JP2010532989A - 神経変性疾患におけるcd44スプライスバリアント - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
死後のAD患者および正常対照から単離した凍結した海馬試料から全RNAを抽出した(EZ RNAキット、Beit Haemek)。次いでRNAを半定量的RT−PCR分析で使用した。まず、RNAを逆転写反応(RT)に供した。逆転写を、5UのSuperscript II逆転写酵素(インビトロジェン)を用いて行った。反応混合物を、42℃で1時間インキュベーションした。200μM dNTPs、1.25U Thermoprime Plus DNAポリメラーゼ(エービージーン(ABgene))および0.5mM プライマー:
V3_F:5’−TGACCACACAAAACAGAACCA−3’
C6_R:5’−CCCATGTGAGTGTCCATCTG−3’
C5_F:5’−GAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC−3’
V6_R:5’−GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG−3’
C5V10_F:5’−GACAGAATCCCTGCTACCAATAGG−3’
V10C6_R:5’−GGAATGTGTCTTGGTCTCCTGAT−3’
を含む20μlの反応体積で、1μlのRT反応液を用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中でPCR工程を行った。
EZ RNAキット(Beit Haemek)を用いて、死後のAD患者(n=10)および正常対照(n=10)から単離した凍結した海馬の試料から、全RNAを抽出した。全RNA濃度は、nanodrop 1000装置(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific))を用いて測定した。製造業者の指示に従ってBioscript逆転写酵素(バイオライン(Bioline))を用いて、各試料からの1.5μgのRNAを逆転写した。当該反応混合物を42℃で1時間インキュベーションした。Platinum SYBR Green qPCR SuperMix−UDG(インビトロジェン)試薬を、500nM プライマーとともに、qPCRのために用いた。qPCR反応の線形性を確実にするためおよび当該Ct実験値を相対的な発現値に変換するために、標準曲線を、プライマーの各対に対して、(cDNAプールの6つの濃度(二重)に対して)行った。リアルタイムPCRサイクルプログラムは以下のとおりである:50℃、2分間、95℃、2分間、次いで95℃ 15秒間および60℃ 34秒間を40サイクル。全てのqPCR反応を、アプライドバイオシステムズ 7500 リアルタイムPCRシステム(ABI)で行った。
AD様病理におけるCD44V7変異体の発現を特徴付けるために、マウスのThy−1プロモーターの調節下でロンドン(V717I)およびスウェーデン(K670M/N671L)変異(両変異は家族性のADと関連することが見出された)を含むヒトAPP751を発現するhAPPマウスを使用した。当該APP751マウスは、4〜6月齢で新皮質および海馬にアミロイド斑を発生し、6ヶ月で始まる記憶欠損を示す。7〜7.5月齢の雌のAPP751遺伝子導入マウスおよび遺伝子導入していない同腹仔から海馬組織を単離した。EZ−RNA(Beit Haemek)を使用して、RNAを抽出した。5UのSuperscript II逆転写酵素(インビトロジェン)を用いて、等量の全RNAをcDNAへと逆転写した。当該反応混合物を42℃で1時間インキュベーションした。200μM dNTPs、1.25U Thermoprime plus DNAポリメラーゼ(ラローバ(Larova))および0.5μMの、下記の一覧からのオリゴヌクレオチド、
C3F:5’−TCTGTGCAGCAAACAACACA
C6R:5’−CCCATGTGAGTGTCCATCTG
V7F:5’−TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG
アクチンF:5’−CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG
アクチンR:5’−CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT
を含む20μlの反応体積で、1μlのRTを用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的PCR工程を行った。当該PCRのための工程サイクルプログラムは、42サイクル(CD44V7について)、32サイクル(CD44S増幅について)または25サイクル(基準遺伝子として使用したβ−アクチンについて)に対して、94℃で30秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリングおよび72℃で30秒間の伸張を含んでいた。アガロースゲル上で流したPCR生成物のバンド強度を、TotalLabソフトウェアを用いて数量化した。非遺伝子導入マウスと比べて、APP751マウスでは、V7−C10接合部を有する転写物を含むmRNAの発現の7.2倍の増加が認められた。CD44Sの16%の増加を、類似の条件下で認めた。
組織を、Human Brain and Spinal Fluid Resource Centre(米国、カリフォルニア州)から得た。ALS患者および年齢および性別を合致させた正常対照の腰髄および運動皮質からRNAを抽出した。当該RNAを、実施例1で詳述したとおりの半定量的RT−PCR反応で用いた。ALS患者および正常対照の運動皮質および腰髄から得たRNA試料に対して行った半定量的RT−PCRの結果を表3に提示する。表3の左カラムは、配列決定により確認したバリアントエクソンの同一性および定常エクソンへの連結ブリッジを示す。当該様々なPCR生成物の発現レベルは、アガロースゲル中で認められた相対的なバンド強度によって判定した。相対的な発現のレベルは、+記号の数(1、2および3。それぞれ、弱い発現、中程度の発現、強い発現を表す)で示した。0は認められるバンドがなかったことを意味し(発現がなかったことを意味する)、NDは反応を行わなかったことを意味する。
8μmの切片を、ホルマリンで固定した、パラフィンに包埋した海馬組織(Netherland’s brain bank)から調製した。用いた一次抗体は、CD44(HCAM、ラットクローン IM7、サンタクルーズ(Santa Cruz))、CD44V3(マウスモノクローナル vff−327、エービーカム(ABcam))、CD44V6(ウサギポリクローナル、ケミコン(Chemicon))およびCD44V10(ウサギポリクローナル、ケミコン(Chemicon))に対してものであった。用いた二次抗体は、HRPに接合した関連種、ポリマー増強(Envision(登録商標)、ダコ(Dako))、基質:DABに対してものであった。陰性対照は、当該ウサギポリクローナル抗体については、当該一次抗体と同じタンパク質濃度のnon−immuneウサギ血清中のアイソタイプを合致させた血清対照であり、当該マウス抗体については複数のアイソタイプ対照(ダコ(Dako))であった。当該ラット抗体については、それは当該一次抗体と同じタンパク質濃度の合致したアイソタイプの対照であった。表4は、免疫組織化学的染色の結果をまとめる。
確立したパラメータを用いて様々なCD44変異体に対して方向付けられる様々なsiRNA分子を設計し、その配列を下記の表5に列挙した。HeLa細胞(前日に、6穴プレートに15×104細胞を播いた)に、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン RNAi Max(インビトロジェン)を用いて、10nMの最終濃度で様々なsiRNA(IDT)を用いて形質移入した。陰性対照として、細胞を形質移入しないまま残す(NT)か、または細胞を、5’末端でTYE563で標識した関連性のないsiRNA(その配列はいずれの公知のヒトmRNAに対してもまったく意味ある相同性を有しない)を用いて形質移入した(NR)。CD44V6 siRNAで形質移入した細胞は形質移入後24時間血清不足にし、さらに8時間血清更新した(serum renewal)(例えば、Chengら、Genes Dev.(2006)20:1715−20に記載されるとおり)。陽性対照として、この変異体については、Chengらが使用したsiRNA配列を基準として用いた(siRNA #2)。
C3F:5’−TCTGTGCAGCAAACAACACA
C6R:5’−CCCATGTGAGTGTCCATCTG
V3R:5’−AGCCTGCTGAGATGGTATTTGA
V6R:5’−GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG
V10R:5’−TCTTCCACCTGTGACATCATTC
アクチンF:5’−CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG
アクチンR:5’−CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT
からのオリゴヌクレオチドを含む20μlの反応体積で、1μlのRT反応液を用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的PCR工程を行った。
ニューロン由来の細胞でのCD44選択的スプライシングに関するERK経路の関与を試験するために、胚の脊髄運動ニューロンおよび神経芽細胞腫細胞の融合物に由来するマウスのNSC−34細胞を使用した。NSC−34細胞培養(前日に、6穴プレートに15×104細胞を播いた)を、未処置のまま残すか、または10μMのMEK阻害剤U0126(シグマ(Sigma))で6時間処置するかした。EZ−RNAキット(Beit Haemek)を用いて全RNAを当該細胞から単離し、等量のRNAを、5UのSuperscript II逆転写酵素(インビトロジェン)を用いてcDNAへと逆転写した。当該反応混合物を42℃で1時間インキュベーションした。200μM dNTPs、1.25U Thermoprime plus DNAポリメラーゼ(エービージーン(ABgen))および0.5μMの、以下:
C5F:5’−GAGCACCCCAGAAAGCTACATT−3
C7R:5’−CCAGAAGTTGTGGTCACTCCAC−3
V3R:5’−ATCATCAATGCCTGATCCAGA−3
V5F:5’−CCACAGCCTCCTTTCAATAACC−3
V7F:5’−TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG−3
V10F:5’−TCTGGGTATTGAAAGGTGTAGCC−3
アクチンF:5’−CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG−3
アクチンR:5’−CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT−3
のプライマーを含む20μlの反応体積で、1μlのRTを用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的PCR工程を行った。当該PCRのための工程サイクルプログラムを、42サイクル(V3、V7、V5およびV10増幅)または32サイクル(CD44S増幅)に対して、94℃で30秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリングおよび72℃で30秒間の伸張に設定した。アクチン対照PCRを、結果の正規化のために行った。図8、パネルB〜Eに見られ得るように、U0126(右レーン、「=」)によるERK経路の阻害により、CD44バリアントエクソンスプライシングの有意な減少が認められた。
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Claims (85)
- 患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法であって、前記患者の生物学的試料中の核酸の発現レベルを検出する工程を含み、前記核酸は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列を含む方法。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項1記載の方法。
- 前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項1記載の方法。
- 前記発現レベルは、前記核酸によってコードされたリボ核酸(RNA)の発現レベルの測定によって検出される請求項1記載の方法。
- 前記核酸によって発現したRNAレベルを検出する工程の前に、前記生物学的試料からRNAを単離する工程をさらに含む請求項4記載の方法。
- 前記RNAの発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR(RT−PCR)、ノーザンブロット法、リアルタイムPCR、またはそのいずれかの組み合わせによって検出される請求項4記載の方法。
- 前記RNAの発現レベルは、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出される請求項4記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)、RNA、相補的なデオキシリボ核酸(cDNA)、ゲノムDNA、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項7記載の方法。
- 配列番号1の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号1の座標1−1212と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標766−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号3の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号3の座標1−1215と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標769−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号5の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号5の座標1−1218と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標772−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号7の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号7の座標1−1290と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標844−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法であって、前記患者の生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出する工程を含み、前記ポリペプチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列からなる群から選択される方法。
- 配列番号2の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸座標1−403と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標256−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 配列番号4の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸座標1−404と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標257−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 配列番号6の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸座標1−405と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標258−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 配列番号8の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸座標1−429と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標282−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項13記載の方法。
- 前記検出する工程は、前記ポリペプチドと前記ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体との免疫複合体の検出を含む、請求項13記載の方法。
- 免疫複合体を検出する前記工程は、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項20記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項20記載の方法。
- 神経変性疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、核酸によってコードされたリボ核酸(RNA)の発現を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含み、前記核酸は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列からなる群から選択される方法。
- 配列番号1の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号1の座標1−1212と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標766−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
- 配列番号3の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号3の座標1−1215と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標769−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
- 配列番号5の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号5の座標1−1218と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標772−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
- 配列番号7の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号7の座標1−1290と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標844−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
- 前記投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含む、請求項23記載の方法。
- 前記調節は、核酸によってコードされた前記リボ核酸(RNA)の発現の減弱および/または発現の増加を含む、請求項23記載の方法。
- 前記試薬は、前記核酸とハイブリダイズできる1以上のポリヌクレオチドを含む、請求項23記載の方法。
- 前記1以上のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)、RNA、低分子干渉RNA(siRNA)、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項30記載の方法。
- 前記siRNAは、第1のポリヌクレオチド配列と相補的な第2のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされた第1のポリヌクレオチド配列を含み、前記第1のポリヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列の少なくとも15のヌクレオチドの近接するスパンである請求項31記載の方法。
- 前記試薬は小分子実体(SME)である請求項23記載の方法。
- 前記小分子実体は、ERK−MAP キナーゼ経路の修飾因子、PKC経路の修飾因子、または両方を含む、請求項33記載の方法。
- 神経変性疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、ポリペプチドの発現および/または活性を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含み、前記ポリペプチドの配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列からなる群から選択される方法。
- 配列番号2の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸座標1−403と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標256−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項35記載の方法。
- 配列番号4の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸座標1−404と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標257−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項35記載の方法。
- 配列番号6の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸座標1−405と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標258−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項35記載の方法。
- 配列番号8の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸座標1−429と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標282−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項35記載の方法。
- 前記投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含む、請求項35記載の方法。
- 前記調節は、前記ポリペプチドの発現の減弱、前記ポリペプチドの発現の増加、または両方を含む、請求項35記載の方法。
- 前記試薬は、前記ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体を含む、請求項35記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項42記載の方法。
- 単離されたポリヌクレオチド分子であって、その配列は配列番号3を含む、ポリヌクレオチド分子。
- 請求項44記載のポリヌクレオチド分子の補完物であって、前記補完物および前記ポリヌクレオチドは100%相補的である補完物。
- 請求項44記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第1のポリヌクレオチドであって、前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド座標639−825と少なくとも90%相同である近接する第1のヌクレオチド配列を含む、第1のポリヌクレオチド。
- 請求項44記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第2のポリヌクレオチドであって、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド座標639−696と少なくとも90%相同である近接する第2のヌクレオチド配列を含む、第2のポリヌクレオチド。
- 請求項44記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第3のポリヌクレオチドであって、前記第3のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド座標769−825と少なくとも90%相同である近接する第3のヌクレオチド配列を含む、第3のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド分子は配列番号4を含んでいるポリペプチドをコードする請求項44記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 請求項49記載のポリペプチド由来の第1のペプチドであって、前記第1のペプチドは、配列番号4のアミノ酸座標214−275と少なくとも90%相同である近接する第1のアミノ酸配列を含む、第1のペプチド。
- 請求項49記載のポリペプチド由来の第2のペプチドであって、前記第2のペプチドは、配列番号4のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接する第2のアミノ酸配列を含む、第2のペプチド。
- 請求項49記載のポリペプチド由来の第3のペプチドであって、前記第3のペプチドは、配列番号4のアミノ酸座標257−275と少なくとも90%相同である近接する第3のアミノ酸配列を含む、第3のペプチド。
- 前記ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で調節される請求項49記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 前記ポリペプチドは、CD44変異体である請求項49記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項49記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 単離されたポリヌクレオチド分子であって、その配列は配列番号5を含む、ポリヌクレオチド分子。
- 請求項56記載のポリヌクレオチド分子の補完物であって、前記補完物および前記ポリヌクレオチドは100%相補的である補完物。
- 請求項56記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第1のポリヌクレオチドであって、前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号5のヌクレオチド座標639−828と少なくとも90%相同である近接する第1のヌクレオチド配列を含む、第1のポリヌクレオチド。
- 請求項56記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第2のポリヌクレオチドであって、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5のヌクレオチド座標639−696と少なくとも90%相同である近接する第2のヌクレオチド配列を含む、第2のポリヌクレオチド。
- 請求項56記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第3のポリヌクレオチドであって、前記第3のポリヌクレオチドは、配列番号5のヌクレオチド座標772−828と少なくとも90%相同である近接する第3のヌクレオチド配列を含む、第3のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド分子は、配列番号6を含んでいるポリペプチドをコードしている請求項56記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 請求項61記載のポリペプチド由来の第1のペプチドであって、前記第1のペプチドは、配列番号6のアミノ酸座標214−276と少なくとも90%相同である近接する第1のアミノ酸配列を含む、第1のペプチド。
- 請求項61記載のポリペプチド由来の第2のペプチドであって、前記第2のペプチドは、配列番号6のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接する第2のアミノ酸配列を含む、第2のペプチド。
- 請求項61記載のポリペプチド由来の第3のペプチドであって、前記第3のペプチドは、配列番号6のアミノ酸座標258−276と少なくとも90%相同である近接する第3のアミノ酸配列を含む、第3のペプチド。
- 前記ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で調節される、請求項61記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 前記ポリペプチドは、CD44スプライスバリアントである請求項61記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項65記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 神経変性疾患を診断するためのキットであって、生物学的試料中の核酸の発現を検出できる少なくとも1の試薬を含み、前記核酸は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列を含むキット。
- 配列番号1の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号1の座標1−1212と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号1の座標766−822と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 配列番号3の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号3の座標1−1215と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号3の座標769−825と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 配列番号5の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号5の座標1−1218と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号5の座標772−828と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 配列番号7の少なくとも20のヌクレオチドと少なくとも90%相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号7の座標1−1290と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標639−696と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号7の座標844−900と少なくとも90%相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 前記少なくとも1の試薬は、前記核酸または前記核酸によってコードされるリボ核酸(RNA)分子とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを含む、請求項68記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項74記載のキット。
- 前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項68記載のキット。
- 神経変性疾患を診断するためのキットであって、生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出できる少なくとも1の試薬を含み、前記ポリペプチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列を含むキット。
- 配列番号2の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸座標1−403と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸座標256−274と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
- 配列番号4の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸座標1−404と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸座標257−275と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
- 配列番号6の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸座標1−405と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号6のアミノ酸座標258−276と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
- 配列番号8の少なくとも10のアミノ酸と少なくとも90%相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸座標1−429と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標214−232と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸座標282−300と少なくとも90%相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
- 前記少なくとも1の試薬は、前記ポリペプチドと特異的に相互作用し、かつ、検出可能な免疫複合体を形成するように適合された抗体を含む、請求項77記載のキット。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項83記載のキット。
- 前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項77記載のキット。
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