WO2006062127A1 - 免疫システム異常疾患の診断支援方法及び診断支援情報出力装置 - Google Patents

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WO2006062127A1
WO2006062127A1 PCT/JP2005/022453 JP2005022453W WO2006062127A1 WO 2006062127 A1 WO2006062127 A1 WO 2006062127A1 JP 2005022453 W JP2005022453 W JP 2005022453W WO 2006062127 A1 WO2006062127 A1 WO 2006062127A1
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Isao Kitajima
Hiroshi Yamane
Tomokazu Yoshida
Yasushi Hasui
Kazuhiko Takeda
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Sysmex Corporation
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Definitions

  • the present invention is intended for the treatment of immune system abnormal diseases such as systemic inflammation response syndrome (SIRS) such as sepsis, and anti-inflammation response syndrome (CARS).
  • SIRS systemic inflammation response syndrome
  • CARS anti-inflammation response syndrome
  • Diagnostic support method and diagnostic support information output device for outputting diagnostic support information on symptoms that will appear several hours later by predicting the onset of causal site force-in at the transcriptional stage with respect to the diagnostic support method and diagnostic support information output device Relates to the device.
  • Septicemia which is a state in which infection has progressed and presents systemic findings, is initially high fever and hyperventilation, warm blood pressure in the skin is slightly reduced, and tachycardia In the output state, cardiac output is increased and peripheral vascular resistance is decreased. If proper treatment is not performed at this time, respiratory problems such as kidney, liver and blood will progress. There are various treatments such as removal of the source of infection, administration of antibiotics, management of lung kidney and liver, control of DIC, but if appropriate treatment is not performed, various organ disorders (multi-organ failure) develop, You will die. Despite advances in intensive care management, the mortality rate for patients with such severe sepsis is as high as 30-50%.
  • SIRS was proposed by Bernard et al. In 1992 and is considered to be abnormal in two or more of the four items reflecting body condition, body temperature, heart rate, respiratory rate, and peripheral blood white blood cell count.
  • SI RS is a nonspecific systemic inflammatory reaction triggered by various endogenous mediators regardless of the type of invasion (surgery, severe trauma, burns, infection, etc.), and sepsis ( se p s i s ) In addition, it has non-infectious, non-specific systemic inflammatory response and! / Manic morbidity.
  • SIRS treatment is based on experience based on judgment of symptom power. Is being done. Specifically, treatments include large doses of steroids and large doses of anti-inflammatory drugs.
  • SIRS symptoms such as hyperthermia and hyperventilation are caused by anti-inflammatory site force-in, not just from a state where the inflammatory reaction caused by inflammatory site force-in is enhanced (hyperimmune state). Similar symptoms are observed even in the anti-inflammatory hypersensitivity state (immunosuppressed state), and if the symptoms are misunderstood, the treatment will be completely reversed. For example, organ dysfunction may develop and death may occur if immunity is reduced due to long-term use of steroids or immunosuppressants.
  • Patent Document 1 as a method for identifying and monitoring a patient at risk for a systemic inflammatory condition, a physiological parameter selected by the patient is measured, and the patient's systemic relationship is measured. A method for obtaining a mediator-related response test profile and comparing it to a control profile is proposed. Physiological parameters include physical examination, vital signs, hemodynamic measurements, clinical laboratory tests, acute inflammatory response mediator concentrations, platelet and granulocyte aggregation measurements and endotoxin levels. ing.
  • leukotrienes, prostaglandins, cytopower in, platelet activity factor, neutrophil elastase are measured by ELISA, complement component C3a is measured by radioimmunoassay, plasma endotoxin Examples include measuring levels and measuring granulocyte aggregation.
  • any physiological parameter, patient force, and blood Measured proteins and growth factors, and the protein to be measured is a secreted product from the cell. Even if it represents the state of the cell at the time of collection, the state at the time of collection is maintained thereafter. It is not always done. In other words, as a cause of difficulty in establishing a method for treating immune system diseases, rapid changes in the pathological condition, that is, site power-in which causes symptoms may change from moment to moment. For this reason, for example, the expression of site force in in the collected sample is measured, and even if significant expression of site force in is recognized, the sample is collected until the force measurement result is obtained. In addition, since the state of expression of site force-in changes, treatment to suppress the measured site force-in is not always appropriate.
  • Patent Document 1 JP 10-500210
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and its purpose is to suggest appropriate diagnosis support information in the treatment of abnormal immune system diseases whose symptoms can change rapidly.
  • An object of the present invention is to provide a diagnostic support method for an immune system abnormal disease.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnosis support information output device capable of outputting appropriate diagnosis support information.
  • the diagnosis support method for an immune system abnormal disease of the present invention includes a site force-in selected from the group consisting of inflammatory site force-in and anti-inflammatory site force-inca contained in a biological sample collected from a patient.
  • the information on the progress of inflammation includes information on whether or not the inflammatory response is enhanced, and information on whether or not the anti-inflammatory response is enhanced.
  • the information group whether or not the expression level of inflammatory site force-in increases and the information force whether or not the expression level of anti-inflammatory site force-in increases Forces may include information on the on-site information selected.
  • the diagnosis support information may further include information on a treatment method.
  • the treatment method includes: It is preferably selected from the group consisting of administration of an anti-inflammatory agent, plasma exchange and granulocyte colony-stimulating factor.
  • the biological sample is preferably a nuclear extract of cells collected by patient force.
  • the measurement step is a surface plasmon resonance method preferably performed by a measurement method in which the time until the measurement start force measurement result is obtained is within 1 hour, preferably 30 minutes or less. It is preferable to use one type selected from the group consisting of the quartz resonator microbalance method and the single molecule fluorescence correlation method.
  • two or more active transcriptional regulatory factors may be measured.
  • the immune system abnormal disease is preferably systemic inflammatory response syndrome (SIRS).
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • the immune system abnormal disease diagnosis support information output device of the present invention is a site force selected from the group consisting of inflammatory site force in and anti-inflammatory site force inca included in a biological sample collected by patient force.
  • diagnostic support information output means for outputting diagnostic support information including information on the progress state of the future inflammation.
  • the information on the progress of inflammation is selected from a group consisting of information on whether an inflammatory response is enhanced and information on whether an anti-inflammatory response is enhanced. It may contain information, or it may be information on whether or not the expression level of inflammatory site force-in increases and information on whether or not the expression level of anti-inflammatory site force-in increases. Group power may include information on site power in expression selected.
  • the diagnosis support information includes information on a treatment method.
  • the treatment method is selected from the group consisting of administration of an anti-inflammatory agent, plasma exchange, and granulocyte colony-stimulating factor. Is preferred.
  • the diagnosis support information output means stores information on a transcription control factor specific to inflammatory site force-in, transcription control factor information acquired by the information acquisition means, and the storage means. Based on the information, and a prediction means for predicting whether the expression level of inflammatory site force-in increases or not. Based on the prediction result of the prediction means, the diagnostic support information is output. It is preferable to force.
  • the storage means may further be a means for storing information on a transcriptional control factor specific to anti-inflammatory site force-in.
  • the diagnosis support information output means includes a storage means for storing information on whether or not an inflammatory reaction is enhanced, transcription control factor information acquired by the information acquisition means, and information stored in the storage means.
  • the storage means further comprising: a predicting means for predicting power dysfunction that enhances the inflammatory response, and outputting diagnosis support information based on a prediction result of the predicting means. Further, it may be a means for storing information on whether or not the anti-inflammatory reaction is enhanced.
  • active transcriptional regulatory factor is a term used to distinguish it from a transcriptional regulatory factor that exists as a complex in the cytoplasm, and is related to the expression of cytoforce-in. A transcriptional regulator that leaves the complex and translocates into the nucleus in order to transcribe the gene.
  • diagnostic support method for an immune system abnormal disease of the present invention based on the active transcriptional regulatory factor that controls the transcriptional stage before the development of the site force-in that causes the manifestation of symptoms, It is possible to output diagnostic support information including information on the future progress of inflammation that can occur before the site force in is secreted.
  • the diagnosis support information output device of the present invention provides diagnosis support information on the state of inflammation that occurs several hours later based on a sample collected from a patient with an abnormal immune system disease whose symptoms change over time. Output, so that appropriate treatment can be given and precautions can be taken before serious symptoms appear.
  • Fig. 1 is an example of a DNA sequence showing a binding site of a transcriptional regulatory factor.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the relationship of transcriptional regulatory factors involved in site force in.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the measurement principle of surface plasmon resonance (SPR).
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the measurement principle of the quartz crystal microbalance method (QCM).
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the measurement principle of single molecule fluorescence correlation method (FCS).
  • FIG. 6 is a diagram for explaining an example of a change in the SIRS state force to the CARS state.
  • FIG. 7 is a block diagram showing a hardware configuration of a diagnosis support system for an immune system abnormal disease according to an embodiment of the diagnosis support information output apparatus of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a flowchart of an embodiment of a diagnosis support information output process.
  • FIG. 9 is a microscopic photograph (400 ⁇ ) showing the result of immunostaining when LiPopolysaccharide is applied to HeLa cells without force.
  • FIG. 10 is a photomicrograph (400 ⁇ ) showing the result of immunostaining when lipopolysaccharide was given to HeLa cells.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of gel shift assembly.
  • FIG. 12 shows the nucleotide probe sequence used in the examples.
  • FIG. 13 is a graph showing the measurement results of the presence or absence of HeLa cell binding to a probe.
  • FIG. 14 is a photograph showing the result of gel shift assay in which the presence or absence of binding to a probe examined in healthy human lymphocytes was examined.
  • FIG. 15 is a graph of SPR measurement results showing the relationship between the concentration of NF ⁇ B and the amount of NF ⁇ -probe complex.
  • FIG. 16 is a graph of FCS measurement results showing the relationship between the concentration of NF ⁇ B and the amount of NF ⁇ -probe complex.
  • FIG. 17 is a graph of QCM measurement results showing the relationship between the concentration of NF ⁇ B and the amount of NF ⁇ -probe complex.
  • FIG. 18 A SPR measurement result diagram showing the relationship between the concentration of SP-1 and the amount of SP-1 probe complex.
  • FIG. 19 A SPR measurement result graph showing the relationship between the concentration of AP-1 and the amount of AP-1 probe complex.
  • FIG. 20 is a photograph of the expression analysis results (electrophoresis) of IL6 and G-CSF mRNA.
  • FIG. 21 is a photograph showing the results of gel shift assay for NF ⁇ B.
  • the method for supporting diagnosis of an immune system abnormal disease of the present invention is a biological sample collected from a patient.
  • Abnormal diseases of the immune system targeted by the diagnosis support method of the present invention include systemic inflammation anti-J hearts such as sepsis; (Systemic Inflammatory Response Syndrome (S IRS)), anti-inflammatory 3 ⁇ 4E anti-J 3 ⁇ 4E group (Compensatory Anti-inflammatoy response syndrome (CARS)) and the like, and the diagnosis support method of the present invention is particularly suitable for diagnosis support of SIRS.
  • systemic inflammation anti-J hearts such as sepsis
  • S IRS Systemic Inflammatory Response Syndrome
  • CARS Cosmetic Anti-inflammatoy response syndrome
  • the biological sample is a sample containing cells collected from patient force, such as patient blood, urine, bronchioloalveolar lavage, saliva, sputum, cerebral bone marrow fluid, joint fluid, infiltrate, etc. .
  • the sample to be used for the measurement is preferably a nuclear extract of the cells from which these forces are also collected.
  • the active transcriptional regulatory factor to be measured is a transcriptional regulatory factor involved in the transcription of the site force-in to be expressed and is present in the nucleus. It should be noted that since transcriptional regulatory factors usually exist as complexes in the cytoplasm, it is difficult to measure the abundance of transcriptional regulatory factors using a measurement method based on interactions between biomolecules using antibodies or the like.
  • the active transcription factor is released from the complex force by a predetermined stimulus. Therefore, the active transcription factor is distinguished from the transcription factor that is not active, and it exists in a measurement method based on the interaction between biomolecules using antibodies. It is possible to measure the quantity.
  • the method for preparing the sample containing the nuclear extract is not particularly limited.
  • the cells are treated with a hypotonic solution to expand, and the cell membrane is broken using a homogenizer or syringe.
  • the nuclear pellet is isolated by centrifugation and treated with a hypertonic solution or a surfactant to extract the nuclear protein, and after centrifugation, the supernatant is recovered. This supernatant contains the protein extracted from the nucleus.
  • the active transcription factor to be measured is specific to the Enno-sense sequence that has the function of increasing the expression of the gene encoding target inflammatory site force-in or anti-inflammatory site force-in.
  • Transcriptional regulator is It has a DNA binding site (DBD) and a transcription activation site (TAD), and recognizes and binds to a unique sequence.
  • DBD DNA binding site
  • TAD transcription activation site
  • the transcriptional regulator force S bound to the enhancer promotes the transcription initiation complex on the promoter via the S mediator, which stabilizes it.
  • Inflammatory site force-in includes, for example, Tumor Necorosis Factor (TNFa), Interleukin 1, Interleukin 2, Interleukin 6, Interleukin 12, Interleukin 18, Platelet Activating Factor (PAF), G— CSF, GM—CSF, and interface.
  • TNFa Tumor Necorosis Factor
  • Interleukin 1 Interleukin 2
  • Interleukin 6 Interleukin 6
  • PAF Platelet Activating Factor
  • G— CSF CSF
  • GM—CSF GM—CSF
  • anti-inflammatory site force-in examples include interleukin 4, interleukin 10, interleukin 13, interleukin 1 receptor, soluble TNF receptor, and TGF jS force S.
  • site force-ins are controlled at the DNA specific position (DNA specific sequence) at the transcription stage!
  • An active transcription regulator binds to a transcriptional regulatory region that regulates the expression of site force-in, particularly an enzyme, RNA polymerase binds to the promoter, transcription is activated, and transcription begins. The generated mRNA is translated to express the encoded site force-in.
  • each transcriptional regulatory factor has a fixed DNA sequence. For example, it specifically binds to the sequence shown in Fig. 1. In the figure, a portion surrounded by a square is a coupling region.
  • Transcriptional regulators that regulate transcription of site force in vary depending on the type of site force in expressed. Transcriptional regulators usually regulate the expression of one type of site force in cooperation with two or more types of transcriptional regulators. For example, as shown in FIG. 2, transcription factors such as AP-1, CZEBP, and NF KB are involved in interleukin 8 (IL8). In Interguchikin 6 (IL6), AP-1, CREB, C / EBP, and NF KB are involved. In NF2 (IL2), NFAT and AP-1 are involved, and in TNFa, NFKB, ERG1, CRE, AP-1, SP1, and AP-2 are involved.
  • IL8 interleukin 8
  • IL6 Interguchikin 6
  • AP-1, CREB, C / EBP, and NF KB are involved in NF2 (IL2)
  • NFAT and AP-1 are involved, and in TNFa, NFKB, ERG1, CRE, AP-1, SP1, and
  • TNF ⁇ there are multiple binding sites for NF ⁇ B in the transcriptional regulatory region, and the amount of NF ⁇ B translocated into the nucleus is larger than the site force in (eg IL8, IL6) when there is only one binding site. Conceivable.
  • AP-1 and C / EBP are involved in interleukin 4.
  • CRE 1, CRE3, CRE 4 are involved in interleukin 10.
  • TATA, C / EBP1, C / EBP3, C / EBP5 are involved.
  • the active transcription factor to be measured can predict the expression level of inflammatory site force-in or anti-inflammatory site force-in, transcription control common to inflammatory site force-in is sufficient. Only one transcription factor that is not involved in the expression of anti-inflammatory site force in may be measured (when predicting the expression of inflammatory site force in) or common to anti-inflammatory site force in Involved in the expression of inflammatory site force-in with an active transcription factor, only one type of transcription factor may be measured (when predicting the expression of anti-inflammatory site force-in) Alternatively, it may be selected so that the expression of individual site force-in can be predicted from the abundance ratio by measuring the amount of a plurality of types of active transcription factors.
  • the site force in particular related to SIRS is IL8, IL6 and TNFa, and the transcriptional control factor common to these is NF ⁇ B.
  • IL8 the site force in particular related to SIRS
  • IL6 the transcriptional control factor common to these
  • NF ⁇ B the transcriptional control factor common to these
  • the measurement of the active transcription control factor is preferably performed by a method in which the measurement time until the measurement start force measurement result is obtained is within one hour, more preferably within 30 minutes.
  • transcription initiation force is expressed in several hours after the start of transcription force. It is also a force that has been developed, and treatment may be late or wrong.
  • Measurement methods with a measurement time of 30 minutes or less include a method for detecting nucleotide hybridization using a nucleotide probe having a specific sequence to which a transcriptional regulatory factor binds, and a method for measuring an interaction between biomolecules. Is preferred. Specific examples include surface plasmon resonance (SPR), quartz crystal microbalance (QCM), single-molecule fluorescence correlation (FCS), and dual polarization interferonmeter-SPR (two-plane polarization interference SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • QCM quartz crystal microbalance
  • FCS single-molecule fluorescence correlation
  • FCS dual polarization interferonmeter-SPR (two-plane polarization interference SPR).
  • SPR surface plasmon resonance method
  • a metal film thin gold or silver layer laid on the prism surface at a specific angle causes electrons on the metal surface to This is a method that uses the surface plasmon resonance phenomenon caused by the reflected light coming out of the stimulus.
  • the surface plasmon resonance and the resonance angle depend on the reflection index, so The presence or absence of chidono and hybrids, that is, the amount of transcriptional regulatory factor bound to the DNA probe can be measured.
  • QCM quartz crystal microbalance method
  • FCS single-molecule fluorescence correlation method
  • a mixture of a measurement sample and a fluorescently labeled nucleotide probe to pass through a confocal region.
  • This method utilizes the difference in confocal region transit time due to the difference in size to separate and detect the transcription factor probe complex and the unreacted fluorescent molecule (probe alone) with the number of pulses emitted by one molecule.
  • the nucleotide probe used in each of the above methods may be an oligonucleotide probe having a base sequence that specifically binds to a transcription control factor to be detected, and the entire sequence is a wild type that exists in nature. It may be synthesized artificially. Further, only one type of nucleotide probe may be used, or the number of nucleotide probes corresponding to a plurality of transcription control factors involved in the site force-in to be predicted may be provided. Preferably, nucleotide probes corresponding to all transcription control factors are provided! /. This is because by detecting and quantifying multiple transcriptional regulators at once, it is possible to predict the site force-in expression.
  • the biomolecular interaction measurement method has a detection sensitivity of ⁇ , and a sample can be quantified in about 10 minutes. Therefore, the patient force can also be collected from the cells and the measurement sample is prepared, and the measurement start can be done within one hour until the measurement result is obtained. You can know the site power in. This predicts whether the symptoms that occur after several hours are anti-inflammatory, inflammatory, and what kind of symptom appears when any site force in appears. It is convenient for In this respect, since ELISA and gel shift assembly take 3 to 6 hours, it is highly possible that the predicted site force-in is likely to be different from the predicted site force-in when the prediction result is obtained. However, there is a problem that it cannot be treated properly. By adopting, it becomes possible to select appropriate treatment and prescription based on prediction.
  • diagnosis support information is output.
  • diagnosis support information is information on the progress of the future inflammation, and information on whether or not the inflammatory response is enhanced and information on whether or not the anti-inflammatory response is enhanced are selected. It may also contain information, and it also has information about whether or not the amount of expression of inflammatory site force-in increases and information about whether or not the amount of expression of anti-inflammatory site force-in increases.
  • the force may also include selected site force in-expression information.
  • Measurement force In particular, by using a measurement method in which the time until measurement results are obtained is 30 minutes or less, it is possible to know the site force in developed several hours after taking a patient force sample. Therefore, it is possible to predict whether the symptom that occurs after several hours is an increase in the anti-inflammatory response or an increase in the inflammatory response.
  • the diagnosis support information further includes information on a treatment method to be selected, information indicating the suitability of the treatment method (information indicating the suitability of administration of an anti-inflammatory agent, information indicating the suitability of plasma exchange, and granulocyte colony) Information indicating the suitability of administration of the stimulating factor) may be included. Promptness By adopting a certain measurement method, the symptoms that occur after several hours are anti-inflammatory, inflammatory, and what kind of site force-in appears and what symptoms appear Therefore, it is possible to output the selection of appropriate treatment and prescription based on the prediction as diagnostic support information.
  • the diagnostic support information output device for an immune system abnormal disease of the present invention is included in a biological sample collected from a patient force, and is specific to a site force in selected from the group consisting of inflammatory site force in and anti-inflammatory site force inca.
  • Diagnostic support information output means for outputting support information is provided.
  • the transcription factor information may be an abundance of an active transcription factor to be measured, or may be converted into a digital signal obtained by a measuring device that measures the abundance, for example, an abundance. It may be a digital signal corresponding to optical intensity such as fluorescence intensity and reflectance before radiation, radiation intensity, or vibration frequency.
  • the information on the progress of inflammation may be information on whether or not an inflammatory reaction is enhanced and information on whether or not an anti-inflammatory reaction is enhanced.
  • information on whether or not the increase in the expression level of inflammatory site force-in and information on whether or not the increase in the expression level of anti-inflammatory site force-in is a group force. Selected site force-in expression information Even if it contains.
  • diagnosis support information further includes information on the method of treatment in addition to information on the progress of the future inflammation.
  • the treatment methods include administration of anti-inflammatory agents, plasma exchange, and granulocytes. It is preferably selected from the group consisting of colony-stimulating factors.
  • the diagnosis support information output means is a storage means for storing information on transcription control factors specific to inflammatory site force-in; and transcription control factor information acquired by the information acquisition means and stored in the storage means Does the expression level of inflammatory site force-in increase based on information? It is preferable to include a predicting means for predicting whether or not to output diagnosis support information based on the prediction result of the predicting means.
  • the storage means is preferably means for storing information on a transcription control factor specific for anti-inflammatory site force-in.
  • the diagnosis support information output means includes a storage means for storing whether or not the inflammatory response is enhanced; and transcription control factor information acquired by the information acquisition means and information stored in the storage means.
  • a predicting means for predicting whether or not the expression level of the inflammatory site force in is increased based on the information, and outputting the diagnosis support information based on the prediction result of the predicting means.
  • the storage means may be a storage means for storing information as to whether or not the anti-inflammatory reaction is further enhanced.
  • diagnosis support information output device of the present invention will be described based on the hardware configuration example of FIG.
  • the system 100 including the diagnosis support output device is configured by a computer 100a mainly configured by a main body 110, a display 120, and an input device 130.
  • the main body 110 is mainly composed of a CPU lOa, a ROMl lOb, a RAMI 10c, a hard disk 110d, a reading device 110e, an input / output interface 110f, a communication interface 110g, and an image output interface 110h.
  • the CPU lOa, the ROM lOb, the RAM 110c, the hard disk 110d, the reading device 110e, the input / output interface 110f, and the image output interface 110h are connected by a bus 110i so that data communication is possible.
  • the input / output interface 110f corresponds to the information acquisition unit
  • the main body 110 corresponds to the diagnosis support information output unit.
  • the storage means specifically corresponds to ROMlOb, RAMI 10c, and hard disk 110d
  • the prediction means corresponds to CPUlOa.
  • the input / output interface 110f includes, for example, a serial interface such as USB, IEEE1394, RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, IEEE1284, and an analog interface that has DZA modification and AZD modification. ing.
  • An input device 130 including a keyboard and a mouse is connected to the input / output interface 110f. When the user uses the input device 130, the input device 130 is connected to the computer 100a. Data can be entered.
  • the transcription control factor information including the measurement data may be input by the user via the input device 130, and the output unit of the measurement apparatus that measures the abundance of the active transcription control factor and the input / output interface 130 Connect the so that the digital signal obtained by measurement can be directly input as transcription control factor information.
  • the CPUlOa serving as the predicting unit can execute the computer program stored in the ROM 110b serving as the storage unit and the computer program loaded in the RAMlOc. Then, the CPU 100a functions as the diagnosis support system 100 when the CPU 110a executes an application program 140a described later. Specifically, it is predicted whether the site force-in expressed based on the information of the active transcriptional regulatory factor input from the information acquisition means is an inflammatory site force-in or an anti-inflammatory site force-in, Based on the prediction result, diagnosis support information is output.
  • the information stored in the memory means is information on a transcriptional control factor that causes an increase in the inflammatory response or anti-inflammatory response, whether the inflammatory response is increased or not, the anti-inflammatory response is increased Whether or not, and based on the prediction result, outputs diagnostic support information.
  • the storage means is based on the transcription control factor information acquired by the information acquisition means! Information necessary for outputting diagnosis support information, specifically, inflammatory site force-in or anti-inflammatory properties Information on the relationship between the site force-in and the transcriptional regulatory factor, or information on the relationship between the site force-in and the transcriptional regulatory factor that causes an increase in the inflammatory or anti-inflammatory response is stored. Further, the information regarding the treatment method may be stored in at least one of the ROM 110b, the RAM 110c, and the hard disk lOd. Information on the relationship between site force-in and transcriptional regulatory factors includes, for example, information on the type of site force-in expressed in response to transcriptional regulatory factors, and expression of site force-in corresponding to the amount of transcriptional regulatory factors present. Information on amount, expression of transcriptional regulatory factors Time to expression of site force in, etc. are included.
  • the ROM 110b is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, and the like.
  • a computer program executed on the CPUlOa And the data used for this Are recorded.
  • the RAMI 10c is configured by SRAM, DRAM, or the like.
  • the RAMI 10c is used for reading computer programs recorded in the ROM 110b and the hard disk 110d. Further, when these computer programs are executed, they are used as a work area of the CPU 110a.
  • the transcription control factor information input from the input / output interface 110f may be temporarily stored.
  • the hard disk 110d includes an operating system that provides a graphical user interface environment such as an operating system (for example, Windows (registered trademark) manufactured and sold by Microsoft Corporation) in addition to information on the relationship between site force-in and transcription control factors. And various computer programs to be executed by the CPU 110a, such as application programs.
  • the application program 14 Oa described later is also installed on the hard disk 110d! /.
  • the reading device 110e is constituted by a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DV D-ROM drive, or the like, and can read a computer program or data recorded on the portable recording medium 140.
  • the portable recording medium 140 stores an abrasion program 140a for causing the computer to function as the diagnosis support system according to the present invention, and the computer 100a relates to the present invention from the portable recording medium 140. It is possible to read the application program 140a and install the application program 140a on the node disk 110d.
  • the application program 140a is not only provided by the portable recording medium 140, but also from an external device that is communicably connected to the computer 100a via an electric communication line (whether wired or wireless). It can also be provided through the telecommunications line.
  • the application program 140a is stored in the hard disk of a server computer on the Internet.
  • the computer 100a accesses the server computer, downloads the computer program, and installs it on the hard disk 110d. Is also possible.
  • the image output interface 110h is a display 12 composed of an LCD, a CRT, or the like.
  • the video signal corresponding to the image data given from the CPU 110a is output to the display 120.
  • the display 120 displays an image (screen) according to the input video signal.
  • FIG. 8 showing a flowchart of the SIRS diagnosis support information output process.
  • the computer 100a obtains measurement data of active transcription control factors obtained by measuring patient blood (Sl). This measurement data is acquired by inputting the measurement data of the active transcription control factor measured by the measurement device with the input device 130. The sample collection time, the time required for measuring the transcription control factor, and the like are also input by the input device 130. In addition, by connecting the computer 100a and the measuring device via a network such as a LAN, the measurement data of the measuring device force-activated transcription control factor connected to the LAN can be acquired via the input / output interface 110f of the computer 100a. It is possible.
  • the CPU 110a predicts the site force-in that will appear based on the acquired measurement data (S2). Prediction of the expression of site force in is performed based on the measured expression level of active NF ⁇ B.
  • NF ⁇ B is a transcriptional regulator specific for inflammatory site force-in (IL8, IL6, TNF a) related to SIRS. Therefore, when NF ⁇ B is expressed in a predetermined amount or more, it is possible to predict that inflammatory site force-in of any of IL8, IL6 and TNFa will be expressed after several hours.
  • the diagnosis support information corresponding to the prediction of the site force in which it appears is selected and displayed on the display 120 (S3).
  • This diagnosis support information includes prediction results as to whether or not the expression level of inflammatory site force-in increases from the time of sample collection, information on the suitability of the treatment method (administration of anti-inflammatory agent), and the like.
  • the site force-in expression that is expressed is predicted based on the measurement data of NF ⁇ B.
  • the type of transcriptional regulatory factor to be measured is increased, and The type may be predicted.
  • APl: C / EBP: NFkB: CREB 1: 1: 1: 1: 1.
  • the error in the amount of each transcription factor is about 0.5.
  • the HeLa cell culture was centrifuged at 4 ° C and 2000 rpm for 10 minutes, and the collected HeLa cells were washed with 5-: LOml of ice-cold phosphate buffered saline (PBS). (Centrifugation at 4 ° C, 2000 rpm for 10 minutes), buffer A (final concentration: 10 mM HEPES (pH 7.9), 1.5 mM MgCl, lOmM KC1, 0.5 mM DDT) is added to 5-LOLO and suspended. 10 Minute
  • swelling of the cell was able to be confirmed by observing with a stereomicroscope. Thereafter, the cells were collected by centrifugation at 4 ° C. and 2000 rpm for 10 minutes, and again suspended in 1 to 5 ml of buffer 1A.
  • the cell pulverized product was collected by centrifugation at 15000Xg for 20 minutes at 4 ° C. Buffer C (final concentration: 20mM HEPES (pH7.9), 25vZv% glycerol, 0.42M NaCl, 1.5mM MgCl
  • HeLa cultured cells were allowed to react with fluorescently labeled anti-NF ⁇ antibody, and then allowed to stand for 120 minutes, and observed with a fluorescence microscope.
  • a photomicrograph (400x magnification) is shown in Fig. 9. When the periphery of the cell nucleus is stained with fluorescent light and is not stimulated, it is encouraging that NF ⁇ is present in the cytoplasm.
  • Fig. 10 A photomicrograph (400x magnification) is shown in Fig. 10. The inside of the nucleus is stained with fluorescence, and it can be seen that the administration of lipopolysaccharide translocated NF ⁇ B into the nucleus.
  • HeLa cell nuclear extract prepared by the above method (control), Lipopolysaccharide 2.5 mgZml immediately after HeLa cell nuclear extract, Lipopolysaccharide 60 minutes, 120 minutes after nuclear extract, NF ⁇ Gel shift assay was performed using a synthetic oligonucleotide having a B-binding sequence as a probe. The results are shown in FIG.
  • a nuclear extract was prepared according to the above-described method of preparing a nuclear extract sample.
  • the nuclear extract (0.2 nmol, 1. Onmol) was applied to an SPR device using a metal film implanted with a WT probe and a metal film implanted with a mutation probe, and measurement was performed. As a control, the probe was implanted and the measurement was performed using the nuclear extract on an SPR device using a metal film. The results are shown in FIG.
  • the vertical axis represents the Resonance Unit (RU) related to the complex of transcription factor and probe.
  • RU Resonance Unit
  • Lipopolysaccharide was administered to human lymphocytes of healthy individuals, and a nuclear extract was prepared by the above-described method for preparing a nuclear extract sample.
  • Fig. 14 1 is when a nuclear extract is used with a synthetic oligonucleotide probe having an NF ⁇ B binding sequence
  • 2 is when a nuclear extract is provided with a mutant probe
  • 3 is The case where the nuclear extract was provided using the WT probe is shown.
  • the complex of probe and NF ⁇ B appeared strongly in case 3. Therefore, it is apparent that the WT probe is useful as a detection probe for NF ⁇ B even in healthy individuals who are not limited to HeLa cells.
  • Sample solution for measurement containing 40 ng, 80 ng, 120 ng, 160 ng, 200 ⁇ g of NF kappa in 20 1 aqueous solution containing lOmM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and O.005% Tween20 Prepared.
  • the measurement initiation force of NF ⁇ B is within 15 minutes until the measurement result is obtained, and it is possible to know by the time when the cellular force-in expressed after several hours is actually secreted by cellular force It is.
  • This sample solution was subjected to NF ⁇ using an SPR device (BIACORE-J, manufactured by Biacore) using a metal film in which a WT probe (5, 1 TGTATCCCCACCCCCTTAAGAA) and a mutation probe (5, -TGTATCCCCAAACCCTTAAGAA) were respectively implanted.
  • the measurement was performed in the same manner as in. The results are shown in FIG.
  • Sample solution for measurement containing 60 ng, 150 ng, 300 ng, 600 ng of AP-1 in 110 / zl of an aqueous solution containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% Tween20 Prepared.
  • RA rheumatism
  • DM EM Dulbecco's modified MEM
  • FCS urine fetal serum
  • the RA patient-derived fibroblasts (2 ⁇ 10 5 cell / well) in (1) were cultured under low serum (0.5% FCS) conditions for 48 hours before stimulation.
  • Thrombin (lOunitZml) was added to this cultured cell solution, and the culture supernatant was collected immediately after addition of thrombin (Otime), 4 hours, 8 hours, 12 hours, and 24 hours later, and secreted by thrombin stimulation.
  • the amount of site force in (G—CSF, IL2, IL6) was measured.
  • the cyto force in (G—CSF, IL2, IL6) in the culture was measured using the respective ELISA kit (Biosource, Camarillo, Calif.). Table 1 shows the measurement results.
  • IL6 is secreted by the thrombin stimulation from cultured fibroblasts in RA patients jointly, and IL-6 has a significant increase in secretion 8 hours after stimulation.
  • G-CSF Secretion increased significantly after 12 hours of stimulation.
  • IL2 which is known as the same inflammatory site force-in group, did not show a significant increase in secretion due to thrombin stimulation.
  • RA patient-derived fibroblasts (2 ⁇ 10 5 cell / well) were cultured under low serum (0.5% FCS) conditions for 48 hours before stimulation.
  • thrombin (lOunitZml) to this culture and immediately add thrombin!] 0.5 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 12 hours, Cells were collected every 24 hours and RNA was extracted.
  • a reverse transcriptase is added to the obtained RNA sample to synthesize cDNA.
  • the PCR product is subjected to agarose gel electrophoresis to obtain the target. mRNA was detected and measured.
  • Figure 20 shows the measurement results.
  • 8actin is a control rule.
  • the primers used in the RT-PCR method are as follows.
  • IL6-1 5 '-GCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTGTC
  • IL6-2 5 '-CCTCTTTGCTGCTTTCACACATG
  • G CSF-1 5 '-AC AGTGC ACTCTGG AC AGT
  • G CSF-2 5 '-TCC AGCTGC AGTGTGTCC A
  • IL6 mRNA expression was confirmed 4 hours after stimulation in IL6, and G-CSF mRNA expression was confirmed in G-CSF 4-8 hours after stimulation. .
  • the RA patient-derived fibroblasts (2 ⁇ 10 5 cell / well) in (1) were cultured under low serum (0.5% FCS) conditions for 48 hours before stimulation. Immediately after thrombin (lOunitZml) was added to this culture solution, the culture fluid cells were collected. The collected cells were washed with PBS, centrifuged, and hypotonic solution (10 mM HEPES / KOH (pH 7.8), 10 mM KC1, 0. ImM EDTA, ImM
  • IL6 and G-CSF are active NF ⁇ levels on DNA. It is thought that expression is controlled by the increase in the number of On the other hand, for IL2, which is a site force-in that does not have an NF ⁇ binding sequence on DNA, even if the abundance of active NF ⁇ is increased by thrombin stimulation, an increase in mRNA expression and secretion is observed. I could't.
  • diagnosis support method of the present invention information based on the prediction result of the site force-in that appears after several hours can be obtained. It is possible to predict and treat symptoms that occur several hours later for diseases whose symptoms change with time, such as sepsis and SIRS.
  • diagnosis support information output device of the present invention in the medical field, it is appropriate to appropriately treat the symptoms that occur after several hours for abnormal immune system diseases that have been difficult to grasp the cause of accurate symptoms. This makes it possible to select an appropriate treatment method, which in turn improves the survival rate and shortens the ICU stay time.

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Abstract

【課題】　ＳＩＲＳ等の急激に症状が変化し得る免疫システム異常疾患を適切に治療すべく、診断のための試料採取から、治療方法の決定、処置に至るまでの時間差を加味した上で、適切な治療方法を示唆できる免疫システム異常疾患の診断支援方法及び診断支援情報出力装置を提供する。生物学的試料における炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインに特異的な活性型転写制御因子を測定することにより、将来の炎症の進行状態に関する診断支援情報を出力する。

Description

明 細 書
免疫システム異常疾患の診断支援方法及び診断支援情報出力装置 技術分野
[0001] 本発明は、敗血症などの全身性炎症反応症候群（Systemic Inflammatory Re sponse Syndrome (SIRS) )、抗炎症反応症 群 (Compensatory Anti— infla mmatoy response syndrome (CARS) )等の免疫システム異常疾患の診断支援 方法及び診断支援情報出力装置に関し、原因となるサイト力インの発現を転写段階 で予測することにより数時間後に現れるであろう症状に関する診断支援情報を出力 する診断支援方法及び診断支援情報出力装置に関する。
背景技術
[0002] 主に感染症が進展して全身所見を呈した状態をいう敗血症は、初期には高熱、過 呼吸がみられ、皮膚は温かぐ血圧はやや低下し、頻脈を呈する高心拍出量状態で 、心拍出量は増加し、末梢血管抵抗は低下している。この時期に適切な治療が行な われないと、呼吸障害ゃ腎、肝、血液などの障害が進行してくる。治療は、感染源の 除去、抗生物質の投与、肺腎、肝の管理、 DICのコントロールなど多岐にわたるが、 適切な治療が行なわれないと、種々の臓器障害 (多臓器不全)が進展し、死亡するこ とになる。集中治療管理が進歩したにもかかわらず、このような重症敗血症患者の死 亡率は 30〜50%と高い。
[0003] 敗血症を含む全身性炎症反応症候群 (SIRS)では、病態重篤性の診断や病態変 化に応じた適切な検査、治療が確立されていないことから、救命率の低さや集中治 療室占拠率の高さ（70%)の原因となって 、ることが報告されて 、る。
[0004] SIRSは、 1992年に Bernardらによって提唱され、病態を反映する 4項目、体温、 心拍数、呼吸数、末梢血白血球数のうち、 2項目以上に異常のある状態とされる。 SI RSは、侵襲の種類 (手術、重傷外傷、熱傷、感染等）にかかわらず、種々の内因性メ ディエータにより惹起される非特異的全身炎症性反応であり、敗血症（sepsis)の他、 非感染性、非特異的全身性炎症反応と!/ヽぅ病態も有する。
[0005] このような SIRSの治療は、現在のところ、症状力 判断して経験に基づく治療、処 置が行なわれている。具体的にはステロイドの大量投与、抗炎症剤の大量投与とい つた治療がなされる。し力しながら、高熱、過呼吸といった SIRSの症状は、炎症性サ イト力インによる炎症性反応が亢進されて 、る状態 (免疫過剰亢進状態)だけからで はなぐ抗炎症性サイト力インによる抗炎症性反応亢進状態 (免疫抑制状態)でも似 た症状を示すことから、症状把握を間違うと、全く逆の治療をしてしまうことになる。例 えば、ステロイドの長期使用や免疫抑制剤使用により免疫能が低下した状態では、 臓器障害が進展し、死亡に至ることもある。
[0006] 1996年に Boneらによって行なわれた敗血症患者に対する炎症性サイト力イン抑 制療法の臨床試験がすべて失敗に終わった理由は、生体内では、炎症反応ー抗炎 症反応の両者力 Sバランスをとつたため、免疫抑制の長期処方が危険ではないかと提 唱している。
[0007] 免疫システム異常による疾患の多くは、血液中の好中球、リンパ球、マクロファージ といった担当細胞から分泌される生理活性物質、サイト力インによって、その病態が 複雑に変化し、また病態が急激に変化することが知られている。このため、適切な薬 物選択や投薬タイミング等の治療スケジュールが非常に複雑かつ困難である。急激 な病態変化に対応するため、集中治療室で監視したりしているが、これが集中治療 室の占拠率の高い原因となっているばかりか、それでも治療が手遅れになることがあ る。
[0008] このようなことから、特許文献 1では、全身性炎症状態の危険にある患者の同定及 び監視方法として、患者カゝら選択された生理的パラメータを測定し、患者の全身性仲 介因子一関連反応試験プロフィルを得て、対照プロフィルと比較する方法を提案して いる。ここで生理的パラメータとしては、物理的検査、生命に関する徴候、血液動力 学的測定値、臨床検査室試験、急性炎症反応仲介因子濃度、血小板と顆粒球との 凝集測定及び内毒素レベルが挙げられている。具体的には、ロイコトリェン、プロスタ グランジン、サイト力イン、血小板活性ィ匕因子、好中球エラスターゼを ELISAで測定 したり、補体成分 C3 aをラジオィムノアツセィで測定したり、血漿内毒素レベルを測 定したり、顆粒球凝集の測定などが挙げられている。
[0009] し力しながら、いずれの生理的パラメータも、患者力も採取した血液などの試料に 含まれる蛋白質や増殖因子を測定したものであり、測定対象となる蛋白質は細胞か らの分泌物で、採取時点の細胞の状態を表していたとしても、その後、採取時点にお ける状態が維持されているとは限らない。つまり、免疫システム疾患の治療方法の確 立が困難な原因として、病態の急激な変化、すなわち症状の原因となるサイト力イン が時々刻々と変化していくことがある。このため、例えば、採取した試料中のサイト力 インの発現を測定し、サイト力インの有意な発現が認められた場合であっても、試料 を採取して力 測定結果が得られるまでの間にサイト力インの発現の状態が変化する ことから、測定されたサイト力インを抑制する治療が必ずしも適切とは限らな 、。
[0010] 特許文献 1 :特表平 10— 500210
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、急激に症 状が変化し得る免疫システム異常疾患の治療に際して、適切な診断支援情報を示 唆することができる免疫システム異常疾患の診断支援方法を提供することにある。ま た、本発明の他の目的は、適切な診断支援情報を出力することができる診断支援情 報出力装置を提供することである。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的 試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力インカ なる群より選択され るサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程;及び 測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に 関する情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。
[0013] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報、お よび抗炎症性反応が亢進する力否かの情報力 なる群力 選択される情報を含むも のであってもよ!/、し、ある 、は炎症性サイト力インの発現量が増加するか否かの情報 、および抗炎症性サイト力インの発現量が増加するか否かの情報力 なる群力 選択 されるサイト力イン発現情報を含むものであってもよ 、。
[0014] 前記診断支援情報は、さらに、治療方法の情報を含んでもょ 、。前記治療方法は、 抗炎症剤の投与、血漿交換および顆粒球コロニー刺激因子の投与力 なる群より選 択されることが好ましい。
[0015] 前記生物学的試料は、患者力 採取した細胞の核抽出物であることが好ましい。
[0016] 前記測定工程は、測定開始力 測定結果が得られるまでの時間が 1時間以内、好 ましくは 30分以下である測定方法により実施されることが好ましぐ表面プラズモン共 鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び 1分子蛍光相関法力もなる群より選択さ れる 1種により実施されることが好ましい。
[0017] 前記測定工程は、 2種以上の活性型転写制御因子を測定してもよい。
[0018] 前記免疫システム異常疾患としては、全身性炎症反応症候群（SIRS)が好適であ る。
[0019] 本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者力 採取した 生物学的試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力インカ なる群より 選択されるサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定して得られ た転写制御因子情報を取得する情報取得手段;及び
取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を 含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段を備えている。
[0020] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報およ び抗炎症性反応が亢進するカゝ否かの情報カゝらなる群カゝら選択される情報を含むもの であってもよ 、し、あるいは炎症性サイト力インの発現量が増加する力否かの情報お よび抗炎症性サイト力インの発現量が増加するか否かの情報力 なる群力 選択さ れるサイト力イン発現情報を含むものであってもよ 、。
[0021] 前記診断支援情報は、治療方法の情報を含むことが好ましぐ前記治療方法は、 抗炎症剤の投与、血漿交換および顆粒球コロニー刺激因子の投与力 なる群より選 択されることが好ましい。
[0022] 診断支援情報出力手段が、炎症性サイト力インに特異的な転写制御因子の情報を 記憶する記憶手段と、情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶 手段に記憶された情報に基づ 、て、炎症性サイト力インの発現量が増加するか否か を予測する予測手段とを備え、予測手段の予測結果に基づ!、て診断支援情報を出 力することが好ましい。前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイト力インに特異的な転 写制御因子の情報を記憶する手段であってもよい。
[0023] あるいは診断支援情報出力手段が、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶 する記憶手段と、情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段 に記憶された情報に基づ 、て、炎症性反応が亢進する力否力を予測する予測手段 とを備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力するものであっても よぐ前記記憶手段は、さらに、抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する 手段であってもよい。
[0024] 本明細書にいう「活性型転写制御因子」とは、細胞質内に複合体として存在してい る状態の転写制御因子とは区別して用いられ用語で、サイト力インの発現にあたり関 係する遺伝子を転写するために複合体から離脱して核内に移行した転写制御因子 をいう。
発明の効果
[0025] 本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法によれば、症状が現れる原因とな るサイト力インが発現する前の転写段階を制御している活性型転写制御因子に基づ いて、サイト力インが分泌されるまでに起こりえる将来の炎症の進行状態に関する情 報を含む診断支援情報を出力することが可能である。
本発明の診断支援情報出力装置は、症状が経時的に変化していくような免疫シス テムの異常疾患の患者力 採取した試料に基づいて、数時間後におこる炎症の状 態に関する診断支援情報を出力するので、好適な治療を施すことができ、また重篤 な症状が現れる前に予防措置を採ることができる。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]転写制御因子の結合部位を示す DNA配列の例である。
[図 2]サイト力インに関与する転写制御因子の関係を示す模式図である。
[図 3]表面プラズモン共鳴法 (SPR)の測定原理を説明するための図である。
[図 4]水晶振動子マイクロバランス法 (QCM)の測定原理を説明するための図である
[図 5]1分子蛍光相関法 (FCS)の測定原理を説明するための図である。 [図 6]SIRS状態力も CARS状態への変化例を説明するための図である。
[図 7]本発明の診断支援情報出力装置の実施形態に係る免疫システム異常疾患の 診断支援システムのハードウェアの構成を示すブロック図である。
[図 8]診断支援情報出力処理の一実施形態のフローチャートを示す図である。
[図 9]HeLa細胞にリポポリサッカライドを与えな力つたときの免疫染色結果を示す顕 微鏡写真 (400倍)である。
[図 10]HeLa細胞にリポポリサッカライドを与えたときの免疫染色結果を示す顕微鏡 写真 (400倍)である。
[図 11]ゲルシフトアツセィの結果を示す写真である。
[図 12]実施例で使用したヌクレオチドプローブの配列である。
[図 13]HeLa細胞のプローブへの結合の有無の測定結果を示すグラフである。
[図 14]健常人リンパ球で調べたプローブへの結合の有無を調べたゲルシフトアツセィ の結果を示す写真である。
[図 15]NF κ Bの濃度と NF κ Β—プローブ複合体量の関係を示す SPR測定結果の グラフである。
[図 16]NF κ Bの濃度と NF κ Β—プローブ複合体量の関係を示す FCS測定結果の グラフである。
[図 17]NF κ Bの濃度と NF κ Β—プローブ複合体量の関係を示す QCM測定結果の グラフである。
[図 18]SP— 1の濃度と SP— 1プローブ複合体量の関係を示す SPR測定結果のダラ フである。
[図 19]AP— 1の濃度と AP— 1プローブ複合体量の関係を示す SPR測定結果のダラ フである。
[図 20]IL6及び G— CSFの mRNAの発現解析結果（電気泳動）の写真である。
[図 21]NF κ Bのゲルシフトアツセィの結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
〔免疫システム異常疾患の診断支援方法〕
本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的 試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力インカ なる群より選択され るサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程;及び測定 された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する 情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。
[0028] 本発明の診断支援方法が対象とする免疫システム異常疾患としては、敗血症など の全身性炎症反 J心; (正候群 (Systemic Inflammatory Response Syndrome (S IRS) )、抗炎 ¾E反 J ¾E候群 (Compensatory Anti― inf lammatoy response s yndrome (CARS) )等が挙げられ、本発明の診断支援方法は、特に SIRSの診断支 援に適している。
[0029] 前記生物学的試料は、患者力 採取された細胞を含む試料で、患者の血液、尿、 細気管支肺胞洗浄、唾液、痰、脳骨髄液、関節液、浸潤液などが挙げられる。測定 に供される試料としては、これら力も採取した細胞の核抽出物であることが好ま 、。 測定対象である活性型転写制御因子は、これから発現しょうとするサイト力インの転 写に関与する転写制御因子で、核内に存在しているからである。尚、転写制御因子 は、通常、細胞質内で複合体として存在するため、抗体等を用いた生体分子間相互 作用に基づく測定方法で、転写制御因子の存在量を測定することは困難であるが、 活性型転写制御因子は、所定の刺激によって複合体力 離脱しているので、活性型 でな 、転写制御因子と区別して、抗体等を用いた生体分子間相互作用に基づく測 定方法でその存在量を測定することが可能である。
[0030] 患者力 採取した試料力 核内抽出物を含む試料の調製方法は特に限定しない 力 例えば、細胞を低張液で処理して膨張させ、ホモジナイザー又はシリンジを用い て、細胞膜を破壊し、遠心により核ペレットを単離し、これを高張液又は界面活性剤 で処理することにより、核蛋白質を抽出し、遠心した後、上清を回収するといつた方法 が挙げられる。この上清には、核から抽出されたタンパク質が含有されている。
[0031] 測定される活性型転写制御因子は、ターゲットとする炎症性サイト力イン又は抗炎 症性サイト力インをコードする遺伝子の発現を上昇させる働きをもつェンノ、ンサ一配 列に特異的に結合して転写活性を調節する因子で、ターゲットとする炎症性サイト力 イン又は抗炎症性サイト力インの種類に応じて、適宜選択される。転写制御因子は、 DNA結合部位 (DBD)と転写活性化部位 (TAD)を有し、特有の配列を認識して結 合する。ェンハンサ一に結合した転写制御因子力 Sメデイエータを介してプロモータ上 の転写開始複合体を促進、ある 、はその安定ィ匕を行なって 、る。
[0032] 炎症性サイト力インとしては、例えば Tumor Necorosis因子（TNF a )、インター ロイキン 1、インターロイキン 2、インターロイキン 6、インターロイキン 12、インターロイ キン 18、 Platelet Activating因子（PAF)、 G— CSF、 GM— CSF、インターフエ口 ン が挙げられる。
[0033] 抗炎症性サイト力インとしては、例えば、インターロイキン 4、インターロイキン 10,ィ ンターロイキン 13、インターロイキン 1レセプター、可溶性 TNFレセプター、 TGF jS力 S 挙げられる。
[0034] これらのサイト力インの発現は、転写段階にお!、て、それぞれ DNA特定位置（DN A特定配列)で制御されている。サイト力インの発現を調節する転写調節領域、特に ェンノヽンサ一に活性型転写制御因子が結合し、プロモータに RNAポリメラーゼが結 合して、転写が活性化されて、転写が開始する。そして、生成された mRNAが翻訳さ れて、コードされていたサイト力インを発現する。
[0035] サイト力イン発現に関与する転写制御因子は 20種類程度であり、それぞれの転写 制御因子は、結合する DNA配列が決まっている。例えば、図 1に示すような配列に 特異的に結合する。図中、四角で囲んだ部分が結合領域である。
[0036] サイト力インの転写を調節する転写制御因子は、発現するサイト力インの種類により 異なる。また転写制御因子は、通常、 2種類以上の転写制御因子と共同して 1種類の サイト力イン発現を調節している。例えば、図 2に示すように、インターロイキン 8 (IL8) では、 AP— 1、 CZEBP、 NF K Bといった転写制御因子が関与している。インター口 ィキン 6 (IL6)では、 AP— 1、 CREB、 C/EBP, NF K Bが関与している。インター口 ィキン 2 (IL2)では、 NFAT、 AP— 1が関与し、 TNF aでは、 NF κ B、 ERG 1、 CR E、 AP— 1、 SP 1、 AP— 2が関与している。尚、 TNF αでは、転写調節領域中に NF κ Bの結合部位が複数あり、結合部位が 1つの場合のサイト力イン (例えば IL8、 IL6 )よりも NF κ Bの核内移行量が多くなると考えられる。また、インターロイキン 4では、 AP— 1、 C/EBPが関与している。インターロイキン 10では、 CRE 1、 CRE3、 CRE 4、 TATA, C/EBP1 , C/EBP3, C/EBP5が関与している。
[0037] 測定する活性型転写制御因子は、炎症性サイト力イン又は抗炎症性サイト力インの 発現量を予測することができるものであればよぐ炎症性サイト力インに共通な転写制 御因子で抗炎症性サイト力インの発現に関与していない転写制御因子を 1種類だけ 測定してもよいし (炎症性サイト力インの発現を予測する場合)、抗炎症性サイト力イン に共通な活性型転写制御因子で炎症性サイト力インの発現に関与して 、な 、転写 制御因子を 1種類だけ測定してもよ 、し (抗炎症性サイト力インの発現を予測する場 合)、複数種類の活性型転写制御因子の量を測定してその存在比率から、個々のサ イト力インの発現を予測できるように選択してもよい。例えば、 SIRSに特に関係する サイト力インは IL8、 IL6および TNF aであり、これらに共通する転写制御因子は NF κ Bであることから、活性型 NF κ Bの存在量を測定することによって、炎症性サイト力 インの発現量が増加する力否かを予測することが可能である。
[0038] 活性型転写制御因子の測定は、測定開始力 測定結果が得られるまでの測定時 間が 1時間以内の方法で行なうことが好ましく、より好ましくは 30分以内の方法で行 なう。測定結果が得られるまでに力かる時間が数時間以上必要とする測定方法では 、転写開始力 数時間後に発現されるサイト力インカ、患者においてすでに発現され 、ひどい場合には新たに別のサイト力インが発現していて、治療が手遅れ、あるいは 誤るおそれがある力もである。
[0039] 測定時間が 30分以内である測定方法としては、転写制御因子が結合する特定配 列を有するヌクレオチドプローブを用いてヌクレオチドハイブリダィゼーシヨンを検出 する方法、生体分子間相互作用測定方法が好ましい。具体的には、表面プラズモン 共鳴法 (SPR)、水晶振動子マイクロバランス法 (QCM)、 1分子蛍光相関法 (FCS) 、 Dual polarization interferonmeter— SPR (二面偏波式干渉 SPR)が挙げ られる。
[0040] SPR (表面プラズモン共鳴法）とは、図 3に示すように、プリズム表面に敷設された 金属膜 (金又は銀の薄層）に特定角度で入射される光が金属表面の電子を刺激して 出てくる反射光により生じる表面プラズモン共鳴現象を利用した方法である。表面プ ラズモン共鳴と共鳴角度が反射インデックスに依存するので、金属膜表面のヌクレオ チドノ、イブリツドの有無、すなわち DNAプローブに結合した転写制御因子量を測定 することができる。
[0041] QCM (水晶振動子マイクロバランス法）は、図 4に示すように、ヌクレオチドプローブ が植設された金薄膜で被覆された水晶振動子を用いて、試料に含まれる転写制御 因子がヌクレオチドプローブに結合することによる金薄膜の質量変化を振動数変化 で検出する方法である。
[0042] FCS (1分子蛍光相関法）は、図 5に示すように、測定試料と蛍光標識したヌクレオ チドプローブの混合物を共焦点領域を通過させ、転写制御因子 プローブ複合体と プローブ単体とは分子サイズの違いから共焦点領域通過時間が異なることを利用し て、 1分子が光るパルス数で、転写制御因子 プローブ複合体と未反応蛍光分子（ プローブ単体)を分離して検出する方法である。
[0043] 上記各方法において使用するヌクレオチドプローブは、検出しょうとする転写制御 因子が特異的に結合する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであればよく 、その全配列は天然に存在するワイルドタイプであってもよいし、人工的に合成したも のであってもよい。また、使用するヌクレオチドプローブは 1種類だけであってもよいし 、予測しょうとするサイト力インに関与する複数の転写制御因子に対応する数のヌクレ ォチドプローブが設けられていても良い。好ましくは、あらゆる転写制御因子に相当 するヌクレオチドプローブが設けられて!/、るものである。複数の転写制御因子を一度 に検出、定量することで、発現するサイト力インを予測できるからである。
[0044] 生体分子間相互作用測定方法は、検出感度が ΙΟηΜであり、 1試料を 10分程度で 定量することができる。従って、患者力も細胞を採取して測定試料を調製し、測定開 始カも測定結果が得られるまで、 1時間以内に行えることから、生物学的試料を患者 力も採取した時点力も数時間後に発現してくるサイト力インを知ることができる。このこ とは、数時間後に起る症状が抗炎症性であるの力、炎症性であるのか、さらには、い かなるサイト力インが発現して、どのような症状が現れるのかを予測するのに便利であ る。この点、 ELISAやゲルシフトアツセィでは、 3〜6時間かかかるため、予測結果が 出る頃には、予測されたサイト力インと発現してくるサイト力インが異なっている可能性 が高ぐ適切な治療ができないという問題があつたが、このような迅速性ある測定方法 を採用することにより、予測による適切な治療、処方の選択が可能となる。
[0045] 測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、診断支援情報を出力する 。ここで、診断支援情報とは、将来の炎症の進行状態に関する情報で、炎症性反応 が亢進する力否かの情報および抗炎症性反応が亢進する力否かの情報力 なる群 力も選択される情報を含むものであってもよ 、し、炎症性サイト力インの発現量が増 加する力否かの情報および抗炎症性サイト力インの発現量が増加する力否かの情報 力もなる群力も選択されるサイト力イン発現情報を含むものであってもよい。
[0046] 目的とするサイト力イン (炎症性サイト力イン又は抗炎症性サイト力イン）に関与する 活性型転写制御因子の存在量を知ることで、これから発現しょうとする炎症性サイト 力イン又は抗炎症性サイト力インが増加する力否かを予測することができ、ひ 、ては 炎症反応が亢進するか否か、抗炎症反応が亢進するか否かと!/、つた将来の炎症の 進行状態を予測することができ、これらを診断支援情報として出力することができる。
[0047] 特に測定開始力 測定結果が得られるまでの時間が 30分以下である測定方法を 採用することにより、患者力 試料を採取した時点から数時間後に発現してくるサイト 力インを知ることができるので、数時間後に起る症状が抗炎症性反応の亢進であるの 力 炎症性反応の亢進であるのかを予測することができる。
[0048] 上記診断支援情報には、さらに、選択すべき治療方法の情報、治療方法の適否を 示す情報 (抗炎症剤の投与の適否を示す情報、血漿交換の適否を示す情報および 顆粒球コロニー刺激因子の投与の適否を示す情報）が含まれていてもよい。迅速性 ある測定方法を採用することにより、数時間後に起る症状が抗炎症性であるの力 炎 症性であるのか、さらには、いかなるサイト力インが発現して、どのような症状が現れる の力を予測することができるので、予測による適切な治療、処方の選択を、診断支援 情報として出力することが可能となる
[0049] 例えば、図 6に示すように、 SIRS症状が後期に入ると、炎症性サイト力インの発現 量が減少し、 CARS状態の抗炎症性サイト力イン発現量が増大して 、るような場合、 サイト力インの測定検出による診断に基づく治療では、抗炎症剤を投与することにな つてしまう。一方、活性型転写制御因子の存在量に基づいて、 SIRS前期の炎症性 サイト力インの発現が増大して 、る時期か、 SIRS後期の炎症性サイト力インの発現が 減少していく時期力 さらには CARSの抗炎症性サイト力イン発現が亢進している時 期かを区別した情報を得ることができる。従って、本発明の方法により出力される診 断支援情報に基づけば、 SIRSの炎症性サイト力インの発現が増大している時期に は抗炎症剤の投与、 CARSの抗炎症性サイト力イン発現が亢進している時期には、 血漿交換や顆粒球コロニー刺激因子の投与といった治療方法を選択することができ る。
[0050] 〔免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置〕
本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者力 採取した 生物学的試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力インカ なる群より 選択されるサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定して得られ た転写制御因子情報を取得する情報取得手段;及び取得した転写制御因子情報に 基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診 断支援情報出力手段を備えている。
[0051] 前記転写制御因子情報とは、測定される活性型転写制御因子の存在量であっても よいし、当該存在量を測定する測定装置で取得されるデジタル信号、例えば存在量 に換算される前の蛍光強度や反射率等の光学的強度、放射線強度、又は振動数な どに相当するデジタル信号であってもよ 、。
[0052] 前記炎症の進行状態に関する情報は、炎症性反応が亢進するか否かの情報およ び抗炎症性反応が亢進する力否かの情報力 なる群力 選択される情報であっても ょ 、し、炎症性サイト力インの発現量が増加する力否かの情報および抗炎症性サイト 力インの発現量が増加する力否かの情報力 なる群力 選択されるサイト力イン発現 情報を含むものであってもよ 、。
[0053] 前記診断支援情報は、将来の炎症の進行状態に関する情報の他、さらに治療方 法の情報を含むことが好ましぐ当該治療方法としては、抗炎症剤の投与、血漿交換 および顆粒球コロニー刺激因子の投与力 なる群より選択されることが好ましい。
[0054] 診断支援情報出力手段は、炎症性サイト力インに特異的な転写制御因子の情報を 記憶する記憶手段;及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記 記憶手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイト力インの発現量が増加するか 否かを予測する予測手段を備え、予測手段の予測結果に基づ!、て診断支援情報を 出力するものであることが好ましい。前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイト力インに 特異的な転写制御因子の情報を記憶する手段であることが好ましい。
[0055] あるいは診断支援情報出力手段は、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶 する記憶手段;及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶 手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイト力インの発現量が増加する力否か を予測する予測手段を備え、予測手段の予測結果に基づ!、て診断支援情報を出力 するものであってもよい。また、前記記憶手段は、さらに抗炎症性反応が亢進するか 否かの情報を記憶する記憶手段であってもよ 、。
[0056] 本発明の診断支援情報出力装置の一実施形態について、図 7のハードウェア構成 例に基づいて説明する。
[0057] 本実施の形態に係る診断支援出力装置を備えたシステム 100は、本体 110と、ディ スプレイ 120と、入力デバイス 130とから主として構成されたコンピュータ 100aによつ て構成されている。本体 110は、 CPUl lOaと、 ROMl lObと、 RAMI 10cと、ハード ディスク 110dと、読出装置 110eと、入出力インタフェース 110fと、通信インタフエ一 ス 110gと、画像出力インタフェース 110hとから主として構成されており、 CPUl lOa 、 ROMl lOb, RAM110c、ハードディスク 110d、読出装置 110e、入出力インタフ エース 110f、および画像出力インタフェース 110hは、バス 110iによってデータ通信 可能に接続されている。
[0058] 図 7に示す診断支援情報出力システムの構成において、入出力インターフェース 1 10fが情報取得手段に該当し、本体 110が診断支援情報出力手段に該当する。また 、記憶手段は、 ROMl lOb, RAMI 10c,ハードディスク 110dが具体的に該当し、 予測手段は CPUl lOaが該当する。
[0059] 入出力インタフェース 110fは、例えば USB, IEEE1394, RS- 232C等のシリアルイン タフエース、 SCSI, IDE, IEEE1284等のパラレルインタフェース、および DZA変^^ 、 AZD変 等力もなるアナログインタフェース等力も構成されている。入出力イン タフエース 110fには、キーボードおよびマウスからなる入力デバイス 130が接続され ており、ユーザが当該入力デバイス 130を使用することにより、コンピュータ 100aに データを入力することが可能である。
[0060] 入力デバイス 130を介して測定データを含む転写制御因子情報をユーザーが入 力してもよいし、活性型転写制御因子の存在量を測定する測定装置の出力部と入出 力インターフェース 130とを接続して、測定により得られたデジタル信号を、転写制御 因子情報として直接入力されるようにしてもょ ヽ。
[0061] 予測手段である CPUl lOaは、記憶手段としての ROM110bに記憶されているコン ピュータプログラムおよび RAMl lOcにロードされたコンピュータプログラムを実行す ることが可能である。そして、後述するようなアプリケーションプログラム 140aを当該 C PU110aが実行することにより、コンピュータ 100aが診断支援システム 100として機 能する。具体的には、情報取得手段から入力された活性型転写制御因子の情報に 基づいて発現するサイト力インが炎症性サイト力インおよび抗炎症性サイト力インの何 れであるかを予測し、この予測結果に基づいて診断支援情報を出力する。あるいは 記憶手段に記憶されている情報が炎症反応又は抗炎症反応の亢進の原因となる転 写制御因子の情報である場合には、炎症反応が亢進するか否か、抗炎症反応が亢 進するか否かを予測し、この予測結果に基づ!、て診断支援情報を出力する。
[0062] 記憶手段には、情報取得手段が取得した転写制御因子情報に基づ!、て診断支援 情報を出力するのに必要な情報、具体的には、炎症性サイト力イン若しくは抗炎症性 サイト力インと転写制御因子との関係に関する情報、あるいは炎症反応又は抗炎症 反応の亢進の原因となるサイト力インと転写制御因子の関係に関する情報が記憶さ れる。さらに治療方法に関する情報を記憶させてもよぐこれらの情報は、少なくとも R OM110b、 RAM110c、ハードディスク l lOdのいずれ力 1つに記憶される。なお、 サイト力インと転写制御因子の関係に関する情報には、例えば、転写制御因子に対 応して発現するサイト力インの種類の情報、転写制御因子の存在量に対応するサイト 力インの発現量の情報、転写制御因子の発現力 サイト力インの発現に至る時間等 が含まれる。
[0063] ROM110bは、マスク ROM、 PROM, EPROM、 EEPROM等によって構成され ており、上記転写制御因子とサイト力インとの関係に関する情報や治療方法に関する 情報の他、 CPUl lOaに実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデー タ等が記録されている。
[0064] RAMI 10cは、 SRAMまたは DRAM等によって構成されている。 RAMI 10cは、 ROM110bおよびハードディスク 110dに記録されているコンピュータプログラムの読 み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、 CPU1 10aの作業領域として利用される。入出力インターフェース 110fから入力された転写 制御因子情報を一時的に記憶してもよい。
[0065] ハードディスク 110dには、サイト力インと転写制御因子との関係に関する情報の他 、オペレーティングシステム（例えば米マイクロソフト社が製造販売する Windows (登録 商標）等のグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーティングシステ ム）およびアプリケーションプログラム等、 CPU110aに実行させるための種々のコン ピュータプログラムがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム 14 Oaも、このハードディスク 110dにインストールされて!/、る。
[0066] 読出装置 110eは、フレキシブルディスクドライブ、 CD— ROMドライブ、または DV D— ROMドライブ等によって構成されており、可搬型記録媒体 140に記録されたコ ンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記録媒体 1 40には、コンピュータを本発明に係る診断支援システムとして機能させるためのアブ リケーシヨンプログラム 140aが格納されており、コンピュータ 100aが当該可搬型記録 媒体 140から本発明に係るアプリケーションプログラム 140aを読み出し、当該アプリ ケーシヨンプログラム 140aをノヽードディスク 110dにインストールすることが可能である
[0067] なお、前記アプリケーションプログラム 140aは、可搬型記録媒体 140によって提供 されるのみならず、電気通信回線 (有線、無線を問わない）によってコンピュータ 100 aと通信可能に接続された外部の機器から前記電気通信回線を通じて提供すること も可能である。例えば、前記アプリケーションプログラム 140aがインターネット上のサ 一バコンピュータのハードディスク内に格納されており、このサーバコンピュータにコ ンピュータ 100aがアクセスして、当該コンピュータプログラムをダウンロードし、これを ハードディスク 110dにインストールすることも可能である。
[0068] 画像出力インタフェース 110hは、 LCDまたは CRT等で構成されたディスプレイ 12 0に接続されており、 CPU110aから与えられた画像データに応じた映像信号をディ スプレイ 120に出力するようになっている。ディスプレイ 120は、入力された映像信号 にしたがって、画像 (画面）を表示する。
[0069] 次に、情報出力手段が行なう診断支援情報出力処理の一実施形態を、 SIRSの診 断支援情報出力処理のフローチャートを示した図 8に基づいて説明する。
[0070] まず、コンピュータ 100aは、患者血液を測定して得られた活性型転写制御因子の 測定データを取得する（S l)。この測定データの取得は、測定装置で測定された活 性型転写制御因子の測定データを入力デバイス 130により入力することにより行われ る。また、試料の採取時刻、転写制御因子の測定に要した時間等も入力デバイス 13 0により入力される。なお、コンピュータ 100aと測定装置を LAN等のネットワークで接 続することによりコンピュータ 100aの入出力インタフェース 110fを介して LANに接 続された測定装置力 活性型転写制御因子の測定データを取得することも可能であ る。
[0071] 次に、 CPU110aは取得した測定データに基づいて発現するサイト力インの予測を 行う（S2)。発現するサイト力インの予測は、測定された活性型 NF κ Bの発現量に基 づいて行われる。 NF κ Bは SIRSに関係する炎症性サイト力イン（IL8、 IL6、 TNF a )に特異的な転写制御因子である。従って、 NF κ Bが所定以上発現している場合に は、 IL8、 IL6および TNF aの何れかの炎症性サイト力インが数時間後に発現する 旨の予測が可能である。
[0072] 発現するサイト力インの予測に対応する診断支援情報を選択しディスプレイ 120に 表示する（S3)。この診断支援情報には、炎症性サイト力インの発現量が試料の採取 時点より増加するか否かの予測結果、治療方法 (抗炎症剤の投与)の適否の情報等 が含まれる。
[0073] なお、この実施形態では、 NF κ Bの測定データに基づ 、て発現するサイト力インの 予測を行ったが、測定する転写制御因子の種類を増加させ、発現するサイト力インの 種類を予測するようにしてもよい。 IL8の発現予測を行う場合、転写因子の種類およ び量比（測定値、定量値等）は APl :C/EBP:NFkB = 1 : 1 : 1である。 IL6の発現予測 を行う場合は、 APl :C/EBP:NFkB:CREB = 1 : 1 : 1 : 1である。 IL2の発現予柳』を行う 場合は、 APl:NFAT:Spl = 1 : 1 : 1である。 TNF αの発現予測を行う場合は、 ΑΡ1:Ν FkB:Spl:EGRl:AP2:CREl = 1 : 3 : 1 : 1 :1 : 1である。 IL4の発現予測を行う場合は 、 AP1:C/EBP = 1： 2である。 IL10の発現予測を行う場合には、 CRE1:CRE3:CRE4: TATA:C/EBP1:C/EBP3:C/EBP5 = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1である。
[0074] なお、これらの量比は、個人、サンプル前処理工程による誤差を含むため、それぞ れの転写因子量の誤差は士 0.5程度である。例えば、 APl:C/EBP:NFkB:CREB = 1 .2： 0.6： 0.9： 1.3の場合には IL6と判定することができる。
実施例
[0075] 〔核抽出物試料の調製方法〕
(l)HeLa細胞の核抽出物試料の調製
Nucleic Acids Res.1983年、 3月 11日発行、 11 (5)、 1475〜1489頁に記載 の方法に準じて行なった。
[0076] 具体的には、 HeLa細胞の培養液を 4°C、 2000rpmで 10分間遠心し、回収した H eLa細胞を 5〜： LOmlの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液 (PBS)で洗浄した (4°C、 2000 rpmで 10分間遠心）後、バッファー A (最終濃度： 10mM HEPES (pH7.9)、 1.5 mM MgCl、 lOmM KC1、 0.5mM DDT)を 5〜： LOml加えて懸濁し、 10分間
2
静置した。このとき、実体顕微鏡で観察することにより、細胞の膨張を確認できた。そ の後、 4°C、 2000rpmで 10分間遠心して、細胞を回収し、再び、 l〜5mlのバッファ 一 Aで懸濁した。
[0077] Dounce ホモゲナイザーで 20〜40ストローク、又は 24G針を用いたシリンジング で 20〜40ストロークすることにより、細胞を破壊した。実体顕微鏡で観察して細胞膜 が崩壊し、裸核となっていることを確認した。
[0078] 4°C、 15000Xgで 20分間遠心することにより、細胞粉砕物を回収した。これにバッ ファー C (最終濃度： 20mM HEPES (pH7.9)、 25vZv%グリセロール、 0.42M NaCl、 1.5mM MgCl
2、 0.2mM EDTA、 0.5mM PMSF、 DDT 0.5mM
) 1mlをカ卩えて懸濁し、 Dounce ホモゲナイザーで 20〜40ストローク、又は 24G針 を用いたシリンジングで 20〜40ストロークすることにより、核を破壊した。 4°C、 1500 OXgで 30分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、液体窒素で凍結し、 -80 °cで保存する。
[0079] 尚、脱塩が必要な場合には、 50倍量のバッファー D (最終濃度： 20mM HEPES
(pH7. 9)、 25vZv%グリセロール、 0. 1M KC1、 0. 2mM EDTA、 0. 5mM P MSF、0. 5mM DDT)で 5時間透析する。
[0080] 〔転写制御因子が核内へ移行することの検証〕
( 1)免疫染色による顕微鏡観察
HeLa培養細胞を、蛍光標識した抗 NF κ Β抗体と反応させた後 120分間静置して 、蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡写真 (倍率 400倍)を図 9に示す。細胞核周辺が蛍 光で染まっており、刺激を受けていないときには、 NF κ Βが細胞質内に存在している ことがわ力ゝる。
[0081] 一方、 HeLa培養細胞に、リポポリサッカライド 2. 5mgZmlを投与するとともに、 He La培養細胞を蛍光標識した抗 NF κ B抗体と反応させた後 120分間静置して、蛍光 顕微鏡で観察した。顕微鏡写真 (倍率 400倍)を図 10に示す。核内が蛍光で染まつ ており、リポポリサッカライド投与により、 NF κ Bが核内に移行したことがわかる。
[0082] (2)ゲルシフトアツセィ
上記方法により調製した HeLa細胞の核抽出液 (コントロール）、リポポリサッカライド 2. 5mgZml投与直後の HeLa細胞の核抽出液、リポポリサッカライド投与 60分後、 120分後の核抽出液を、 NF κ B結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプロ一 ブとして、ゲルシフトアツセィを行なった。結果を図 11に示す。
[0083] コントロール（一）、投与直後（0)では、 NF κ Bのバンドは認められなかった力 60 分後、 120分後となるにつれて、 NF κ Bに該当する部分に濃いバンドが認められた 。従って、リポポリサッカライドの投与により、 NF κ Bが核内へ移行することがわかる。 以上の結果から、活性型転写制御因子の量は、核抽出物に存在する転写制御因 子の量を測定すればょ 、ことがわかる。
[0084] 〔ヌクレオチドプローブの特異性の検証〕
( 1) HeLa細胞での確認 で囲んだ部分が転写制御因子結合部位である）、図 12 (b)に示すような配列を有す る変異プローブ (変異部分をアンダーラインで示す)を用いた。
[0085] HeLa培養細胞に、リポポリサッカライド 2. 5mgZmlを投与した 120分後に、上記 核抽出物試料の調製方法に従って核抽出液を調製した。
[0086] WTプローブを植設した金属膜及び変異プローブを植設した金属膜をそれぞれ用 いた SPR装置に、核抽出液 (0. 2nmol、 1. Onmol)を供して、測定した。コントロー ルとして、プローブを植設して!/ヽな 、金属膜を用いた SPR装置に核抽出液を供して 測定した。結果を図 13に示す。
[0087] 図中、縦軸は、転写因子とプローブの複合体に係る Resonance Unit (RU)を示 している。 0. 2nmol、 1. Onmolいずれについても、変異プローブの場合はコント口 ールと同程度の RUを示し、 WTプローブの場合は、コントロールの RUよりも随分小さ い RUを示した。このことから、核抽出液に含まれる NF κ Bは、 WTプローブと結合し ても、変異プローブとは結合しな 、ことが確認できた。
[0088] (2)健常人リンパ球での確認
健常人のヒトリンパ球にリポポリサッカライドを投与し、上記核抽出物試料の調製方 法により核抽出液を調製した。
[0089] 図 12に示す NF κ B結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブ又は変異プ ローブを用いて、ゲルシフトアツセィを行なった。結果を図 14に示す。
[0090] 図 14中、 1は NF κ B結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて核 抽出液を供しな力つた場合、 2は変異プローブを用いて核抽出液を供した場合、 3は WTプローブを用いて核抽出液を供した場合を示している。プローブと NF κ Bとの複 合体は、 3の場合に強く表れた。従って、 HeLa細胞だけでなぐ健常人においても W Tプローブは、 NF κ Bの検出プローブとして有用であることがわ力る。
[0091] 〔転写制御因子の検出測定: NF K B〕
lOmMの HEPES (pH7. 4)、 150mMの NaCl、 3mMの EDTA及び O. 005%の Tween20を含む水溶液 20 1中、 NF κ Βを 40ng、 80ng、 120ng、 160ng、 200η g含む測定用試料液を調製した。
[0092] この試料液を、 WTプローブを設けた SPR装置（ビアコア社製 BIACORE— J)で測 定した。結果を図 15に示す。測定に力かった時間は 15分であった。信号強度は、 N F K Bの含有濃度に比例して大きくなつた。
[0093] 上記試料液につ!、て、 WTプローブを設けた FCS装置（浜松フォト-タス社製）、 Q CM装置 (ィ -シアム社製 Affinix— Q4)で、同様に測定した。それぞれの結果を図 16及び図 17に示す。いずれの方法も NF κ Bの含有濃度に比例して信号強度に該 当する拡散時間又は振動数変化が大きくなつた。また、測定にかかった時間は、 10 分であった。
いずれの方法も NF κ Bの測定開始力も測定結果が得られるまでの時間は 15分以 内であり、数時間後に発現するサイト力インが実際に細胞力 分泌されるときまでに 知ることが可能である。
[0094] 〔転写制御因子の検出測定: SP— 1〕
10mMの HEPES (pH7. 4)、 150mMの NaCl、 3mMの EDTA及び 0. 005%の Tween20を含む水溶液 110 /z l中に、 SP— 1を 215ng、 430ng、 645ng、 1075ng 含む測定用試料液を調製した。
[0095] この試料液を、 WTプローブ（5，一 TGTATCCCCACCCCCTTAAGAA)、変異 プローブ（5， -TGTATCCCCAAACCCTTAAGAA)をそれぞれ植設した金属 膜を用いた SPR装置（ビアコア社製 BIACORE -J)で、 NF κ Βの場合と同様にして 測定した。結果を図 18に示す。
[0096] 試料液中の SP— 1は、 WTプローブと結合しても、変異プローブとは結合しないこと が確認できた。測定に力かった時間は 15分であった。また、図 18に示すように、信号 強度 (Resonance unit)は、 SP— 1の含有濃度に比例して大きくなつた。
[0097] 〔転写制御因子の検出測定: AP— 1〕
10mMの HEPES (pH7. 4)、 150mMの NaCl、 3mMの EDTA及び 0. 005%の Tween20を含む水溶液 110 /z l中に、 AP— 1を 60ng、 150ng、 300ng、 600ng含 む測定用試料液を調製した。
[0098] この試料液を、 WTプローブ（5， -TCGACGTGACTCAGCGCGCATCGTG ACTCAGCGCGC)、変異プローブ（5， - TCG ACGTG ACTTGGCGCGC ATC GTGACTTGGCGCGC)をそれぞれ植設した金属膜を用いた SPR装置（ビアコア 社製 BIACORE— J)で、 NF κ Βの場合と同様にして測定した。結果を図 19に示す。 [0099] 試料液中の AP— 1は、 WTプローブと結合しても、変異プローブとは結合しないこと が確認できた。測定に力かった時間は 15分であった。また、図 19に示すように、信号 強度 (Resonance unit)は、 AP— 1の含有濃度に比例して大きくなつた。
[0100] 〔リウマチ患者関節液由来の線維芽細胞を用いたサイト力インの発現解析〕
( 1 )リゥマチ患者関節液由来の線維芽細胞
リウマチ (RA)患者よりインフォームドコンセントを得た後、関節液を 10〜15ml回収 し、 PBSで 3回洗浄し、 10%ゥシ胎仔血清（FCS)を含むダルベッコ改変 MEM (DM EM)中で、 37°C、 5%COで培養を行ない 5〜8回継代培養したものを、以下の実
2
験に用いた。
(2)トロンビン刺激によるサイト力イン分泌
(1)の RA患者由来線維芽細胞（2 X 105cell/well)を刺激前 48時間、低血清 (0 . 5%FCS)条件下で培養した。この培養細胞液に、トロンビン（lOunitZml)を添カロ し、トロンビン添加直後（Otime)、添加 4時間後、 8時間後、 12時間後、 24時間後に 培養上清を回収して、トロンビン刺激によって分泌されたサイト力イン (G— CSF、 IL2 、 IL6)量を測定した。培養液中のサイト力イン (G— CSF、 IL2、 IL6)は、それぞれの ELISAキット（Biosource、 Camarillo,カリフォルニア州）を用いて測定した。測定 結果を表 1に示す。
[0101] [表 1]
/ /me (hr)
Cytokine
(pg ml) 0 4 8 12 24
*
IL-6 14土 5 16土 &2 108土 2&5* 178土 34-7* 288 ± 48.5 G-CSF 10土 4-3 14土 5.5 20土 7.5 39土 5.5* 58土 8.8* IL-2 32土 8.7 26土 6- 7 40土 8.3 37土 7.5 42士 9.5
★ p<0.05
表 1からわ力るように、 RA患者関節液力 培養した線維芽細胞からトロンビン刺激 によって分泌されたサイト力インのうち、 IL6は刺激後 8時間で優位に分泌が亢進し、 G— CSFでは刺激 12時間後に優位に分泌が亢進していた。一方、同じ炎症性サイト 力イン群として知られて 、る IL2では、トロンビン刺激による優位な分泌亢進は認めら れなかった。
[0102] (3)トロンビン刺激によるサイト力イン mRNA発現解析
( 1)の RA患者由来線維芽細胞（2 X 105cell/well)を刺激前 48時間、低血清 (0 . 5%FCS)条件下で培養した。この培養液に、トロンビン（lOunitZml)を添カ卩し、ト ロンビン添力!]直後、添加 0. 5時間後、 1時間後、 2時間後、 4時間後、 8時間後、 12 時間後、 24時間後ごとに細胞を回収し、 RNAを抽出した。得られた RNA試料に、逆 転写酵素をカ卩えて cDNAを合成し、下記サイト力イン測定用プライマーを用いて PC Rで増幅させた後、 PCR合成物をァガロースゲル電気泳動を行ない、目的とする mR NAを検出測定した。測定結果を図 20に示す。図 20において、 |8ァクチンはコント口 ールである。
[0103] 尚、 RT— PCR法で用いたプライマーは、下記の通りである。
IL6 - 1 : 5 ' - GCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTGTC
IL6 - 2 : 5 ' - CCTCTTTGCTGCTTTCACACATG
G CSF - 1 : 5 ' - AC AGTGC ACTCTGG AC AGT
G CSF - 2 : 5 ' - TCC AGCTGC AGTGTGTCC A
[0104] 図 20からわ力るように、 IL6では刺激後 4時間で IL6の mRNAの発現が確認され、 G— CSFでは刺激後 4〜8時間で G— CSFの mRNAの発現が確認された。
(4)トロンビン刺激による活性型 NF κ Bの測定
(4 1)核抽出液の調製
(1)の RA患者由来線維芽細胞（2 X 105cell/well)を刺激前 48時間、低血清 (0 . 5%FCS)条件下で培養した。この培養液に、トロンビン（lOunitZml)を添カ卩した 直後、培養液力 細胞を回収した。回収した細胞を PBSで洗浄し、遠心後、低張溶 液（10mM HEPES/KOH (pH7. 8)、 10mM KC1、 0. ImM EDTA、 ImM
DTT、0. 1 % NP— 40及びタンパク質分解酵素阻害剤（Sigma社製)）を加え、 氷冷しながら 30分間反応させ、細胞を可溶化した。細胞可溶化液を、 4°C、 2500 X gで 1分間遠心し、沈殿 (核分画)を回収した。回収した核分画に核可溶ィ匕溶液 (50 mM HEPES/KOH (pH7. 8)、 0. ImM EDTA、 5mM MgCl 、 2%グリセ口
2
ール、 ImM DTT、 0. 42M KC1及びタンパク質分解酵素阻害剤（Sigma社製）） を加え、核の可溶ィ匕を行なった。核可溶化液を、 4°C、 12000 X gで 15分間遠心し、 上清を核抽出液として使用した。
[0105] (4 2)ゲノレシフトアツセィ
10mMの Tris/塩酸（pH7. 1)、 50mMの KC1、 ImMの DTT、 5%グリセロール 、 0. 25%の NP— 40、及び ImMの MgClを含有した混合液に、（4—1)で調製し
2
た核抽出液 (任意濃度）、： gZmlの Poly— dlZdC、及び 20fmolの FITC標識プ ローブ（5， 一 FITC— AGTTGAGGGACTTTCCCAGGC (インビトロジェン社の 特注品））を加えて、 4°Cで 30分間反応させた。反応後、 25%グリセロール及び青色 色素（ブロモフエノールブルー）を適当量カ卩え、予め通電（150V、 90分間）した 5% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（150V、 4°C、 2〜4時間）を行なった。電気泳動終 了後、ゲル内の蛍光色素を Molecular Imager FX (BIO Rad社）を用いて可視 化し、解析を行なった。結果を図 21に示す。
[0106] 図 21から、活性型 NF κ Bの量は、トロンビン刺激の 30分後力も増加して 4時間後 にピークに達したことがわかる。
[0107] トロンビン刺激によるサイト力インの分泌 (表 1)、 mRNAの発現（図 20)、ゲルシフト アツセィ（図 21)の結果から、 IL6及び G— CSFは、 DNA上で活性型 NF κ Β量の増 大による発現制御を受けていると考えられる。一方、 DNA上に NF κ Β結合配列をも たないサイト力インである IL2については、トロンビン刺激により活性型 NF κ Βの存在 量が増加しても、 mRNA発現量、分泌量の亢進は認められなかった。これらの結果 から、 RA患者関節液由来線維芽細胞 (慢性的炎症患者)では、生理活性物質や炎 症起因物質による活性型 NF κ B量の増加に伴って IL6、 G— CSF発現が亢進され 、 NF κ B配列を持たない IL2の発現調節は独自の転写制御因子配列 (NFAT、 AP - 1)により行なわれていると考えられる。従って、 RA患者について、 IL6、 G— CSF の発現による症状の発生の有無を前もって知りた!/、場合、これらに共通する転写制 御因子である NF κ Βの核内の存在量 (活性型 NF κ Bの存在量）を、生検試料につ いて測定すれば、炎症性反応が亢進する力否かの情報を得ることができると考えら れる。
産業上の利用可能性
本発明の診断支援方法によれば、数時間後に発現されるサイト力インの予測結果 に基づく情報が得られるので、症状や患者から採取した試料中に存在するサイトカイ ンの測定といった従来の診断方法では適切な対処が困難であった、時事刻々と症状 が変化する疾病、すなわち敗血症や SIRS等の免疫システム異常疾患について、数 時間後に起る症状を予測して治療にあたることが可能となる。
従って、本発明の診断支援情報出力装置を医療現場に設置しておくことにより、従 来、正確な症状の原因把握が困難であった免疫システム異常疾患について、数時 間後に起る症状に対する適切な治療方法の選択が可能となり、ひいては救命率の 向上、 ICU滞在時間を短縮ィ匕することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] 患者力 採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力 インカ なる群より選択されるサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量 を測定する工程;及び
測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に 関する情報を含む診断支援情報を出力する工程
を備えた免疫システム異常疾患の診断支援方法。
[2] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進する力否力の情報、およ び抗炎症性反応が亢進する力否かの情報力 なる群力 選択される情報を含む請 求項 1に記載の診断支援方法。
[3] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性サイト力インの発現量が増加するか否 かの情報、および抗炎症性サイト力インの発現量が増加する力否かの情報、力 なる 群から選択されるサイト力イン発現情報を含む請求項 1に記載の診断支援方法。
[4] 前記診断支援情報は、治療方法の情報を含む請求項 1に記載の診断支援方法。
[5] 前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換、および顆粒球コロニー刺激因子の 投与力 なる群より選択される請求項 4に記載の診断支援方法。
[6] 前記試料は、患者力 採取した細胞の核抽出物である請求項 1に記載の診断支援 方法。
[7] 前記測定工程は、測定開始力も測定結果が得られるまでの時間が 30分以下である 測定方法により実施される請求項 1に記載の診断支援方法。
[8] 前記測定方法は、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び 1分 子蛍光相関法力 なる群より選択される 1種である請求項 7に記載の診断支援方法。
[9] 前記測定工程は、 2種以上の活性型転写制御因子を測定する請求項 1に記載の診 断支援方法。
[10] 前記免疫システム異常疾患は、全身性炎症反応症候群（SIRS)である請求項 1に記 載の診断支援方法。
[II] 患者力 採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイト力イン及び抗炎症性サイト力 インカ なる群より選択されるサイト力インに特異的な活性型転写制御因子の存在量 を測定して得られた転写制御因子情報を取得する情報取得手段;及び 取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を 含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段
を備えた免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置。
[12] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進する力否力の情報、およ び抗炎症性反応が亢進する力否かの情報力 なる群力 選択される情報を含む請 求項 11に記載の診断支援情報出力装置。
[13] 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性サイト力インの発現量が増加するか否 かの情報、および抗炎症性サイト力インの発現量が増加する力否かの情報力 なる 群から選択されるサイト力イン発現情報を含む請求項 11に記載の診断支援情報出 力装置。
[14] 前記診断支援情報は、治療方法の情報を含む請求項 11に記載の診断支援情報出 力装置。
[15] 前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換、および顆粒球コロニー刺激因子の 投与力もなる群より選択される請求項 14に記載の診断支援情報出力装置。
[16] 診断支援情報出力手段が、炎症性サイト力インに特異的な転写制御因子の情報を 記憶する記憶手段;及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記 記憶手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイト力インの発現量が増加するか 否力を予測する予測手段を備え、
予測手段の予測結果に基づ!、て診断支援情報を出力する請求項 11に記載の診 断支援情報出力装置。
[17] 前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイト力インに特異的な転写制御因子の情報を記 憶する手段である請求項 16に記載の診断支援情報出力装置。
[18] 診断支援情報出力手段が、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手 段;及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶さ れた情報に基づいて炎症性反応が亢進するか否力を予測する予測手段を備え、 予測手段の予測結果に基づ!、て診断支援情報を出力する請求項 11に記載の診 断支援情報出力装置。 前記記憶手段は、さらに、抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する手段で ある請求項 18に記載の診断支援情報出力装置。
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