CN114264767A - 用于糖尿病诊断的生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于糖尿病诊断的生物标志物及其用途。具体地，所述生物标志物包括三甲基赖氨酸。本发明首次发现三甲基赖氨酸在用于诊断区分糖尿病患者与健康人时，AUC达0.7以上，而氧化三甲胺与三甲基赖氨酸两个指标联合应用时，AUC接近于1。本发明的生物标志物可准确、高灵敏度、高特异性的诊断糖尿病。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及疾病诊断标志物，具体涉及用于糖尿病诊断的生物标志物及其用途。
背景技术
随着人们生活方式的改变和生活水平的提高以及老龄人口的增加，全球糖尿病的发病率持续增长,根据国际糖尿病联盟发布的最新全球糖尿病地图显示：2019年，成人糖尿病患者人数最多的国家排行，中国持续排名第一，预计将持续到2030年，发病率高，低诊断率和低控制率是我国糖尿病的现状。糖尿病是以慢性高血糖为共同临床特征的一组代谢综合征群，引起血糖增高的原因是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素抵抗以及糖原代谢异常等诸多因素而导致机体利用葡萄糖障碍，同时伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等代谢紊乱。病情严重者或应激状态下易并发急性代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒或糖尿病非酮症高渗综合征，直接危害到患者生命。长期的高血糖会使全身各个组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生，如胰腺功能衰竭、失水、电解质紊乱、营养缺乏、免疫力下降、肾功能受损、神经病变、眼底病变等。因此，早期发现和早期诊断糖尿病以及很好地控制血糖是目前糖尿病防治最有效的方法。
2019世界卫生组织WHO公布糖尿病诊断标准：依据患者的症状(多饮、多尿、多食、身体体重减轻)、空腹及餐后随机血糖浓度、OGTT试验及血红蛋白A1c(HbA1c)等来诊断糖尿病。糖尿病的诊断单凭症状和血糖等有些不可靠，因为50％以上的糖尿病患者并无明显症状，靠症状发现糖尿病很被动，而且目前常用的诊断方法中有的操作步骤繁琐、有的有使用局限性，所以导致我国糖尿病患者的诊断率还是非常低的。
代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后兴起的又一新的组学研究分支，代谢组学通过测量细胞、组织和机体代谢产物的浓度变化来反映基因、蛋白质和代谢活性本身的直接关系。由于代谢组学变化是机体对基因、疾病、环境和药物等作用的最终反映，其内源性代谢产物是机体一系列生命事件的关键或终点反应，因此代谢组学可以帮助人们更好地了解生物体中各种复杂的相互作用及其本质，可用于人类疾病的诊断，实现个体化的精准治疗。
人类肠道菌群是一个复杂的群落，肠道微生物群在免疫和防御、消化和代谢、炎症和细胞增殖中起到重要作用。来自红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼的主要营养素胆碱、甜菜碱和肉碱，参与人体内的能量代谢等生物活动。摄入后，肠道微生物对这些营养素的发酵会导致三甲胺(TMA)的释放，通过宿主肝酶，含黄素的单加氧酶3(FMO3)转化为氧化三甲胺(TMAO)。越来越多的证据表明：肠道微生物代谢小分子之一的TMAO不仅参与胆固醇代谢、促进血小板高聚集增加血栓的形成、促进血管炎症反应导致动脉斑块形成，更是参与胰岛素抵抗，与糖尿病的发病机理密切相关。但目前尚无糖尿病诊断相关的代谢标志物。
因此，本领域急需提供能够准确、高灵敏度、高特异性的诊断糖尿病的生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供能够准确、高灵敏度、高特异性的诊断糖尿病的生物标志物及其用途。
本发明第一方面，提供了一种生物标志物、和/或其检测试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于：(A)判断某一对象是否患有糖尿病；和/或(B)对糖尿病进行风险预测；
其中，所述生物标志物包括选自下组物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：同位素内标。
在另一优选例中，所述生物标志物包括三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在另一优选例中，所述同位素内标中的同位素各自独立地选自下组：2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、36Cl，或其组合，优选地，D(2H)、C13或15N，或其组合。
在另一优选例中，所述同位素为D时，所述D取代C原子上的H(非活性氢)。
在另一优选例中，所述同位素内标的分子量M1与所述标志物(自然丰度下)的分子量M0之差(M1-M0)≥2,更佳地，≥3，≥4，如4、5、6、7、8、9、10、11、12。
在另一优选例中，所述生物标志物为血浆生物标志物。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸，或其组合。
在另一优选例中，所述同位素内标包括氧化三甲胺的同位素内标，较佳地，TMAO-D9。
在另一优选例中，所述同位素内标还包括选自下组的物质：甜菜碱-D11、γ-丁基甜菜碱-D9、左旋肉碱-D9，或其组合。
本发明第二方面，提供了一种生物标志物的集合，其中所述生物标志物包括三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)生物标志物标准品，所述生物标志物包括选自下组的物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
以及(2)上述(1)中所述至少一种生物标志物的同位素内标。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括一个或多个选自下组的试剂：
(3)空白血浆，较佳地，碳吸附空白人血浆；
(4)提取溶剂，较佳地，所述提取溶剂包括含有1.0-3.0％乙酸(较佳地1.5-2.5％)的乙腈(v/v，百分比以提取溶剂总体积计)；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；和/或
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的部件：
96孔反应板、标签或说明书。
在另一优选例中，所述标签或说明书注明：
当检测对象的血液中所述生物标志物的检测结果满足以下一个或多个条件时，则提示所述对象患有糖尿病：
(1)三甲基赖氨酸≥2.2μM；和/或
(2)氧化三甲胺≥4.2uM。
在另一优选例中，所述标准品为所述生物标志物的溶液，较佳地，为所述生物标志物的混合标准溶液。
在另一优选例中，所述同位素内标为所述同位素内标的溶液(较佳地，甲醇溶液)，较佳地，为混合内标溶液。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
在另一优选例中，所述同位素内标包括氧化三甲胺的同位素内标，较佳地，TMAO-D9。
在另一优选例中，所述同位素内标还包括选自下组的物质：甜菜碱-D11、γ-丁基甜菜碱-D9、左旋肉碱-D9，或其组合。
本发明第四方面，提供了一种样本中生物标志物的液-质谱联用检测方法，包括步骤：
(a)提供如本发明第三方面所述的试剂盒以及一待测样本，较佳地，所述待测样本为生物样本，更佳地，所述待测样本选自下组：血液、血清、血浆、或其组合，优选地，外周全血；
(b)将所述同位素内标的溶液分别加入标准品溶液和所述待测样本中，提取溶剂提取，分别得到标准样品和待测样品；和
(c)将所述标准样品和待测样品分别上样至HPLC-MS并分析，所述MS采用正离子MRM(Multi Reaction Monitor,多反应监测)模式。
在另一优选例中，步骤(b)中，还包括以同样的方法处理已知浓度标准品溶液与空白血浆混合后获得的质控样品，所述质控样品用于评价检测过程中方法的稳定性和/或准确性。
在另一优选例中，所生物标志物为糖尿病相关生物标志物。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(d)根据HPLC所测得的离子丰度(子离子或母离子)，通过内标曲线法，计算样本中所述生物标志物的浓度。
在另一优选例中，所述液质联用法采用HPLC-MS或UPLC-MS液质联用仪，如岛津LC-MS 8050。
在另一优选例中，所述质谱为三重四级杆质谱或离子阱质谱。
在另一优选例中，所述质谱的离子源为电喷雾电离源(ESI)或大气压化学电离源(APCI)。
在另一优选例中，所述HPLC的洗脱条件包括的一个或多个选自下组的特征：
(i)色谱柱为反相色谱柱(如C18色谱柱)；
(ii)流动相：A相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.05-0.2％，更佳地0.08-0.12％)和0.01-0.1％氨水(较佳地0.015-0.07％，更佳地0.02-0.05％)的水(v/v，以A相总体积计)；B相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.07-0.25％，更佳地0.08-0.15％)的乙腈(v/v，以B相总体积计)；和
(iii)梯度洗脱。
在另一优选例中，所述梯度程序包括：
从平衡状态开始，在2-10min(较佳地，2-5min)内，A相从1-20％变化至55-65％，所述百分比以流动相总流速计(v/v)，较佳地，A相从2-18％变化至58-63％，更佳地，A相从4-16％变化至59-62％。
在另一优选例中，所述梯度程序包括，百分比以流动相A和流动相B的总流量计(v/v)：
0min：流动相B为92-99％，其余为流动相A；
1.5min：流动相B为80-90％，其余为流动相A；
2.5min：流动相B为55-65％，其余为流动相A；
3.5min：流动相B为92-99％，其余为流动相A。
在另一优选例中，色谱洗脱条件还包括一个或多个选自下组的特征：
(a)色谱柱柱温为25-50℃，较佳地35-45℃；
(b)进样室温度为2-20℃，较佳地5-15℃；
(c)流速为0.1-1.5mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.3-0.8mL/min，最佳地0.4-0.6mL/min。
在另一优选例中，流动相A中，甲酸：氨水：水的体积比为(0.05-0.2％)：(0.03-0.1％)：100％；较佳地，(0.08-0.12％)：(0.02-0.03％)：100％。
在另一优选例中，所述的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC。
在另一优选例中，所述的色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μM)。典型地，所述的色谱柱的规格为(2.1×100mm，1.7μM)。
代表性的，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×100mm，1.7μM)。优选地，所述色谱柱还加装有保护预柱，如保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuardpre-column(
1.7μM，2.1×5mm)。保护预柱可以拦截样品中的部分杂质，从而对色谱柱起到保护作用。
再另一优选例中，所述方法包括：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述HPLC洗脱液进行电离，以产生所述生物代谢物和内标的前体离子；和
(ii)在质谱内对所述前体离子进行碰撞，分别产生所述前体离子的碎片离子。
在另一优选例中，所述质谱的检测条件包括一个或多个下述特征：
雾化气流量2.5-3.5L/min，较佳地，2.8-3.2L/min，更佳地，2.9-3L/min；
加热气流量8-12L/min，较佳地，9-11L/min，更佳地，9.5-10L/min；
干燥气流量8-12L/min，较佳地，9-11L/min，更佳地，9.5-10L/min；
接口温度为250-350℃；较佳地，270-320℃，更佳地，280-300℃；
DL温度为250-350℃；较佳地，270-320℃，更佳地，280-300℃；和/或
加热块温度为350-450℃；较佳地，370-420℃，更佳地，380-400℃。
在另一优选例中，所述三甲基赖氨酸的碰撞能为-20--25eV，较佳地，-21--22eV。
在另一优选例中，所述氧化三甲胺的碰撞能为-20--25eV，较佳地，-21--22eV。
在另一优选例中，所述三甲基赖氨酸的母离子/子离子的监测质荷比为189.20＞84.10。
在另一优选例中，氧化三甲胺的母离子/子离子的监测质荷比为76.15＞58.15。
本发明第五方面，提供了一种用于糖尿病辅助筛查装置，所述装置包括：
(a)生物标志物水平输入模块，所述生物标志物水平输入模块用于输入来源于某一对象的样品中各个生物标志物的水平，其中所述的生物标志物包括三甲基赖氨酸；
(b)糖尿病判别处理模块，所述处理模块对于输入的生物标志物水平C1，与糖尿病风险度阈值CO进行比较，从而得出辅助筛查结果，其中，当所C1≥C0，则提示该对象患有糖尿病或患糖尿病风险高；和
(c)辅助筛查结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果。
在另一优选例中，所述生物标志物包括三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在另一优选例中，所述“生物标志物水平”指生物样品中所述生物标志物的浓度，较佳地所述生物样本选自下组：血液、血清、血浆、或其组合，优选地，外周全血。
本发明第六方面，提供了一种糖尿病诊断方法，包括步骤：
(1)提供一检测样本，较佳地，所述样本为血液样本(如血液、血清、血浆、或其组合，优选地，外周全血)；
(2)检测样本中的生物标志物的浓度，记为C1；
(3)将所述生物标志物的浓度C1与对照参比值C0进行比较，
其中，所述生物标志物包括选自下组的物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
如果检测对象的所述生物标志物浓度C1＞C0时，则提示检测对象患有糖尿病。反之亦然。
在另一优选例中，所述对比参照值C0为正常人样本中所述标志物浓度的1.2-5倍，较佳地，1.5-3倍，更佳地，2倍。
在另一优选例中，三甲基赖氨酸的对照参比值C0为2.2μM。
在另一优选例中，氧化三甲胺的对照参比值C0为4.2uM。
在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
本发明第七方面，提供了一种建立糖尿病风险预测的方法，所述的方法包括：识别患者和健康对照者之间，血液样品中差异表达物质的步骤,
其中，所述的差异表达物质包括选自下组的生物标志物：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在另一优选例中，所述差异表达物质还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1得到的氧化三甲胺标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:氧化三甲胺，m/z:76.15>58.15，标准曲线公式:f(x)＝0.135069*x+0.00872933，相关系数(R)＝0.9981007，拟合度(R^2)＝0.9962049。
图2为实施例1得到的三甲基赖氨酸标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:左旋肉碱，m/z:162.10>60.10，标准曲线公式:f(x)＝0.134479*x-0.00550064，相关系数(R)＝0.9957066，拟合度(R^2)＝0.9914317。
图3为实施例1得到的甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:甜菜碱，m/z:118.10>85.10，标准曲线公式:f(x)＝0.229124*x+0.0305053，相关系数(R)＝0.9992594，拟合度(R^2)＝0.9985193。
图4为实施例1得到的巴豆甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:巴豆甜菜碱，m/z:144.00>85.10，标准曲线公式:f(x)＝0.272751*x-0.00613629，相关系数(R)＝0.9961319，拟合度(R^2)＝0.9922787。
图5为实施例1得到的γ-丁基甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:γ-丁基甜菜碱，m/z:146.00>87.05，标准曲线公式:f(x)＝0.198595*x-0.0105567，相关系数(R)＝0.9957488，拟合度(R^2)＝0.9915156。
图6为实施例1得到的左旋肉碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:左旋肉碱，m/z:162.10>60.10，标准曲线公式:f(x)＝0.373827*x+0.806322，相关系数(R)＝0.9997124，拟合度(R^2)＝0.9994249。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试。提供了能够作为准确诊断糖尿病的生物标志物(群)。本发明首次发现了三甲基赖氨酸可以作为生物标志物用于诊断糖尿病，且诊断灵敏度和特异性高。而将三甲基赖氨酸与氧化三甲胺一起作为诊断糖尿病的生物标志物时，可高特异性、高灵敏度、高准确性的诊断患者是否患有糖尿病。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“液-质联用”为高效液相-质谱联用的简称，即“液-质联用”与“高效液相-质谱联用”可互换使用。
如本文所用，术语“氧化三甲胺”简称TMAO，即“氧化三甲胺”与“TMAO”可互换使用。
如本文所用，术语“超高效液相色谱”简称UPLC，即“超高效液相色谱”与“UPLC”可互换使用。
在本发明中，应当理解的是，所述的流动相流速为流动相A和流动相B的流速之和。
如本文所用，术语“氧化三甲胺-D9甲醇”与“TMAO-D9”可互换使用，在本发明中，它被用作氧化三甲胺和三甲基赖氨酸质谱检测的内标。
如本文所用，术语“碎片离子”和“子离子”可以互换使用，是指由分子离子或较大碎片离子的单分子裂解反应产生的。
如本文所用，术语“流动相A”、“A相”或“水流动相”可以互换使用是指液相条件中按0.05-0.4％(v/v)甲酸和0.01-0.1％(v/v)氨水的比例分别加入到超纯水后得到的流动相A。
如本文所用，术语“流动相B”、“B相”或“有机流动相”可以互换使用是指液相条件中，所述的流动相B为包括0.05-0.4％(v/v)甲酸的乙腈。
如本文所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。
如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术，MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)，化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器(离子源)和离子检测器。
根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。所述生物标志物可以分开包装或混合在一起。
根据本发明，生物标志物的含量通过质谱信号面积归一化值指示。
如本文所用，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
如本文所用，术语“同位素内标”或“同位素衍生物”可互换使用，指一化合物中的一个或多个原子被其同位素原子代替后形成的同位素衍生物。同位素内标与所述化合物的理化性质基本相同，但分子量不同，所以非常适合作为质谱检测中的内标物。常见的同位素包括，但并不限于：2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、36Cl，或其组合，优选地，D(2H)、C13或15N，或其组合。通常，所述同位素内标比原化合物的分子量之差(M1-M0)≥2,更佳地，≥3，≥4，如4、5、6、7、8、9、10、11、12。不同标志物的同位素内标了各自独立地包含不同种类、不同数目的同位素。
术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％，较佳地5％，更佳地1％。
ROC-AUC
ROC-AUC是一种评价模型准确性的方法，ROC曲线为受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve)，以假阳性概率(False positive rate)为横轴，真阳性(True positive rate)为纵轴所组成的坐标图，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。AUC为ROC曲线下方面积(Area under the curve)。ROC-AUC值在1.0和0.5之间，越接近于1，说明诊断效果越好，在0.5～0.7时有较低准确性，在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。
糖尿病生物标志物
本发明人意外地首次发现，三甲基赖氨酸可用于糖尿病的诊断和/或预测。
因此，本发明的糖尿病生物标志物包括三甲基赖氨酸。
优选地，所述生物标志物包括三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
此外，所述生物标志物还可包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
三甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸和单甲基赖氨酸的结构式分别如下所示:
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)生物标志物标准品，所述生物标志物包括选自下组的物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
以及(2)上述(1)中所述至少一种生物标志物的同位素内标。
更具体地，本发明提供了一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，包括：
(1)标准品，所述标准品含TMAO、三甲基赖氨酸；
(2)质控品，所述质控品含TMAO、三甲基赖氨酸；
(3)同位素内标溶液，所述同位素内标溶液含有TMAO-D9和甲醇；
(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。
在另一优选例中，所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比(v/v)为1.0-3.0％，较佳地1.5-2.5％。
在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括(7)对照品，所述对照品含TMAO、三甲基赖氨酸。
检测方法
本发明还提供了一种检测方法，用于检测以甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺、二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、为代表的多种肠道微生物代谢物。
优选地，本发明的方法为液质联用检测，包括步骤：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的至少一种前体离子；
(ii)分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和
(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种肠道微生物代谢物的量；
其中，色谱检测过程中的流动相中甲酸和氨水。
本发明方法特别适合检测甜菜碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺、二甲基赖氨酸、(单)甲基赖氨酸、或其组合。
在一优选实施方式中，本发明的检测方法包括如下步骤：
(1)将本发明所述的标准品、内标品和提取溶剂加入到质控品和待测血样中，经充分反应后，取上清液，通过高效液相-质谱联用测定分析待测血样中以上标志物的含量。
在一个优选例中，所述的高效液相的色谱条件为：
(i)色谱柱为反相色谱柱(如C18色谱柱)。
(ii)流动相：A相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.05-0.2％，更佳地0.08-0.12％)和0.01-0.1％氨水(较佳地0.015-0.07％，更佳地0.02-0.05％)的水(v/v，以A相总体积计)。A相中，加入甲酸和氨水用于调整色谱峰峰型。甲酸和氨水中的部分也可以以甲酸铵等形式加入。
B相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.07-0.25％，更佳地0.08-0.15％)的乙腈(v/v，以B相总体积计)。
(iii)梯度洗脱。
优选地，所述的梯度洗脱的程序包括：
另一优选例中，所述的梯度洗脱的程序包括：
另一优选例中，所述的梯度洗脱的程序包括：
在另一优选例中，所述的梯度洗脱程序包括：
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
色谱柱温度：25-50℃，较佳地35-45℃；
进样室温度：2-20℃，较佳地5-15℃；
流动相(流动相A+流动相B)流速：0.1-1.5mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.3-0.8mL/min，最佳地0.4-0.6mL/min。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μM)。典型地，所述的反相色谱柱的规格为(2.1×100mm，1.7μM)。
代表性的，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×100mm，1.7μM)。优选地，所述色谱柱还加装有保护预柱，如保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuardpre-column(
1.7μM，2.1×5mm)。保护预柱可以拦截样品中的部分杂质，从而对色谱柱起到保护作用。
通常，在质谱阶段，样品经历下述阶段：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述HPLC洗脱液进行电离，以产生所述生物代谢物和内标的前体离子；和
(ii)在质谱内对所述前体离子进行碰撞，分别产生所述前体离子的碎片离子。
在本发明方法是体外非治疗性和非诊断性的。
糖尿病辅助筛查方法和装置
本发明还提供了基于比较某一对象的样本中，所述生物标志物水平来诊断所述对象是否患有糖尿病或预测所述对象糖尿病患病风险的方法和装置，其中所述生物标志物包括三甲基赖氨酸。
评估方法包括：
(1)提供一检测样本，较佳地，所述样本为血液样本(如血液、血清、血浆、或其组合，优选地，外周全血)；
(2)检测样本中的生物标志物的浓度，记为C1；
(3)将所述生物标志物的浓度C1与对照参比值C0进行比较。
如果检测对象的所述生物标志物浓度C1＞C0时，则提示该对象患有糖尿病。而检测对象的所述生物标志物浓度C1与C0的差异大小可用于预测糖尿病患病风险。
如本文所用，术语“参比值”或“风险度阈值”、“对照参比值”“阈值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据比较不同人群(如正常人群和/或糖尿病患者群体)中本发明的生物标志物的血液浓度，并进行统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次发现了三甲基赖氨酸与糖尿病具有高相关性(AUC＞0.75)，可用作诊断糖尿病的标志物。
(b)进一步地，本发明发现三甲基赖氨酸与TMAO联检，可显著提高对糖尿病诊断的准确性、灵敏度、特异性，ACU接近1(＞0.93)，诊断区分性好，可实现糖尿病的精准诊断。
(c)本发明还提供了检测复杂生物样品(如血液)中，多种糖尿病相关的生物标志物液质联用方法，所述方法单次检测即可实现多种生物标志物的定性和定量检测，且该检测方法操作简单，分析时间短(联检仅需5分钟)、检测结果准确，且结果重现率高(CV＜10％)，非常适合大规模样品的自动进样检测。
(d)本发明提供的试剂盒可以用于通过液质联用法诊断糖尿病，提高诊断便利性，促进诊断方法标准化。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
1.1标本来源
在取得患者同意后，收集了29例临床诊断为糖尿病患者(空腹血糖＞7.0mmol/L，餐后两小时血糖＞11.1mmol/L)的血浆样本、以及29例健康人的血浆样本，且年龄、性别与糖尿病患者相匹配。
1.2主要仪器与设备：
岛津LC-MS 8050；LabSolutions Insight软件。
1.3试剂与材料：
甜菜碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺标准品；甜菜碱-D11、γ-丁基甜菜碱-D9、左旋肉碱-D9、氧化三甲胺-D9、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氨水、碳吸附人血浆皆为市售试剂。
1.4液相色谱和质谱分析条件：
1.4.1色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(
1.7μM，2.1×100mm)；
保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuard pre-column(
1.7μM，2.1×5mm)；
流动相A：0.1％(v/v)甲酸(A)+0.025％(v/v)氨水(B)的水溶液；流动相B：0.1％(v/v)甲酸(A)的乙腈溶液；以流动相B的总体积计；流速0.6mL/min：柱温45℃：进样室温度：8℃；进样量1μL；洗针液：50％甲醇水。
流动相梯度方法：
1.4.2质谱条件：
采用电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM模式检测；
雾化气流量3L/min，加热气流量10L/min；干燥气流量10L/min；接口温度：300℃；DL温度：300℃；加热块温度：400℃。
1.5溶液配制
1.5.1混合标准曲线溶液配制：
精密称取甜菜碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解后分别配制成浓度为5mmol/L的标准品储备液。再用50％甲醇水溶液将浓度为5mmol/L的标准品储备液依次稀释为以下标准曲线工作溶液。
混合标准品溶液，所述的巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、三甲基赖氨酸这三种物质标准曲线的浓度为0.05、0.25、1、2.5、5、10、25μmol/L；所述的甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺这三种物质标准曲线的浓度为0.1、0.5、2、5、10、20、50μmol/L；以上混标溶液的配制基质为50％甲醇水溶液。
1.5.2混合内标溶液配制：
精密称取甜菜碱-D11、γ-丁基甜菜碱-D9、左旋肉碱-D9、氧化三甲胺-D9适量，用甲醇溶解得到1mmol/L混合内标储存溶液，再用甲醇稀释到10μmol/L的混合内标工作溶液。
1.5.3提取溶剂
所述的提取溶剂的成分为乙腈和乙酸，且乙酸的体积比为2.0％。
1.5.4质控品I和质控品II的配制：
取适量Seralab碳吸附空白人血浆，加入少量混合标准品的浓度最高点溶液，分别配制质控I和质控II。
1.6血浆样本的前处理及进样分析：
分别将混合标准品工作液和待测血浆样本各25μL加入到96孔板的不同孔中，然后向每个孔中依次加入20μL的混合内标，再加入400μL乙酸乙腈溶液(乙酸浓度为2％)，涡旋1min，4000rpm离心5min，取上清液120μL，分别进样1μL到液质联用仪，测定分析待测血浆样本中肠道菌群代谢物各代谢物的含量(单位为μM)。其中，以上化合物的标准回归曲线如图1-图6所示。如图1-图6所示，以上化合物的标准回归曲线线性很好，R2＞0.99，符合性能要求。
1.7结果
检测结果如下表1所示，根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，特固定所有指标的特异性为96.6％(即健康人群样本中只有一例为阳性),从ROC曲线中得到的AUC面积及阈值如表1所示。表1中大于该阈值的为定义为+，小于该阈值的定义为-。
表1各指标的AUC及阈值
实施例2
2.1构建ROC曲线，比较以上肠道菌群代谢物单个或联合对诊断区分糖尿病患者和健康人群的能力。
采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过29例糖尿病患者样本与29例健康人血浆样本中甜菜碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺的表达水平判断其用于诊断糖尿病的能力。根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，特固定所有指标的特异性为96.6％(即健康人群样本中只有一例为阳性),从ROC曲线中得到的灵敏度、AUC及阈值如表2所示。
表2单个差异代谢物诊断区分糖尿病患者与健康人群的能力
| 单个差异代谢物 | 特异性 | 灵敏度 | AUC | 阈值 |
| 氧化三甲胺 | 96.6％ | 65.5％ | 0.861 | 4.2uM |
| 三甲基赖氨酸 | 96.6％ | 48.3％ | 0.763 | 2.2uM |
| 左旋肉碱 | 96.6％ | 17％ | 0.413 | 102uM |
| 巴豆甜菜碱 | 96.6％ | 10％ | 0.22 | 8uM |
| γ-丁基甜菜碱 | 96.6％ | 6.7％ | 0.536 | 1.5uM |
| 甜菜碱 | 96.6％ | 6.7％ | 0.429 | 116.5uM |
从表2可以看出，TMAO和三甲基赖氨酸在单个用于诊断区分糖尿病患者与健康人的AUC均在0.7以上。
在以上两个差异性指标中，TMAO诊断区分糖尿病患者与健康人的能力最强，AUC为0.861，灵敏度为65.5％、特异性为96.6％。三甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力其次，AUC为0.763，灵敏度为48.3％、特异性为96.6％。
2.2进一步验证TMAO和三甲基赖氨酸这两个指标联合检测是否提高诊断效果。
表3两个差异代谢物联合诊断区分糖尿病患者与健康人群的能力
如表3所示，当TMAO和三甲基赖氨酸联合应用时，可明显提升诊断区分糖尿病患者与健康人的能力，AUC为0.933，诊断区分效果优；在特异性均为96.6％的情况下，灵敏度分别由单检时的65.5％、48.3％提升到联检时的93.1％。
而氧化三甲胺与左旋肉碱联合应用时，AUC为0.861，诊断区分效果一般；在特异性均为93.1％的情况下，灵敏度分别由单检时的65.5％、17％提升到联检时的69％。
而三甲基赖氨酸与左旋肉碱联合应用时，AUC为0.759，诊断区分效果一般；在特异性均为93.1％的情况下，灵敏度分别由单检时的48.3％、17％提升到联检时的58.6％。
综上所述，TMAO和三甲基赖氨酸联合应用时，可明显提升诊断区分糖尿病患者与健康人的能力。当氧化三甲胺与左旋肉碱联合应用、三甲基赖氨酸与左旋肉碱联合应用时，并没有明显提升诊断区分糖尿病患者与健康人的能力。
实施例3：糖尿病患者样本中筛选出的指标在心肌梗死样本中的验证
3.1标本来源
在取得患者同意后，收集了20例心肌梗死患者(肌钙蛋白＞500pg/mL)的血浆样本，29例健康人的年龄、性别与心肌梗死患者相匹配，采血时间均为清晨空腹状态。
使用实施例1中的实验方法对20例心肌梗死患者和29例健康人的血浆进行前处理及LC-MS/MS上机检测，再构建ROC曲线进一步验证糖尿病患者样本中筛选出的单个或指标组合在心肌梗死样本中的灵敏度、特异性。根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，当固定心肌梗死中所有联检指标的特异性与糖尿病中所有联检指标的特异性一致时(均为96.6％),从ROC曲线中得到的灵敏度及AUC如表4所示。
表4糖尿病中单个或联合差异代谢物在区分心肌梗死患者和健康人群的验证
如表4所示，在糖尿病患者样本中筛选出的TMAO、三甲基赖氨酸单指标在特异性为96.6％的条件下，灵敏度在糖尿病患者样本中分别为65.5％、48.3％，在心肌梗死样本中仅为30.0％、5.0％，说明心肌梗死样本对TMAO、三甲基赖氨酸无干扰。
进一步地，在糖尿病患者样本中筛选出的TMAO与三甲基赖氨酸联检时(保持特异性为96.6％的条件下)，灵敏度在糖尿病患者样本中达到93.1％，在心肌梗死样本中仅为20％。说明TMAO与三甲基赖氨酸联检时能很好的区分诊断糖尿病患者样本和健康人群样本，心肌梗死样本对以上两指标组合无干扰。
实施例4：检测试剂盒的制备
基于本发明提供的代谢标志物制备了检测试剂盒，该试剂盒包括如下成分：质控品、同位素内标提取液、提取溶剂、流动相添加剂A、流动相添加剂B。优选地，所述检测试剂盒还包括对照品、96孔反应板、96孔过滤板、说明书等。本发明的试剂盒可检测TMAO和三甲基赖氨酸的含量。
具体地，在本发明的试剂盒中，对照品和/或质控品含有TMAO和三甲基赖氨酸，同位素内标提取液中含有TMAO-D9，浓度均为5μM，提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸，体积比(v/v)为2.0％，流动相添加剂A为甲酸，流动相添加剂B为氨水。本试剂盒保存于2～8℃。
当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述两个代谢标志物的标准品，可以仅使用其中几个进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。该试剂盒是基于本发明提供的代谢标志物群而设计的，可以用于诊断区分糖尿病患者与健康人群。
实施例5：验证甲基基团对甲基赖氨酸衍生物的影响为进一步验证甲基基团对甲基赖氨酸衍生物在诊断糖尿病中是否有影响，使用实施例1的实验检测方法对实施例1中的健康人群样本和糖尿病患者样本进行了检测，各指标的AUC及阈值见表5。
表5各指标的AUC及阈值
表6单个差异代谢物诊断区分糖尿病患者与健康人群的能力
| 单个差异代谢物 | 特异性 | 灵敏度 | AUC | 阈值 |
| 氧化三甲胺 | 96.6％ | 65.5％ | 0.861 | 4.2uM |
| 三甲基赖氨酸 | 96.6％ | 48.3％ | 0.763 | 2.2uM |
| 二甲基赖氨酸 | 96.6％ | 20.5％ | 0.461 | 2.7uM |
| 甲基赖氨酸 | 96.6％ | 6.9％ | 0.419 | 24uM |
| 赖氨酸 | 96.6％ | 37.9％ | 0.685 | 230uM |
从表6可以看出，甲基基团的个数对甲基赖氨酸衍生物在诊断糖尿病中的确有影响，三甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力最强，AUC为0.763，灵敏度为48.3％、特异性为96.6％。二甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力次于三甲基赖氨酸，AUC为0.461，灵敏度为20.5％、特异性为96.6％。(单)甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力次于二甲基赖氨酸，AUC为0.419，灵敏度为6.9％、特异性为96.6％。
进一步验证几种甲基赖氨酸衍生物与TMAO联合检测对诊断区分糖尿病的效果。表7两个差异代谢物联合诊断区分糖尿病患者与健康人群的能力
从表7可以看出，三甲基赖氨酸与TMAO联检对诊断区分糖尿病患者与健康人的能力最强，AUC为0.933，灵敏度为93.1％、特异性为96.6％。二甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力次于三甲基赖氨酸，AUC为0.889，灵敏度为72.4％、特异性为93.1％。甲基赖氨酸诊断区分糖尿病患者与健康人的能力次于二甲基赖氨酸，AUC为0.861，灵敏度为65.5％、特异性为93.1％。
综上所述，本发明首次发现了三甲基赖氨酸可以作为生物标志物用于诊断糖尿病，且诊断灵敏度高。而将三甲基赖氨酸与氧化三甲胺两个指标一起作为诊断糖尿病的生物标志物时，可高特异性、高灵敏度、高准确性的诊断患者是否患有糖尿病，可简单、准确、快速的诊断糖尿病，降低误诊率，具有显著的进步。
本发明还提供了用于检测样品中所述生物标志物的高效液相色谱-质谱连用分析方法，可以在单次实验中完成复杂样品中与糖尿病相关的肠道微生物代谢标志物(尤其是本发明的生物标志物)的分离和检测，且所述方法准确度高、灵敏度高、稳定性、重现性好，非常适合作为检测生物样品中肠道微生物代谢标志物的标准分析方法。
通过对本发明的生物标志物的检测，为开发针对性地调节肠道微生物代谢标志物来预防和糖尿病的方法提供了可能，从而满足临床上早期诊断糖尿病的需求，有望实现糖尿病的精准医疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种生物标志物、和/或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于：(A)判断某一对象是否患有糖尿病；和/或(B)对糖尿病进行风险预测；
其中，所述生物标志物包括选自下组物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂选自下组：同位素内标。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物还包括一个或多个选自下组的物质：二甲基赖氨酸、甲基赖氨酸、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱。
4.一种生物标志物的集合，其特征在于，所述集合包括三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)生物标志物标准品，所述生物标志物包括选自下组的物质：
(a)三甲基赖氨酸；和
(b)三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
以及(2)上述(1)中所述至少一种生物标志物的同位素内标。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一个或多个选自下组的试剂：
(3)空白血浆，较佳地，碳吸附空白人血浆；
(4)提取溶剂，较佳地，所述提取溶剂包括含有1.0-3.0％乙酸(较佳地1.5-2.5％)的乙腈(v/v，百分比以提取溶剂总体积计)；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；和/或
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。
7.一种样本中生物标志物的液-质谱联用检测方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供如权利要求5所述的试剂盒以及一待测样本，较佳地，所述待测样本为生物样本，更佳地，所述待测样本选自下组：血液、血清、血浆、或其组合，优选地，外周全血；
(b)将所述同位素内标的溶液分别加入标准品溶液和所述待测样本中，提取溶剂提取，分别得到标准样品和待测样品；和
(c)将所述标准样品和待测样品分别上样至HPLC-MS并分析，所述MS采用正离子MRM(Multi Reaction Monitor,多反应监测)模式。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC的洗脱条件包括的一个或多个选自下组的特征：
(i)色谱柱为反相色谱柱(如C18色谱柱)；
(ii)流动相：A相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.05-0.2％，更佳地0.08-0.12％)和0.01-0.1％氨水(较佳地0.015-0.07％，更佳地0.02-0.05％)的水(v/v，以A相总体积计)；B相：含有0.05-0.4％甲酸(较佳地0.07-0.25％，更佳地0.08-0.15％)的乙腈(v/v，以B相总体积计)；和
(iii)梯度洗脱。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述梯度程序包括，百分比以流动相A和流动相B的总流量计(v/v)：
0min：流动相B为92-99％，其余为流动相A；
1.5min：流动相B为80-90％，其余为流动相A；
2.5min：流动相B为55-65％，其余为流动相A；
3.5min：流动相B为92-99％，其余为流动相A。
10.一种用于糖尿病辅助筛查的装置，其特征在于，所述装置包括：
(a)生物标志物水平输入模块，所述生物标志物水平输入模块用于输入来源于某一对象的样品中各个生物标志物的水平，其中所述的生物标志物包括三甲基赖氨酸；
(b)糖尿病判别处理模块，所述处理模块对于输入的生物标志物水平C1，与糖尿病风险度阈值CO进行比较，从而得出辅助筛查结果，其中，当所C1≥C0，则提示该对象患有糖尿病或患糖尿病风险高；和
(c)辅助筛查结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果。
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