CN108913769A - 早期诊断心肌梗死的分子标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了早期诊断心肌梗死的分子标志物。本发明通过高通量测序筛选在心肌梗死患者和正常人血液中存在差异表达的基因，后经大样本QPCR验证证明HELLS基因在心肌梗死患者血液中的含量比正常人的低。据此可将HELLS基因作为诊断心肌梗死的生物标志物。本发明的研究成果为临床上进行心肌梗死的早期诊断提供了一种无创的方法，适于临床推广。

Description

早期诊断心肌梗死的分子标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种心肌梗死诊断试剂盒以及HELLS基因在制备心肌梗死诊断试剂盒中的用途。

背景技术

随着冠心病的发病率不断增加，冠心病已成为威胁人类健康的头号杀手。冠心病可分为急性冠脉综合征和慢性冠脉病。心肌梗死是急性冠脉综合征中典型类型，主要表现为各种原因所致的冠状动脉血流急剧减少或中断，对应的远端心肌因持续缺血缺氧而产生严重损伤或坏死，常常会导致一系列严重并发症，如心律失常、心力衰竭、心脏破裂、心源性休克、室壁瘤、附壁血栓形成等，死亡率高。随着药物治疗、溶栓治疗、冠脉介入治疗治疗及外科搭桥手术治疗等手段的广泛应用，使得心肌梗死患者的生存率明显提高，预后也得到改善。尽管如此，心肌梗死所导致的严重并发症，及心梗后心脏结构和功能的变化，对患者的生命仍存在着极大威胁，心肌梗死仍然是世界范围内的主要死亡原因。

冠心病是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病。大量资料显示，除了我们已知的传统危险因素，如高血压、糖尿病、吸烟、性别、血脂水平等与冠心病明确相关，遗传因素在冠心病发病过程中同样起着重要作用。与单基因遗传性疾病不同，冠心病发病可能涉及到多个基因之间的相互作用，或环境与基因之间的相互作用。冠心病的发病可能与多个基因相关，而这些基因是否主要为单基因致病或联合作用致病，或通过基因与传统易感因素互相作用使得冠心病发病率增加，其遗传学致病机制仍不明确。

随着高通量筛选技术的不断成熟，基因芯片技术已被广泛应用于疾病差异表达基因的筛选。近年来，通过对多种疾病的差异基因筛选，发现了许多与疾病的发病相关基因位点，为疾病的基因诊疗提供了依据，如专利申请号：

201510629981.0，201510809837.5，201510794868.8，201510725408.X，201510861260.2，201510849579.3，201510767426.4，201510724988.0，201510713527.3，201511004521.5，201610112211.3，201610200574.2，201610202285.6公开的。本申请的研究就是基于高通量筛选技术开发可用于早期诊断心肌梗死的生物标志物。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于心肌梗死早期诊断的分子标志物。使用基因标志物来诊断心肌梗死的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测HELLS基因表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测HELLS基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测HELLS基因表达水平以诊断心肌梗死的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增HELLS基因的引物；所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增HELLS基因的引物；所述用免疫检测诊断心肌梗死的产品包括：与HELLS蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断心肌梗死的产品包括：与HELLS基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与HELLS蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与HELLS基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增HELLS基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测HELLS基因表达的产品可以应用于该平台实现对HELLS基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知HELLS基因的异常与心肌梗死相关也属于HELLS基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断心肌梗死的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HELLS基因转录水平的针对HELLS基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的HELLS蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括HELLS基因在内的多个基因(例如，与心肌梗死相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括HELLS蛋白在内的多个蛋白质(例如与心肌梗死相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与心肌梗死的标志物同时检测，可大大提高心肌梗死诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测HELLS基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括HELLS蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测HELLS基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对HELLS基因的引物和/或探针。根据HELLS基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测HELLS基因表达水平的引物和探针。

与HELLS基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测HELLS基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测HELLS基因的转录水平。

进一步，所述HELLS蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述HELLS蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与HELLS蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对HELLS基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。

用于诊断心肌梗死的HELLS基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断心肌梗死的HELLS基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“HELLS基因”包括HELLS基因以及HELLS基因的任何功能等同物的多核苷酸。HELLS基因(Chromosome 10,NC_000010.11(94545767..94613905))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

在本发明的上下文中，HELLS基因表达产物包括HELLS蛋白以及HELLS蛋白的部分肽。所述HELLS蛋白的部分肽含有与心肌梗死相关的功能域。

“HELLS蛋白”包括HELLS蛋白以及HELLS蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括HELLS蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与HELLS的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是HELLS蛋白的融合蛋白。对于与HELLS蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留HELLS蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断心肌梗死”既包括判断受试者是否已经患有心肌梗死、也包括判断受试者是否存在患有心肌梗死的风险。

本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了HELLS基因与心肌梗死相关，因此HELLS基因成为了诊断心肌梗死的分子标志物，同时为研究心肌梗死的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断心肌梗死较现有技术中的使用方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。

附图说明

图1显示利用QPCR检测HELLS基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选心肌梗死患者和正常人的差异表达基因

1、病例的收集

依据2012年公布的心肌梗死全球统一定义，选取住院治疗，明确诊断为心肌梗死的病人5例。

排除标准：

1)因经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植术引发的心肌梗死。

2)继发于供需失衡相关的心肌损伤：如冠脉内皮功能障碍无明显冠脉疾病、冠脉痉挛、冠脉栓塞、快速/缓慢型心律失常、严重贫血、重症呼吸衰竭、主动脉夹层或严重主动脉瓣疾病、肥厚型心肌病等。

3)非心肌缺血相关的心肌损伤：心脏挫伤、手术、消融、起搏、或除颤仪除颤、伴心脏受累的横纹肌溶解症、心肌炎、心脏毒性药物等。

4)多因素或不确定的心肌损伤：严重心力衰竭、应激性心肌病、严重肺栓塞或肺动脉高压、败血症和危重病人、肾功能衰竭、严重的急性神经系统疾病，如卒中、蛛网膜下腔出血等。

5)合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。

6)正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。

7)(活动性或潜伏性)结核感染史或证据。

8)患有免疫系统疾病和(或)正在服用激素。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者。

9)临床资料或者冠脉造影资料不全者。

详细记录临床资料，包括：用药史、血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、体质指数(BMI)、冠状动脉造影资料、冠心病家族史、吸烟史，以及合并其它临床疾病情况(如高血压、糖尿病)等。

所有研究对象均签署了知情同意书。

另外，收集健康志愿者5例。

2、白细胞分离

(1)抽取符合入排标准的病人和正常人群的外周静脉血2m1，加入含EDTA的抗凝管中，进行白细胞分离；

(2)向(1)管加入等体积无菌PBS液，充分混匀成细胞悬液；

(3)在另一新的离心管中加入4m1淋巴细胞分离；

(4)将(2)中的细胞悬液沿管壁轻轻加入到(3)管中，可见明显分层，上层为红色稀释后血液，下层为清亮淋巴细胞分离液。常温下1500rpm离心20min；

(5)用吸管小心吸出“白膜层”，转入另一新的离心管中。

(6)向(5)中新的离心管中加入约2-4m1PBS液，离心后倒掉上清。

(7)重复(6)一次，将洗涤完成的细胞移入EP管中，用于提取RNA。

3、RNA提取

(1)裂解：将上述分离的白细胞加入1.5mL Eppendorf管，置于冰上，加lml Trizol于EP管中，用电动匀浆器充分震荡混匀，室温下静置5min，4度12000g离心15min。

(2)分层：加入200μ1氯仿，剧烈震荡15s，室温下静置10min，4度12000g离心15min。

(3)沉淀：小心吸出上清液(约600μ1)，转移至新的1.5m1EP管中，加入500μ1异丙醇，缓慢颠倒混匀，室温下静置10min，4度12000g离心10min，可见底部白色沉淀物。

(4)洗涤：弃上清，加入1ml冷75％乙醇，悬浮RNA沉淀，4度12000g离心l 0min。

(5)重复步骤(4)一次。

(6)弃除乙醇溶液，用枪头尽可能吸干乙醇溶液，室温下晾干RNA约5-l0min，半透明即可，加入20μ1 DNase/RNase-free水溶解RNA。

(7)取3μ1总RNA样本与0.5μ1 6*loading buffer混匀上样，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测RNA完整性；取lμ1总RNA样品于NanoDrop 2000 UV-Vis紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。RNA样本放在-80度冰箱中保存。

4、样本的准备与测序：

将RNA样本送交上海伯豪生物技术有限公司采用Solexa测序技术对样品进行测序。

5、数据分析

5.1原始数据处理

测序仪产生的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据，称之为原始序列数据，结果以FASTQ文件格式存储。由于原始序列数据可能包含低质量序列、接头序列等杂质序列数据，不能直接用于生物信息分析，所以原始序列数据必需经过数据处理转换为高质量序列数据，利用Tophat(version：2.0.6)软件的spliced mapping算法对高质量序列数据进行基因组比对，采用基因组版本为Sscrofa10.2。

5.2差异基因的筛选

基因表达量的计算使FPKM法。根据基因的表达量(FPKM值)计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。差异表达基因定义为FDR≤0.01且倍数差异在2倍及以上的基因。

5.3结果

用以上标准筛选得到差异表达基因748个，其中表达上调的基因415个，表达下调的基因有333个。

实施例2 QPCR验证候选基因与心肌梗死的关系

基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择HELLS基因(其表达在心肌梗死患者中下调)进行验证。

1、研究对象：

按照实施例1的方法选择心肌梗死患者45例，正常人40例。

2、血液总RNA提取

同实施例1。

3、逆转录

使用Invitrigen公司的M-MLV逆转录试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA.C28025-032)，按说明书用Oligo(dT)为逆转录引物，取0.5μg总RNA进行逆转录，逆转录体系共20μl冰上操作，配置体系如表1所示。

表1 反应体系1

0.5μg RNA	0.5μg RNA对应的μl数
		Oligo(dT)20(50μM)	1μl
10mM dNTP mix	1μl
		DEPC H2O	To10μl

共10μl体系，在PCR仪中完成变性过程，65℃5min，4℃至少1min；取出反应体系立即置于冰上，立即配置如表2的反应体系。

表2 反应体系1

加入标记好的EP管中各10μl，在PCR仪中完成如下步骤：25℃退火10min，37℃延伸50min；70℃终止反应15min；4℃forever将上述逆转录好的cDNA分装保存-20℃备用。

4、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)反应

取10ng的cDNA与 Green qPCR SuperMix with ROX(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行实时荧光定量PCR反应，10μl反应体系如表3所示。

表3 QPCR反应体系

实时荧光定量PCR仪(7900HT Fast Real-Time PCR System，AppliedBiosystems，USA)中完成如下PCR过程：第一步，50℃2min；第二步，95℃预变性10min；第三步，95℃变性15sec，60℃退火与延伸1min，次步骤重复40个循环。溶解曲线阶段反应过程：95℃ 15sec，60℃ 15sec，95℃ 15sec。利用溶解曲线观察有无二聚体出现以及引物是否特异，利用扩增曲线观察产物扩增的情况。

引物序列：

针对HELLS基因：

上游引物：5’-GAAGAGAAGCCAGTTATGAG-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5’-GAGATTAGTAGAGGAGGAGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

针对GAPDH：

上游引物：5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，

下游引物：5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。

5、结果分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因CT均数-参照基因GAPDH CT均数；目的基因的相对表达量为＝2^-ΔCt。

6、结果

结果显示，45例心肌梗死患者中有42例患者血液中的HELLS基因表达水平显著低于正常人群的平均值。统计结果如图1所示，与正常人相比，HELLS基因表达水平在心肌梗死患者中下调，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 泰山医学院，泰山医学院附属医院

<120> 早期诊断心肌梗死的分子标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagagaagc cagttatgag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagattagta gaggaggagt t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttccaat atgattcca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttccatt gatgacaag 19

Claims (10)

1.检测HELLS基因表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测HELLS基因表达水平以诊断心肌梗死的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增HELLS基因的引物；所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增HELLS基因的引物；所述用免疫检测诊断心肌梗死的产品包括：与HELLS蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断心肌梗死的产品包括：与HELLS基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与HELLS蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与HELLS基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括的一对特异扩增HELLS基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.一种用于诊断心肌梗死的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中HELLS基因的表达来诊断心肌梗死。

6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HELLS基因转录水平的针对HELLS基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的HELLS蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测HELLS基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括HELLS蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测HELLS基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测HELLS基因转录水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测HELLS基因转录水平的试剂包括针对HELLS基因的引物和/或探针。

9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对HELLS基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。