KR102476905B1

KR102476905B1 - 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR102476905B1
Application number: KR1020210012274A
Authority: KR
Inventors: 이홍준; 김정학
Original assignee: 주식회사 휴메타셀
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2022-12-14
Also published as: KR20220109049A

Abstract

본 발명은 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커, 상기 바이오마커를 이용한 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트, 및 상기 바이오마커를 이용한 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ADGRG3, AATK, ALOX5, CD177, CREB5, ICAM3, LSM3 및 S100A6로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 바이오마커, 상기 바이오마커에 결합하는 물질을 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트, 및 개체로부터 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단의 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커{Biomarker for diagnosis or prognosis of ischemic disease}

본 발명은 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커, 상기 바이오마커를 이용한 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트, 및 상기 바이오마커를 이용한 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명은 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단 바이오·의료기술개발사업의 지원을 받아 수행된 연구이다(NRF-2016M3A9B6900776).

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상으로서, 크게 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke) 두 가지로 구분된다. 허혈성 뇌졸중은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직이 허혈 상태가 되어 발생하고, 출혈성 뇌졸중은 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈이 발생되어 나타나는데, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 허혈성 뇌졸중이 발생하면 혈액의 흐름이 일시적으로 끊어짐으로써 세포가 산소와 영양분을 얻을 수 없게 되는데, 이때 수술이나 혈전용해제를 사용하여 혈관 흐름을 재개시켜 주는 조치인 재관류(reperfusion)를 통해 재산소화(reoxygenation) 과정으로 신경 손상을 최소화할 수 있다.

뇌경색(ischemic stroke)은 뇌혈관의 폐색으로 뇌조직에 혈류 공급이 부족하여 뇌신경세포가 손상되는 질환으로, 뇌경색 손상 부위는 그 기능을 되살릴 수 없어 뇌경색에 의한 장애는 영구적으로 남아서 큰 장애로 작용할 수 있다. 그러나 최근 뇌혈관 동맥 내 혈전 제거술이 비약적으로 발전하고 있어, 뇌경색 증상 발생 후 신속하게 병원을 방문하여 성공적인 혈전 제거술이 이루어진 경우, 뇌경색에 의한 후유증을 최소한으로 줄일 수 있게 되었다.

뇌졸중은 신속한 진단을 통해 조기 발견하는 것이 그 피해를 줄일 수 있는 최선의 방어책이 된다. 뇌졸중의 진단법은 예방 진단법과 발병 후 진단법으로 구분되어지는데, 상기 예방 진단법으로는 혈액 검사법이 대표적이며, 상기 발병 후 진단법으로는 우선 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중의 지극히 상반된 치료 기전으로 인해 뇌졸중 발생 초기에 출혈성인지 경색성인지로 이분되는 병인론적인 진단을 위해서 뇌 전산화 단층촬영(CT, computer aided tomography) 또는 자기공명촬영(MRI, magnetic resonance imaging)을 수행하며, 이외에도, 방사성동위원소 또는 초음파을 이용한 뇌혈류 측정법, 뇌혈관 촬영 등이 가능하다. 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중의 감별진단에는 CT가 가장 도움이 되며 급성기의 허혈성 뇌졸중 정도와 혈관 상태 파악을 위해서는 MRI가 우수하다는 평가를 받고 있다. 그러나 고가 장비의 사용으로 인한 고 비용 및 진단 장소의 제한 등 단점이 있다.

상기 종래의 뇌졸중 진단법은 예방 진단법이 혈액검사 이외에는 없고, 발병 후 진단법은 인체에 해로운 방사성 동위원소를 사용하는 진단이 다수이며, 고가 장비의 사용으로 진단비용이 비싸며, 진단장소가 제한되는 문제점을 구비할 뿐 아니라, 진단결과가 나오는 데까지도 상당 기간이 소요되는 문제점을 발생시키고 있다.

그러나 뇌 조직은 한 번 손상되면 재생되지 않고 일단 발생하면 후유증이 심각하기에, 상기와 같은 발병 이후의 치료법 결정을 위한 진단의 중요성이 사회 경제적 손실비용 감소 측면 외에도 사망률 감소 및 국가 질병관리 측면에서 그 순기능적 가치가 매우 높다 하겠다. 따라서 뇌졸중 조기 진단을 효과적으로 가능하게 하는 새로운 뇌졸중 마커의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다.

이에 대해, 본 발명자들은 뇌경색을 포함한 허혈성 질환의 새로운 바이오마커를 발굴하기 위해 노력한 결과, 인간과 원숭이 뇌경색 질환 모델에서 정상 대조군에 비해 유전자 및 단백질 발현 변화가 2배 이상 보이며, 특히 뇌경색 시기별로 유전자 및 단백질 발현 변화가 유의적으로 변화하는 새로운 8종의 바이오마커를 발굴함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 10-2170826 대한민국 등록특허 10-2140581 대한민국 등록특허 10-1478426 대한민국 공개특허 10-2011-0133133

본 발명의 목적은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 중 어느 하나 이상을 더 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트 또는 바이오칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 본 발명에 따른 바이오마커의 발현 수준을 확인하여 개체의 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단의 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 허혈성 질환 예방 또는 치료용 후보약물을 처리한 생물학적 시료에서 상기 본 발명에 따른 바이오마커의 발현 수준을 확인하여 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 분리된 생물학적 시료에 허혈성 질환을 예방 또는 치료할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및, 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 분리된 생물학적 시료에 허혈성 질환을 예방 또는 치료할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및, 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오마커 ADGRG3, AATK, ALOX5, CD177, CREB5, ICAM3, LSM3 및 S100A6는 환자 뇌경색 모델 및 영장류 뇌경색 유발 모델에서 정상 대조군에 비해 유전자 및 단백질 발현 변화가 2배 이상 보이며, 특히 뇌경색 시기별로 유전자 및 단백질 발현 변화가 유의적으로 변화하는 것을 보임으로써, 상기 바이오마커를 이용한 키트는 인간 및 동물의 뇌경색 진단 또는 예후 진단, 또는 뇌경색 치료 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 바이오마커의 뇌경색 시기별 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 바이오마커의 Dot blot 분석 결과로서 뇌경색 그룹에서 발현이 증가되어 있는 것을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 바이오마커의 Dot blot 분석 결과(장기 노출)로서 뇌경색 그룹에서 발현이 증가되어 있는 것을 보여주는 그림이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 하나 또는 둘 이상 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오마커를 제공한다.

상기 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, AATK(apoptosis associated tyrosine kinase)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase)는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되고, CD177(CD177 molecule)는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되며, CREB5(cAMP responsive element binding protein 5)는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되고, ICAM3(intercellular adhesion molecule 3)는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되며, LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되고, S100A6(S100 calcium binding protein A6)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.

상기 '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 허혈성 질환의 발병 여부, 발병 가능성, 발병 시기 및 또는 진행 정도를 모두 포함할 수 있다.

상기 '허혈성 질환'은 뇌경색, 뇌허혈, 뇌 저산소증, 허혈성 심질환, 심부전, 심근 허혈, 허혈성 신부전, 골격근 허혈, 창자 허혈, 수면무호흡, 수면 동안의 저산소증, 국소관류 결손, 망막 허혈, 신생아 저산소증, 태아 저산소증, 혈전증, 고산병, 일산화탄소 중독, 영아돌연사증후군 및 선천적 순환 장애로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 그 외 당업계에 알려진 허혈성 질환을 모두 포함할 수 있다.

상기 바이오마커의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 항체는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.

상기 PNA(Peptide Nucleic Acid)는 인공적으로 합성된, DNA [0029] 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

상기 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cellcycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

상기 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

상기 프로브란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

상기 LNA(Locked nucleic acids)란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다[J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.

상기 안티센스는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 바이오마커 단백질이나, 이를 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공한다.

상기 허혈성 질환은 뇌경색, 뇌허혈, 뇌 저산소증, 허혈성 심질환, 심부전, 심근 허혈, 허혈성 신부전, 골격근 허혈, 창자 허혈, 수면무호흡, 수면 동안의 저산소증, 국소관류 결손, 망막 허혈, 신생아 저산소증, 태아 저산소증, 혈전증, 고산병, 일산화탄소 중독, 영아돌연사증후군 및 선천적 순환 장애로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 그 외 당업계에 알려진 허혈성 질환을 모두 포함할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, PCR 키트, 핵산증폭 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트 및 LFA(측면흐름분석) 키트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 진단 또는 예후 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단 또는 예후 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단 또는 예후 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 바이오칩을 제공한다.

상기 바이오칩은 단백질 칩 또는 DNA 칩일 수 있다.

또한, 본 발명은 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 목적하는 개체는 허혈성 질환의 발병 여부가 불확실하거나 발병 가능성이 높은 개체를 의미하며, 인간, 원숭이, 유인원, 랫트 및 마우스를 포함함 모든 포유류를 의미한다.

상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 바람직하게는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고 펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF 분석, SELDI-TOF 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(LC-MS), LC-MS/MS, 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 분리된 생물학적 시료에 허혈성 질환을 예방 또는 치료할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및, 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 후보 물질은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에서 상기 바이오마커 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준이, 상기 후보 물질의 처리 전에 비하여 증가 또는 감소된 경우, 상기 후보 물질을 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 발현 수준을 측정하는 제제 및 발현 수준의 측정 방법에 관한 기재는 본 발명의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 방지하기 위해 이하 그 기재를 생략한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 환자 뇌경색 및 원숭이 뇌경색 유발 모델

인간 뇌경색 환자 혈액 샘플을 대조군(Pre), 관류 후 (Post), 1일 후(1d), 1주, 4주 시기별로 각각의 유전체/단백체 확인하기 위하여 대조군 대비 각 군의 유전자 발현을 비교하였다. 우선 원래 대조군으로 써야 하는 정상상태 혈액샘플을 인간의 경우에 채취할 수 없으므로 병원에 도착한 상태인 Pre 샘플을 대조군으로 정하고 Pre 샘플 대비 다른 군의 유전자 발현 변화를 관찰하였다(유전체). 단백체 분석에서는 상업적으로 판매하고 있는 인간 혈청을 구매하여 대조군과 실험군 간의 단백질 변화 분석을 하였다(단백체).

원숭이 뇌경색 유발 모델(cynomolgus) 유발 후 유전자 발현 변화/분석을 위해 폐색 전/후, 1일, 1주, 4주 혈액을 채취/RNA를 분리하였으면, 44K Agilent GX array를 이용하여 유전체, cytokine/chemokines array를 이용하여 단백체를 분석하였다.

데이터 분석을 각 군에서 2배 이상 발현 변화를 보이는 유전자들이 어떤 기능을 하는지 분석하였으면, 통계적으로 유의성 있는 결과로 합치고 p-value로 분류하여 분석하였다.

< 실시예 2> 인간 뇌경색 및 원숭이 뇌경색 유발 모델 혈액 샘플에서 cytokine/chemokines array 분석

인간 뇌경색 환자 혈액을 Normal, Pre, Post, 1일, 1주 그리고 4주 시기에 분리하였다. 분리된 혈액은 2000 g에서 20분간 원심분리를 돌려 혈청을 분리하였고 분리된 혈청은 cytokine/chemokines array 키트로 단백질 발현을 분석하였다.

환자 뇌경색 cytokine/chemokines 발현은 환자별로 약간 차이가 있었다. 환자 뇌경색 발현 양상을 보게 되면 normal에서 pre, post 때 cytokine/chemokines 발현 양상에 큰 변화가 있으면, 24시간, 1주, 4주 때에는 발현한 단백질 증가 또는 감소에 변화 양상을 보였다. 원숭이 뇌경색 유발 모델 cytokine/chemokines 발현에서는 개체 간에 큰 변화가 있었다. baseline (normal) 에 비해서 크게 단백질 변화는 없는 양상을 보여 주었다.

환자 total signification에서 pre, post 시기에는 extracellular matrix, secretion, neurogenesis, cell migration, immune response, inflammatory response, cell differentiation 순으로 단백질 변화가 있으며, 24시간, 1주 시기에서는 secretion, inflammatory response, cell migration, immune response, cell differentiation, 4주 시기에는 extracellular matrix, cell migration, neurogenesis, secretion, immune response, inflammatory response, cell differentiation 순으로 total signification 발현 경향을 보여 주었다. 원숭이 뇌경색 유발 모델에서는 D0, 24hrs, 1주, 4주 시기에서 apoptotic process & cell death, cell differentiation, neurogenesis, cell cycle, cell migration, inflammatory response, secretion, immune response, aging, angiogenesis, extracellular matrix, 순으로 total signification 발현 경향을 보여 주었으며, 특히 angiogenesis 관련 단백질은 뇌경색 유발 후 D0에서만, extracellular matrix 관련 단백질 경우에는 24시간 때만 발현 양상을 보여 주었다

환자 뇌경색/원숭이 뇌경색 cytokine/chemokine 발현패턴 및 네트워크 분석을 위해서 유사한 단백질을 찾기 위하여 이들 cytokine/chemokine 발현량을 imageJ 프로그램으로 정량화한 수치로 heatmap 분석을 수행하였다.

< 실시예 3> 인간 뇌경색 및 원숭이 뇌경색 유발 모델 혈액 샘플에서 Next generation sequencing ( NGS ) 분석

<3-1> 인간 뇌경색 ontology 별 유전자 발현 분석

인간 뇌경색 환자 발생 후 재관류 직전(Pre-control), 재관류 직후(Post), 1일, 1주일 각각 혈액을 분리하여 일부는 혈청을 분리하고 일부는 total RNA를 분리하고 mRNA식 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)을 수행하였다. Total RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer system을 이용하여 quality를 측정하였고 NGS를 수행하는데 문제없음을 확인하였다.

뇌경색 기전에 관련된 hypoxia, cytokine/chemokines, inflammatory response, apoptotic process & cell death, autophagy & phagocytosis, excitotoxicity, peri-infarct depolarization, mitochondrial clustering 분석을 실시하였다. 인간 뇌경색 환자 발생 후 재관류 직전(Pre-control), 재관류 직후(Post), 24hrs, 1wks 시기별 전체적으로 각 유전자 ontology에 따라 정도 차이는 있지만 대부분의 처리군에서 post 이후 24hrs, 1wks의 발현 양상이 유사하였고, post 군에서 유전자 발현 양상이 다른 처리군에 비하여 많은 변화를 보여 주었다.

인간 뇌경색 모델에서 인간 뇌경색 환자 발생 후 재관류 직전(Pre), 재관류 직후(Post), 24hrs, 1주 유전자들의 주요 세포 생리/병리학적 발현 변화을 확인하기 위하여 유전자 ontology 별로 excitotoxicity, acidotoxicity, inflammation, peri-infarct depolarization, cell death, hypoxia, oxidative stress, ER stress, mTOR, autophagy& phagocytosis, astrocyte, mitochondria, neuron, astrocyte, microglia, endothelial, cell pericyte로 분류해 분석하였다. 전반적으로 분석한 결과 모든 유전자군에서 발현이 24hrs때 떨어지는 경향을 보여주다가, 1주째 다시 증가하는 경향을 보여 주고 있지만, autophagy&phagocytosis, microglia, pericyte, endothelial cell는 1주째까지 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

<3-2> 원숭이 뇌경색 유발 모델 ontology 별 유전자 발현 분석

원숭이 뇌경색 유발 후 대조군, 재관류 직후(Post), 1일, 1주(1wks), 4주 (4wks)에 각각 혈액을 분리하여 일부는 혈청을 분리하고 일부는 total RNA를 분리하고 mRNA식 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)을 수행하였다. Total RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer system을 이용하여 quality를 측정하였고 NGS를 수행하는데 문제없음을 확인하였다.

환자 뇌경색 기전과 같이 hypoxia, cytokine/chemokines, inflammatory response, apoptotic process & cell death, autophagy & phagocytosis, excitotoxicity, peri-infarct depolarization, mitochondrial clustering 분석을 실시하였다. 원숭이 뇌경색 유발 후 D0 1st, D0 2nd, 24hrs, 1wks, 4wks 시기별 전체적으로 각 유전자 ontology에 따라 정도 차이는 있지만 대부분의 대조군에서 D0 1st, D0 2nd, 24hrs, 1wks의 발현 양상이 유사하였고, 4wks 군에서 유전자 발현 양상이 다른 처리군에 비하여 많은 변화를 보여 주었다.

원숭이 뇌경색 유발 모델에서 인간 뇌경색 환자 발생 후 재관류 직전(Pre), 재관류 직후(Post), 24hrs, 1주 유전자들의 주요 세포 생리/병리학적 발현 변화를 확인하기 위하여 유전자 ontology 별로 excitotoxicity, acidotoxicity, inflammation, peri-infarct depolarization, cell death, hypoxia, oxidative stress, ER stress, mTOR, autophagy& phagocytosis, astrocyte, mitochondria, neuron, astrocyte, microglia, endothelial, cell pericyte로 분류해 분석하였다. 전반적으로 분석한 결과 모든 세포, 생리 및 병리 기전을 보게 되면, 24시간째에 최고 발현 양상을 보여 주면, 1, 4주째에 유전자 발현 양상이 지속적으로 떨어지는 경향을 보여 주고 있으나, ER stress, mTOR 신호 기전에서는 D0 2nd부터 유전자 발현이 최고점으로 발현을 하다가, 24시간째부터는 유전자 발현 양상이 떨어지는 결과를 확인하였다.

그 결과, ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)가 뇌경색 시기별 유의적인 발현 변화를 나타내는 주요 바이오마커임을 확인하였다.

< 실시예 4> 원숭이 뇌경색 유발 모델에 세포 치료제 이식 효능 분석

<4-1> 뇌경색 유발 모델에 이용한 인간신경줄기세포 특성화 분석

태아 15주령 뇌 조직에서 추출한 인간신경줄기세포를 v-myc 유전자를 이용하여 세포주를 제작하였다. LK1.NSCc 신경줄기세포주를 면역형광염색 및 RT-PCR을 분석한 결과 전형적인 신경줄기세포주의 특성을 가지고 있는 것으로 확인하였다.

원숭이 뇌경색 유발 모델에 이식할 인간신경줄기세포주에 형광나노입자를 이식 2일째에 세포내에 탑재하여 MRI 영상이미지를 얻을 수 있게 하였다. 나노입자 11시간째부터 세포내에 형광나노입자를 관찰할 수 있었으면, 계대배양 3회까지 나노입자가 있는 것을 관찰하였다.

<4-2> 원숭이 뇌경색 유발 모델에 인간신경줄기세포주 치료제 이식 효능 평가

원숭이 뇌경색 유발 90분째에 형광나노입자가 탑재된 세포 치료제를 IA-2X106, SWI, DWI 30분 이미지 촬영후 IV-6X106, 뇌경색 유발후 1일, 2일째에 IV-6X106 세포를 이식하였다. 혈액 세포는 D8 (baseline), 뇌경색 유발후 90분째 (D0), 1wks, 4wks에 혈액 샘플 채취하여 NGS, cytokine/chemokines array를 분석하였다.

전반적으로 세포사멸, 염증반응 및 cytokine/chemokines 관련된 유전자 발현들이 인간신경줄기세포주 치료제 이식한 처리군에서 효능이 있는 것을 확인하였다.

뇌 구성을 이루고 있는 신경세포, 성상세포, 미세아교세포, 뇌혈관주변세포, 뇌혈관내피세포들의 유전체 발현 양상을 분석한 결과가 세포 치료제 이식한 처리군에서 뇌경색 유발한 대조군에 비해서 발현이 증가는 하는 것으로 확인되었으면, 그러나 미세아교세포 경우에는 D0, 1wks 샘플 시기에서 처리군보다 대조군에서 유전자 발현 양상이 증가는 것으로 확인하였다.

원숭이 뇌경색 유발 모델에 세포 치료제 이식후 cytokine/chemokines array을 분석한 결과 전반적으로 cytokine/chemokines 단백질 발현 양상이 세포 치료제를 이식한 처리군에서 발현 변화가 감소하는 것을 확인하였다.

그 결과, ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)가 뇌경색 유발 모델에 세포 치료제 이식후 발현 변화를 나타냄을 확인하였다.

< 실시예 5> 도트 블락(Dot blot)을 이용한 바이오마커 검증

대조군과 뇌경색 발병 시료로 발굴된 바이오마커를 dot blot을 이용하여 검증하였다.

구체적으로, dot 장비를 사용하기 전에 니트로셀룰로오스 막은 TBS에 미리 적셨다. dot 장비에 니트로셀룰로오스 막을 넣은 후, 나사를 확실하게 잠궈 교차 웰 오염이 발생하지 않도록 하였다. 항원의 균일한 결합을 보장하기 위해, 웰당 100 ul TBS를 넣어서 다시 막을 적셨다. flow valve를 air로 하고 약 250ul 의 항원을 넣었다. gentle vacuum을 만들어 전체 샘플이 중력 흐름에 의해 막을 통해 여과되도록 하였다. 200 ul의 TBS를 각 well에 넣어주어 washing을 진행하였다. 각 well의 washing이 완전히 끝나면 장비로부터 NC membrane을 제거하여 Blocking을 진행하였다. 나머지 부분은 western blot과 동일하게 진행하였다.

그 결과, ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), AATK(apoptosis associated tyrosine kinase), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)가 뇌경색 시기별 유의적인 발현 변화를 나타내는 주요 바이오마커임을 확인하였다(도 1 ~ 도 3).

<110> EBIOGEN CO., LTD. <120> Biomarker for diagnosis or prognosis of ischemic disease <130> NP21-1107 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 549 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Pro Arg Gly Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Pro Thr Ser Gly Gln Glu Lys Pro Thr Glu Gly Pro Arg Asn Thr Cys 20 25 30 Leu Gly Ser Asn Asn Met Tyr Asp Ile Phe Asn Leu Asn Asp Lys Ala 35 40 45 Leu Cys Phe Thr Lys Cys Arg Gln Ser Gly Ser Asp Ser Cys Asn Val 50 55 60 Glu Asn Leu Gln Arg Tyr Trp Leu Asn Tyr Glu Ala His Leu Met Lys 65 70 75 80 Glu Gly Leu Thr Gln Lys Val Asn Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Val 85 90 95 Gln Asn Leu Ser Thr Asn Thr Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Ser Leu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Val Pro Arg Gln Val Met Lys Asp Glu Asp Lys Pro Pro 115 120 125 Asp Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Leu Phe Arg Ser Leu Pro Gly Asn 130 135 140 Arg Ser Val Val Arg Leu Ala Val Thr Ile Leu Asp Ile Gly Pro Gly 145 150 155 160 Thr Leu Phe Lys Gly Pro Arg Leu Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Val 165 170 175 Leu Asn Asn Arg Leu Val Gly Leu Ser Val Gly Gln Met His Val Thr 180 185 190 Lys Leu Ala Glu Pro Leu Glu Ile Val Phe Ser His Gln Arg Pro Pro 195 200 205 Pro Asn Met Thr Leu Thr Cys Val Phe Trp Asp Val Thr Lys Gly Thr 210 215 220 Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Gly Cys Ser Thr Glu Val Arg Pro Glu 225 230 235 240 Gly Thr Val Cys Cys Cys Asp His Leu Thr Phe Phe Ala Leu Leu Leu 245 250 255 Arg Pro Thr Leu Asp Gln Ser Thr Val His Ile Leu Thr Arg Ile Ser 260 265 270 Gln Ala Gly Cys Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Phe Thr Ile Ile 275 280 285 Leu Tyr Ala Phe Leu Arg Leu Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Glu Asp 290 295 300 Ala Pro Lys Ile His Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Leu Leu Asn 305 310 315 320 Leu Ala Phe Leu Val Asn Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ala 325 330 335 Ala Cys Trp Ala Arg Gly Ala Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Cys Ala 340 345 350 Phe Thr Trp Met Gly Leu Glu Ala Phe His Leu Tyr Leu Leu Ala Val 355 360 365 Arg Val Phe Asn Thr Tyr Phe Gly His Tyr Phe Leu Lys Leu Ser Leu 370 375 380 Val Gly Trp Gly Leu Pro Ala Leu Met Val Ile Gly Thr Gly Ser Ala 385 390 395 400 Asn Ser Tyr Gly Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Glu Asn Arg Thr Ser 405 410 415 Leu Glu Leu Cys Trp Phe Arg Glu Gly Thr Thr Met Tyr Ala Leu Tyr 420 425 430 Ile Thr Val His Gly Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Leu Phe Gly Met Val 435 440 445 Val Leu Ala Leu Val Val Trp Lys Ile Phe Thr Leu Ser Arg Ala Thr 450 455 460 Ala Val Lys Glu Arg Gly Lys Asn Arg Lys Lys Val Leu Thr Leu Leu 465 470 475 480 Gly Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Thr Trp Gly Leu Ala Ile Phe Thr 485 490 495 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Val Tyr Ile Phe Ala Leu Phe Asn Ser Leu 500 505 510 Gln Gly Val Phe Ile Cys Cys Trp Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Pro Ser 515 520 525 Gln Ser Thr Thr Val Ser Ser Ser Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ala His 530 535 540 Ser Ala Ser Gln Glu 545 <210> 2 <211> 1374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Ser Phe Phe Asn Pro Ser Phe Ala Phe Ser Ser His Phe 1 5 10 15 Asp Pro Asp Gly Ala Pro Leu Ser Glu Leu Ser Trp Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ala Val Val Ala Val Ser Phe Ser Gly Leu Phe Ala Val Ile Val Leu 35 40 45 Met Leu Ala Cys Leu Cys Cys Lys Lys Gly Gly Ile Gly Phe Lys Glu 50 55 60 Phe Glu Asn Ala Glu Gly Asp Glu Tyr Ala Ala Asp Leu Ala Gln Gly 65 70 75 80 Ser Pro Ala Thr Ala Ala Gln Asn Gly Pro Asp Val Tyr Val Leu Pro 85 90 95 Leu Thr Glu Val Ser Leu Pro Met Ala Lys Gln Pro Gly Arg Ser Val 100 105 110 Gln Leu Leu Lys Ser Thr Asp Val Gly Arg His Ser Leu Leu Tyr Leu 115 120 125 Lys Glu Ile Gly Arg Gly Trp Phe Gly Lys Val Phe Leu Gly Glu Val 130 135 140 Asn Ser Gly Ile Ser Ser Ala Gln Val Val Val Lys Glu Leu Gln Ala 145 150 155 160 Ser Ala Ser Val Gln Glu Gln Met Gln Phe Leu Glu Glu Val Gln Pro 165 170 175 Tyr Arg Ala Leu Lys His Ser Asn Leu Leu Gln Cys Leu Ala Gln Cys 180 185 190 Ala Glu Val Thr Pro Tyr Leu Leu Val Met Glu Phe Cys Pro Leu Gly 195 200 205 Asp Leu Lys Gly Tyr Leu Arg Ser Cys Arg Val Ala Glu Ser Met Ala 210 215 220 Pro Asp Pro Arg Thr Leu Gln Arg Met Ala Cys Glu Val Ala Cys Gly 225 230 235 240 Val Leu His Leu His Arg Asn Asn Phe Val His Ser Asp Leu Ala Leu 245 250 255 Arg Asn Cys Leu Leu Thr Ala Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Tyr 260 265 270 Gly Leu Ala His Cys Lys Tyr Arg Glu Asp Tyr Phe Val Thr Ala Asp 275 280 285 Gln Leu Trp Val Pro Leu Arg Trp Ile Ala Pro Glu Leu Val Asp Glu 290 295 300 Val His Ser Asn Leu Leu Val Val Asp Gln Thr Lys Ser Gly Asn Val 305 310 315 320 Trp Ser Leu Gly Val Thr Ile Trp Glu Leu Phe Glu Leu Gly Thr Gln 325 330 335 Pro Tyr Pro Gln His Ser Asp Gln Gln Val Leu Ala Tyr Thr Val Arg 340 345 350 Glu Gln Gln Leu Lys Leu Pro Lys Pro Gln Leu Gln Leu Thr Leu Ser 355 360 365 Asp Arg Trp Tyr Glu Val Met Gln Phe Cys Trp Leu Gln Pro Glu Gln 370 375 380 Arg Pro Thr Ala Glu Glu Val His Leu Leu Leu Ser Tyr Leu Cys Ala 385 390 395 400 Lys Gly Ala Thr Glu Ala Glu Glu Glu Phe Glu Arg Arg Trp Arg Ser 405 410 415 Leu Arg Pro Gly Gly Gly Gly Val Gly Pro Gly Pro Gly Ala Ala Gly 420 425 430 Pro Met Leu Gly Gly Val Val Glu Leu Ala Ala Ala Ser Ser Phe Pro 435 440 445 Leu Leu Glu Gln Phe Ala Gly Asp Gly Phe His Ala Asp Gly Asp Asp 450 455 460 Val Leu Thr Val Thr Glu Thr Ser Arg Gly Leu Asn Phe Glu Tyr Lys 465 470 475 480 Trp Glu Ala Gly Arg Gly Ala Glu Ala Phe Pro Ala Thr Leu Ser Pro 485 490 495 Gly Arg Thr Ala Arg Leu Gln Glu Leu Cys Ala Pro Asp Gly Ala Pro 500 505 510 Pro Gly Val Val Pro Val Leu Ser Ala His Ser Pro Ser Leu Gly Ser 515 520 525 Glu Tyr Phe Ile Arg Leu Glu Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly His Asp 530 535 540 Pro Asp Cys Ala Gly Cys Ala Pro Ser Pro Pro Ala Thr Ala Asp Gln 545 550 555 560 Asp Asp Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu Ala Met Glu Pro 565 570 575 Leu Leu Gly His Gly Pro Pro Val Asp Val Pro Trp Gly Arg Gly Asp 580 585 590 His Tyr Pro Arg Arg Ser Leu Ala Arg Asp Pro Leu Cys Pro Ser Arg 595 600 605 Ser Pro Ser Pro Ser Ala Gly Pro Leu Ser Leu Ala Glu Gly Gly Ala 610 615 620 Glu Asp Ala Asp Trp Gly Val Ala Ala Phe Cys Pro Ala Phe Phe Glu 625 630 635 640 Asp Pro Leu Gly Thr Ser Pro Leu Gly Ser Ser Gly Ala Pro Pro Leu 645 650 655 Pro Leu Thr Gly Glu Asp Glu Leu Glu Glu Val Gly Ala Arg Arg Ala 660 665 670 Ala Gln Arg Gly His Trp Arg Ser Asn Val Ser Ala Asn Asn Asn Ser 675 680 685 Gly Ser Arg Cys Pro Glu Ser Trp Asp Pro Val Ser Ala Gly Gly His 690 695 700 Ala Glu Gly Cys Pro Ser Pro Lys Gln Thr Pro Arg Ala Ser Pro Glu 705 710 715 720 Pro Gly Tyr Pro Gly Glu Pro Leu Leu Gly Leu Gln Ala Ala Ser Ala 725 730 735 Gln Glu Pro Gly Cys Cys Pro Gly Leu Pro His Leu Cys Ser Ala Gln 740 745 750 Gly Leu Ala Pro Ala Pro Cys Leu Val Thr Pro Ser Trp Thr Glu Thr 755 760 765 Ala Ser Ser Gly Gly Asp His Pro Gln Ala Glu Pro Lys Leu Ala Thr 770 775 780 Glu Ala Glu Gly Thr Thr Gly Pro Arg Leu Pro Leu Pro Ser Val Pro 785 790 795 800 Ser Pro Ser Gln Glu Gly Ala Pro Leu Pro Ser Glu Glu Ala Ser Ala 805 810 815 Pro Asp Ala Pro Asp Ala Leu Pro Asp Ser Pro Thr Pro Ala Thr Gly 820 825 830 Gly Glu Val Ser Ala Ile Lys Leu Ala Ser Ala Leu Asn Gly Ser Ser 835 840 845 Ser Ser Pro Glu Val Glu Ala Pro Ser Ser Glu Asp Glu Asp Thr Ala 850 855 860 Glu Ala Thr Ser Gly Ile Phe Thr Asp Thr Ser Ser Asp Gly Leu Gln 865 870 875 880 Ala Arg Arg Pro Asp Val Val Pro Ala Phe Arg Ser Leu Gln Lys Gln 885 890 895 Val Gly Thr Pro Asp Ser Leu Asp Ser Leu Asp Ile Pro Ser Ser Ala 900 905 910 Ser Asp Gly Gly Tyr Glu Val Phe Ser Pro Ser Ala Thr Gly Pro Ser 915 920 925 Gly Gly Gln Pro Arg Ala Leu Asp Ser Gly Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr 930 935 940 Glu Ser Pro Glu Phe Val Leu Lys Glu Ala Gln Glu Gly Cys Glu Pro 945 950 955 960 Gln Ala Phe Ala Glu Leu Ala Ser Glu Gly Glu Gly Pro Gly Pro Glu 965 970 975 Thr Arg Leu Ser Thr Ser Leu Ser Gly Leu Asn Glu Lys Asn Pro Tyr 980 985 990 Arg Asp Ser Ala Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Thr 995 1000 1005 Ser Gly Pro Glu Lys Lys Cys Gly Gly Asp Arg Ala Pro Gly Pro Glu 1010 1015 1020 Leu Gly Leu Pro Ser Thr Gly Gln Pro Ser Glu Gln Val Cys Leu Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Gly Val Ser Gly Glu Ala Gln Gly Ser Gly Pro Gly Glu Val Leu 1045 1050 1055 Pro Pro Leu Leu Gln Leu Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Ser Thr Cys 1060 1065 1070 Pro Ser Gly Leu Val Pro Glu Pro Pro Glu Pro Gln Gly Pro Ala Lys 1075 1080 1085 Val Arg Pro Gly Pro Ser Pro Ser Cys Ser Gln Phe Phe Leu Leu Thr 1090 1095 1100 Pro Val Pro Leu Arg Ser Glu Gly Asn Ser Ser Glu Phe Gln Gly Pro 1105 1110 1115 1120 Pro Gly Leu Leu Ser Gly Pro Ala Pro Gln Lys Arg Met Gly Gly Pro 1125 1130 1135 Gly Thr Pro Arg Ala Pro Leu Arg Leu Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala 1140 1145 1150 Ala Leu Glu Gly Arg Pro Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Glu Asp Ser 1155 1160 1165 Asp Glu Ser Asp Glu Glu Leu Arg Cys Tyr Ser Val Gln Glu Pro Ser 1170 1175 1180 Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ala Pro Ala Val Pro Val Val Val Ala Glu 1185 1190 1195 1200 Ser Gln Ser Ala Arg Asn Leu Arg Ser Leu Leu Lys Met Pro Ser Leu 1205 1210 1215 Leu Ser Glu Thr Phe Cys Glu Asp Leu Glu Arg Lys Lys Lys Ala Val 1220 1225 1230 Ser Phe Phe Asp Asp Val Thr Val Tyr Leu Phe Asp Gln Glu Ser Pro 1235 1240 1245 Thr Arg Glu Leu Gly Glu Pro Phe Pro Gly Ala Lys Glu Ser Pro Pro 1250 1255 1260 Thr Phe Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Pro 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Leu Leu Leu Leu Asp Val Gly Leu Thr 245 250 255 Ser Thr Leu Val Gly Thr Lys Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala Gln Asn 260 265 270 Ser Gln Lys Thr Thr Ile His Ser Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ala 275 280 285 Ser Tyr Thr His Phe Cys Ser Ser Asp Leu Cys Asn Ser Ala Ser Ser 290 295 300 Ser Ser Val Leu Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gln Ala Ala Pro Val Pro 305 310 315 320 Gly Asp Arg Gln Cys Pro Thr Cys Val Gln Pro Leu Gly Thr Cys Ser 325 330 335 Ser Gly Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr 340 345 350 Asp Gly Tyr Ile His Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Thr Lys Met Ser 355 360 365 Ile Gln Gly Cys Val Ala Gln Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr 370 375 380 Arg Gln Ile Gly Ile Phe Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro 385 390 395 400 Pro Ala Ser Gln His Glu Gly Gly Gly Ala Glu Gly Leu Glu Ser Leu 405 410 415 Thr Trp Gly Val Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Trp Trp Gly Val 420 425 430 Val Cys Pro Ser Cys 435 <210> 5 <211> 568 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ile Tyr Glu Glu Ser Lys Met Asn Leu Glu Gln Glu Arg Pro Phe 1 5 10 15 Val Cys Ser Ala Pro Gly Cys Ser Gln Arg Phe Pro Thr Glu Asp His 20 25 30 Leu Met Ile His Arg His Lys His Glu Met Thr Leu Lys Phe Pro Ser 35 40 45 Ile Lys Thr Asp Asn Met Leu Ser Asp Gln Thr Pro Met Ile Tyr Glu 50 55 60 Glu Ser Lys Met Asn Leu Glu Gln Glu Arg Pro Phe Val Cys Ser Ala 65 70 75 80 Pro Gly Cys Ser Gln Arg Phe Pro Thr Glu Asp His Leu Met Ile His 85 90 95 Arg His Lys His Glu Met Thr Leu Lys Phe Pro Ser Ile Lys Thr Asp 100 105 110 Asn Met Leu Ser Asp Gln Thr Pro Thr Pro Thr Arg Phe Leu Lys Asn 115 120 125 Cys Glu Glu Val Gly Leu Phe Ser Glu Leu Asp Cys Ser Leu Glu His 130 135 140 Glu Phe Arg Lys Ala Gln Glu Glu Glu Ser Ser Lys Arg Asn Ile Ser 145 150 155 160 Met His Asn Ala Val Gly Gly Ala Met Thr Gly Pro Gly Thr His Gln 165 170 175 Leu Ser Ser Ala Arg Leu Pro Asn His Asp Thr Asn Val Val Ile Gln 180 185 190 Gln Ala Met Pro Ser Pro Gln Ser Ser Ser Val Ile Thr Gln Ala Pro 195 200 205 Ser Thr Asn Arg Gln Ile Gly Pro Val Pro Gly Ser 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Lys Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Thr Leu Ser Lys Lys 20 25 30 Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gln Lys Glu Leu Thr Ile Gly Ser Lys Leu 35 40 45 Gln Asp Ala Glu Ile Ala Arg Leu Met Glu Asp Leu Asp Arg Asn Lys 50 55 60 Asp Gln Glu Val Asn Phe Gln Glu Tyr Val Thr Phe Leu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Ala Leu Ile Tyr Asn Glu Ala Leu Lys Gly 85 90

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 AATK(apoptosis associated tyrosine kinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트.
제1항에 있어서,
ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트.
제1항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, PCR 키트, 핵산증폭 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트 및 LFA(측면흐름분석) 키트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트.
제1항에 있어서,
상기 허혈성 질환은 뇌경색, 뇌허혈, 뇌 저산소증, 허혈성 심질환, 심부전, 심근 허혈, 허혈성 신부전, 골격근 허혈, 창자 허혈, 수면무호흡, 수면 동안의 저산소증, 국소관류 결손, 망막 허혈, 신생아 저산소증, 태아 저산소증, 혈전증, 고산병, 일산화탄소 중독, 영아돌연사증후군 및 선천적 순환 장애로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 키트.
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 AATK(apoptosis associated tyrosine kinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 진단 또는 예후 진단용 조성물.
목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 AATK(apoptosis associated tyrosine kinase) 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
ADGRG3(adhesion G protein-coupled receptor G3), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), CD177(CD177 molecule), CREB5(cAMP responsive element binding protein 5), ICAM3(intercellular adhesion molecule 3), LSM3(LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA and mRNA degradation associated) 및 S100A6(S100 calcium binding protein A6)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDITOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환을 진단 또는 예후 진단하기 위한 정보 제공 방법.
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