CN110208413B - 血清生物标志物在制备issu的诊断试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组与缺血性卒中并发应激性溃疡诊断相关的血清代谢小分子标志物，所述的生物标志物包括甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸中的一种或多种。基于该组生物标志物的分析检测方法具有高灵敏度、高通量、操作简便的优点，可实现对缺血性卒中并发应激性溃疡的准确诊断，可应用于制备缺血性卒中并发应激性溃疡的的诊断试剂。

Description

血清生物标志物在制备ISSU的诊断试剂中的应用
技术领 域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组诊断缺血性卒中并发应激性溃疡的血清生物标志物组合及其应用。
背景技术
缺血性卒中(IS)，又被称为脑梗死，机体因脑部供血供氧出现障碍，脑组织出现坏死或者软化病症，继发神经功能障碍，多发于中老年人。IS临床有着较高的死亡率及致残率，据《2018中国卫生健康统计提要》测算，我国每年死于脑卒中的患者高达196万，约占总死亡人数的20％，对人民生命健康造成了巨大威胁。临床上IS致死率高的原因除了其本身病情凶险外，还在于其易出现多种并发症，例如上消化道出血、肺部感染、癫痫等。应激性溃疡是较为常见的一种并发症，患者在脑缺血的应激状态下发生胃肠道粘膜充血、糜烂及溃疡，甚至出现穿孔等症状；临床以呕血、便血为主要表现，严重者可陷入失血性休克；影响预后的同时，增加病人的死亡率。
目前临床针对应激性溃疡的诊断主要依赖于患者临床表现、血常规检查、隐血实验和内镜检查等。但是由于其病情发展迅速，且部分临床表现会被原发病的症状所掩盖，现有的诊断方案准确率低且易延误最佳的治疗时间，导致病情的恶化。临床对于溃疡的治疗一般利用质子泵抑制剂、H2受体阻断剂抑制胃酸刺激，或联用胃黏膜保护剂恢复黏膜屏障保护作用，但由于应激性溃疡的高危型，该治疗方案仅能改善病人出血症状，疗效有限且对病死率无明显降低作用。因此预防性给药是临床治疗应激性溃疡的关键，即在IS患者发病初期就进行抑酸治疗。然而该方法忽略了患者间的个体化差异，易增加患者胃肠道和呼吸道感染的概率。鉴于缺血性卒中并发应激性溃疡(ISSU)的发病率高且危险性大，而临床诊断准确率低，治疗效果差且副作用多的现状，筛选出高灵敏性、高特异性的生物标志物，用于ISSU患者的临床诊断，及时实现个体化和综合性治疗，提高患者的治愈率是目前亟待解决的问题。
代谢组学是针对内源性小分子代谢物，研究其在生物系统受到外部刺激或内部变异后所出现的整体轮廓变化规律的科学。通过代谢组学分析小分子代谢物在疾病发生发展过程中的变化，筛选有关的生物标志物，有助于人们探究疾病的发病机制，实现对疾病的准确诊断，指导临床合理给药。
IS和ISSU患者发病初期未进行治疗的血清样本适用于并发症的早期诊断。在IS发生后，应激信号通过交感-肾上腺髓质系统(Sympathetic-adrenal medullary system)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis) 传递到胃组织，引起神经和体液系统紊乱，出现生理功能障碍，体液中的代谢物发生变化。研究表明，应激状态下的能量代谢异常在疾病发展中扮演着重要角色，其中氨基酸及脂肪酸代谢相关物质占主要部分。依托本课题组建立的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析技术(An extendable all-in-one injection twin derivatization LC-MS/MS strategy forthe absolute quantification of multiple chemical-group-basedsubmetabolomes.Analytica Chimica Acta.2019.)，实现对血清样本中相关小分子代谢物的靶向代谢组学分析，筛选出相对含量变化明显且对分组有突出贡献的物质作为潜在的生物标志物，其对实现ISSU的早期临床诊断具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本申请提供了一组高灵敏性、高特异性的血清生物标志物组合，并提供了所述血清生物标志物组合在制备诊断缺血性卒中并发应激性溃疡(ISSU)试剂中的应用。
技术方案：本申请所述的一种诊断缺血性卒中并发应激性溃疡的血清生物标志物组合，包括以下标志物中的一种或几种：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸。
其中，棕榈油酸是9-十六碳烯酸，花生四烯酸是5,8,11,14-二十碳四烯酸，油酸是9-十八碳烯酸。
优选的，所述的一种诊断缺血性卒中并发应激性溃疡的血清生物标志物组合，包括三个以上任选自以下的标志物：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸。
本发明还公开了所述血清生物标志物组合在制备缺血性卒中并发应激性溃疡的诊断试剂中的应用。
本发明还公开了一种检测试剂盒，其包括上述血清生物标志物标准品，以及用于检测所述血清生物标志物的检测试剂。
上述试检测剂盒在诊断缺血性卒中并发应激性溃疡中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明获得ISSU的血清诊断标志物的具体实现步骤如下：
1、IS和ISSU患者血清样本收集与信息获取分析
(1)采集IS和ISSU患者发病初期血液样本，建立和整理血样标本库；
(2)收集和整理患者的病理档案、检查检验结果等数据，分析两组患者的性别、年龄、既往病史、脑梗死部位及卒中原因是否存在显著性差异；
2、生物样本处理与检测
(1)所收集到的全血样本静置后4℃，8000rpm条件下离心10min，分离得上层血清于EP管中，迅速置于-80℃的环境下冷藏待测；
(2)采用丹磺酰氯和丹磺酰哌嗪的衍生化反应；
(3)LC-MS/MS检测；
3、数据处理与生物标志物筛选
(1)经过预处理后的数据，运用主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal partial squares discriminantanalysis，OPLS-DA)等多元统计方法对数据进行分析；
(2)通过OPLS-DA分析下的变量投影重要性(Variable importance in theprojection，VIP)进行标志物的初筛(阈值>1)，结合非参数检验的显著性参数 p值(阈值＜0.05)来寻找两组之间的差异代谢物。
4、IS与ISSU患者血清样本中小分子代谢物的含量差异及与ISSU诊断的关系分析。
本发明以上述标准操作程序(SOP)采集IS和ISSU患者住院早期未接受药物治疗的血液样本，采用基于柱前衍生化LC-MS/MS的靶向代谢组学技术，结合多元统计分析和统计学检验，对IS和ISSU患者血清样本进行分析，筛选并鉴定出与ISSU相关的差异代谢物，将其作为诊断ISSU的生物标志物。
有益效果：(1)本发明提供的一组诊断ISSU的血清生物标志物，通过IS和 ISSU患者样本进行验证，证明该组标志物相对含量在组间存在显著性差异，且结果稳定，说明该组生物标志物具有良好的特异性和灵敏度，表现出临床诊断价值。(2)本发明提供的一组诊断ISSU的血清生物标志物，能够反映IS患者并发应激性溃疡的发展规律，指导临床制定合理的给药方案，有助于改善治疗效果和患者预后。
附图说明
图1为基于LC-MS/MS的IS与ISSU患者的PCA得分图；
图2为基于LC-MS/MS的IS与ISSU患者的OPLS-DA得分图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明中的技术方案进行清楚、完整地说明。
实施例1：IS患者和ISSU患者之间血清差异代谢物的筛选表征
一、对象和方法
1.样本采集与处理
该研究获得医院伦理委员会批准，并经患者或家属签署知情同意书。收集33例IS患者和15例ISSU患者的血清样本，置于-80℃低温下冷冻保存待用。从各待测样本中各取20μL，混匀制得QC样本，相同条件下保存。
2.标准品与试剂
稳定同位素标记标准品D1-亮氨酸(含量99％)和十七烷酸(含量99.9％) 购自美国Sigma-Aldrich公司，D5-胆酸(含量98％)购自美国Cambridge Isotope Laboratories公司。丹磺酰氯(Dns-Cl，含量98％)购自上海百灵威公司；丹磺酰哌嗪(Dns-PP)按现有流程自备。2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸脂(HATU，含量99％)购自上海阿达玛斯公司，碳酸氢钠(含量99.5％)、无水碳酸钠(含量99.8％)、乙酸乙酯和丙酮(分析纯)均购自南京化学试剂有限公司；乙腈和甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购自美国ROE公司；超纯水由美国Millipore的Milli-Q纯水制备系统制备。
3.血清差异代谢物的测定
3.1.溶液配制
精密称取Dns-Cl、Dns-PP、HATU适量，Dns-Cl配制成16mM的丙酮溶液。 Dns-PP和HATU分别配制成9mM和3mM的乙腈溶液。衍生化试剂溶液需新鲜配制。
精密称取内标D1-亮氨酸、D5-胆酸和十七烷酸适量，用甲醇/水(1:1，v/v) 配制成10mM的内标储备液，临用前用甲醇稀释成一定浓度的内标溶液。
3.2.血清样本前处理
将冷冻保存的血清样本置于4℃的冰箱中解冻。样本根据衍生化反应的不同分为两部分。Dns-Cl部分：取10μL血清样本，加入10μL内标溶液和40μL冰甲醇。涡旋5min混匀，4℃、16000rpm、10min低温高速离心，取尽上清，挥干溶剂。Dns-PP部分：取20μL血清样本，加入10μL内标溶液、20μL 0.5％甲酸和200μL乙酸乙酯。涡旋5min混匀，4℃、6000rpm、10min离心，取尽上清，挥干溶剂。
3.3.衍生化反应
Dns-Cl部分：样本用20μL甲醇复溶，加入100μL Dns-Cl、100μL碳酸盐缓冲液(pH10.5)，涡旋均匀，25℃恒温反应15min。加入1mL乙酸乙酯，涡旋5min，4℃、6000rpm、10min离心，取尽上清，挥干溶剂。Dns-Cl具有光敏性，需注意避光。
Dns-PP部分：样本用20μL甲醇复溶、加入20μL Dns-PP、20μL HATU和 40μL水/乙腈(1:1，v/v)。涡旋均匀，45℃恒温反应40min。
用Dns-PP反应溶液复溶Dns-Cl反应产物，4℃，16000rpm，10min离心，取50μL上清液待分析。
3.4.仪器分析
采用超高效液相色谱串联质谱系统(LC-MS/MS 8040，Shimadzu Co.,Kyoto,Japan)下多反应监控(Multiple Reaction Monitoring，MRM)模式分析血清样本中内源性代谢物的水平。
色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×100mm,1.8 μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇(B)二元梯度洗脱系统，洗脱梯度如下：0-2min，30％B，2-5min，30％-52％B，5-15min，52％-65％B，15-20min， 65％-78％B，20-22.5min，78％B，22.5-29min，78％-90％B，29.1-38min，100％ B，38.1％-40min，30％B。流速：0.4mL/min；柱温：50℃；自动进样器温度： 4℃；进样量：2μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子MRM检测模式，喷雾电压为 4.5kV，毛细管加热温度为250℃，氮气作为雾化气和干燥气，流量分别为3L/min 和15L/min，氩气作为CID气，压力为230kPa。93个代谢物(含内标)测定参数如表1所示：
表1基于LC-MS/MS的相关代谢物测定参数
Figure BDA0002098076460000051
Figure BDA0002098076460000061
Figure BDA0002098076460000071
Figure BDA0002098076460000081
4.数据处理与差异代谢物的筛选
将LC-MS/MS采集到的代谢物峰信息进行预处理，包括填补缺失值，内标归一化等，得到的数据矩阵导入SIMCA-P软件(13.0版)，进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。通过PCA 得分图，可以观察样本的总体分布情况，判断样本的大致分类和异常值，并根据 QC样本的聚集程度判断分析方法的稳定性。OPLS-DA则可以进一步分析两组之间的差异情况，根据所提供的变量投影重要性(VIP)判断变量对分组的贡献值，常以VIP＞1作为筛选标准。接下来对筛选出的变量进行两独立样本的非参数检验，即Mann-Whitney U检验，筛选出p＜0.05的差异代谢物，即潜在的生物标志物。
二、结果
1.多元统计分析结果
1.1.主成分分析(PCA)
PCA作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。PCA得分图能够直观地反映样本的总体分布情况，有助于离群点和分析方法可靠性的判断。对IS和ISSU患者血清样本的LC-MS/MS检测数据进行PCA分析，所得模型参数R2X＝0.515，Q2＝0.207，PCA得分图如图1所示。由图可知，QC样本聚集程度良好，验证了该分析方法的稳定性，无明显离群点，两组样本呈现大致分离的趋势。
1.2.正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)
OPLS-DA是一种有监督的模式识别方法，通过设置分组信息，进一步对IS 和ISSU患者血清样本的差异情况进行分析，所得模型参数R2X＝0.474，R2Y ＝0.709，Q2＝0.254。OPLS-DA得分图如图2所示，两组区分明显，表明应激性溃疡的发生对卒中患者血清代谢物组有显著影响。
2.差异代谢物筛选
本发明以OPLS-DA中的VIP＞1和非参数检验的p<0.05为筛选标准，最终得到6个差异代谢物，分别为：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸。与IS患者相比，上述6个差异代谢物在ISSU患者血清中的表达水平上调。通过标准品定量，棕榈油酸上调1.2～2.6倍，花生四烯酸上调1.2～1.7 倍，油酸上调1.1～1.9倍，甘氨酸、苯丙氨酸和鸟氨酸上调1.1～1.5倍。由此可见，上述6个差异代谢物在IS和ISSU患者血清中表达水平明显不同，可用于诊断区分IS和ISSU。
实施例2：构建ROC曲线用于验证6个差异代谢物用于诊断区分IS和ISSU的能力
采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过IS和ISSU患者血清中差异代谢物的表达水平判断其用于诊断区分IS和ISSU患者的能力。结果表明，甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸这6个差异代谢物单个用于诊断区分IS和ISSU患者的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义；联合用于诊断时，随着联合个数的增加，AUC进一步提高， 6个全部联合时最高，AUC达到0.986，灵敏度和特异性分别为93.3％和93.9％。单个及任意2～5个联合诊断结果见表2～4。
表2单个差异代谢物诊断区分IS和ISSU患者
单个差异代谢物 AUC 灵敏度 特异性
甘氨酸 0.855 73.3％ 87.9％
苯丙氨酸 0.902 73.3％ 90.9％
鸟氨酸 0.701 60.0％ 66.7％
棕榈油酸 0.758 60.0％ 81.8％
花生四烯酸 0.709 66.7％ 72.7％
油酸 0.717 66.7％ 69.7％
表3两个差异代谢物联合诊断区分IS和ISSU患者
Figure BDA0002098076460000091
Figure BDA0002098076460000101
表4任意三～五差异代谢物诊断区分IS和ISSU患者
联合个数 AUC 灵敏度 特异性
三个 ≥0.790 ≥73.3％ ≥75.8％
四个 ≥0.836 ≥80.0％ ≥81.8％
五个 ≥0.923 ≥86.7％ ≥90.9％
从表2可以看出，上述6个差异代谢物单个用于诊断区分IS和ISSU患者的能力较强，AUC均大于0.7，灵敏度较高、特异性较强，具有临床诊断意义；从表3可以看出，这6个差异代谢物两两联合用于诊断时，AUC比单个用于诊断时更高，灵敏度高、特异性较强，具有临床诊断意义；从表4可以看出，这6 个差异代谢物3～5个联合用于诊断时，AUC进一步提高，灵敏度高、特异性强，具有临床诊断意义。
实施例3：检测试剂盒的制备：
基于本发明提供的血清生物标志物，制备了检测试剂盒，该试剂盒包含如下成分：
血清生物标志物标准品：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸；
检测试剂：丹磺酰氯、丹磺酰哌嗪、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸脂、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、甲酸(用于样品制备、衍生化反应和LC-MS/MS测定)；
内标：稳定同位素标记标准品D1-亮氨酸、D5-胆酸和十七烷酸。

Claims (3)

1.血清生物标志物在制备缺血性卒中并发应激性溃疡ISSU的诊断试剂中的应用，其中，所述血清生物标志物包括2个以上任选自以下的标志物：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清生物标志物包括三个以上任选自以下的标志物：甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸。
3.一种检测缺血性卒中并发应激性溃疡ISSU的试剂盒，其特征在于，包括选自甘氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、棕榈油酸、花生四烯酸、油酸中的两种以上的血清生物标志物标准品，以及用于检测所述血清生物标志物的检测试剂。
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花生四烯酸代谢物在湿热型溃疡性结肠炎大鼠的表达与调节;郑学宝等;《中华中医药学刊》;20110131;第29卷(第1期);第14-17页 *

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