[参考文献8：Tong J,Geng H,Zhang Z,et al.Brain metabolite alterationsdemonstrated by proton magnetic resonance spectroscopy in diabetic patientswith retinopathy[J].Magnetic resonance imaging,2014,32(8):1037-1042.]。目前为止，尚无研究将乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇作为组合标志物用于诊断糖尿病患者中有无视网膜病变。
发明内容
本发明的目的是针对糖尿病人群中视网膜病变诊断困难，尤其是早期的视网膜病变并发症难以区分的临床问题，提出了一种新的血清代谢组合标志物能够应用于糖尿病患者中视网膜病变的诊断。该血清代谢组合标志物包括乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇，所述组合标志物特征和检测方法如下：
(1)采用气相色谱-质谱联用仪对糖尿病患者血清样品进行代谢轮廓分析，对代谢物进行筛选，保留经非参数检验后显著差异(P<0.05，FDR<0.01)，变化倍率大于1.3或小于0.7，并且仪器分析过程的质控样品中相对标准偏差RSD<20％的代谢物。
(2)对(1)中保留的13种差异代谢物(乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇、2，3-丁二醇、苯甲酸、β-丙氨酸、苹果酸、次黄嘌呤、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸)，采用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，回归得4个组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇。
(3)将糖尿无视网膜病变并发症患者和糖尿病有视网膜病变并发症患者(包括1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性视网膜病变)两类样本中随机选出2/3的样本作为发现集。剩下1/3样本作为验证集。发现集样品用于建模，得到组合标记物变量的Prob值和截点值；验证集样品用于模型验证。
(4)将发现集中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇内标校正后的相对浓度通过SPSS软件进行二元逻辑回归建模分析，采用受试者工作(ROC，receiver operatingcharacteristic)曲线来评价组合标志物的诊断敏感性和特异性。所建模型的回归方程如下：
Prob(糖尿病性视网膜病变)＝1/[1+e-(5.222*A+47.032*B+17.838*C+0.739*D-3.138)]；
其中Prob(糖尿病性视网膜病变)为糖尿病人群中患有视网膜病变的概率，A、B、C、D分别为乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇内标校正后的相对浓度；乙醇胺采用内标D5-苯丙氨酸校正，延胡索酸和亚牛磺酸采用十三酸校正，肌醇采用D4-琥珀酸校正。所得变量Prob(糖尿病性视网膜病变)在有视网膜病变的糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断糖尿病人群中的视网膜病变，本发明确定的该组合标志物的对糖尿病人群中是否有视网膜病变的最佳截点值设为0.753，对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值的则可能为有视网膜病变。也可以根据实验者的实验结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据组合标志物变量Prob值作ROC曲线，ROC曲线的纵坐标为敏感度，横坐标为(1-特异性)，取敏感度与特异性之和最大的Prob值作为最佳截点值，该点对应的敏感性和特异性即为该组合标志物对应的敏感性与特异性。
(5)应用验证集样本对组合标志物进行验证，确定乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇可作为辅助诊断糖尿病患者有无视网膜病变的组合标志物。
(6)诊断系统所包括的装置：色谱柱为安捷伦DB-5MS色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；检测仪器为气相色谱-质谱联用仪。
(7)确定试剂盒组成：
a.血清样品前处理试剂包括：
标准品：乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇，所述标准品分别用于对应的血清中代谢物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的定性。
含内标化合物的提取液：含有内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇溶液，内标化合物的浓度为5～20μg/mL，所述提取液用于预处理来自糖尿病患者的血清样品。
衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品，包括浓度为20mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，分别用于对含羰基的代谢物进行肟化反应以及代谢物进行硅烷化衍生。
b.血清样本前处理方法：
取50～200μL的血清，加入4倍体积含内标提取液，涡旋混合均匀。在4～10℃条件下，13000～14000rpm离心10～15min，取上清液冻干。冻干样品进行15～20mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺衍生化处理，进行气相色谱-质谱分析。
c.仪器分析条件：
所述的气相色谱条件：DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,AgilentTechnologies,USA)；程序升温条件为80℃保持1min，以30℃/min的速度升至210℃，然后以20℃/min的速度升至320℃，保持4min。进样口温度320℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，线速度40cm/sec，采用恒线速度模式。
所述质谱条件：EI源，70eV，离子源和传输线温度分别是230℃和300℃。采用全扫描模式采集数据(m/z 33-600)，扫描速度为0.20s/scan，起始数据采集时间为2.92min，检测电压参考调谐文件的电压值。也可根据全扫描模式采集的数据进行处理，选择化合物的特征离子，对样本进行选择离子扫描采集数据，灵敏度高，重复性好，可提高数据质量。其中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的特征离子分别是m/z 174、245、188和305，内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的特征离子分别是m/z 251、125及197和271。
糖尿病患者的血清样品经气相色谱-质谱分析后，根据标准品的保留时间或保留指数以及全扫描模式获取的质谱图信息对乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇进行定性。也可将代谢物质谱图与质谱库中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的标准质谱图进行比对，并采用乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇标准品所获取的保留时间或保留指数进行验证。提取并记录乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇和内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的特征离子峰强度，计算以上所述四种代谢物经内标校正后的相对值，乙醇胺采用内标D5-苯丙氨酸校正，延胡索酸和亚牛磺酸采用十三酸校正，肌醇采用D4-琥珀酸校正，获得以上乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇各自的相对浓度。基于二元逻辑回归方程计算组合型标志物变量Prob值，比较所得Prob值与最佳截点值的大小，进而判断糖尿病患者有无视网膜病变。
(8)采用发现集和验证集血清样本检测本发明的应用效果，结果如下：
定量分析发现集和验证集中组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇在糖尿病对无视网膜病变组和有视网膜病变组(包括1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组)血清中含量，结果如表1和图1柱状图所示，左侧白色柱状图为发现集，右侧灰色柱状图为验证集。与无视网膜病变相比，有视网膜病变组血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇含量显著上调。
所建立模型中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇组合标志物对糖尿病性视网膜病和早期糖尿病性视网膜病变均具有较好的判别能力(1期)。发现集和验证集的ROC曲线下面积(AUC)均在0.7～0.9之间，具有中等诊断价值，同时组合标记物具有较好的敏感性、特异性和诊断正确率(见表2)。
对于糖尿病无视网膜病变与糖尿病有视网膜病变，该小分子代谢组合标志物在发现集和验证集中均具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。在发现集中AUC＝0.811，灵敏度为0.714，特异性为0.811，正确诊断率为0.737；其中1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性糖尿病性视网膜病变的正确诊断率分别为0.807、0.769、0.763和0.728(见表2和图2)。在验证集中AUC＝0.827，灵敏度为0.690，特异性为0.838，正确诊断率为0.725；其中1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性糖尿病性视网膜病变的正确诊断率分别为0.757、0.716、0.831和0.790(见表2和图3)。优异的ROC曲线结果和发现集、验证集中良好的诊断准确率使得该组合标志物具有辅助糖尿病人群中视网膜病变的诊断潜力。
对于糖尿病无视网膜病变与早期糖尿病性视网膜病变，该小分子代谢组合标志物在发现集和验证集中也均具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。在发现集中AUC＝0.860，灵敏度为0.803，特异性为0.811；在验证集中AUC＝0.814，灵敏度为0.667，特异性为0.838(见表2和图4)。优异的ROC曲线结果和发现集、验证集中良好的诊断准确率使得该组合标志物具有辅助糖尿病人群中早期视网膜病变的诊断潜力。
本发明效果：通过检测来自糖尿病患者血清样品中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇组合标志物的相对浓度，基于二元逻辑回归计算所述组合标志物变量Prob值，再基于确定的截点值，可以用于判别所述糖尿病患者是否患有视网膜病变，同时该组合标志物对于早期的视网膜病变并发症也能有良好的诊断效果。本发明涉及的组合标志物对糖尿病人群中视网膜病变诊断具有操作简便、灵敏度高、特异性好、重复性好的特征，具有较好的应用前景。
附图说明
图1，血清样本中组合标志物中各代谢物相对浓度在糖尿病性视网膜病变各个时期的变化(均值±标准偏差)。(A)乙醇胺；(B)延胡索酸；(C)亚牛磺酸；(D)肌醇。左侧白色柱状图为发现集，右侧灰色柱状图验证集。纵坐标表示相对于提取剂中5μg/mL内标化合物血清中组合标记物的浓度，乙醇胺相对于内标D5-苯丙氨酸，延胡索酸和亚牛磺酸相对于十三酸，肌醇相对于D4-琥珀酸；横坐标0，1，2，3，4分别代表糖尿病无视网膜病变对照组，1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组。
图2，发现集中组合标志物在判别糖尿病人群中有无视网膜病变的(A)ROC曲线以及(B)诊断结果图。横坐标0，1，2，3，4分别代表糖尿病无视网膜病变对照组，1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组。
图3，验证集中组合标志物在判别糖尿病人群中有无视网膜病变的(A)ROC曲线以及(B)诊断结果图。横坐标0，1，2，3，4分别代表糖尿病无视网膜病变对照组，1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组。
图4，组合标志物在判别糖尿病人群中有无早期视网膜病变的ROC曲线。(A)发现集；(B)验证集。横坐标0，1分别代表糖尿病无视网膜病变对照组，1期轻度糖尿病性视网膜病变组。
具体实施方式
实施例1
1.血清样品采集
血清样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
相同条件下采集血清样本：74例无视网膜病变的糖尿病人作为对照组和234例有视网膜病变的糖尿患者(其中，1期轻度糖尿病性视网膜病变组66例，2期中度糖尿病性视网膜病变组60例，3期重度糖尿病性视网膜病变组57例，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组51例)作为疾病组，采集后将样本置于-80℃冰箱保存，备检。
2.分析方法
2.1血清样品预处理
样品在4℃条件下解冻，取50μL血清，加入200μL含内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇提取液(浓度分别为5μg/mL)，涡旋振荡30s，离心(14000rpm，10min，4℃)，吸取上清液冻干。于冻干样本中，加入50μL甲氧胺盐的吡啶溶液(浓度为20mg/mL)，涡旋使样品溶解，于37℃条件下恒温孵育1.5h。然后加入40μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋振荡30s，于37℃条件下恒温孵育1h。离心(14000rpm，10min，4℃)，取上清液进行气相色谱-质谱检测分析。
2.2气相色谱-质谱联用仪分析
(1)色谱条件
DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)；程序升温条件为80℃保持1min，以30℃/min的速度升至210℃，然后以20℃/min的速度升至320℃，保持4min。进样口温度320℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，线速度40cm/sec，采用恒线速度模式。
(2)质谱条件
EI源，70eV，离子源和传输线温度分别是230℃和300℃。采用全扫描模式采集数据(m/z 33-600)，扫描速度为0.20s/scan，起始数据采集时间为2.92min，检测电压参考调谐文件的电压值。
3.血清测试结果及辅助预测分析
提取组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇和内标化合物的特征离子峰强度，对代谢物的峰强度进行内标校正得到相应的相对浓度，乙醇胺采用内标D5-苯丙氨酸校正，延胡索酸和亚牛磺酸采用十三酸校正，肌醇采用D4-琥珀酸校正。定量分析组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇在糖尿病对无视网膜病变组和有视网膜病变组(包括1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组)血清中的含量，结果如表1及图1左侧白色柱状图所示，与无视网膜病变相比，有视网膜病变组血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇含量显著上调。同时将各代谢物的相对含量代入SPSS软件进行二元逻辑建模分析，所建模型的回归方程如下：
Prob(糖尿病性视网膜病变)＝1/[1+e-(5.222*A+47.032*B+17.838*C+0.739*D-3.138)]；
其中Prob(糖尿病性视网膜病变)为糖尿病人群中患有视网膜病变的概率，A、B、C、D分别为乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇内标校正后的相对浓度。本发明确定的该组合标志物的对糖尿病人群中是否有视网膜病变的最佳截点值设为0.753，Prob(糖尿病性视网膜病变)值高于该截点值的则可能为有视网膜病变；e是自然对数函数的底数，有时称它为欧拉数(Euler number)。
对于乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇组合标志物建模所得Prob值与视网膜病变程度(眼底造影所得分组)做ROC曲线，用于评价组合标志物对于判别糖尿病无视网膜病变与糖尿病有视网膜病变的适用性。对于糖尿病无视网膜病变与糖尿病有视网膜病变，该小分子代谢组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.811，灵敏度为0.714，特异性为0.811，正确诊断率为0.737；其中1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性糖尿病性视网膜病变的正确诊断率分别为0.807、0.769、0.763和0.728(见表2和图2)。对于糖尿病无视网膜病变与糖尿病早期视网膜病变，该小分子代谢组合标志物在也具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.860，灵敏度为0.803，特异性为0.811(见表2和图4)。
实施例2
1.血清样品采集
血清样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
相同条件下采集血清样本：37例无视网膜病变的糖尿病人作为对照组和116例有视网膜病变的糖尿患者(其中，1期轻度糖尿病性视网膜病变组33例，2期中度糖尿病性视网膜病变组30例，3期重度糖尿病性视网膜病变组28例，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组25例)作为疾病组，采集后将样本置于-80℃冰箱保存，备检。
2.分析方法
同实施例1。
3.血清测试结果及辅助预测分析
实施例2验证集的结果与实施例1发现集的结果基本吻合。验证集的糖尿病性视网膜病变组与无视网膜病变相比，血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸、肌醇浓度显著上调，如表1和图1右侧灰色柱状图所示。
将代谢物相对浓度分别代入实施例1中所得二元逻辑回归方程并采用实施例1中所得截止值进行诊断效果判别。对于糖尿病无视网膜病变与糖尿病有视网膜病变，该小分子代谢组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.827，灵敏度为0.690，特异性为0.838，正确诊断率为0.725；其中1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性糖尿病性视网膜病变的正确诊断率分别为0.757、0.716、0.831和0.790(见表2和图3)。对于糖尿病无视网膜病变与糖尿病早期视网膜病变，该小分子代谢组合标志物在发现集和验证集中也均具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.814，灵敏度为0.667，特异性为0.838(见表2和图4)。
发现集和验证集中均具有较好的ROC曲线结果、良好的诊断正确率使得该组合标志物具有辅助糖尿病人群中视网膜病变诊断的潜力。本发明所述的组合标志物对糖尿病人群中视网膜病变的诊断具有成本低、操作简便、灵敏度高、特异性好、重复性好的特征，同时该组合标志物对于早期的视网膜病变也能有良好的诊断，具有较好的应用前景。
表1
Figure BDA0002377935340000101
注：1.血清样本中组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇在糖尿病性视网膜病变各个时期的含量变化表示为均值±标准偏差。
2.0，1，2，3，4分别代表糖尿病无视网膜病变对照组，1期轻度糖尿病性视网膜病变组，2期中度糖尿病性视网膜病变组，3期重度糖尿病性视网膜病变组，4期增殖性糖尿病性视网膜病变组。
表2
Figure BDA0002377935340000102
Figure BDA0002377935340000111

Claims (9)

1.组合标志物，所述组合标志物包括或由乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇组成。
2.一种权利要求1所述的组合标志物在制备用于糖尿病患者中视网膜病变诊断试剂或在糖尿病患者中视网膜病变诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的诊断试剂或试剂盒为包含采用气相色谱-质谱联用仪检测糖尿病患者血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的相对浓度的试剂的组合。
4.根据权利要求2或3所述的应用，所述的采用气相色谱-质谱联用仪检测糖尿病患者血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇相对浓度的试剂包括：
(1)标准化学品：乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇，所述标准品分别用于对应的血清中小分子代谢物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的定性；
(2)含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来糖尿病患者的血清样品，为包含内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇溶液，内标化合物的浓度分别为5～20μg/mL；
(3)衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品溶解及衍生化反应；所述衍生化试剂包括浓度为15～20mg/mL甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其中诊断步骤包括：
(1)首先用含内标化合物的提取液处理来自糖尿病患者的血清样本，沉淀血清蛋白并提取代谢物，离心取上清液真空冷冻干燥，冻干样品经甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺衍生化处理后采用气相色谱-质谱联用仪检测分析；
(2)在气相色谱-质谱联用仪检测获得的总离子流图上，提取经标准品定性后组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇各自的特征离子峰强度，以及内标化合物D5-苯丙氨酸、十三酸和D4-琥珀酸的特征离子峰强度；
(3)对每一个糖尿病患者血清样品中所述组合标志物的特征离子峰强度分别与内标化合物的特征离子峰强度相除进行校正，其中乙醇胺采用内标D5-苯丙氨酸校正，延胡索酸和亚牛磺酸采用十三酸校正，肌醇采用D4-琥珀酸校正，获得以上所述的四种代谢物各自的相对浓度值；
(4)基于以上所述组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的相对浓度值，通过二元逻辑回归方程计算组合型标志物变量Prob值，比较所得Prob值与最佳截点值的大小，从而判断糖尿病患者有无视网膜病变。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所建模型的二元逻辑回归方程为Prob(糖尿病性视网膜病变)＝1/[1+e-(5.222*A+47.032*B+17.838*C+0.739*D-3.138)]；其中Prob(糖尿病性视网膜病变)为糖尿病人群中患有视网膜病变的概率，A、B、C、D分别为乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇内标校正后的相对浓度；最佳截点值设为0.753，对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值则为有视网膜病变，否则(小于等于)表明无视网膜病变。
7.根据权利要求2-6所述糖尿病患者包括有视网膜病变的糖尿病患者(1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性视网膜病变中的一种或二种及以上)以及作为对照的无视网膜病变的糖尿病患者。
8.一种糖尿病患者中视网膜病变试剂盒诊断试剂盒，所述试剂盒包含乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇标准品。
9.按照权利要求8所述的诊断试剂盒，还包含
(1)含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自糖尿病患者的血清样品，为包含内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇溶液，内标化合物的浓度分别为5～20μg/mL；
(2)衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品溶解及衍生化反应；所述衍生化试剂包括浓度为15～20mg/mL甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。
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