KR101289134B1

KR101289134B1 - 유전성 샤르코-마리-투스 말초신경병증의 cmt4b3 아형에 대한 원인 유전자로서의 sbf1(mtmr5) 돌연변이 유전자 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법 및 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101289134B1
Application number: KR1020130044124A
Authority: KR
Inventors: 정기화; 최병옥
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2013-07-23

Abstract

본 발명은 SBF1 유전자에서 동정된 신규 미스센스 돌연변이가, 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내고 다른 아형의 CMT와 구별되는 새로운 아형인 CMT4B3의 원인이 되는 유전자 돌연변이임을 규명하고, 이 SBF1 돌연변이 유전자 및 이로부터 코딩되는 단백질을 CMT4B3 아형의 진단 마커로서 제공한다. 또한, 본 발명에서는 상기 SBF1 돌연변이 유전자 및 단백질을 이용하여 CMT4B3 아형의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발생하는 한국인에 특이적인 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환인 CMT4B3 아형에 대하여 간단한 유전자 검사를 통해 정확한 조기 진단이 가능하며, 정확한 진단에 따라 정확한 병인에 따른 맞춤치료가 가능하게 한다.

Description

유전성 샤르코-마리-투스 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 원인 유전자로서의 SBF1(MTMR5) 돌연변이 유전자 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법 및 진단용 조성물 {SBF1 (MTMR5) as a causative gene responsible for a inherited Charcot-Marie-Tooth peripheral neuropathy type CMT4B3 and diagnosis method and composition for the disease}

본 발명은 샤르코-마리-투스 말초신경병증(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)의 상염색체 열성의 수초결손형 말초신경병증인 CMT4 아형의 원인유전자에 관한 것으로, 특히 기존에 알려진 CMT4 아형의 유전성 신경질환과 구별되는 새로운 CMT4 아형과 이의 원인 유전자 및 이를 이용한 상기 질병의 진단에 관한 것이다.

샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)은 유전적으로 그리고 임상적으로 이질적인 말초신경계 질환으로서, 점진적인 손발 근육의 약화 및 감각 기능의 손상을 나타낸다. 수초결손형 CMT의 상염색체 열성 형태를 일반적으로 CMT4라 한다. 많은 CMT4 아형이 보고되었는데, 각 아형들은 독특한 표현형 및 유전형적 특징을 가지고 있다. CMT4B1 및 CMT4B2는 근세관계(myotubularin family)인 MTMR2(MIM 603557)(Bolino A, et al., Nat Genet 2000;25:17-19) 및 SBF2(MTMR13이라고도 함)(MIM607697)(Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356, Azzedine H, et al., Am J Hum Genet 2003;72:1141-1153, Hirano R, et al., Neurology 2004;63:577-580)를 암호화하는 유전자에서 일어난 돌연변이가 원인으로 보여진다. MTMR2- 및/또는 SBF2-결핍 쥐에서 신경 전도 속도(nerve conduction velocity)가 감소되고 미엘린 수초의 외부접힘과 내부접힘이 나타나는 특징을 가진 말초신경장애를 나타내는데, 이는 CMT4B1 및 CMT4B2 환자에서 관찰된 것과 유사하다(Bonneick S, et al., Hum Mol Genet 2005;14:3685-3695, Tersar K, et al., Hum Mol Genet 2007;16:2991-3001, Robinson FL, et al., Proc Nat Acad Sci USA 2008;105:4916-4921). 다른 근세관 관련 단백질(myotubularin-related protein)을 암호화하는 MTM1 유전자에 일어난 돌연변이는 X-연관 근세관성 근질환과 관련되어 있다(Laporte J, et al., Nat Genet 1996;13:175-182, Laporte J, et al., Hum Mutat 2000;15:393-409).

MTMR2 단백질은 포스파타제(phosphatase) 영역을 가지고 있다; 그러나 SBF2는 시스테인(cysteine) 대신에 루신(leucine) 잔기가 치환되어 유발되는 모조 포스파타제(pseudophosphatase)를 가진다(Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356, Azzedine H, et al., Am J Hum Genet 2003;72:1141-1153). SBF2에서 포스파타제 활성도가 손실되면 포스파티딜이노시톨 3-포스페이트(phosphatidylinositol 3-phosphate)와 포스파티딜이노시톨 3,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate)의 축적을 일으켜 막 수송(membrane trafficking), 세포 내 섭취 및 세포 외 배출 과정(endocytic/exocytic process)의 기능 부전, 및 신경-슈반(Schwann) 세포 간 상호작용을 변경시키는 결과를 낳는다(Berger P, et al., Hum Mol Genet 2002;11:1569-1579, Berger P, et al., Hum Mol Genet 2006;15:569-579). SBF2-결핍 쥐는 MTMR2의 발현수준이 감소된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 SBF2의 상태가 MTMR2의 안정성에 영향을 미치는 것을 의미하며, 또한 SBF2와 MTMR2 중 어느 한 유전자에서의 돌연변이들이 유사한 표현형을 나타내기 때문인 것으로 보여진다.

전체 엑솜 서열 분석(whole exome sequencing, WES)은 최근 멘델 유전병(Mendelian diseases)의 유전적 원인을 확인하는데 유용한 방법으로 인식되었다(Choi M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:19096-19101, Ng SB, et al., Nat Genet 2010;42:30-35, Bamshad MJ, et al., Nat Rev Genet 2011;12:745-755). 특히, WES를 CMT에 적용한 몇몇 사례들은 이들이 소규모 가계로부터 희귀한 유전적 요인을 확인하는데 상당한 장점이 있다는 것을 보여주었다 {Montenegro G, et al., Ann Neurol 2011;69:464-470, Weedon MN, et al., Am J Hum Genet 2011;89:308-312, Beetz C, et al., Am J Hum Genet 2012;91:139-145, Choi BO, et al., Hum Mutat 2012;33:1610-1615, Lee S-S, et al., Arch Neurol 2012(in press)}.

비록 SBF1의 기능에 대하여는 별로 알려지지 않았지만, SBF1은 SBF2와 구조적 유사성을 나타내며 MTMR2 및 SBF2와 상호작용을 한다(Kim S-A, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:4492-4497, Cui X, et al., Nat Genet. 1998;18:331-337). 이는 SBF1이 다른 근세관 관련 단백질과 유사한 기능을 가질 수 있지만, SBF1의 돌연변이가 사람의 질병과 연관되어 있다는 것은 아직 보고된 바 없다는 것을 나타낸다.

대한민국 등록특허공보 10-0810903 대한민국 등록특허공보 10-0613038 대한민국 공개특허공보 10-2012-0097304

본 발명은 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)의 상염색체 열성의 수초결손형 말초신경병 증상을 나타내는 CMT4 아형의 유전성 신경질환 중에서도 기존에 알려진 CMT4 아형과 구별되는 새로운 아형의 유전성 신경질환과 그 원인 유전자를 밝히고, 이의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 다른 아형의 CMT와 구별되는 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환인 새로운 CMT4 아형이 있고, SBF1(MTMR5)에서의 복합 이형 돌연변이가 이를 유발하는 원인 유전자임을 확인하였다. 본 발명에서는 이 새로운 CMT4 아형을 "CMT4B3"로 명명하였다.

본 발명에서는,

샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단 마커로서 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 SBF1 돌연변이 유전자를 제공한다.

또한 본 발명에서는,

CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단 마커로서 제1항에 따른 SBF1 돌연변이 유전자로부터 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질을 제공한다. 특히 상기 SBF1 돌연변이 단백질은 서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산 잔기인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산 잔기인 메티오닌이 발린으로 치환된 서열을 포함한다.

본 발명에서는,

개체 시료로부터 상기 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에서는,

상기 진단용 조성물을 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명에서는,

하기 단계를 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 개시한다:

(1) 개체 시료로부터 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질의 발현을 검출하는 단계; 및

(2) 개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질의 발현이 검출된 경우, 이 개체가 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3 아형의 유전성 신경질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.

본 발명에서 용어 "진단"은 어떤 질환의 성질(특성)을 확정하거나 또는 한 질환을 다른 질환으로부터 구별하여 존재를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에 비추어 진단은 특정 유전성 신경질환의 발병 여부 및 그 특성을 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단 마커(diagnosis marker)"는 어떤 질환의 존재 여부 및 성질을 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 목적에 비추어 진단마커는 특정 유전성 신경질환의 발병 여부를 진단할 수 있는 물질이다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기를 갖는 핵산서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복제를 위한 개시점으로 작용하는 단일가닥 올리고뉴클로오티드를 말한다.

본 발명에서 용어 "탐침"은 mRNA와 특이적 결합을 형성할 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지 길게는 수백 개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다.

본 발명에서는 SBF1 돌연변이 유전자가, 한국인 환자에서 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는, 이제까지 보고되지 않았던 새로운 CMT 아형의 유전성 신경질환인 CMT4B3의 병인으로 규명하였다.

상기 SBF1 돌연변이 유전자를 이용한 진단은 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3의 유전성 신경질환에 대하여 유전자 또는 단백질 검사를 통하여 정확한 조기진단을 가능케 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있고, 나아가 정확한 병인에 따른 맞춤치료를 가능케 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 연구 대상인 FC478 CMT4B 가계에 대한 SBF1 유전자 돌연변이의 계통을 나타낸 것이다. 백색 기호는 발병하지 않은 개체를 나타내며 검정 기호는 발병한 개체를 나타낸다. 계보발단자(proband)는 화살표로 표시하였다. 별표(*)는 그의 DNA가 전체 액솜서열분석 (whole exome sequencing: WES) 수행에 사용된 개체를 나타낸다. 두 SBF1 돌연변이의 대립유전자는 각 조사된 구성원 아래에 나타내었다. 괄호 안의 대립 유전자는 추론한 것이다.
도 2는 환자(III-8, 52세)의 사진으로, 이 환자는 43세에 휠체어를 타야했고, 하퇴와 손 근육의 위축이 현저하였다.
도 3은 FC478 CMT4B 가계에 대한 SBF1 유전자 돌연변이의 서열분석 크로마토그램이다. 수직 방향 화살표(↓)는 돌연변이 위치를 나타내고 있다.
도 4는 서로 다른 종들(NP_002963.2 Homo sapiens; NP_001164032.1 Mus musculus; NP_001258102.1 Rattus norvegicus; DAA28984.1 Bos taurus; XP_003780432.1 Pongo abelii; XP_003461615.1 Cavia porcellus; EHB03481.1 Heterocephalus glaber; XP_001914946.2 Equus caballus; 및 NP_001038623.1 Danio rerio) 간 SBF1 단백질의 아미노산 서열 보존 분석 결과를 나타낸 것으로, MEGA5 ver. 5.05 프로그램을 사용하여 분석하였다. 다른 종들에서도 양 돌연변이 위치와 이들에 인접하는 서열은 잘 보존되었다.
도 5는 원위성 비복 신경(distal sural nerve)에서의 SBF1 발현 정도를 나타내고 있다. 2명의 건강한 대조군(F/37 및 F/38)의 원위성 비복 신경 생체검사로부터 추출한 폴리A RNA를 사용하여 RNA 서열분석을 하였다. cDNA 라이브러리는 TruSeq RNA 라이브러리 키트를 사용하여 제조하였으며, 쌍을 이룬 말단 서열분석은 HiSeq2000 게놈 분석기(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 행하였다.
도 6은 T1-가중 관상면(A, G 및 M) 과 축면(B-F, H-L 및 N-R)으로 나타낸 발병한 3명의 개체(III-7, A-F; III-9, G-L; III-8, M-R)의 엉덩이, 대퇴부 및 하지 MRI이다. 흰색 화살표와 화살촉(△)은 각각 대퇴근막 장근과 소전근을 나타낸다. 대퇴부 수준에서, 검정색 화살표는 후방 구획을 나타내고, 검정색 화살촉(▲)은 전방 구획을 나타낸다.(A-C) 57세 여성 환자(III-7) 는 대퇴근막 장근과 소전근에서 위축과 지방 변화를 나타내었지만, 대전근과 폐쇄근은 비교적 보존된 것으로 나타났다.(D-E) 대퇴부 수준에서의 MRI는 반힘줄근(semitendinosus muscle), 반막근(semimembranosus muscle), 및 대퇴이두 장두근(biceps femoris long head muscle)을 포함하는 후방 구획에서 위축과 지방 변화를 나타내었지만, 대퇴근(vastus muscle) 및 폐각근(adductor muscle)을 포함하는 전방 및 내측 구획은 비교적 보존되어 있었다.(F) 하퇴에서, MRI는 분산된 지방 초강력 신호 변화(diffuse fatty hyperintense signal changes)를 가진 거의 완전한 근위축을 나타내었다.(G-L) 52세 여성 환자(III-9) 는 그녀의 언니(III-7) 에 비해 지방 침윤이 더 많이 진행된 것으로 나타났다. J와 K에서, 대퇴근과 폐각근이 비교적 온전한 것은 주목할 만하다.(M-R) 54세 여성 환자(III-8) 은 엉덩이 근육에서 분산된 중증 위축과 지방 변화를 나타내었고, 대전근은 비교적 보존되어 있었다. 분산된 중증 위축과 지방 변화는 전체 하지 근육에서 관찰되었고, 대퇴부 상의 전방 구획, 특히 넓은 중간부분에서는 비교적 보존되어 있었다.
도 7은 원위성 비복 신경 생체 검사(III-7)의 조직병리학적 특성을 나타낸 것이다. (A) 반초박 횡단 절편(semi-thin transverse sections)은 자주 확인되는 미엘린 비정상과 함께 대형 수초성 섬유(myelinated fibers, MFs)는 없고 중형 및 소형 MFs는 남아있는 것을 보여주었다.(B) 히스토그램은 3 ㎛ 이하의 직경을 갖는 MFs가 총 MFs의 92.7%를 구성하는 단봉 분포 패턴을 나타내었다.(C-J) 전자 현미경 분석 결과 두꺼운 미엘린을 가진 축색돌기 클러스트와 위축 뿐 아니라 다양한 형태의 미엘린의 외부접힘과 내부접힘이 나타났다.(배율 A: 톨루이딘 블루로 염색한 반초박 횡단 절편의 흑백 전환, 원배율x1000, C: x20000, D: x30000, E: x20000, F: x20000, G: x8000, H: x15000, I: x12000, J: x25000).

본 발명에서는, SBF1 유전자에서의 특정 미스센스 돌연변이를 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환인 CMT4B3 아형의 원인이 되는 유전자 돌연변이로 제공한다.

본 발명에서는 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 상염색체 열성 가계를 대상으로 상기 복합 증상에 대한 새로운 염색체 유전자좌를 22q13.33에 지도화하였다. 이로부터 9개의 후보 유전자들에 대한 서열분석을 통해 상기 복합 증상을 나타내는 환자군에서만 특이적으로 검출되는 SBF1 유전자에서의 신규한 미스센스 돌연변이를 확인하였다. 어떠한 대조군(n=500)도 2가지 이형 돌연변이를 동시에 가지지 않았다.

상기 환자의 임상적 표현형은 이전에 보고된 CMT4B1과 CMT4B2 환자와 상당히 유사하다(Bolino A, et al., Nat Genet 2000; 25:17-19; Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356; Azzedine H, et al., Am J Hum Genet 2003;72:1141-1153). 그러나 CMT4B1과 CMT4B2는 임상적으로 동형 중증 표현형을 가지는 것으로 알려져 있고, 이들 중 일부는 생후 1년 내에 임상적 증상이 나타났지만(Baets J, et al., Brain 2011;134:2664-2676), 본 발명의 환자들의 경우 평균 발병나이가 7.7세였고, III-7 환자의 경우에는 원위성 각약증(distal leg weakness)이 11세에 처음 나타났으며, 이 환자는 57세에도 여전히 목발을 짚고 걸을 수 있는 등 임상적 표현형이 덜 심각하였다. 또한 휠체어를 타게 된 나이도 보고된 CMT4B 환자들에 비해 늦었고 CMT4B2 환자들에게 나타나는 녹내장이 본 발명의 환자들 중 누구에게도 나타나지 않았다(Bolino A, et al., Nat Genet 2000; 25:17-19; Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356; Azzedine H, et al., Am J Hum Genet 2003;72:1141-1153; Hirano R, et al., Neurology 2004;63:577-580).

CMT4B에 대한 이전 연구들이 미엘린 외부접힘과 내부접힘뿐 아니라, 부분적 탈미엘린/미엘린 재형성(segmental demyelination/remyelination)(양파구근), 미엘린형성저하(hypomyelination), 젊은 나이에 대형 MFs의 손실뿐 아니라 총 MFs의 심각한(moderate-to severe) 감소를 밝혀내었다(Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356; Othmane KB, et al., Genomics 1999;62:344-349; Kiwaki T, et al., Neurology 2000;55:392-397)). MTMR 13-결핍 쥐의 좌골신경(sciatic nerve)은 심각한 축색돌기 손실도 양파구근 형성도 나타내지 않았고 매우 드물게 재생한 축색돌기 클러스트만을 나타내었다(Robinson FL, et al., Proc Nat Acad Sci USA 2008;105:4916-4921). 본 발명의 케이스와 이전에 보고된 케이스들 모두 대형 MFs의 손실을 나타내지만, 본 발명의 케이스에서는 MF의 총 수가 57세의 나이에도 정상 한계 내(9,099/mm²)에 있었지만, 이전의 보고들에서는 젊은 나이에 총 MFs가 상당히 감소(CMT4B2 케이스의 경우 8살에 2,720/mm²)한 것으로 보여 차이가 있다.(Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356;).

엉덩이, 대퇴부, 및 하퇴(lower leg)의 MRIs는 독특한 패턴의 근육 관련을 보여주었다. SBF1 돌연변이의 MRI 특징은 일반적으로 길이의존성 신경장애 패턴(length-dependent neuropathy pattern)과 잘 일치하였다. 그러나 엉덩이의 대퇴근막 장근(tensor fascia lata muscle) 및 소전근(gluteus minimus muscle)이 대퇴부의 대퇴근(vastus muscle)그룹보다 심한 지방 침윤을 나타내고 있는 것이 두드러진 특징인데, 이는 길이의존성 가설과 일치하지 않는다. 또한, 대퇴부 수준에서, 전방과 내측 구획에 비해 후방 구획에서 선택적이고 현저하게 지방이 침윤된 것은 변별적 발견이고 다른 형태의 CMT와 구별하는데 유용할 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 신규한 CMT4B3 아형이 SBF1 유전자에서의 복합 이형 돌연변이에 의해 유발된다는 것을 확인하였다. SBF1 유전자(NM_002972.2)는 22번 염색체에 존재하고 있으며, 그 염기서열은 GenBank 등록번호: NM_002972.2 와 같다. 본 발명에서는 이 염기서열을 ATG 개시 코돈부터 시작하여 서열번호: 1 및 2로 기재하였다. SBF1은 SBF2와 전체 서열 중 59%가 동일한 1,892개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화한다(Senderek J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:349-356; Laporte J, et al., Hum Mol Genet 2003;12:R285-292). 6 kb의 SBF1 mRNA는 정소를 제외하고는 검사한 모든 조직에서 발견되었다(Laporte J, et al., Hum Mol Genet 1998;7:1703-1712).

본 발명에 따르면, 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 환자군에서 특이적으로 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌(c.4768A>G)으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌(c.1249A>G)으로 치환된 SBF1 유전자에서의 미스센스 돌연변이가 확인되었다.

상기 돌연변이를 포함하는 SBF1 유전자로부터 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질은 서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌(Thr1590Ala)으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산인 메티오닌이 발린(Met417Val)으로 치환된 돌연변이를 포함한다.

본 발명에서는 SBF1 유전자에서 c.4768A>G 및 c.12249A>G 돌연변이가 다음과 같은 이유로 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3 아형의 유전성 신경질환에 대한 원인 유전자인 것으로 판단한다: (1) 가계 내 발병한 구성원에서 상기 돌연변이가 환자와 공동분리(cosegregation)되고, (2) 대조군 500명의 염색체에서 상기 돌연변이가 검출되지 않으며, (3) 이종 간에도 돌연변이 부위의 아미노산이 잘 보존됨.

본 발명에서는 염색체 22q13.33 근처에 위치하는 SBF1에서의 돌연변이를 포함하여, APOB, MUC4, TACC2 및 KRTAP1-1을 비롯한 부가적인 후보 유전자들의 서열을 분석하였지만, 다른 유전자에서는 유전적 원인이 될 돌연변이를 발견하지 못하였다.

결론적으로, 본 발명에서 새롭게 동정된 말초신경장애, 근육병 및 감각신경 손실의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환 CMT4B3의 원인이 되는 돌연변이는 다음과 같다:

SBF1 c.4768A>G: SBF1 유전자의 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 돌연변이; 및

상기 돌연변이 유전자로부터 암호화된 서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산인 메티오닌이 발린으로 치환된 돌연변이.

따라서, 본 발명은 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환 CMT4B3의 진단 마커로서 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 SBF1 돌연변이 유전자 및 상기 SBF1 돌연변이 유전자로부터 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 단백질은 서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산 잔기인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산 잔기인 메티오닌이 발린으로 치환된 것이다.

본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자 및/또는 이로부터 코딩되는 SBF1 돌연변이 단백질은 말초신경장애, 근육병 및 감각신경 손실의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3 아형의 유전성 신경질환의 발병 여부를 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명에 따른 진단 마커로서 SBF1 돌연변이 유전자는, 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상 증상을 나타내는 환자군에서만 검출되고 정상 대조군에서는 검출될 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 따라서 본 발명의 유의성 있는 진단 마커로서 SBF1 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

발명의 다른 양태로서 본 발명은 개체 시료로부터 SBF1 돌연변이 유전자 또는 그로부터 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 존재 여부를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3의 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 진단용 조성물에서, SBF1 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하기 위한 제제는 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 것을 검출할 수 있도록 고안된 프라이머 또는 탐침(probe)일 수 있다. SBF1 유전자의 염기서열을 바탕으로 하여 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭시키는 프라이머 또는 탐침을 고안할 수 있다. SBF1 유전자의 염기서열이 이미 당해 분야에 공지된 상태이고 (GenBank 등록번호: NM_002972,2), 상기 염기서열에서 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 진단 마커로 사용되는 돌연변이 부위가 본 발명에 의해 규명되었으므로, 당업자는 상기 염기서열을 바탕으로 SBF1 돌연변이 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 탐침을 용이하게 고안할 수 있다.

상기 프라이머는 적절한 완충액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 중합효소 또는 역전사 효소와 같은 중합체) 및 적절한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30개 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서 더 낮은 온도를 요구한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명에서는 SBF1 돌연변이 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 PCR 생성물의 증폭 여부를 통해 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

본 발명에 적합한 프라이머는 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적인, 즉 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 것을 검출할 수 있도록 고안된 프라이머로, 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 갖는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

상기 탐침은 올리고뉴클레오티드 탐침, 단일가닥 DNA 탐침, 이중가닥 DNA 탐침, RNA 탐침 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 SBF1 돌연변이 유전자에 대해 상보적인 탐침을 이용하여 혼성화를 실시한 후, 혼성화 여부를 통해 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다. 적당한 탐침의 선택 및 혼성화 조건은 당해 분야에 공지된 것을 기초로 적절히 변형할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 또는 탐침은 포스포라미디트 고체 지지체 방법을 비롯하여 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 방법을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 진단용 조성물은 SBF1 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있고, 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 것을 검출할 수 있도록 고안된 프라이머 쌍을 포함한다.

개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자의 존재는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 여부를 측정함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 발현 측정"이란 개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블로팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "단백질 발현 측정"이란 개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자로부터 발현된 SBF1 돌연변이 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블로팅(Western blotting), 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사선 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation Assay), 보체고정분석(Complement fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "항체"는 당해 분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서 항체는 SBF1 돌연변이 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻은 후, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 펩티드 단편도 포함된다. 본 발명의 항체는 그 형태가 특별히 제한되지 않으며, 다중클론항체, 단일클론항체 또는 항원결합성을 갖는 것이라면 그 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다.

본 발명에 의해 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환 CMT4B3의 진단 마커로서 SBF1 유전자의 특정 돌연변위 부위가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 제조하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다.

다중클론항체는 상기한 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물종 숙주로부터 제조할 수 있다.

단일클론항체는 당해 분야에서 널리 공지된 하이브리도마법(hybridoma method)(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson, et al., Nature 352: 624-628, 1991; Marks, et al., J Mol Bio 222(58): I-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab') F(ab')₂, Fv 등이 있다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, CMT4B3의 발병을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 검사 대상에게서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 발현 또는 상기 유전자로부터 코딩된 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하여, 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌(c.4768A>G)으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌(c.1249A>G)으로 치환된 SBF1 돌연변이 유전자, 및/또는 서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌(Thr1590Ala)으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산인 메티오닌이 발린(Met417Val)으로 치환된 SBF1 돌연변이 단백질을 확인함으로써 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

본 발명의 키트에는 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 발현을 검출할 수 있는 프라이머 또는 탐침 및/또는 상기 유전자로부터 코딩된 SBF1 돌연변이 단백질을 선택적으로 인지하는 항체가 포함되고, 이에 추가하여 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 발현을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 시험관 또는 다른 적절한 용기, 반응완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자를 포함하는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 탐침을 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자의 염기서열에 특이적인 탐침을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하여 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자에 대한 탐침을 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, DNA 마이크로어레이는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 압전(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 본 발명에 따른 진단 마커인 탐침을 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출을 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 기재로는 니트로셀룰로스 막, 폴리비닐수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatese) 등이 사용될 수 있다. 또한 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS{2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)}, OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 검사 대상에게서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 발현 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 SBF1 돌연변이 단백질의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, CMT4B3의 발병을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 정보를 제공하는 방법은,

(1) 개체 시료로부터 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현을 검출하는 단계; 및

(2) 개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현이 검출된 경우, 이 개체가 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3 아형의 유전성 신경질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체 시료"란 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

mRNA 발현을 측정하기위한 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블로팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 분석방법을 통하여 대상 질환의 발병이 의심되는 개체에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 발현을 측정할 수 있고, mRNA 발현의 검출 여부를 판단하여 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다. mRNA 발현은, 바람직하게는 진단 마커로 사용되는 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 역전사효소 중합반응 또는 상기 유전자에 특이적인 탐침을 사용하는 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 측정할 수 있다.

구체적인 일례로서, 진단 마커로 사용되는 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 역전사효소 중합반응을 수행한 후 생성물을 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 돌연변이 유전자의 mRNA 발현을 측정하고, 그로부터 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA 마이크로어레이 칩은 상기 SBF1 돌연변이 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 등의 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 개체 시료로부터 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부에 형광물질이 표지된 cDNA 탐침을 만들어 DNA 칩에 혼성화시킴으로써 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

구체적으로, DNA 마이크로 어레이 칩을 이용한 분석방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

(1) 개체 시료로부터 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA를 분리하는 단계;

(2) 상기 mRNA를 cDNA로 합성하면서 형광물질로 표지하는 단계;

(3) 상기 형광물질로 표지된 cDNA를 SBF1 돌연변이 유전자에 대한 탐침이 고정된 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화하는 단계; 및

(4) 상기 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하여 개체 시료에서의 SBF1 돌연변이 유전자의 발현을 검출하는 단계.

상기 분석방법에 적합한 형광물질로 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 등을 사용할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 DNA 마이크로어레이 칩은 36k Human V4.0 OpArray 올리고마이크로어레이(Operon, Germany) 또는 전체 인간 게놈 올리고마이크로어레이(Whole human genome oligomicroarray, Agilent, USA) 등을 사용할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

단백질 발현을 측정하기 위한 분석방법으로는, 웨스턴 블로팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 분석방법을 통하여 대상 질환의 발병이 의심되는 개체에서 항원-항체 복합체의 형성량을 검출할 수 있고, SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현 여부를 판단하여 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 표지의 신호강도를 통해서만 정량적으로 측정할 수 있다.

단백질 발현은 예를 들면 ELISA를 이용하여 측정할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

또한 상기 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인함으로써 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

또한 상기 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직화학염색을 실시할 수 있다. 개체로부터 채취한 조직을 고정시킨 후 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 만든다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙여 조직 절편 슬라이드를 만든 후, 여기에 본 발명에 따른 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 공지의 방법에 따라 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하여 제거하고, 면역반응을 관찰하기 위한 발색시약으로 반응시켜 상기 단백질의 발현을 현미경 하에서 관찰함으로써 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

또한 상기 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인함으로써 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 유전성 신경질환의 발병 가능성을 진단할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: SBF1 유전자의 이형 돌연변이의 동정

<1-1> 대상 환자군

본 발명에 따른 연구에는 한국 수초결손형 CMT 가계의 구성원 총 14명(3명의 환자 및 11명의 비환자)(가계 ID: FC478, 도 1) 및 아무런 임상적 특징이 없는 500명의 건강한 대조군이 포함되었다. CMT 표현형은 상염색체 열성 형태로 유전되는 것으로 보이는데, 이는 6명의 형제 자매 중 3명이 발병하였으나 그들의 부모는 발병하지 않았기 때문이다. 그리고 가족의 가까운 친척들로부터 다른 환자는 확인되지 않았다. 이화여자대학교 목동병원의 생명윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았다.

<1-2> CMT 유전자를 위한 DNA 준비 및 사전 스크리닝

퀴아앰프 혈액 DNA 정제 키트(QIAamp Blood DNA purification kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 혈액 시료로부터 DNA를 정제하였다. 환자 시료는 헥사플렉스 미소부수체(hexaplex microsatellite) PC 을 이용하여 수초결손형 CMT의 주된 유전적 요인으로 알려진 17p12 중복여부를 사전 스크리닝하였다(Choi B-k, et al., Mol Cells 2007;23:39-48). MPZ, PMP22, GJB1, MFN2 및 GDAP1을 포함하는 주된 CMT 관련 유전자의 코딩 엑손(coding exon)들에 대하여 서열을 확인하였다.

<1-3> 엑솜 및 전사체 서열 분석

엑솜(exome) 및 전사체(transcriptome) 서열 분석은 Lee et al. 의 방식{Lee S-S et al., Arch Neurol 2012(in press)}에 의해 실시하였으며, WES는 FC478 가계의 6개 시료(발병한 3개 시료: III-7, -8, 및 -9; 발병하지 않은 3개 시료: II-3, III-5 및 -11)에 대해 행해졌다. 2 명의 건강한 대조군을 원위성 비복 신경 생체검사하여 추출된 폴리A RNA를 이용하여 전사체 서열 분석을 하였다. UCSC 어셈블리 hg19를 기준 서열로 사용하였으며, ≥20 SNP 점수를 가진 것들을 변이체로 판단하였다.

<1-4> 원인 돌연변이의 선별 및 확인

WES 데이터로부터 기능적으로 중요한 변이체들을 먼저 선택한 후, 50개 이상의 CMT 관련 유전자로부터 변이체들을 선택하였다. CMT 유전자에서 원인 돌연변이가 검출되지 않는 경우에는, dbSNP135(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 1000 게놈 프로젝트 데이터베이스(Genome project database)(1000G, http://www.1000genomes.org/) 에 등록된 흔한 변이체들은 배제하였다. 동형 또는 복합 이형 돌연변이를 선택하고, 이들에 대하여 공동분리 또는 공동분리의 결여를 확인하였다. 원인 변이체가 될 수 있는 변이체들을 자동 유전자 분석기 ABI3130XL(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 생어(Sanger) 서열분석법으로 확인하였다. 발병한 사람들과 공동분리되고 300개 이상의 대조군 시료에서 검출되지 않는 돌연변이를 잠재적인 원인인 것으로 결정하였다.MEGA5 ver 5.05 프로그램을 사용하여 단백질 서열의 보존 분석을 하였다.

그 결과, WES 데이터의 평균 총 서열분석 양은 약 10.47 Gbp/시료이고, 표적 엑손 영역(≥10X)의 커버율(coverage rate)은 91.72%였다. 시료 당 관찰된 변이체들의 평균적인 수는 81,806 SNPs 와 8,383 삽입-결실(indel)이었다. 그 중에서 기능적으로 중요한 변이체는 시료 당 9856.8개로 나타났다. FC478 CMT4B 가계에서 전체 엑솜 서열분석한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

엑솜 데이터를 선별하기 위하여 먼저 dbSNP135 및 1000G를 사용하였다. 상기 dbSNP135 및 1000G에서의 흔하지 않으면서 기능적으로 중요한 SNVs로부터, 114개의 변이체가 세 명의 발병 환자들에서 일치하게 관찰되었다. 그 중, 9개의 SNVs는 동형(homozygous)이고, 다른 5개의 SNV 쌍은 복합 이형(compound heterozygous)이었다. FC478 CMT4 가계의 3명의 발병한 구성원에서 동시에 관찰되는 기능적으로 중요한 변이체를 하기 표 2에 나타내었다.

선별된 SNVs를 3명의 발병하지 않은 사람들의 엑솜 데이터와 비교하였을 때, 다음과 같은 2쌍의 복합 이형만이 열성 형태로 제대로 공동 분리되었다: MUC4에서 [c.8055T>G(His2685Gln)]+[c.8141A>C(Tyr2714Ser)] 및 SBF1에서 [c.1249A>G(Met417Val)]+[c.4768A>G(Thr1590Ala)]. 대조군 연구를 통해 MUC4 돌연변이는 잠재적 원인에서 제외될 수 있는데, 이는 두 MUC4 SNVs 모두 대한민국 국민에 있어 흔한 다형성(polymorphisms)으로 확인되었기 때문이다(대립유전자 빈도가 c.8055T>G의 경우 0.472이고 c.8141A>C의 경우 0.650). 그렇지만 c.1249A>G 돌연변이만을 나타낸 대조군 시료는 1명 있었지만 c.4768A>G 돌연변이는 어떤 대조군에서도 관찰되지 않았으므로, 어떤 대조군(n=500)도 두 SBF1 돌연변이를 동시에 나타내지는 않았다. 검사받은 각 사람들에 대한 두 SBF1 돌연변이의 대립유전자를 도 1에 나타내었다. 모세관 DNA 서열분석 결과는 양 돌연변이들이 각 부모(어머니로부터 Met417Val, 및 아버지로부터 Thr1590Ala)로부터 전달된 것임을 나타낸다(도 3 참조). 다른 종들 사이에서 양 돌연변이 부위는 매우 잘 보존되는 것으로 나타났다(도 4 참조). RNA 서열분석 데이터는 원위성 비복 신경에서 SBF1 발현 수준이 SBF2(2.4배) 및 MTMR2(2.1배) 에 비해 비교적 높은 수준이라는 보여준다(도 5 참조).

또한 CMT-관련 유전자에서 몇몇 기능적으로 중요한 변이체를 확인하였으나(하기 표 3 참조), 가족의 상염색체 열성 유전에 해당하는 것은 없는 것으로 나타났다. 또한 대다수의 변이체는 대조군에서도 관찰되었다. 17p12 중복도 엑솜 서열분석 전 사전테스트에서 배제되었다.

실시예 2. 임상 평가

환자의 운동 및 감각 신경 장애, 심부반사(deep tendon reflexes) 및 근위축(muscle atrophy) 을 검사하였다. 굴근(flexor muscle) 및 신근(extensor muscle)의 세기는 의학연구심의위원회(medical research council, MRC) 척도를 이용하여 수동으로 평가하였다. 물리적 장애는 다음과 같은 2가지 다른 척도를 이용하여 평가하였다: 기능적 장애 척도(functional disability scale, FDS) 및 CMT 신경장애 점수(CMT neuropathy score, CMTNS). 모든 환자들에 대해 시각적 유발 전위 검사(visual evoked potential test), 팽창 안저 검사(dilated fundus examinations) 및 자동 시야검사(automated visual field test)를 포함하는 안과 검사를 행하였다.

임상 분석 결과는 하기 표 4와 같다.

^a 상지에서 근육의 약한 정도: + = 고유 손 약하기(intrinsic hand weakness)가 MRC 척도에서 4/5; ++ = 고유 손 약하기 <4/5; +++ = 근위 약하고 휠체어 의존. 하지에서 근육의 약한 정도: + = 발목 배굴곡(ankle dorsiflextion)이 MRC 척도에서 4/5; ++ = 발목 배굴곡 <4/5; +++ = 근위 약하고 휠체어 의존

^b U<L ; 하지근 우세 위축증

^c P = 통각(pain sence); V = 진동각(vibration sence)

^d 기능적 장애 척도(5= 목발을 짚고 걸음; 6= 보행기를 짚고 걸음; 7= 휠체어에 탐)

^e 크레아틴키나제(Creatin kinase): 당 실험실에서 정상범위 <185 IU/l

발병한 나이의 범위는 5세부터 11세였다. 3 경우 모두에서, 초기 운동 마일스톤이 상당히 지체되지는 않았다. 이들의 지능은 정상이었고, 임상적으로 신경이 확대되었는지는 명확하지 않았다. 이들은 다리가 점점 약해지고 걷는 게 어려워졌다; III-8과 III-9는 각각 43세와 45세부터 휠체어를 탔다. 그러나 III-7은 57세에 목발을 짚고 걸을 수 있었다(도 2 참조). 이들 모두에서 상지와 하지의 근위 및 원위 근육이 위축되고 약해진 것으로 관찰되었는데, 하퇴와 본질적 손 근육에서 가장 두드러졌다. 진동각과 위치각(position sence)이 통각과 온도각(temperature sence)에 비해 더 심하게 교란되었다. 상기 질환의 초기 단계에서 무반사증(Areflexia)이 알려졌지만, 병적반사는 보이지 않았다. 발병한 모든 환자에게서 평발이 발견되었지만, 녹내장은 관찰되지 않았다. 계보발단자의 엄마와 다른 친척들은 세심한 임상적 및 전기생리학적 검사 결과 정상인 것으로 입증되었다. 취합된 이력을 근거로 할 때, 계보발단자의 고인이 된 아버지(II-2)도 CMT 증상이 없었다.

실시예 3. 전기생리학적 검사

표면 전극을 이용하여 신경 전도 검사를 수행하였다. 각각 단모지외전근(abductor pollicis brevis) 및 외전근(adductor digiti quinti)에 대한 복합 근육 활동 전위(compound muscle action potentials, CMAPs) 를 기록하면서 팔꿈치와 손목에 자극을 가함으로써 정중 신경(median nerve) 및 척골 신경(ulnar nerve)의 운동 신경 전도 속도(motor nerve conduction velocities, MNCVs)를 확인하였다. 동일한 방식으로, 비골 신경(peroneal nerve) 및 경골 신경(tibial nerve)의 MNCVs 및 CMAPs를 확인하였다. 감각 신경 전도 속도(sensory nerve conduction velocities, SNCVs) 및 활동 전위(SNAPs) 는 정중 신경 및 척골 신경으로부터 손가락-손목 부분에 대하여 얻었다. 근위 및 원위 팔 근육 모두에서 전극 근전도검사(electromyography, EMG)를 하였다.

그 결과, 모든 환자에 있어 정중 및 척골 MNCVs 값이 38 m/s 이하인 것으로 나타났다(하기 표 5 참조).

환자 III-9의 척골 신경 CMAP 값을 제외하고, 정중 신경 및 척골 신경의 CMAPs 값이 정상 범위 아래였다. 경골 및 비골 CMAPs 는 밝혀내지 못했으며, 정중 신경, 척골 신경 및 비복 신경의 SNAPs도 값을 나타내지 못하였다. 바늘 EMG는 연축 전위(fibrillation potential) 및 신경성 운동 단위 활동 전위(neurogenic motor unit action potential)를 보여주었다.

실시예 4. 하지 MRI 촬영

1.5-T 시스템(Siemens Vision, Siemens, Germany)을 사용하여 세 환자들(III-7, -8, 및 -9)에 대하여 엉덩이, 대퇴부 및 하퇴의 MRI 촬영을 하였다. 축면 [시계(field of view, FOV) 24-32cm, 슬라이스 두께 10mm, 및 슬라이스 갭 0.5-1.0mm] 및 관상면 [FOV 38-40cm, 슬라이스 두께 4-5mm, 및 슬라이스 갭 0.5-1.0mm] 에서 하퇴 영상을 얻었다. 다음의 프로토콜이 모든 환자의 MRI 촬영에서 사용되었다: T1-가중 스핀에코[T1-weighted spin-echo(SE)(TR/TE 570-650/14-20, 512 매트릭스)], T2-가중 SE(TR/TE 2800-4000/96-99, 512 매트릭스), 및 지방-억제T2-가중 SE(TR/TE 3090-4900/85-99, 512 매트릭스).

그 결과, T1-가중 영상은 대퇴부 및 엉덩이 근육과 비교했을 때 하퇴 근육에서 현저한 지방 대체와 위축증을 나타내었으며, 이는 길이의존성 신경장애이론와 일치하는 것이었다(도 6 참조). 그러나, 엉덩이의 대퇴근막 장근 및 소전근은 발병 초기 단계에 관여하지만, 대둔근(gluteus maximus muscle) 및 폐쇄근(obturator muscle)은 후기 단계가 될 때까지 관여하지 않았다(도 6의 A-C, G-I, 및 M-O 참조). 대퇴부 수준에서, 반힘줄근, 반막근, 및 대퇴이두 장두근을 포함하는 후방 구획은 선택적이고 현저하게 관련되었지만; 대퇴근 및 폐각근을 포함하는 전방 및 내측 구획은 비교적 보존되어 있었다(도 6의 D, E, J, K, P, 및 Q 참조). 하퇴 MRI 영상은 분산된 지방 초강력 신호 변화를 가진 거의 완전한 근위축증을 나타내었다(도 6의 F, L, 및 R).

실시예 5. 조직병리학적 검사

57세의 환자(III-7)의 원위성 비복 신경을 생체 검사하였다. 컴퓨터지원형 영상 분석기(AnalySIS, Germany)를 이용하여 반초박 횡단 절편으로부터 미엘린화 섬유(myelinated fibers, MFs)의 밀도, 축색돌기 직경, 미엘린 두께를 확인하였다. 초박 절단 시료(60-65nm)를 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 시트르산 납(lead citrate)으로 조영하여 전자현미경 조사를 하였다(H-7650, Hitachi, Japan).

환자(III-7)의 비복 신경의 반초박 횡단 절편을 생체 검사한 결과 대형 MFs는 없고 중형 및 소형 MFs(9,099/㎟)는 남아 있으면서 미엘린 비정상이 빈번하고 때때로 재생한 축색돌기 클러스터가 나타났다(도 7의 A 참조).

MF 직경 범위와 평균값은 각각 0.7-4.7 ㎛ 및 1.9 ㎛로 나타났다(45세 여성의 원위성 비복 신경 길이의 정상 범위는 각각 1.8-14.8 ㎛ 및 5.2 ㎛이다) . 히스토그램에서 MF 직경은 3 ㎛ 이하는 MFs의 92.7 %, 6 ㎛ 이하는 MFs의 100 %를 구성하는 단봉형태로 나타났다(도 7의 B 참조). MF% 영역은 2.9%였다(45세 여성의 정상 비복 신경: 26.9%). g-비율(g-ratio)(축색돌기 직경/MF 직경)의 범위와 평균은 각각 0.2-0.8 및 0.6ㅁ0.1이었다(21-50세의 평균 g-비율: 0.7). g-비율이 0.7 이상인 경우(비정상적으로 얇은 미엘린)가 MFs의 9.0%를 구성하고, g-비율이 0.4 이하인 경우(비정상적으로 두꺼운 미엘린)가 MFs의 0.8%를 구성하였다.

전자현미경 검사 결과 많은 MFs가 비정상적 미엘린 형태학(미엘린의 외부접힘과 내부접힘을 가진 대규모의 불필요한 미엘린 루프)을 나타냈고, 양파 구근 형태를 가진 MFs도 드물게 보였다(도 7의 C 내지 J 참조). 또한, 재생되는 클러스터(2 또는 그 이상의 납작해진 슈반 세포 과정에 의해 둘러싸인 2 이상의 인접한 미엘린화된 축색돌기로 이루어짐) 및 두꺼운 미엘린화된 축색돌기(축색돌기 위축을 암시함)가 때때로 관찰되었다(도 7의 G 내지 J 참조).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단 마커로서 서열번호: 1로 기재되는 염기서열에서 4768번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환되고 서열번호: 2로 기재되는 염기서열에서 1249번째 염기인 아데닌이 구아닌으로 치환된 SBF1 돌연변이 유전자.
CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단 마커로서 제1항에 따른 SBF1 돌연변이 유전자로부터 암호화되는 SBF1 돌연변이 단백질.
제2항에 있어서,
서열번호: 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 1590번째 아미노산 잔기인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열에서 417번째 아미노산 잔기인 메티오닌이 발린으로 치환된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 Sbf1 돌연변이 단백질.
개체 시료로부터 제1항에 따른 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단용 조성물.
제4항에 있어서,
mRNA 발현을 검출할 수 있는 제제가 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 탐침인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제4항에 있어서,
단백질의 발현을 검출할 수 있는 제제가 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 진단용 키트.
제7항에 있어서,
키트가 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
하기 단계를 포함하는, CMT 말초신경병증의 CMT4B3 아형에 대한 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법:
(1) 개체 시료로부터 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현을 검출하는 단계; 및
(2) 개체 시료에서 SBF1 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 Sbf1 돌연변이 단백질의 발현이 검출된 경우, 이 개체가 말초신경장애, 근육병 및 감각기능 손상의 복합 증상을 나타내는 CMT4B3 아형의 유전성 신경질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.
제9항에 있어서,
단계(1)에서 mRNA 발현이 SBF1 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 탐침을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
단계(1)에서 mRNA 발현이 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블로팅 및 DNA 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
단계(1)에서 단백질 발현이 SBF1 돌연변이 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,
단계(1)에서 단백질 발현이 웨스턴 블로팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.