CN107815438A

CN107815438A - 重组细胞、筛选l型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物

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Publication number: CN107815438A
Application number: CN201710651274.0A
Authority: CN
Inventors: 刘晓冬; 刘楠
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2018-03-20

Abstract

本发明提出了重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。所述重组细胞表达：第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。本发明的重组细胞能够实现第二蛋白和第三蛋白的至少之一转移到细胞膜附近，使得其与第一蛋白在空间位置上足够靠近，从而发挥CMI作用，对α_1DS实现专一性抑制，并使抑制效果达到CMI极限水平。

Description

重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。

背景技术

L型钙通道(L-Type Calcium Channel，LTCC)是电压门控钙通道(Voltage-GatedCalciumChannel，VGCC)的重要成员，通过介导钙内流并且参与细胞电活动在多种生理活动中发挥关键的作用。在LTCC包含的四种亚型(Ca_V1.1，Ca_V1.2，Ca_V1.3和Ca_V1.4)中，Ca_V1.3广泛分布在心血管及神经系统等多种兴奋性组织中。Ca_V1.3具有独特的电生理特性，相较于其它亚型能够被域下膜电位激活，因而能够参与并调控心脏起搏、激素释放及神经元自发放电等重要生命过程。目前普遍认为表达在黑质致密部(substantia nigra parscompacta，SNc)神经元的Ca_V1.3控制自发性域下钙振荡，与帕金森疾病(Parkinson’sdisease，PD)的发生密切相关。另外，编码Ca_V1.3的基因CACNA1D产生突变会导致一系列严重的疾病，如原发性醛固酮增多症、自闭症、神经系统异常及癫痫等。

Ca_V1.3的门控特性受到通道自身碳末端(Distal carboxyl tail，DCT)和未结合钙离子的钙调蛋白(Calmodulin，CaM)的竞争调控，最终影响通道的电压门控激活特性(voltage-gatedactivation，VGA)及钙依赖失活特性(Ca²⁺-dependent inactivation，CDI)。DCT包含两个重要的区域，即远碳端调节结构域(Distal C-terminus RegulatoryDomain，DCRD)和近碳端调节结构域(Proximal C-terminus Regulatory Domain，PCRD)，携带正电荷的PCRD与携带负电荷的DCRD相互配合能够调节CaM与通道碳端的preIQ₃-IQ结构域(简称为IQ_V结构域)的结合能力，进而影响通道的活动。Ca_V1.3与其它LTCC亚型不同，可通过选择性剪接产生不同碳端的剪接变体，其中Ca_V1.3₄₂(也称为α_1DL)由外显子42编码而得，该通道携带有完整的CTM，Ca_V1.3_42a(也称为α_1DS)由外显子42a编码而得，该通道在IQ结构域后终止编码，缺失PCRD和DCRD的相应区域，因而CaM更容易与其IQ_V结构域发生预结合，该通道表现出很强的CDI和较负的激活电压。α_1DL和α_1DS两种剪接变体在大脑和心脏的多种组织内均有分布，有助于适应不同生理条件对Ca_V1.3电学活动的需求。对于维持神经元域下钙振荡及自发放电，α_1DS的贡献相较于α_1DL更为显著，因此如何有效地特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调(如钙超载等)导致的严重病变，不仅有利于维持心脑等器官的生理机能，也有助于治疗心律失常及帕金森等重大疾病。

目前可使用基于二氢吡啶类(1,4-dihydropyridines，DHPs)的LTCC传统小分子抑制剂如尼莫地平nimodipine、伊拉地平isradipine等对Ca_V1.3的活动进行抑制，这些抑制剂能够与LTCC的α₁亚基细胞膜外侧的相应受体结合，通过减少功能性通道的数量使通道钙电流(如I_peak和I₃₀₀)整体发生变化，从而导致钙内流总量的减少。由此可见，DHPs这一类药物并不影响通道内在的门控特性，阻断过程中通道的CDI强度(用参数S_Ca表示)保持不变(图1)。由于LTCC自身的DCT与CaM竞争性调节通道的激活或失活性质，因此基于两者的竞争关系理性设计并开发基因编码的抑制多肽以选择性靶向Ca_V1.3一直得到热切关注，这种方法作为不同于LTCC传统小分子抑制剂的新型抑制方法，不仅能够在生物体内实现局部高表达及高效力而且对生物体各系统的副作用小，为选择性抑制Ca_V1.3的剪接变体α_1DS提供了可能的解决途径，同时对于Ca_V1.3相关的神经退行性疾病具有治疗干预潜力。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。本发明的重组细胞能够实现第二蛋白和第三蛋白的至少之一转移到细胞膜附近，使得其与第一蛋白在空间位置上足够靠近，从而发挥CMI作用，对α_1DS实现专一性抑制，并使抑制效果达到CMI极限水平。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

文献“基于碳末端的多域协同急性抑制L型钙通道”(Cooperative and acuteinhibition bymultiple C-terminal motifs of L-type Ca²⁺channels)提出了一种抑制L型钙通道的新型方式，即碳末端介导的抑制(C-terminus mediated inhibition，CMI)。这种新型抑制方式基于L型钙通道碳末端的三个关键结构域(IQ_V结构域、PCRD和DCRD)之间的协同抑制法则，如图2所示，在其中任何两个结构域空间距离足够接近的情况下，第三个结构域可作为调控多肽使三者形成复合体，最终阻碍CaM与通道结合，进而改变通道门控特性，降低钙内流的总量。根据该法则，图3所示的方法使PCRD和DCRD分别与FRB和FKBP融合，两种融合蛋白与Ca_V1.3剪接变体α_1DS共表达在细胞中，由于小分子化学药物雷帕霉素(rapamycin)能够同时与FRB和FKBP两种蛋白结合，因此，加入雷帕霉素可诱导PCRD和DCRD两个多肽发生连接导致这两者的相对位置足够靠近，迅速抑制了α_1DS的CDI程度及钙电流瞬态峰值，但并不影响其稳态电流水平，最终实现钙内流总量的下调。

但是，PCRD和DCRD都属于小分子多肽，大约由100个氨基酸构成，与雷帕霉素结合的FRB和FKBP也大约包含100个氨基酸，由此可见这四种多肽具有同一数量级水平的空间结构。当PCRD和DCRD分别与FRB和FKBP融合后，雷帕霉素与FRB和FKBP结合形成的复合体虽然可导致PCRD和DCRD发生连接，但是该复合体的空间结构在一定程度上限制了PCRD和DCRD的极限距离，两者很难实现足够近的相对位置以协同发挥强劲的抑制效力，从图3的实验结果可以看出这种方法确实无法使α_1DS达到直接共表达融合蛋白PCRD-DCRD的抑制水平，因此现有的方法不适用于大幅度地改变α_1DS的CDI程度和钙电流瞬态峰值。

有鉴于此，为了充分利用碳末端三个关键结构域协同组合法则，发明人从碳末端三个关键结构域的位置分布出发设计并开发针对Ca_V1.3剪接体α_1DS的新型抑制方法及抑制多肽。由于功能性的α_1DS的IQ_V结构域主要分布在细胞膜附近，因此将PCRD或DCRD转移到细胞膜附近就能有效拉近PCRD与IQ_V结构域或DCRD与IQ_V结构域的空间距离，进而实现CMI对Ca_V1.3剪接变体α_1DS的抑制。基于上述设计思路，为了进行初步验证，首先发明人通过融合Ras蛋白的膜锚定序列将PCRD或DCRD稳定定位在细胞膜附近，将PCRD-CFP-Ras和DCRD-CFP-Ras分别与α_1DS共表达，如图4所示，α_1DS的CDI程度均未发生明显改变，说明即使三个关键结构域的其中两者相对位置足够靠近，但是缺少第三个结构域的协同作用，仍无法发挥CMI效应。接下来，在三个关键结构域都存在的情况下，发明人改变PCRD和DCRD的膜锚定情况，只要保证PCRD和DCRD的至少一个锚定于细胞膜附近，且当PCRD和DCRD中的一个锚定于细胞膜附近，另一个游离于细胞质内，从而有效地拉近其与IQ_V结构域的相对距离，有助于三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞表达：第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

发明人发现，第二蛋白和第三蛋白的至少一个锚定于细胞膜上，从而有效地拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域(第一至第三蛋白)协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

根据本发明的实施例，上述重组蛋白还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在所述细胞膜上。

根据本发明的实施例，所述锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一与所述锚定序列呈融合蛋白的形式。

根据本发明的实施例，所述第二蛋白、所述第三蛋白与所述锚定序列分别独立地与荧光蛋白相连，所述荧光蛋白为选自青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的至少之一。

根据本发明的实施例，所述锚定序列与第一靶序列相连，所述第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，并且所述重组细胞进一步含有中间连接蛋白，所述中间连接蛋白包括：第一结合序列，所述第一结合序列特异性地与所述第一靶序列结合；第二结合序列，所述第二结合序列特异性地与所述第二靶序列结合。

根据本发明的实施例，所述第一靶序列是如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述第二靶序列是如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选L型钙通道调节剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选试剂与前面所述的重组细胞接触；检测所述接触前后所述重组细胞的钙通道参数，所述钙通道参数的变化是所述候选试剂为所述L型钙离子通道调节剂的指示，所述钙通道参数包括CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一。候选试剂与重组细胞接触，通过检测接触前后重组细胞的钙通道参数，以便判断该候选试剂促使或者抑制第二蛋白和/或第三蛋白锚定于细胞膜上，从而确定筛选L型钙通道调节剂。

根据本发明的实施例，接触后所述钙通道的CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一降低，是所述候选试剂为所述L型钙离子通道抑制剂的指示。

在本发明的又一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗神经退行性疾病，所述试剂适于使患者的神经元细胞表达下列的至少之一：第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

根据本发明的实施例，所述神经元细胞自身表达第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白。

发明人发现，第二蛋白和第三蛋白的至少一个锚定于细胞膜上，从而有效地拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，有助于治疗神经退行性疾病。

根据本发明的实施例，所述试剂呈蛋白质或者其编码核酸的形式。

根据本发明的实施例，神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化、神经病、亨廷顿病与肌萎缩侧索硬化。

根据本发明的实施例，所述锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体。

根据本发明的实施例，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一与所述锚定序列呈融合蛋白的形式。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含选自下列的至少之一：第二蛋白或其编码核酸，所述第二蛋白含有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白或其编码核酸，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一含有锚定序列。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的伊拉地平抑制剂的阻断过程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的碳末端关键结构域的协同抑制法则；

图3显示了根据本发明一个实施例的药物诱导CMI控制α_1DS的示意图，(a)药物诱导CMI对α_1DS抑制的钙电流图，(b)药物诱导CMI对α_1DS抑制的统计结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的碳末端有效结构域单独锚定于膜上对通道门控特性的影响，(a)α_1DS与PCRD-CFP-Ras共表达组、α_1DS与DCRD-CFP-Ras共表达组的通道钙电流图例，(b)CDI程度随电压的变化示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-PCRD和YFP-DCRD共表达的示意图，(a)药物诱导PCRD转移到细胞膜附近实现CMI对α_1DS抑制的钙电流图例，(b)CDI程度随电压的变化情况；

图6显示了根据本发明一个实施例的α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-DCRD和YFP-PCRD共表达的示意图，(a)药物诱导PCRD和DCRD转移到细胞膜附近实现CMI对α_1DS抑制的钙电流图例，(b)药物诱导PCRD和DCRD转移到细胞膜附近实现CMI对α_1DS抑制的统计结果；

图7显示了根据本发明一个实施例的α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-PCRD和YFP-FKBP-DCRD共表达的示意图，(a)药物诱导PCRD和DCRD转移到细胞膜附近实现CMI对α_1DS抑制的钙电流图例，(b)药物诱导PCRD和DCRD转移到细胞膜附近实现CMI对α_1DS抑制的统计结果；以及

图8显示了根据本发明一个实施例的雷帕霉素诱导CMI对α_1DS门控特性的影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了一种重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。下面将分别对其进行详细描述。

重组细胞

在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，重组细胞表达：第一蛋白，第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

发明人发现，第二蛋白(PCRD蛋白)和第三蛋白(DCRD蛋白)的至少一个锚定于细胞膜上，从而有效地拉近其与第一蛋白(IQv)的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

需要说明的是，LTCC存在一类特殊的动力学调控过程，称为钙依赖失活调控(Calciumdependent inactivation，缩写CDI)，其调控结果会影响LTCC的进钙能力。进而，通过检测接触后钙通道的CDI程度，能够有效地确定L型钙离子通道是被激活或者被抑制。具体地，可以使用参数Sca(Sca＝1-I₅₀/I_peak)衡量通道的CDI程度，Sca值越大表示CDI越强，Sca值升高表示CDI程度升高。

SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(IQv蛋白)如下所示：

MQHQRQQQEDHANEANYARGTRLPISGEGPTSQPNSSKQTVLSWQAAIDAARQAKAAQTMSTSAPPPVGSLSQRKRQQYAKSKKQGNSSNSRPARALFCLSLNNPIRRACISIVDWKPFDIFILLAIFANCVALAIYIPFPEDDSNSTNHNLEKVEYAFLIIFTVETFLKIIAYGLLLHPNAYVRNGWNLLDFVIVIVGLFSVILEQLTKETEGGNHSSGKSGGFDVKALRAFRVLRPLRLVSSVPSLQVVLNSIIKAMVPLLHIALLVLFVIIIYAIIGLELFIGKMHKTCFFADSDIVAEEDPAPCAFSGNGRQCAANGTECRSGWVGPNGGITNFDNFAFAMLTVFQCITMEGWTDVLYWVNDAIGWEWPWVYFVSLIILGSFFVLNLVLGVLSGEFSKEREKAKARGDFQKLREKQQLEEDLKGYLDWITQAEDIDPENEEEGGEEGKRNTSMPTSETESVNTENVSGEGETQGCCGSLWCWWKRRGAAKTGPSGCRRWGQAISKSKLSRRWRRWNRFNRRRCRAAVKSVTFYWLVIVLVFLNTLTISSEHYNQPDWLTQIQDIANKVLLALFTCEMLVKMYSLGLQAYFVSLFNRFDCFVVCGGITETILVELELMSPLGVSVFRCVRLLRIFKVTRHWTSLSNLVASLLNSMKSIASLLLLLFLFIIIFSLLGMQLFGGKFNFDETQTKRSTFDNFPQALLTVFQILTGEDWNAVMYDGIMAYGGPSSSGMIVCIYFIILFICGNYILLNVFLAIAVDNLADAESLNTAQKEEAEEKERKKIARKESLENKKNNKPEVNQIANSDNKVTIDDYQEEAEDKDPYPPCDVPVGEEEEEEEEDEPEVPAGPRPRRISELNMKEKIAPIPEGSAFFILSKTNPIRVGCHKLINHHIFTNLILVFIMLSSAALAAEDPIRSHSFRNTILGYFDYAFTAIFTVEILLKMTTFGAFLHKGAFCRNYFNLLDMLVVGVSLVSFGIQSSAISVVKILRVLRVLRPLRAINRAKGLKHVVQCVFVAIRTIGNIMIVTTLLQFMFACIGVQLFKGKFYRCTDEAKSNPEECRGLFILYKDGDVDSPVVRERIWQNSDFNFDNVLSAMMVLFTVSTFEGWPALLYKAIDSNGENVGPVYNYRVEISIFFIIYIIIVAFFMMNIFVGFVIVTFQEQGEKEYKNCELDKNQRQCVEYALKARPLRRYIPKNPYQYKFWYVVNSSPFEYMMFVLIMLNTLCLAMQHYEQSKMFNDAMDILNMVFTGVFTVEMVLKVIAFKPKHYFTDAWNTFDALIVVGSVVDIAITEVNNSEESNRISITFFRLFRVMRLVKLLSRGEGIRTLLWTFIKSFQALPYVALLIAMLFFIYAVIGMQMFGKVAMRDNNQINRNNNFQTFPQAVLLLFRCATGEAWQEIMLACLPGKLCDPDSDYNPGEEYTCGSNFAIVYFISFYMLCAFLIINLFVAVIMDNFDYLTRDWSILGPHHLDEFKRIWSEYDPEAKGRIKHLDVVTLLRRIQPPLGFGKLCPHRVACKRLVAMNMPLNSDGTVMFNATLFALVRTALKIKTEGNLEQANEELRAVIKKIWKKTSMKLLDQVVPPAGDDEVTVGKFYATFLIQDYFRKFKKRKEQGLVGKYPAKNTTIALQMLERML

SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(PCRD蛋白)如下所示：

NDAAPSTSSALQAGLRSLQDLGPEMRQALTCDTEEEEEEGQEGVEEEDEKDLETNKATMVSQPSARRGSGISVSLPVGDRLPDSLSFGPSDDDRGTPTSSQPSVPQAGSNTHRRGSGALIFTIPEEGN

SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列(DCRD蛋白)如下所示：

LHVPGTHSDPSHGKRGSADSLVEAVLISEGLGLFARDPRFVALAKQEIADACRLTLDEMDNAASDLLAQGTSSLYSDEESILSRFDEEDLGDEMACVHAL

根据本发明的实施例，第二蛋白和第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在细胞膜上，以便有效地拉进第二蛋白和/或第三蛋白与第一蛋白的相对距离，三者协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

根据本发明的实施例，锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体，第二蛋白和第三蛋白的至少之一与锚定序列呈融合蛋白的形式。发明人发现，第二蛋白和/或第三蛋白与锚定序列(融合Ras蛋白)呈融合蛋白的形式，从而更加准确、牢固的将第二蛋白和/或第三蛋白锚定于细胞膜上，促使其进一步靠近第一蛋白，从而发挥CMI作用。

SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列如下所示：KLNPPDESGPGCMSCKCVLS。

根据本发明的实施例，第二蛋白、第三蛋白与锚定序列分别独立地与荧光蛋白相连，荧光蛋白为选自青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的至少之一。由此，便于观察。

根据本发明的具体实施例，荧光蛋白可以为CFP蛋白和YEP蛋白，具体氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(CFP蛋白)如下所示：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHRFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKAHFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITL

SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列(YFP蛋白)如下所示：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITL

需要说明的是，本发明对于第二蛋白/第三蛋白与锚定序列的连接方式不作严格限定，既可以使重组细胞表达中间连接蛋白，通过中间连接蛋白将第二蛋白/第三蛋白与锚定序列相连，从而起到锚定作用；也可以对重组细胞进行调节，例如加入调节剂，促使第二蛋白/第三蛋白与锚定序列相连。

根据本发明的具体实施例，针对第一种情形，锚定序列与第一靶序列相连，第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，并且重组细胞进一步含有中间连接蛋白，中间连接蛋白包括：第一结合序列，第一结合序列特异性地与第一靶序列结合；第二结合序列，第二结合序列特异性地与第二靶序列结合。在中间连接蛋白的作用下，使得第二蛋白/第三蛋白与锚定序列相连，从而锚定于细胞膜上，拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

需要说明的是，“第二蛋白和第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连”主要存在两种方式，一是第二蛋白和第三蛋白的其中一个与第二靶序列相连，通过中间连接蛋白连接于锚定序列上，从而锚定于细胞膜上，拉进其与第一蛋白的相对距离，而另一个蛋白游离于细胞质内，协同发挥作用；二是第二蛋白和第三蛋白均连有第二靶序列，均通过中间连接蛋白连接于锚定序列上，从而锚定于细胞膜上，同时拉进第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白的相对距离，协同发挥作用。

根据本发明的具体实施例，针对第二种情形，通过外加含有雷帕霉素的钙溶液，雷帕霉素可以分别与第二蛋白/第三蛋白和锚定序列相连，从而锚定于细胞膜上，拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。

根据本发明的实施例，第一靶序列是如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，第二靶序列是如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列(FRB蛋白)如下所示：

ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISK

SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列(FKBP蛋白)如下所示：

GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE

筛选L型钙通道调节剂的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选L型钙通道调节剂的方法。根据本发明的实施例，方法包括：将候选试剂与前面所述的重组细胞接触；检测接触前后重组细胞的钙通道参数，钙通道参数的变化是候选试剂为L型钙离子通道调节剂的指示，钙通道参数包括CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一。候选试剂与重组细胞接触，通过检测接触前后重组细胞的钙通道参数，以便判断该候选试剂促使或者抑制第二蛋白和/或第三蛋白锚定于细胞膜上，从而筛选L型钙通道调节剂。

根据本发明的实施例，接触后钙通道的CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一降低，是候选试剂为L型钙离子通道抑制剂的指示。由此，以便筛选出L型钙离子通道抑制剂。根据本发明的另一个实施例，接触后钙通道的CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一升高，是候选试剂为L型钙离子通道激活剂的指示。由此，以便筛选出L型钙离子通道激活剂。

试剂在制备药物中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于治疗神经退行性疾病，试剂适于使患者的神经元细胞表达下列的至少之一：第二蛋白，第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

根据本发明的实施例，神经元细胞自身表达第一蛋白，第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第一蛋白为膜蛋白。

根据本发明的实施例，试剂呈蛋白质或者其编码核酸的形式。

根据本发明的实施例，第二蛋白和第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在细胞膜上。锚定序列通过与第二蛋白或第三蛋白相连，从而将第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上，以便有效地拉进其与第一蛋白的相对距离，三者协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，有助于治疗神经退行性疾病。

根据本发明的实施例，锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体。

根据本发明的实施例，第二蛋白和第三蛋白的至少之一与锚定序列呈融合蛋白的形式。发明人发现，第二蛋白和/或第三蛋白与锚定序列呈融合蛋白的形式，从而更加准确、牢固的将第二蛋白和/或第三蛋白锚定于细胞膜上，促使其进一步靠近第一蛋白，从而发挥CMI作用。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，有助于治疗神经退行性疾病。

根据本发明的实施例，锚定序列与第一靶序列相连，第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，并且重组细胞进一步含有中间连接蛋白，中间连接蛋白包括：第一结合序列，第一结合序列特异性地与第一靶序列结合；第二结合序列，第二结合序列特异性地与第二靶序列结合。在中间连接蛋白的作用下，使得第二蛋白/第三蛋白与锚定序列相连，从而锚定于细胞膜上，拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，有助于治疗神经退行性疾病。

需要说明的是，本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防神经退行性疾病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物给予有需要的个体。

药物组合物

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，药物组合物包含选自下列的至少之一：第二蛋白或其编码核酸，第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白或其编码核酸，第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，第二蛋白和第三蛋白的至少之一含有锚定序列。给药后，第二蛋白和第三蛋白的至少一个锚定于细胞膜上，从而有效地拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，起到治疗的目的。

根据本发明的实施例，锚定序列与第一靶序列相连，第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，并且重组细胞进一步含有中间连接蛋白，中间连接蛋白包括：第一结合序列，第一结合序列特异性地与第一靶序列结合；第二结合序列，第二结合序列特异性地与第二靶序列结合。在中间连接蛋白的作用下，使得第二蛋白/第三蛋白与锚定序列相连，从而锚定于细胞膜上，拉近其与第一蛋白的相对距离，有助于这三个关键结构域协同发挥CMI作用，可明显改变α_1DS的CDI程度，且使抑制效果达到CMI极限水平。由此，通过特异性抑制α_1DS的活动能够干预细胞钙失调导致的病变，起到治疗的目的。

根据本发明的实施例，第一结合序列是如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，第二结合序列是如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

第二蛋白、第三蛋白以及中间连接蛋白，及其衍生物、片段、类似物和同系物，都可以掺入适于给药的药物组合物中。这类组合物通常包括核酸分子、蛋白质或抗体以及药物学上可接受载体。本发明使用的“药物学上可接受载体”是指与药物给药相适宜的任一及所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌及抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂等。合适载体的描述见最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，本领域一标准教科书，在此引入作为参考。这类载体或稀释剂的优选实例包括，但不限于，水、盐水、finger’s溶液、葡萄糖溶液以及5％人血清白蛋白。也可使用脂质体及无水载体如不挥发性油。除非任一常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则其在组合物中的用途都是可预期的。另外，还可在组合物中掺入辅助性活性化合物。

本发明药物组合物配制成与其给药途径相容的形式。所述给药途径的实例包括肠胃外给药，例如，静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜及直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下使用的溶液或悬液可以包括下列组分：用于注射的无菌溶剂如注射用水、盐溶液、不挥发的油、聚乙二醇、甘氨酸、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液，以及用于调节张力的溶剂如氯化钠或葡萄糖。PH可用酸或碱来调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外给药制剂可以封装入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多剂小瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散液以及用于即时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。就静脉给药而言，合适载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲液。所有情况下，所述组合物都必须无菌而且均应当为流动性达到易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下是稳定的，还必须防止微生物如细菌和真菌的污染。所述载体可以是一种溶剂或分散介质含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液态聚乙二醇等)，及其合适的混合物。保持适当的流动性可以通过，例如，使用卵磷脂等包被，在分散液情况下保持所需颗粒大小，以及使用表面活性剂来实现。防止微生物污染可以通过各种抗细菌及抗真菌的试剂来实现，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚，抗坏血酸，乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨醇，氯化钠。注射组合物的缓慢吸收可以通过在该组合物中包含一延迟吸收的试剂来实现，例如一硬脂酸铝和明胶。

无菌注射液可以通过向合适溶剂中引入需要量的活性化合物(例如，BAFF-R蛋白或抗-BAFF-R抗体)以及一种或多种上述列举成分(如需要)，然后过滤灭菌制备而成。通常，分散液的制备方法为将活性化合物引入一种含有基本分散介质以及上述列举的所需其他成分的无菌载体中。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所产生的活性成分的粉末中再加入由预先无菌过滤的溶液制得的其它的所需成分。

口服组合物通常包括一惰性溶剂或可食用载体。它们可以被包裹在明胶胶囊中或被压缩成片剂。当口服治疗给药时，可将所述活性化合物和赋形剂组合在一起，以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可用流体载体制备成漱口剂来使用，其中流体载体中的化合物可在口腔中敷涂，漱口后吐出或咽下。药物相容的粘合剂，和/或佐剂材料也可以掺入作为组合物的部分。所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有下列成分中的任一种，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如褐藻酸(alginicacid)、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)如胶状二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷油、甲基水杨酸盐或桔味矫味剂。

就吸入给药而言，所述化合物以气溶胶喷射方式从受压容器或配送器中释放出来，所述容器中含有适当的抛射剂，例如气体(如二氧化碳)，或所述化合物也可以从喷雾器中释放出来。

另外还可以通过经粘膜或经皮的方式来系统给药。就经粘膜或经皮给药而言，在制剂中使用了适合于要通透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域所已知，包括，例如，经粘膜给药时，清洁剂、胆汁酸盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可通过鼻腔喷雾或栓剂来实现。就经皮给药而言，所述的活性化合物被配制成本领域通常已知的油膏、软膏、凝胶剂、霜剂。

该化合物还可以配制成栓剂(例如，用常规的栓剂基质如可可油以及其他甘油酯)或用于直肠给药的滞留灌肠剂。

一个实施方案中，活性化合物用能够保护该化合物不被机体迅速排除的载体来配制，例如一种缓释制剂，包括输注及微胶囊释放系统。可以使用可生物降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。脂质体悬液(包括用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药物学上可接受的载体。这些制剂可以按照本领域技术人员已知的方法来配制，例如美国专利US4,522,811中所述的方法。

按剂量单位的形式配制成口服或非肠道用组合物因易于给药并能保证剂量的均一性而特别有益。本发明中使用的剂量单位是指合适用作被治疗患者单次剂量的物理分割单位；每一单位中包含预先计算出能与所需药物载体共同作用产生预期治疗效果的量的活性化合物。本发明所述的剂量单位形式的规定受制于或直接取决于活性化合物的独特的特性以及要达到的具体疗效。

本发明所述的核酸分子可以被插入载体并被用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过多种途径中的任一种递送给患者，例如，静脉注射、局部给药或定向注射。所述基因载体的药物制剂可以包括可接受的稀释液中的基因治疗载体，或者可以含有一缓释基质，基因递送载体埋于其中。替代地，所述的完整基因递送载体可以由重组细胞完整地制备而成，例如逆转录病毒载体，所述药物制剂可以包括一种或多种能产生基因递送系统的细胞。

可将药物组合物与使用说明书一起装入容器、包装或配送器中。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

设计两个重组细胞，其中一个共表达α_1DS(含IQv结构域)、第二蛋白(PCRD)、荧光蛋白(CFP)、融合蛋白(Ras)，如图4(a)左侧图所示，通过融合蛋白Ras将PCRD稳定定位在细胞膜附近，形成PCRD-CFP-Ras；另一个共表达α_1DS(含IQv结构域)、第三蛋白(DCRD)-荧光蛋白(CFP)-融合蛋白(Ras)，如图4(a)右侧图所示，通过融合蛋白Ras将DCRD稳定定位在细胞膜附近，形成DCRD-CFP-Ras。

图4(b)所示，α_1DS的CDI程度均未发生明显改变，说明即使三个关键结构域的其中两者相对位置足够靠近，但是缺少第三个结构域的协同作用，仍无法发挥CMI效应。

实施例2

设置三个重组细胞：(a)α_1DS(含IQv结构域)与PCRD-Linker-CFP-Ras和YFP-DCRD共表达；(b)α_1DS(含IQv结构域)与DCRD-CFP-Ras和YFP-PCRD共表达；(c)α_1DS(含IQv结构域)与PCRD-Linker-CFP-Ras和DCRD-CFP-Ras共表达。

三种新型抑制方法的实施策略分别为：(1)α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-PCRD和YFP-DCRD共表达，而FRB稳定定位于细胞膜上，通过加入含雷帕霉素的钙溶液，雷帕霉素与FRB和FKBP的结合导致PCRD转移至细胞膜附近；(2)α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-DCRD和YFP-PCRD共表达，而FRB稳定定位于细胞膜上，通过加入含雷帕霉素的钙溶液，雷帕霉素与FRB和FKBP的结合导致DCRD转移至细胞膜附近；(3)α_1DS(含IQv结构域)与YFP-FKBP-PCRD和YFP-FKBP-DCRD共表达，而FRB稳定定位于细胞膜上，通过加入含雷帕霉素的钙溶液，雷帕霉素与FRB和FKBP的结合导致PCRD和DCRD都转移至细胞膜附近。

图5～7的结果表明以上三种实施策略通过加入雷帕霉素提高了PCRD和DCRD在细胞膜附近的局部浓度，使其与通道IQ_V结构域的相对距离减小，协同改变了通道碳末端与CaM的竞争关系，从而调控通道的门控特性如CDI程度及钙电流瞬态峰值等。

具体地，图5中，单独的α_1DS作为对照组，1μM雷帕霉素并不影响其的CDI程度和钙电流瞬态峰值，FRB稳定定位于细胞膜，当α_1DS与YFP-FKBP-PCRD和YFP-DCRD共表达时，1μM雷帕霉素能够诱导PCRD转移到细胞膜附近，拉近PCRD与IQ_V结构域的相对距离，协同发挥CMI作用，减弱α_1DS的CDI程度并减小钙电流瞬态峰值。随着时间的变化，与对照组变化情况相比，加入1μM雷帕霉素α_1DS的CDI程度逐渐减弱，钙电流瞬态峰值逐渐减小。

图6中，单独的α_1DS作为对照组，1μM雷帕霉素并不影响其的CDI程度和钙电流瞬态峰值，FRB稳定定位于细胞膜，当α_1DS与YFP-FKBP-DCRD和YFP-PCRD共表达时，1μM雷帕霉素能够诱导DCRD转移到细胞膜附近，拉近DCRD与IQ_V结构域的相对距离，协同发挥CMI作用，减弱α_1DS的CDI程度并减小钙电流瞬态峰值。随着时间的变化，与对照组变化情况相比，加入1μM雷帕霉素α_1DS的CDI程度逐渐减弱，钙电流瞬态峰值逐渐减小。

图7中，单独的α_1DS作为对照组，1μM雷帕霉素并不影响其的CDI程度和钙电流瞬态峰值，FRB稳定定位于细胞膜，当α_1DS与YFP-FKBP-PCRD和YFP-FKBP-DCRD共表达时，1μM雷帕霉素能够诱导PCRD和DCRD转移到细胞膜附近，拉近PCRD和DCRD与IQ_V结构域的相对距离，协同发挥CMI作用，减弱α_1DS的CDI程度并减小钙电流瞬态峰值。随着时间的变化，与对照组变化情况相比，加入1μM雷帕霉素α_1DS的CDI程度逐渐减弱，钙电流瞬态峰值逐渐减小。

其中，同时诱导PCRD和DCRD转移至细胞膜附近达到的抑制效果最佳(图8)，这与最大限度地使三个关键结构域的空间距离足够接近密不可分，可使α_1DS的抑制效果达到CMI极限水平。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物

<130> PIDC3170947

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1643

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> IQv蛋白

<400> 1

Met Gln His Gln Arg Gln Gln Gln Glu Asp His Ala Asn Glu Ala Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Arg Gly Thr Arg Leu Pro Ile Ser Gly Glu Gly Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Pro Asn Ser Ser Lys Gln Thr Val Leu Ser Trp Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Asp Ala Ala Arg Gln Ala Lys Ala Ala Gln Thr Met Ser Thr Ser Ala

50 55 60

Pro Pro Pro Val Gly Ser Leu Ser Gln Arg Lys Arg Gln Gln Tyr Ala

65 70 75 80

Lys Ser Lys Lys Gln Gly Asn Ser Ser Asn Ser Arg Pro Ala Arg Ala

85 90 95

Leu Phe Cys Leu Ser Leu Asn Asn Pro Ile Arg Arg Ala Cys Ile Ser

100 105 110

Ile Val Asp Trp Lys Pro Phe Asp Ile Phe Ile Leu Leu Ala Ile Phe

115 120 125

Ala Asn Cys Val Ala Leu Ala Ile Tyr Ile Pro Phe Pro Glu Asp Asp

130 135 140

Ser Asn Ser Thr Asn His Asn Leu Glu Lys Val Glu Tyr Ala Phe Leu

145 150 155 160

Ile Ile Phe Thr Val Glu Thr Phe Leu Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Leu

165 170 175

Leu Leu His Pro Asn Ala Tyr Val Arg Asn Gly Trp Asn Leu Leu Asp

180 185 190

Phe Val Ile Val Ile Val Gly Leu Phe Ser Val Ile Leu Glu Gln Leu

195 200 205

Thr Lys Glu Thr Glu Gly Gly Asn His Ser Ser Gly Lys Ser Gly Gly

210 215 220

Phe Asp Val Lys Ala Leu Arg Ala Phe Arg Val Leu Arg Pro Leu Arg

225 230 235 240

Leu Val Ser Ser Val Pro Ser Leu Gln Val Val Leu Asn Ser Ile Ile

245 250 255

Lys Ala Met Val Pro Leu Leu His Ile Ala Leu Leu Val Leu Phe Val

260 265 270

Ile Ile Ile Tyr Ala Ile Ile Gly Leu Glu Leu Phe Ile Gly Lys Met

275 280 285

His Lys Thr Cys Phe Phe Ala Asp Ser Asp Ile Val Ala Glu Glu Asp

290 295 300

Pro Ala Pro Cys Ala Phe Ser Gly Asn Gly Arg Gln Cys Ala Ala Asn

305 310 315 320

Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Trp Val Gly Pro Asn Gly Gly Ile Thr

325 330 335

Asn Phe Asp Asn Phe Ala Phe Ala Met Leu Thr Val Phe Gln Cys Ile

340 345 350

Thr Met Glu Gly Trp Thr Asp Val Leu Tyr Trp Val Asn Asp Ala Ile

355 360 365

Gly Trp Glu Trp Pro Trp Val Tyr Phe Val Ser Leu Ile Ile Leu Gly

370 375 380

Ser Phe Phe Val Leu Asn Leu Val Leu Gly Val Leu Ser Gly Glu Phe

385 390 395 400

Ser Lys Glu Arg Glu Lys Ala Lys Ala Arg Gly Asp Phe Gln Lys Leu

405 410 415

Arg Glu Lys Gln Gln Leu Glu Glu Asp Leu Lys Gly Tyr Leu Asp Trp

420 425 430

Ile Thr Gln Ala Glu Asp Ile Asp Pro Glu Asn Glu Glu Glu Gly Gly

435 440 445

Glu Glu Gly Lys Arg Asn Thr Ser Met Pro Thr Ser Glu Thr Glu Ser

450 455 460

Val Asn Thr Glu Asn Val Ser Gly Glu Gly Glu Thr Gln Gly Cys Cys

465 470 475 480

Gly Ser Leu Trp Cys Trp Trp Lys Arg Arg Gly Ala Ala Lys Thr Gly

485 490 495

Pro Ser Gly Cys Arg Arg Trp Gly Gln Ala Ile Ser Lys Ser Lys Leu

500 505 510

Ser Arg Arg Trp Arg Arg Trp Asn Arg Phe Asn Arg Arg Arg Cys Arg

515 520 525

Ala Ala Val Lys Ser Val Thr Phe Tyr Trp Leu Val Ile Val Leu Val

530 535 540

Phe Leu Asn Thr Leu Thr Ile Ser Ser Glu His Tyr Asn Gln Pro Asp

545 550 555 560

Trp Leu Thr Gln Ile Gln Asp Ile Ala Asn Lys Val Leu Leu Ala Leu

565 570 575

Phe Thr Cys Glu Met Leu Val Lys Met Tyr Ser Leu Gly Leu Gln Ala

580 585 590

Tyr Phe Val Ser Leu Phe Asn Arg Phe Asp Cys Phe Val Val Cys Gly

595 600 605

Gly Ile Thr Glu Thr Ile Leu Val Glu Leu Glu Leu Met Ser Pro Leu

610 615 620

Gly Val Ser Val Phe Arg Cys Val Arg Leu Leu Arg Ile Phe Lys Val

625 630 635 640

Thr Arg His Trp Thr Ser Leu Ser Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Asn

645 650 655

Ser Met Lys Ser Ile Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Phe Ile

660 665 670

Ile Ile Phe Ser Leu Leu Gly Met Gln Leu Phe Gly Gly Lys Phe Asn

675 680 685

Phe Asp Glu Thr Gln Thr Lys Arg Ser Thr Phe Asp Asn Phe Pro Gln

690 695 700

Ala Leu Leu Thr Val Phe Gln Ile Leu Thr Gly Glu Asp Trp Asn Ala

705 710 715 720

Val Met Tyr Asp Gly Ile Met Ala Tyr Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly

725 730 735

Met Ile Val Cys Ile Tyr Phe Ile Ile Leu Phe Ile Cys Gly Asn Tyr

740 745 750

Ile Leu Leu Asn Val Phe Leu Ala Ile Ala Val Asp Asn Leu Ala Asp

755 760 765

Ala Glu Ser Leu Asn Thr Ala Gln Lys Glu Glu Ala Glu Glu Lys Glu

770 775 780

Arg Lys Lys Ile Ala Arg Lys Glu Ser Leu Glu Asn Lys Lys Asn Asn

785 790 795 800

Lys Pro Glu Val Asn Gln Ile Ala Asn Ser Asp Asn Lys Val Thr Ile

805 810 815

Asp Asp Tyr Gln Glu Glu Ala Glu Asp Lys Asp Pro Tyr Pro Pro Cys

820 825 830

Asp Val Pro Val Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Pro

835 840 845

Glu Val Pro Ala Gly Pro Arg Pro Arg Arg Ile Ser Glu Leu Asn Met

850 855 860

Lys Glu Lys Ile Ala Pro Ile Pro Glu Gly Ser Ala Phe Phe Ile Leu

865 870 875 880

Ser Lys Thr Asn Pro Ile Arg Val Gly Cys His Lys Leu Ile Asn His

885 890 895

His Ile Phe Thr Asn Leu Ile Leu Val Phe Ile Met Leu Ser Ser Ala

900 905 910

Ala Leu Ala Ala Glu Asp Pro Ile Arg Ser His Ser Phe Arg Asn Thr

915 920 925

Ile Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Ala Phe Thr Ala Ile Phe Thr Val Glu

930 935 940

Ile Leu Leu Lys Met Thr Thr Phe Gly Ala Phe Leu His Lys Gly Ala

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Phe Cys Arg Asn Tyr Phe Asn Leu Leu Asp Met Leu Val Val Gly Val

965 970 975

Ser Leu Val Ser Phe Gly Ile Gln Ser Ser Ala Ile Ser Val Val Lys

980 985 990

Ile Leu Arg Val Leu Arg Val Leu Arg Pro Leu Arg Ala Ile Asn Arg

995 1000 1005

Ala Lys Gly Leu Lys His Val Val Gln Cys Val Phe Val Ala Ile

1010 1015 1020

Arg Thr Ile Gly Asn Ile Met Ile Val Thr Thr Leu Leu Gln Phe

1025 1030 1035

Met Phe Ala Cys Ile Gly Val Gln Leu Phe Lys Gly Lys Phe Tyr

1040 1045 1050

Arg Cys Thr Asp Glu Ala Lys Ser Asn Pro Glu Glu Cys Arg Gly

1055 1060 1065

Leu Phe Ile Leu Tyr Lys Asp Gly Asp Val Asp Ser Pro Val Val

1070 1075 1080

Arg Glu Arg Ile Trp Gln Asn Ser Asp Phe Asn Phe Asp Asn Val

1085 1090 1095

Leu Ser Ala Met Met Val Leu Phe Thr Val Ser Thr Phe Glu Gly

1100 1105 1110

Trp Pro Ala Leu Leu Tyr Lys Ala Ile Asp Ser Asn Gly Glu Asn

1115 1120 1125

Val Gly Pro Val Tyr Asn Tyr Arg Val Glu Ile Ser Ile Phe Phe

1130 1135 1140

Ile Ile Tyr Ile Ile Ile Val Ala Phe Phe Met Met Asn Ile Phe

1145 1150 1155

Val Gly Phe Val Ile Val Thr Phe Gln Glu Gln Gly Glu Lys Glu

1160 1165 1170

Tyr Lys Asn Cys Glu Leu Asp Lys Asn Gln Arg Gln Cys Val Glu

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Ala Arg Pro Leu Arg Arg Tyr Ile Pro Lys Asn

1190 1195 1200

Pro Tyr Gln Tyr Lys Phe Trp Tyr Val Val Asn Ser Ser Pro Phe

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1220 1225 1230

Ala Met Gln His Tyr Glu Gln Ser Lys Met Phe Asn Asp Ala Met

1235 1240 1245

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1250 1255 1260

Val Leu Lys Val Ile Ala Phe Lys Pro Lys His Tyr Phe Thr Asp

1265 1270 1275

Ala Trp Asn Thr Phe Asp Ala Leu Ile Val Val Gly Ser Val Val

1280 1285 1290

Asp Ile Ala Ile Thr Glu Val Asn Asn Ser Glu Glu Ser Asn Arg

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Ile Ser Ile Thr Phe Phe Arg Leu Phe Arg Val Met Arg Leu Val

1310 1315 1320

Lys Leu Leu Ser Arg Gly Glu Gly Ile Arg Thr Leu Leu Trp Thr

1325 1330 1335

Phe Ile Lys Ser Phe Gln Ala Leu Pro Tyr Val Ala Leu Leu Ile

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Ala Met Leu Phe Phe Ile Tyr Ala Val Ile Gly Met Gln Met Phe

1355 1360 1365

Gly Lys Val Ala Met Arg Asp Asn Asn Gln Ile Asn Arg Asn Asn

1370 1375 1380

Asn Phe Gln Thr Phe Pro Gln Ala Val Leu Leu Leu Phe Arg Cys

1385 1390 1395

Ala Thr Gly Glu Ala Trp Gln Glu Ile Met Leu Ala Cys Leu Pro

1400 1405 1410

Gly Lys Leu Cys Asp Pro Asp Ser Asp Tyr Asn Pro Gly Glu Glu

1415 1420 1425

Tyr Thr Cys Gly Ser Asn Phe Ala Ile Val Tyr Phe Ile Ser Phe

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Tyr Met Leu Cys Ala Phe Leu Ile Ile Asn Leu Phe Val Ala Val

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Leu Glu Arg Met Leu

1640

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PCRD蛋白

<400> 2

Asn Asp Ala Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ala Leu Gln Ala Gly Leu Arg

1 5 10 15

Ser Leu Gln Asp Leu Gly Pro Glu Met Arg Gln Ala Leu Thr Cys Asp

20 25 30

Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gln Glu Gly Val Glu Glu Glu Asp

35 40 45

Glu Lys Asp Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Met Val Ser Gln Pro Ser

50 55 60

Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ile Ser Val Ser Leu Pro Val Gly Asp Arg

65 70 75 80

Leu Pro Asp Ser Leu Ser Phe Gly Pro Ser Asp Asp Asp Arg Gly Thr

85 90 95

Pro Thr Ser Ser Gln Pro Ser Val Pro Gln Ala Gly Ser Asn Thr His

100 105 110

Arg Arg Gly Ser Gly Ala Leu Ile Phe Thr Ile Pro Glu Glu Gly Asn

115 120 125

<210> 3

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> DCRD蛋白

<400> 3

Leu His Val Pro Gly Thr His Ser Asp Pro Ser His Gly Lys Arg Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asp Ser Leu Val Glu Ala Val Leu Ile Ser Glu Gly Leu Gly

20 25 30

Leu Phe Ala Arg Asp Pro Arg Phe Val Ala Leu Ala Lys Gln Glu Ile

35 40 45

Ala Asp Ala Cys Arg Leu Thr Leu Asp Glu Met Asp Asn Ala Ala Ser

50 55 60

Asp Leu Leu Ala Gln Gly Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Asp Glu Glu Ser

65 70 75 80

Ile Leu Ser Arg Phe Asp Glu Glu Asp Leu Gly Asp Glu Met Ala Cys

85 90 95

Val His Ala Leu

100

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 锚定序列

<400> 4

Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys

1 5 10 15

Cys Val Leu Ser

20

<210> 5

<211> 93

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FRB蛋白

<400> 5

Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg

1 5 10 15

Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu

20 25 30

Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr

35 40 45

Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp

50 55 60

Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala

65 70 75 80

Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys

85 90

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FKBP蛋白

<400> 6

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 7

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CFP蛋白

<400> 7

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu

225 230

<210> 8

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> YFP蛋白

<400> 8

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu

225 230

Claims

1.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达：

第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；

第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及

第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，

其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在所述细胞膜上，

任选地，所述锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一与所述锚定序列呈融合蛋白的形式。

3.根据权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述第二蛋白、所述第三蛋白与所述锚定序列分别独立地与荧光蛋白相连，所述荧光蛋白为选自青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的至少之一。

4.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述锚定序列与第一靶序列相连，所述第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，

并且所述重组细胞进一步含有中间连接蛋白，所述中间连接蛋白包括：

第一结合序列，所述第一结合序列特异性地与所述第一靶序列结合；

第二结合序列，所述第二结合序列特异性地与所述第二靶序列结合，

任选地，所述第一靶序列是如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述第二靶序列是如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.一种筛选L型钙通道调节剂的方法，其特征在于，包括：

将候选试剂与权利要求1～4任一项所述的重组细胞接触；

检测所述接触前后所述重组细胞的钙通道参数，所述钙通道参数的变化是所述候选试剂为所述L型钙离子通道调节剂的指示，所述钙通道参数包括CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一。

任选地，接触后所述钙通道的CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一降低，是所述候选试剂为所述L型钙离子通道抑制剂的指示。

6.试剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗神经退行性疾病，所述试剂适于使患者的神经元细胞表达下列的至少之一：

其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上，

任选地，所述神经元细胞自身表达第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂呈蛋白质或者其编码核酸的形式，

优选地，所述神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化、神经病、亨廷顿病与肌萎缩侧索硬化。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在所述细胞膜上，

任选地，所述锚定序列含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体；

任选地，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一与所述锚定序列呈融合蛋白的形式；

任选地，所述锚定序列与第一靶序列相连，所述第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，

第二结合序列，所述第二结合序列特异性地与所述第二靶序列结合。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含选自下列的至少之一：

第二蛋白或其编码核酸，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及

第三蛋白或其编码核酸，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，

所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一含有锚定序列。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述锚定序列与第一靶序列相连，所述第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，