CN104777242A

CN104777242A - 用于诊断多囊卵巢综合征的联合标志物、试剂盒和系统

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Publication number: CN104777242A
Application number: CN201410018414.7A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 李艳杰; 赵欣捷; 侯丽辉
Original assignee: First Affiliated Hospital Heilongjiang University Of Chinese Medicine; Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: First Affiliated Hospital Heilongjiang University Of Chinese Medicine; Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2034-01-14
Also published as: CN104777242B

Abstract

本发明涉及血清样品中小分子代谢物油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷作为联合标志物在制备用于诊断受试者中的多囊卵巢综合征的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的多囊卵巢综合征的试剂盒，通过检测来自女性受试者的血清样品中上述联合标志物各自的浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有多囊卵巢综合征。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。上述几种小分子代谢物联合使用，可在辅助诊断不同症型的多囊卵巢综合征中得到应用。

Description

用于诊断多囊卵巢综合征的联合标志物、试剂盒和系统

技术领域

本发明涉及已知代谢物的新用途。具体地，本发明涉及血清中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷联合用作诊断多囊卵巢综合征的标志物，并且涉及检测受试者中的多囊卵巢综合征的试剂盒和系统。

背景技术

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome)是青春期及育龄妇女最常见疾病，其发病率为5％～10％。多囊卵巢综合征能导致女性不孕不育、增加心血管疾病、糖尿病发生风险等。多囊卵巢综合征是妇科内分泌领域最复杂疑难疾病之一，病因不明，发生发展机制至今尚未阐明，涉及多基因遗传、环境因素及生活方式的综合作用。多囊卵巢综合征的症状也多种多样，给临床诊断造成了难度。临床上普遍以鹿特丹标准诊断多囊卵巢综合征。符合鹿特丹标准三条中的二条或以上，即可诊断为多囊卵巢综合征，包括：月经稀发和(或)无排卵、超声检查卵巢多囊样改变以及高雄激素血症及高雄激素临床表现(文献1：Fauser B，Chang J，Azziz R，Legro R，Dewailly D，Franks S，Tarlatzis R，Fauser B，Balen A，Bouchard P，Dahlgren E，Devoto L，Diamanti E，Dunaif A，Filicori M，Homburg R，Ibanez L，Laven J，Magoffin D，Nestler J，Norman RJ，Pasquali R，Pugeat M，Strauss J，Tan S，Taylor A，Wild R，Wild S，Ehrmann D，Lobo R，Rotterdam E-A-s，HumanReproduction2004，19(1)：41-47)。诊断过程需要结合问诊、超声和多个免疫生化试剂盒的联合检测，成本高、诊断复杂。因此开发新的方法应用于临床十分紧迫。

已有研究表明，多囊卵巢综合征涉及多条代谢通路对的改变，氨基酸、乳酸、脂类及肌酐等多种小分子代谢物血中的含量在多囊卵巢综合征患者与正常人之间存在差异。本发明通过液相色谱质谱联用的代谢组学方法检测血中的代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，有望在多囊卵巢综合征的诊断中有应用。而且，色谱质谱联用技术为小分子代谢物的检测提供了快速、灵敏的重复性好、成本低的检测方法。色谱质谱联用技术检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例。如液质谱联用技术检测多种氨基酸，用于新生儿疾病筛查；以及液质谱联用技术检测肌氨酸判别前列腺癌(文献2：Sreekumar，A.；Poisson，L.M.；Rajendiran，T.M.；Khan，A.P.；Cao，Q.；Yu，J.；Laxman，B.；Mehra，R.；Lonigro，R.J.；Li，Y.；Nyati，M.K.；Ahsan，A.；Kalyana-Sundaram，S.；Han，B.；Cao，X.；Byun，J.；Omenn，G.S.；Ghosh，D.；Pennathur，S.；Alexander，D.C.；Berger，A.；Shuster，J.R.；Wei，J.T.；Varambally，S.；Beecher，C.；Chinnaiyan，A.M.，Nature2009，457，(7231)，910-914)等。

本发明确定的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷都是人体重要的代谢物，参与人体多种病理生理过程。油酸和硬脂酸的比值，常用来评价硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoAdesaturase，SCD)的活性(文献：3：Attie AD，Krauss RM，Gray-Keller MP，Brownlie A，Miyazaki M，Kastelein JJ，Lusis AJ，StalenhoefAF，Stoehr JP，Hayden MR，Ntambi JM，Journal of lipid research2002，43(11)：1899-1907)，二十烷三烯酸是一种多不饱和脂肪酸。硫化脱氢表雄酮是一种肾上腺雄激素的标志物(文献4：Legro，R.S.；Kunselman，A.R.；Demers，L.；Wang，S.C.；Bentley-Lewis，R.；Dunaif，A.，Journal of ClinicalEndocrinology＆Metabolism2002，87，(5)，2134-2138)。糖基化氨基酸的升高表明晚期糖基末端产物产生积累，晚期糖基末端产物的积累常出现在与年龄有关的疾病中，例如糖尿病、心血管疾病、中风及阿尔茨海默氏病等(文献5：Singh R，Barden A，Mori T，Beilin L，Diabetologia2001，44(2)：129-146)。但到目前为止油酸和硬脂酸的比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷尚无研究将其作为联合标志物应用于多囊卵巢综合征。

发明内容

本发明的目的是针对多囊卵巢综合征诊断复杂、成本高的临床问题，提供一种组合的小分子代谢物在多囊卵巢综合征辅助诊断中的应用，并提供可用于上述组合的小分子代谢物的分析检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)利用高效液相色谱质谱联用的代谢组学技术，对正常人和多囊卵巢综合征患者血清进行了代谢组学指纹分析，发现并定性46种代谢物在正常人和多囊卵巢综合征患者中存在显著性差异；

(2)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法(文献6：1.Bewick V，Cheek L，Ball J，Critical care2005，9(1)：112-118)，结合代谢物生理功能在46个差异代谢物中随机组合，回归为联合标志物变量，然后用ROC(receiver operating characteristic)曲线来评价联合标志物的灵敏性和特异性。特异性和灵敏度均较高，同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的组合可以作为联合标志物；

(3)应用另外一批正常人和多囊卵巢综合征患者血清样本对组合代谢标志物进行验证，确定油酸和硬脂酸的比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷可作为辅助诊断多囊卵巢综合征的联合标志物；

(4)联合标志物的使用：在多囊卵巢综合征病人中二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮和糖基化苯丙氨酸的浓度及油酸和硬脂酸浓度的比值增高，而尿苷的浓度降低。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，将油酸和硬脂酸的比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷回归为联合标志物变量P，优选地，二元逻辑回归方程如下：

方程1：

P=1/1+e^{-(4.113×a+2.508×b+1.809×c-5.328×d+2.532×f-4.608)}

其中，a为血清样品中硫化脱氢表雄酮浓度，b为血清样品中二十烷三烯酸浓度，c为血清样品中糖基化苯丙氨酸浓度，d为血清样品中尿苷浓度，f为血清样品中油酸和硬脂酸浓度的比值。

所得变量P在多囊卵巢综合征病人中增高，该变量的值可用于辅助判定多囊卵巢综合征。在此，基于试验涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最佳的原则，即ROC曲线下面积(AUC)最大的原则，该联合标志物变量的截点值(cut-off值)设为0.584，高于该截点值则有可能为多囊卵巢综合征。也可以根据实验者的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。

(5)诊断系统所包括的装置：色谱柱为waters T3色谱柱(也可使用C18色谱柱，但该柱对糖基化苯丙氨酸和尿苷的分离度较差)，检测仪器为超高效液相色谱串联质谱仪，使用负离子模式检测；

(6)确定试剂盒最佳组成：

a.标准品：油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、鹅脱氧胆酸、苯丙氨酸和尿苷(均购白sigma公司)。油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸和尿苷标准品，用于对应的血清代谢物的定性和定量标准曲线绘制。硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸暂时无商品化标准品，本发明暂用鹅脱氧胆酸、苯丙氨酸绘制定量标准曲线(硫化脱氢表雄酮胆汁酸同为固醇衍生物，所以使用鹅脱氧胆酸，也可使用其它胆汁酸，如：胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸等。糖基化苯丙氨酸暂时使用苯丙氨酸。)硫化脱氢表雄酮和糖基化苯丙氨酸根据质谱精确质量和二级质谱碎片及保留时间作为定性依据。硫化脱氢表雄酮在质谱负离子模式检测到的精确质量数为369.1752，二级特征碎片为硫酸根离子，精确质量数为96.9596；糖基化苯丙氨酸在质谱负离子模式检测到的精确质量数为326.1255，二级特征碎片为苯丙氨酸离子，精确质量数为164.0712：

b.用于血清样品预处理的提取液：包含内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸D3-棕榈酸和D3-硬脂酸乙腈溶液，用于血清样本预处理。D5-苯丙氨酸用于校正糖基化苯丙氨酸及尿苷，D4-鹅脱氧胆酸用于硫化脱氢表雄酮(无商品化的同位素标记硫化脱氢表雄酮)，D3-棕榈酸和D3-硬脂酸用于校正油酸、硬脂酸和二十烷三烯酸；

c.洗脱液：洗脱液包含：6.5mM的碳酸氢铵水溶液和6.5mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，甲醇：水=95∶5，v/v。(也可以选择醋酸铵水溶液和甲醇(乙腈)洗脱液，或者甲酸水溶液和甲醇(乙腈)洗脱液，但6.5mM的碳酸氢铵水溶液和6.5mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，甲醇：水=95∶5，v/v的灵敏度较高。)通常来说，推测的未知代谢物的结构需要同标准品比对才能最终确认其结构；

(7)试剂盒应用于超高效液相色谱串联质谱仪还可以同时检测20多种游离脂肪酸、4个硫化固醇、氨基酸等代谢物，可更为全面的透视多囊卵巢综合征的代谢异常；

(8)采用血清样本测试本发明的应用效果。分别采用2批次的正常人和多囊卵巢综合征患者的血清样本，其中多囊卵巢综合征患者分为肥胖和非肥胖两个症型(肥胖定义为BMI(体重/身高²(kg/m²))>23)。使用联合标志物正常人和多囊卵巢综合征患者可得到很好的区分，灵敏度和特异性及曲线下面积(AUC)见下表1。

表1

具体来说，本发明提供下述各项：

1.联合标志物在制备用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒中的用途，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷。

2.一种检测受试者中的多囊卵巢综合征的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)标准品：包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、鹅脱氧胆酸、苯丙氨酸和尿苷，所述标准品分别用于绘制对应的血清代谢物油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷的定性和定量标准曲线；

(2)用于预处理来自受试者的血清样品的提取液：包含内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸的乙腈溶液；和

(3)用于洗脱色谱柱的洗脱液。

3.第2项所述的试剂盒，其中所述提取液包含1.6×10^-3mg/ml的D5-苯丙氨酸，1.3×10^-4mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸，2.0×10^-3mg/ml的D3-棕榈酸和2.0×10^-3mg/ml的D3-硬脂酸。

4.第2项所述的试剂盒，其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱waters T3色谱柱的洗脱液。

5.第4项所述的试剂盒，其中所述洗脱液包括：

流动相A：6.5mM的碳酸氢铵水溶液，和

流动相B：6.5mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，其中甲醇：水=95∶5，v/v。

6.第2项所述的试剂盒，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

7.一种计算受试者的血清样品中的联合标志物变量的方法，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷，所述方法包括下述步骤：

(1)利用油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、鹅脱氧胆酸、苯丙氨酸和尿苷作为标准品，加入内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸，分别绘制相对应的血清代谢物油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷的定量标准曲线；

(2)用提取液预处理来自受试者的血清样品，其中所述提取液为包含内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸的乙腈溶液；沉淀血清样品中的蛋白，将上清液冷冻干燥，然后用乙腈：水=1∶4v/v复溶，上样到色谱柱，洗脱，记录所述血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的洗脱峰强度；和

(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度，计算所述受试者的血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的浓度，并计算所述受试者的血清样品中油酸和硬脂酸的浓度比值，最后基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量。

8.第7项所述的方法，其中基于下述二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P：

P=1/1+e-^{(4.113×a+2.508×b+1.809×c-5.328×d+2.532×f-4.608)}

其中，a表示受试者血清样品中的脱氢表雄酮的浓度，b表示受试者血清样品中的二十烷三烯酸的浓度，c表示受试者血清样品中的糖基化苯丙氨酸的浓度，d表示受试者血清样品中的尿苷的浓度，f表示受试者血清样品中油酸和硬脂酸的浓度比值。

9.第7项所述的方法，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

10.第7项所述的方法，其中步骤(2)的提取液包含1.6×10^-3mg/ml的D5-苯丙氨酸，1.3×10^-4mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸，2.0×10^-3mg/ml的D3-棕榈酸和2.0×10^-3mg/ml的D3-硬脂酸。

11.一种计算受试者的血清样品中的联合标志物变量的系统，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷，所述系统包括：

(1)绘制定量标准曲线的模块，所述模块基于利用油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、鹅脱氧胆酸、苯丙氨酸和尿苷作为标准品，加入内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸获得的数据，分别绘制相对应的血清代谢物油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷的定量标准曲线；

(2)分离装置，所述分离装置提取并洗脱来自所述受试者的血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷并记录各自的洗脱峰强度；

(3)计算模块，所述计算模块基于所述绘制定量标准曲线的模块绘制的定量标准曲线和所述分离装置记录的洗脱峰强度计算所述血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的浓度，并计算所述血清样品中油酸和硬脂酸的浓度比值；和

(4)计算所述联合标志变量的模块，所述计算所述联合标志变量的模块利用所述计算模块计算的二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的浓度值和油酸和硬脂酸的浓度比值基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量。

12.第11项所述的系统，其中基于下述二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P：

P=1/1+e^{-(4.113×a+2.508×b+1.809×c-5.328×d+2.532×f-4.608)}

其中a表示所述血清样品中的脱氢表雄酮的浓度，b表示所述血清样品中的二十烷三烯酸的浓度，c表示所述血清样品中的糖基化苯丙氨酸的浓度，d表示所述血清样品中的尿苷的浓度，f表示所述血清样品中的油酸和硬脂酸的浓度比值。

13.第11项所述的系统，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

14.第11项所述的系统，其中所述分离装置包括waters T3色谱柱和超高效液相色谱串联质谱仪。

15.一种诊断女性受试者中的多囊卵巢综合征的方法，所述方法包括下述步骤：

(2)在所述女性受试者自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离血清样品，用提取液预处理所述血清样品，其中所述提取液为包含内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸的乙腈溶液；沉淀血清样品中的蛋白，将上清液冷冻干燥，然后用乙腈：水=1∶4v/v复溶，上样到色谱柱，洗脱，记录所述血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的洗脱峰强度；

(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度，计算所述血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的浓度，并计算所述血清样品中油酸和硬脂酸的浓度比值f，其中所述血清样品中的脱氢表雄酮的浓度表示为a，二十烷三烯酸的浓度表示为b，糖基化苯丙氨酸的浓度表示为c，尿苷的浓度表示为d；基于适当的二元逻辑回归方程计算联合标志物变量P；和

(4)根据试验者对诊断灵敏度和特异性的要求，或ROC曲线下面积最大的原则，设定合适的截点值，当步骤(3)计算的联合标志物变量P大于该截点值时，判断所述受试者患有多囊卵巢综合征。

16.第15项所述的方法，其中步骤(3)所用的计算所述联合标志物变量P的二元逻辑回归方程为：

P=1/1+e^{-(4.113×a+2.508×b+1.809×c-5.328×d+2.532×f-4.608)}

17.第15项所述的方法，其中步骤(2)的提取液包含1.6×10^-3mg/ml的D5-苯丙氨酸，1.3×10^-4mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸，2.0×10^-3mg/ml的D3-棕榈酸和2.0×10^-3mg/ml的D3-硬脂酸。

本发明具有的效果是：血清样品中小分子代谢物油酸、硬脂酸(利用二者的浓度比值)、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷可以联合用于多囊卵巢综合征病人的识别，并对肥胖和非肥胖两种症型的多囊卵巢综合征病人都得到很好识别。通过本发明涉及的上述几种小分子代谢物的检测试剂盒，可以实现高灵敏、高效检测，且具有检测成本低，重复性好的特点。上述几种小分子代谢物的联合使用可用于辅助诊断多囊卵巢综合征。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示本发明的分析策略流程。

图2显示二十烷三烯酸(A)、油酸和硬脂酸的浓度比值(B)、尿苷(C)、糖基化苯丙氨酸(D)、硫化脱氢表雄酮(E)在正常对照组、多囊卵巢综合征组血清样本中的含量变化(均值±标准偏差表示)，及联合标志物在正常人和多囊病人之间的差异(F)。

图3(A)联合标志物在用于第一批正常体重的对照组和多囊卵巢综合征组血清样本中的ROC曲线，AUC=0.735；(B)联合标志物在用于第一批肥胖的对照组和多囊卵巢综合征组血清组样本中的ROC曲线，AUC=0.880；(C)联合标志物在用于第一批全部对照组和多囊卵巢综合征组血清样本中的ROC曲线，AUC=0.821；(D)联合标志物在用于第一批正常体重的对照组和多囊卵巢综合征组血清样本中的ROC曲线，AUC=0.839；(E)联合标志物在用于第一批肥胖的对照组和多囊卵巢综合征组血清组样本中的ROC曲线，AUC=0.845；(F)联合标志物在用于第一批全部对照组和多囊卵巢综合征组血清样本中的ROC曲线，AUC=0.848。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

实施例1

1.血清样品收集

采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。

50例多囊卵巢综合征患者(包括肥胖(即BMI>23)多囊卵巢综合征患者25例和非肥胖多囊卵巢综合征患者25例)在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采血，35例正常人(包括肥胖正常人15例和正常体重正常人20例)在月经第3-5天采血。所有人均是在禁食8小时以上后，次日早晨采血。采集的血样静置30分钟，3000rpm/min离心10分钟后，取血清，至于-80℃冰箱保存备用。

2.分析方法

2.1血清样本预处理

血样在4℃下解冻，取100μL血清样本，加入400μL包含内标的提取液(即，包含内标D5-苯丙氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸和D3-硬脂酸的乙腈溶液，内标的浓度参见表2)沉淀蛋白；震荡后，14000g，4℃，离心12分钟；取上清冷冻干燥，保存在-80℃冰箱中。进样前，样品用100μL乙腈：水=1∶4(v/v)复溶；震荡后，14000g，4℃，离心10分钟；取上清3μL用于进样。

表2.提取液中内标的浓度

2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：色谱仪为Agilent超高效液相色谱(Agilent1290Infinity，USA)；色谱柱为ACQUITY2.1×100nm，1.8μm，HSS T3柱(Waters，Ireland)；流动相A为6.5mM碳酸氢铵水溶液，流动相B为6.5mM碳酸氢铵甲醇/水溶液(甲醇：水=95：5，v/v)；洗脱梯度：0-1min为2％B相，1min-18min线性变化到100％B相，保持4min，24min-24，.5min线性降至2％B相并保持；柱温为50℃；流动相流速为0.35mL/min；进样量为3μL。

(2)质谱条件：质谱仪为Agilent quadrupole time-of-flight massspectrometry(q-TOF MS)(Agilent6540，USA)；采用电喷雾电离负离子模式检测；扫描范围：m/z80-1000；脱溶剂气温度为350℃，流速为11L/min；毛细管电压为3000V；碰撞电压为230V。

2.3血清测试结果及辅助诊断方法

定量分析油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷。油酸和硬脂酸的浓度比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷在正常对照组、多囊卵巢综合征组血清样本中的含量如图2A-E所示。相对于正常对照组，油酸和硬脂酸的浓度比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮和糖基化苯丙氨酸在多囊卵巢综合征组中有显著性升高，尿苷则有显著性下降。运用二元逻辑回归(即，方程1(见“发明内容”部分)，参见文献6：1.Bewick V， Cheek L，Ball J，Criticalcare2005，9(1)：112-118)，联合标志物在正常人和多囊病人之间的差异如图2F所示。当联合标志物使用0.584的截点值时，使用结果如下表3。联合标志物用于区分正常人和多囊卵巢综合征患者以及亚型的区分，均具有较高的灵敏度和特异性。

表3.

实施例2

采集了另外一批血清样本对多囊卵巢综合征的联合标志物进行了验证，包括12例正常体重对照、7例肥胖对照、15例正常体重的多囊卵巢综合征患者、12例肥胖的多囊卵巢综合征患者。

1.血清样品收集

样品收集方法同实施例1。

2.分析方法

2.1血清样品预处理方法同实施例1。

2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：液相色谱分析仪器采用Waters ACQUITY-UltraPerformance Liquid Chromatography system(Milford，Milford，USA)。色谱柱为Waters2.1×100nm，1.8μm，HSS T3柱(Waters，Milford，USA)；流动相A为6.5mM碳酸氢铵水溶液，流动相B为6.5mM碳酸氢铵甲醇/水溶液(甲醇：水=95：5，v/v)；洗脱梯度：0-0.5min为10％B相，0.5min-22min线性变化到100％B相，保持5.5min，27.5min-28min线性降至10％B相并保持3min来平衡色谱柱。柱温维持在55℃。流动相流速为0.35mL/min。进样量均为10μL。

(2)质谱条件：质谱系统使用Waters四级杆飞行时间(q-TOF)质谱(Waters，Manchester，UK)。采用电喷雾电离负离子模式检测。脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流量分别为600L/h和50L/h；脱溶剂气温度300℃；离子源温度为110℃；正离子模式下，毛细管电压为3000V，负离子模式下，毛细管电压为2500V；锥孔电压为40V；微通道板电压为2600V；质量扫描范围为80-1000m/z；每0.48秒采集一次数据。同时，Lock spay接入以校正质量。质量锁定溶液为亮氨酸-脑啡汰溶液([M+H]=556.2771，[M-H]=554.2615)。流速为0.1mL/min。

2.3验证结果。

油酸和硬脂酸的浓度比值、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的含量在多囊卵巢综合征患者组和正常对照组中有明显不同。使用二元逻辑回归方程，当联合标志物使用0.584的截点值时，使用结果如下表4。

表4.

第二批验证结果与第一批发现的结果基本吻合。油酸、硬脂酸(利用油酸和硬脂酸的浓度比值)、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷作为联合标志物用于诊断受试者中的多囊卵巢综合征，其灵敏度和特异性均较高，具有较好的应用前景。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.联合标志物在制备用于诊断受试者中的多囊卵巢综合征的试剂盒中的用途，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷。

(3)用于洗脱色谱柱的洗脱液。

3.权利要求2所述的试剂盒，其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱waters T3色谱柱的洗脱液。

4.权利要求3所述的试剂盒，其中所述洗脱液包括：

流动相A：6.5mM的碳酸氢铵水溶液，和

5.权利要求2所述的试剂盒，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

6.一种计算受试者的血清样品中的联合标志物变量的方法，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷，所述方法包括下述步骤：

(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度，计算所述受试者的血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷的浓度，并计算所述受试者的血清样品中油酸和硬脂酸的浓度比值；最后基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量。

7.权利要求6所述的方法，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

8.一种计算受试者的血清样品中的联合标志物变量的系统，其中所述联合标志物包括油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸和尿苷，所述系统包括：

(2)分离装置，所述分离装置提取并洗脱来自所述受试者的血清样品中的油酸、硬脂酸、二十烷三烯酸、硫化脱氢表雄酮、糖基化苯丙氨酸及尿苷并记录各自洗脱峰强度；

9.权利要求8所述的系统，其中所述受试者为女性受试者，所述血清样品为在自然月经周期或孕激素撤退第3-5天或双侧卵巢均无优势卵泡时采集并分离的血清样品。

10.权利要求8所述的系统，其中所述分离装置包括waters T3色谱柱和超高效液相色谱串联质谱仪。