CN114236110A - 一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物，所述标志物包括乙醇胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸、哌可酸、色氨酸、谷氨酰胺、吲哚中的一种或多种的组合。本发明通过代谢组学检测，以及进行单维、多维统计法和随机森林法等数据分析，从数千种代谢物中挖掘出用于糖尿病视网膜病变早期诊断的血清代谢标志物，所述标志物能够辅助检测和诊断血糖控制良好的糖尿病人群中的视网膜病变。本发明公开的标志物对血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变的诊断具有操作简便、灵敏度高、特异性好、无创等特点，易于医疗机构的临床推广，填补目前该人群无生物标志物检测的空白，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于检测诊断技术领域，具体涉及一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物及应用。
背景技术
糖尿病是全球高发性的慢性代谢疾病。糖尿病患者由于胰岛素代谢异常，引起全身各器官的微血管病变。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是最重要的致盲原因之一。我国糖尿病患者居世界首位，其中DR患病率高达24.7-37.5％，每年有300-400万糖尿病患者因DR失明。随着糖尿病病程进展，所有糖尿病患者都有发展成糖尿病性视网膜病变的可能。DR以是否有从视网膜发出的异常新生血管作为判断标准，可分为增殖型和非增殖型两种。
糖尿病视网膜病变病程可分为六个时期：I期：出现微动脉瘤或小出血点，但出血点较少，临床表现一般不明显，患者往往没有特殊感觉；Ⅱ期：有黄白色“硬性渗出”并可见出血点，临床表现轻微，患者有时可感到轻微眼部不适，或在视线中突然出现黑影、“蜘蛛网”、“飞蚊”等现象；Ⅲ期：有白色“软性渗出”并可见出血点，开始出现轻微视力下降或视野异常；Ⅳ期：眼底有新生血管生成并发生玻璃体出血，视力下降明显；V期：眼底有新生血管生成和纤维增生，视力和视野都有明显影响；Ⅵ期：眼底有新生血管生成和纤维增生，并发生视网膜脱离，视力受损严重，甚至失明。其中I、Ⅱ、Ⅲ期为非增殖型，亦称单纯型或背景型，Ⅳ、V、Ⅵ为增殖型。在严重的非增殖型糖尿病性视网膜病变时期，若不及时治疗，1年左右将发展成为增殖型糖尿病性视网膜病变。
在我国患糖尿病30年以上的患者中，约50％以上患糖尿病视网膜病变，约30％以上患增殖性糖尿病视网膜病变，8％因视网膜病变失明，一旦发生，患者采用激光治疗或玻璃体切除手术，也只能保存部分视功能及降低中度或重度视力丧失的危险性，因此DR致盲属于“难治盲”。然而，糖尿病致盲又属于“可避免盲”，其可通过早期筛查、早期发现和及早干预而有效改善视力预后。根据《中国2型糖尿病防治指南(2020版)》，目前的早期筛查手段主要是进行血糖和糖化血红蛋白水平测定及定期的眼底检查，但由于患者须定期入院接受检查，故患者的依从性低，导致随访率低，DR的早期筛查和早期诊疗面临巨大挑战，成为我国卫生防控的主要负担。因此，早期发现早期治疗成为了糖尿病视网膜病变的重要防控措施。
DR早期导致的眼底血管神经单元病变无明显体征而常常延误诊治，故DR的早期诊断和防控面临着巨大挑战。现阶段DR的早期临床预测指标具有较好的预测和防控DR发生发展的价值，如糖化血红蛋白和血糖，但有近50％控制好血糖的糖尿病患者，仍发生糖尿病视网膜病变。这部分人群缺少并亟需除血糖之外的可简便用于早期诊断筛查糖尿病视网膜病变的生物标志物。
发明内容
本发明的目的是针对血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变诊断困难的问题，提供了一种用于该人群中糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物及应用，所述标志物对于诊断糖尿病视网膜病变的鉴别准确性高，可应用在制备用于糖尿病视网膜病变的诊断试剂产品中。
基于上述，本发明首先提供了一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸、哌可酸、色氨酸、谷氨酰胺、吲哚中的一种或多种的组合；
优选地，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、精氨酸。
优选地，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸。
优选地，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、哌可酸和谷氨酰胺。
本发明另一方面还提供了前面所述的代谢标志物在制备糖尿病视网膜病变早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明另一方面还提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂，所述试剂能够检测样本中前面所述的代谢标志物的浓度。
优选地，所述样本为血清样本。
优选地，所述试剂通过检测受试者血清中所述代谢标志物的浓度来判断受试者是否患有糖尿病视网膜病变。
本发明另一方面还提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括提取试剂和前面所述的代谢标志物的标准品。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过代谢组学检测，以及进行单维、多维统计法和随机森林法等数据分析，从数千种代谢物中挖掘出用于糖尿病视网膜病变早期诊断的血清代谢标志物，所述标志物能够辅助检测和诊断血糖控制良好的糖尿病人群中的视网膜病变。
(2)本发明公开的标志物对那些血糖控制良好、却仍然发生糖尿病视网膜病变的糖尿病患者具有重要应用价值，解决了这类患者在现有检测血糖和糖化血红蛋白技术下，无法提供预警作用从而错过最佳治疗期的问题。
(3)本发明公开的标志物对血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变的诊断具有操作简便、灵敏度高、特异性好、无创等特点，易于医疗机构的临床推广，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明血清样本来源的受试者相关信息；图中：GW-Control为对照组，GW-DR为疾病组。
图2为本发明采用OPLS-DA模型筛选差异代谢物的结果，其中，
A表示OPLS-DA得分图；
B表示OPLS-DA置换检验图。
图3为本发明通过随机森林分析筛选重要性排序前10的差异代谢物得分结果。
图4为本发明代谢标志物与HbAlc在判别糖尿病人群中有无视网膜病变的单独诊断效能，其中，
A表示乙醇胺对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
B表示苏氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
C表示赖氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
D表示精氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
E表示蛋氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
F表示乙酰鸟氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
G表示哌可酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
H表示色氨酸对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
I表示谷氨酰胺对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
J表示吲哚对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线；
图5为乙醇胺在疾病组和对照组血清的浓度对比图；图中：GW-Control为对照组，GW-DR为疾病组。
图6为本发明代谢标志物在判别糖尿病人群中有无视网膜病变的联合诊断效能，其中，
A表示乙醇胺、苏氨酸、精氨酸对疾病组和对照组的联合诊断效果的ROC曲线；
B表示乙醇胺、苏氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸对疾病组和对照组的联合诊断效果的ROC曲线；
C表示乙醇胺、苏氨酸、哌可酸和谷氨酰胺对疾病组和对照组的联合诊断效果的ROC曲线；
D表示HbAlc对疾病组和对照组的诊断效果的ROC曲线。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
如前所述，鉴于现有技术中对血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变诊断困难的问题，本发明首先提供了一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸、哌可酸、色氨酸、谷氨酰胺、吲哚中的一种或多种的组合；
一些实施例中，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、精氨酸。
一些实施例中，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸。
一些实施例中，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、哌可酸和谷氨酰胺。
本发明另一方面还提供了前面所述的代谢标志物在制备糖尿病视网膜病变早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
优选地，所述的诊断试剂或试剂盒的受试者为血糖控制良好的糖尿病人群。
进一步地，所述血糖控制良好的标准为受试者血液中糖化血红蛋白浓度≤6.5％。
本发明另一方面还提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂，所述试剂能够检测样本中前面所述的代谢标志物的浓度。
优选地，所述样本为血清样本。
优选地，所述试剂通过检测受试者血清中所述代谢标志物的浓度来判断受试者是否患有糖尿病视网膜病变。
本发明另一方面还提供了一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括提取试剂和前面所述的代谢标志物的标准品。
本发明申请人为获得正确诊断血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变的代谢标志物，通过收集糖尿病视网膜病变患者与糖尿病无视网膜病变患者的血清样本，进行了单维、多维统计法和随机森林分析，且通过logistic回归检验标志物的诊断性能，最终提出了用于诊断血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变的高灵敏度、高特异度的代谢标志物，具体过程如下：
实施例1
(一)血清样本的来源和收集
所有的血清样本均在书面同意下根据上海交通大学附属上海市第一人民医院的临床试验审查委员会(IRB)所批准的程序进行。疾病组及对照组均来自于上海交通大学附属上海市第一人民医院内分泌科确诊的糖尿病病人，均已接受血糖的控制跟踪和眼科随访。
糖尿病视网膜病变(疾病组)的血清样本从通过影像学(眼底照相+光学相干断层扫描oct)与血液生化指标检测诊断方法被诊断为患者的21人中得到；糖尿病无视网膜病变(对照组)的血清样本则从上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院内分泌科就诊的21人中取得。两组人群的信息如图1所示。
收集方法：利用含有4mg K2EDTA的5mL灭菌真空取血管取得血液样本，加入促凝剂，上下颠倒5-10次以确保促凝作用，3000rpm离心15min，取上清分装于保存管内，在-80℃的条件下保存，备检测。
(二)LC/MS分析和数据处理
1、血清样本前处理
血清样本在37℃解冻，涡旋30秒、液氮速冻、37℃解冻，重复5-10次后，于4℃、15000rpm条件下离心10min；取800μL上清液(取决于上面添加的体积，避免使用任何沉淀物)在4℃条件下再离心10min，如果在上清液中发现漂浮的脂质样或细胞碎片(有时在顶层发现)，则需要在4℃条件下以最大速度再离心30min(如果它们难以沉淀，则在转移到新的EP管中时避免使用它们)；将750μL上清液转移到新的EP管中并使用speed vac完全干燥样品，干燥后的样品于-80℃下保存，待质谱分析。
质谱分析前，用50-100μL 60％乙腈/H2O(MS级)重悬干燥样品；用力吹打30s，冰上放置30s，重复至少5次后，在冰上放置至少30min；将样品于15000g、4℃条件下离心10min，取上清液(45-95μL)转移到新的EP管中，再离心10min，随后取40-80μL样品装入MS样品瓶中，待MS上样检测。
2、超高液相色谱质谱分析
(1)液相色谱：色谱仪为QTRAP 6500+Low Mass超高液相色谱；柱45℃；流速0.1500mL/min；总的分离检测时间为16min；进样室温度为4℃；进样体积为2μl。
分离条件为：SeQuant ZIC-pHILIC色谱柱150×2.1mm，5μm；流动相：A相为100％质谱水+5mM碳酸胺，B相为100％乙腈，洗脱梯度为：0-1min，20％B(v/v)；1-3min，梯度线性增加至60％B(v/v)；3-13min，梯度线性增加至98％B(v/v)；13-13.1min，梯度从98％B(v/v)减少至20％B(v/v)；13.1-16min，维持20％B(v/v)的梯度平衡系统。
(2)质谱条件：气帘气curtain gas(CUR)流速45PSI，正离子源电压5.5kv，负离子源电压-4.5kv，离子源加热温度350℃，碰撞气Collision Gas(CAD)流速Medium，离子源气1(Ion Source Gas 1)流速45PSI，离子源气2(Ion Source Gas 2)流速40PSI。
3、数据处理、分析及标志物的筛选
(1)代谢物的定性和定量处理
目标代谢物定量分析利用基于质谱的多反应检测技术(Multiple ReactionMonitoring,MRM)有目标地分析检测可能与特殊功能相关的关键代谢物在多样本中的表达量变化情况。该技术基于三重四级杆质谱仪，根据已建立的方法设定检测规则，基于目标代谢物的特定母离子和子离子对，选择采集符合目标离子规则的信号，去除不符合规则的信号干扰，进行高灵敏度、高准确性和特异性的靶向代谢物定量。MRM质谱分析主要包括三个阶段：(1)一级质谱扫描筛选出与目标分子特异性一致的母离子；(2)碰撞碎裂母离子，去除干扰离子；(3)只采集来自选定的特异离子的质谱信号。
(2)标志物的筛选
将峰面积积分数据导入SIMCA-P+12.0软件进行多维统计分析。通过建立正交-偏最小二乘法判别(OPLS-DA)模型，寻找糖尿病视网膜病变患者和糖尿病无视网膜病变患者之间贡献较大的代谢物，OPLS-DA得分结果和置换检验结果如图2所示，OPLS-DA统计分析中选取VIP>1作为多维分析潜在的生物标志物，共得到32个差异代谢物。同时采用单维检验(依据数据的正态性和方差齐性选取T Test或Mann-Whitney U Test)来获得两组间的差异代谢物，设置P<0.05，且log2FC的绝对值>1(FC，Fold Change，即组间变化倍数)为标准，最终筛选出log2FC的绝对值>1且p<0.05的差异代谢物共36个。多维和单维统计分析筛选出的差异代谢物取交集，得到更有可能是潜在的诊断糖尿病视网膜病变的代谢生物标志物。
为了从这些候选差异代谢物中寻找有潜力的生物标志物，进一步对各个差异代谢物依次执行了随机森林(Random Forest，RF)分析，用十折交叉验证的随机森林模型分析筛选对判别糖尿病有无视网膜病变具有重要作用的差异代谢物，RF重要性排序前10的差异代谢物得分结果如图3所示。
进一步，利用逻辑回归法(Logistic Regression)进行建模预测。建模后，通过绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)和精确率召回率曲线(Precision Recall Curve)，计算敏感性和特异性数值，以评估模型效果。结果如图4所示，这10个差异代谢物用于诊断区分血糖控制良好的糖尿病人群中有无视网膜病变的鉴别能力强，ROC曲线下面积(AUC)均大于88％，具有临床诊断意义。其中，参见图4和图5可知，乙醇胺的单独诊断能力最高：在糖尿病视网膜病变组中，患者血清中的乙醇胺含量显著降低，约低至糖尿病无视网膜病变人群的0.425倍(图5)；ROC曲线可知，乙醇胺诊断区分糖尿病有无视网膜病变的准确度(AUC)达到98.6％，特异度为90.5％，灵敏度为100％(图4的A)。
而现有技术采用的糖化血红蛋白(HbA1c)的诊断准确度(AUC)为50.6％(图6的D)，本发明标志物的诊断效能均显著优于糖化血红蛋白的诊断性能。
进一步，将10个差异代谢物进行联合诊断效能的分析，结果发现AUC进一步提高，例如，当乙醇胺、苏氨酸用于联合诊断时，ROC曲线下面积(AUC)达到0.99；当赖氨酸、精氨酸用于联合诊断时，ROC曲线下面积(AUC)达到0.961；当乙醇胺、苏氨酸、精氨酸用于联合诊断时，ROC曲线下面积(AUC)达到1(图6的A)；当乙醇胺、苏氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸用于联合诊断时，ROC曲线下面积(AUC)达到1(图6的B)；当乙醇胺、苏氨酸、哌可酸和谷氨酰胺用于联合诊断时，ROC曲线下面积(AUC)达到1(图6的C)。
综上所述，本发明通过代谢组学检测，以及进行单维、多维统计法和随机森林法等数据分析，从数千种代谢物中挖掘出用于血糖控制良好的糖尿病人群中视网膜病变早期诊断的血清代谢标志物，并通过逻辑回归法评价了标志物的诊断性能。本发明标志物对于区分血糖控制良好的糖尿病人群中有无视网膜病变的鉴别准确性高，且高效实用、无创，易于医疗机构的临床推广。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种用于糖尿病视网膜病变早期诊断的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸、哌可酸、色氨酸、谷氨酰胺、吲哚中的一种或多种的组合。
2.如权利要求1所述的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、精氨酸。
3.如权利要求1所述的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、蛋氨酸、乙酰鸟氨酸。
4.如权利要求1所述的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物包括乙醇胺、苏氨酸、哌可酸和谷氨酰胺。
5.如权利要求1-4中任一项所述的代谢标志物在制备糖尿病视网膜病变早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
6.一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂，其特征在于，所述试剂能够检测样本中权利要求1-4中任一项所述的代谢标志物的浓度。
7.如权利要求6所述的糖尿病视网膜病变早期诊断试剂，其特征在于，所述样本为血清样本。
8.如权利要求7所述的糖尿病视网膜病变早期诊断试剂，其特征在于，所述试剂通过检测受试者血清中所述代谢标志物的浓度来判断受试者是否患有糖尿病视网膜病变。
9.一种糖尿病视网膜病变早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括提取试剂和权利要求1所述的代谢标志物的标准品。
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