CN1997383A - 含水母发光蛋白的组合物及使用它的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含水母发光蛋白的组合物，以及它们用于预防和/或减轻与钙失调相关的症状和障碍的方法。

Description

含水母发光蛋白的组合物及使用它的方法

发明领域

本发明一般地涉及适用于维持钙体内稳态的组合物。特别地，本发明涉及适用于预防和/或减轻与钙失调相关的疾病或症状的含水母发光蛋白的药物组合物和营养制品组合物。

发明背景

钙是人体内第五最富含的元素，并且主要存在于骨中。体内超过99％的钙是储藏于骨骼中，其不断地改变其供应，剩余的1％溶解于体液和软组织如血液中。这种交换的控制在很大程度上受内分泌系统支配，其感觉血浆中离子化钙的浓度并指引钙交换来维持这种关键的平衡。在组织液和软组织中所述1％的钙中只有一小部分是离子化的和可溶的，剩下的结合蛋白质，特别是钙结合蛋白(CaBPs)。已知这些CaBPs在维持钙体内稳态中发挥作用。由于为了完成必需的生理过程身体需要特定浓度的钙离子，因此维持钙体内稳态对于身体健康是极其重要的。医学界了解血浆和体液中适当的离子钙浓度在身体功能上是关键的，该身体功能包括但不限于神经元兴奋性、肌肉收缩性、膜渗透性、细胞分裂、激素分泌和骨矿化。钙体内稳态的破坏，即钙失调与很多疾病、综合征和病况相关，包括但不限于癌症、心脏病和神经变性疾病。

在过去，钙通道拮抗剂(其阻滞钙在细胞内与组织液之间的流动)已经作为适用于预防钙相关的障碍包括高血压、心绞痛、哮喘、偏头痛和神经衰退的药剂被广泛地处方。例如，已经发现尼莫地平通过减轻引起神经衰退的钙失调，改善痴呆中的临床症状学和认知功能。然而，很多这些钙通道拮抗剂具有不需要的副作用，包括但不限于不适、液体潴留、胃灼热、游走的心率、头晕、胃不适，在罕见的病例中有昏厥、发烧和过度出血。

因此，需要新的和可替代性的减轻或预防钙失调的治疗剂。特别地，与现有的活性剂相比副作用减少的药物或营养制品组合物是期望的，如果发现，将满足医学界和营养健康界中长期感觉到的需要。

发明概述

本发明提供药物组合物和营养制品组合物，其有利于减轻和/或预防与钙失调相关的症状或障碍。这样的组合物包括与可接受的载体组合的水母发光蛋白，用于通过多种途径向受试者给药。因此，本发明涉及含有与可接受的载体组合的有效量的水母发光蛋白的药物组合物。在其它实施方案中，本发明涉及营养制品组合物，它包含与可接受的载体组合的有效量的水母发光蛋白。在某些实施方案中，营养制品组合物除了包含水母发光蛋白之外，还包含至少一种被认为提供营养制品益处的其它成分。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了治疗与钙失调有关的症状或障碍的方法，通过向需要这种治疗的患者给药治疗有效量的水母发光蛋白。

而在另一个实施方案中，本发明包括水母发光蛋白在制备用于减轻或预防与钙失调有关的症状或障碍的组合物中的应用。

在阅读了说明书和权利要求书之后，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。

附图简要说明

图1描述了描绘海马神经元摄取水母发光蛋白的荧光显微照片。

图2显示了视频显微照片，其说明缺血之前给予水母发光蛋白时，它具有神经保护作用。

图3说明了缺血后含有(死亡的)神经元的锥虫蓝的平均数的棒图。

发明详述

I.一般原则

在描述本方法之前，应当理解的是本发明不限于所述的特定方法学和材料，因为它们可以变化。还应当理解的是本文使用的术语的目的仅在于描述特定的实施方案，不是想要限制本发明的范围，本发明的范围仅受附加的权利要求限制。

必需注意的是，如本文和在附加的权利要求书中使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数的提及，除非上下文另外清楚地指出。另外，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中交换使用。还应当注意的是术语“含有”、“包含”和“具有”可以交换使用。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常了解的相同的含义。尽管同本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本发明的实践或试验中，但是当前描述的是优选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此并入作为参考，目的在于描述和公开出版物中报道的化学试剂和方法学，所述出版物可以用于结合本发明。不应将本文中的任何内容解释为承认：本发明没有权利由于在先发明而将这类公开的日期提前。

II.本发明

水母发光蛋白是最初从发光水母和其它海洋生物中分离出来的背光蛋白质(aphotoprotein)。水母发光蛋白复合物含有22,000-道尔顿的原水母发光蛋白蛋白质、分子氧和发光体腔肠素。当三个Ca²⁺离子结合此复合物时，腔肠素被氧化成腔肠酰胺，并发释放二氧化碳和蓝光。水母发光蛋白不被细胞排出或分泌，在细胞内也不被区室化或隔离。因此，水母发光蛋白测量法用于检测相对长时间内发生的Ca²⁺变化。在多个实验系统中，细胞加载后数小时至数天，水母发光蛋白的发光是可探测的。进一步认识到水母发光蛋白还不干扰细胞功能或胚胎发育。

因为其Ca²⁺-依赖性发光，水母发光蛋白复合物已经广泛用作细胞内Ca²⁺指示剂。水母(Aequorea victoria)水母发光蛋白已被具体用于：(1)分析单个肾上腺嗜铬细胞对烟碱胆碱能激动剂的分泌响应；(2)阐明Ca²⁺释放在心肌损伤中的作用；(3)证明了受精过程中的Ca²⁺的大量释放；(4)研究了在发育鸡成肌细胞中肌质网Ca²⁺泵表达的调节；和(5)用少至3皮升的注射体积校准微量移液管。

来自水母Aequorea victaria的水母发光蛋白的常规纯化需要吃力的提取程序，而且有时得到的制品实质上是异源的或者对研究的生物有毒性。两吨的水母通常得到-125mg的纯化的光蛋白质。相反，重组水母发光蛋白优选通过从基因工程大肠杆菌(Escherichia coli)中纯化原水母发光蛋白，接着在体外用纯的腔肠素(coelenterazine)重构水母发光蛋白复合物来生产。这种制备方法得到纯的、无毒的、完全带电的水母发光蛋白复合物，适于在本发明中使用。适用于本发明的一种示例性的商购的水母发光蛋白制品可从Molecular Probes，Inc.，以商品名AQUALITE购得。因此，描述了适用于本发明的水母发光蛋白，并可通过本领域技术人员已知的纯化方案和/或合成而商业获得。

依据几个特征区别水母发光蛋白的功能：水母发光蛋白是无毒的并且不干扰内部的细胞化学计量。(Miller等人，Methods Cell Biol.40：305-338(1994))；当引入外来细胞时该蛋白质是无毒的(Blinks，J.Environ Health Persp 83：75-81(1990))。已知水母发光蛋白的每个分子结合至多三个钙离子(Inouye等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3154-3158(1985))。

本发明涉及向受试者给予含水母发光蛋白的组合物，以便纠正或维持受试者体内的钙平衡。认为维持血浆和体液中的离子钙浓度对于广泛的多种身体功能，包括但不限于神经元兴奋性、肌肉收缩、膜通透性、细胞分裂、激素分泌和骨矿化是关键的。认为钙体内稳态的破坏，即钙失调引起很多疾病、综合征和病况和/或与它们相关。CaBPs的研究导致将它们认为是在维持适当的离子钙水平中起作用的保护因子。

在某些实施方案中，本发明的方法包括给予作为唯一的活性成分的水母发光蛋白，用于治疗钙失调、延迟钙失调的进展、预防钙失调的开始以及预防和/或治疗钙失调的复发。在其它的实施方案中，本发明提供了包括给予与一种或多种具有已知治疗价值的另外的活性剂组合的水母发光蛋白。

如本文所使用，术语“治疗”包括预防和障碍缓解治疗。如本文所使用，术语“减少”、“减轻”、“压制”和“抑制”具有它们通常理解的减轻或减少的含义。如本文所使用，术语“进展”意思是范围或严重性的增加、推进、发展或变得更糟。如本文所使用，术语“复发”意思是减轻后疾病的复原。

如本文所使用，术语“给予”是指使水母发光蛋白与患者、组织、器官或细胞相接触。如本文所使用，给药可以在体外即在试管中完成，或在体内即在活的生物例如人的细胞或组织中完成。在优选的实施方案中，本发明包括向患者或受试者给予本发明中有用的分子。“患者”或“受试者”，在此同等使用，是指哺乳动物，优选是人，其：(1)具有钙失调相关的紊乱，其通过给予水母发光蛋白可矫正或可治疗；或(2)对钙失调有关的紊乱敏感，所述紊乱可以通过给予水母发光蛋白预防。

如在本文中所用的，“药物组合物”意思是治疗有效量的水母发光蛋白连同适合的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和助剂，总称为“药物上可接受的载体”。如本文所使用的，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗反应却没有过度的不利副作用如毒性、刺激性或过敏反应的活性剂的量。显然，特定的“有效量”将随这些因素如要治疗的特定的病况、患者的身体状况、治疗动物的类型、治疗的持续时间、同时治疗(如果有)的性质、所用的特定制剂和化合物或其衍生物的结构而变化。在这种情况下，如果某一量导致以下的一种或多种情况，将认为此量是治疗有效的：(a)预防钙失调有关的紊乱；和(b)逆转或稳定钙失调有关的紊乱。本领域的普通技术人员采用常规实验很容易确定最佳有效量。

药物组合物是液体或冻干或以其它方式干燥的制剂，包含不同缓冲剂内容物(例如Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、防止吸收于表面的添加剂如白蛋白或明胶、去污剂(例如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、增溶剂(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类)、膨胀物质或张力改性剂(例如，乳糖、甘露醇)、共价连接的聚合物如连接于蛋白的聚乙二醇、与金属离子络合，或将物质掺到聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制品中或其上，或者掺到脂质体、微乳、胶束、单层(milamellar)或多层囊泡、红细胞影或原生质球。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放的速率和体内清除的速率。受控或持续释放的组合物包括亲脂性贮库(例如，脂肪酸、蜡、油)形式的制剂。

本发明还包括给予用聚合物(例如泊洛沙姆或poloxamines)包衣的颗粒组合物。本发明的组合物的其它实施方案包括用于各种给药途径，包括肠胃外、经肺、经鼻和口服的颗粒形式、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。在某些实施方案中，药物组合物经下列途径给药：肠胃外、癌周围(paracancerally)、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和肿瘤内。

此外，如本文所使用，“药物上可接受的载体”为本领域技术人员所熟知，包括但不限于，0.01-0.1M并优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。另外，此类药物上可接受的载体可以是含水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。

胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充物、电介质补充物如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。也可以含有防腐剂及其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、对照(collating)剂、惰性气体等。

根据本发明可给药的控释或持续释放组合物包括亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)形式的制剂。本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或poloxamines)包衣的颗粒组合物，以及与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶合的化合物，或者与组织特异性受体的配体偶合的化合物。

根据本发明给予的组合物的其它实施方案包括用于各种给药途径，包括肠胃外、经肺、经鼻、经眼和口服的颗粒剂型、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。

已知通过水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸的共价连接修饰的化合物在静脉内注射后，在血中显示出比相应的未修饰的化合物显著更长的半衰期。这些修饰还可能增加化合物在水溶液中的溶解度、消除聚集、提高化合物的物理和化学稳定性，并极大地降低化合物的免疫原性和反应性。结果，通过以与未修饰的化合物相比更低的频率或更低的剂量给予这种聚合物-化合物加合物，可以达到期望的体内生物活性。

在本发明的另一种方法中，药物组合物可以用控释系统给药。例如，可以使用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它给药方式给予药物。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。在另一个实施方案中，可以将控释系统放置于治疗靶，即前列腺的附近，从而仅需要全身剂量的一部分。

药物制剂可以只包含水母发光蛋白，或者进一步包含药物上可接受的载体，并且可以是固体或液体形式，如片剂、散剂、胶囊剂、小丸、溶液、混悬剂、酏剂、糖浆剂、饮料、乳剂、凝胶剂、乳膏、眼用制剂或栓剂，包括直肠和尿道栓剂。药物上可接受的载体还包括树胶、淀粉、糖、纤维素物质及其混合物。含有水母发光蛋白的药物制剂可以通过例如皮下植入小丸而给与患者。在进一步的实施方案中，小丸在一段时期内提供水母发光蛋白的控制释放。制剂也可以通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂、口服给予液体或固体制剂，或通过局部应用而给予。也可以通过使用直肠栓剂或尿道栓剂而完成给药。

可通过本发明给予的药物制剂可以通过已知的溶解、混合、造粒或形成片的方法而制备。为了口服给药，把水母发光蛋白或其生理学可耐受的衍生物如盐、酯、N-氧化物等与常规用于此目的的添加剂如载体、稳定剂或惰性稀释剂混合，并通过常规方法转化为用于给药的适宜形式，如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、水、醇或油溶液。适宜的惰性载体的实例是常规的片剂基质如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，其与粘合剂如阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶组合，或者与崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸组合，或者与润滑剂如硬脂酸或硬脂酸镁组合。

适宜的油载体或溶剂的实例是植物油或动物油，如向日葵油或鱼肝油。制剂可以作为干颗粒和作为湿颗粒而实现。为了胃肠外给药(皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)，将抗雄激素化合物或其生理学上耐受的衍生物如盐、酯、N-氧化物等转化成溶液、悬浮液或乳液(expulsion)，如果期望，与惯用并适合于该目的物质例如增溶剂或其它辅剂一起配制。实例是无菌液体如水和油，有或没有加入表面活性剂和其它药物上可接受的辅助剂。举例说明的油是来源于石油、动物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、葡萄糖水溶液及有关的糖溶液，以及二醇类如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是用于可注射溶液。

含有活性组分的药物组合物的制备是本领域公知的。将这些组合物制备成给药到鼻咽部的气溶胶，或者制备成可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可以制备成适合在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性治疗成分常常与药物上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。适宜的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其任意组合。另外，组合物可以含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，其提高活性成分的有效性。

可以将活性组分以中和的药物上可接受的盐形式配制在组合物中。药物上可接受的盐包括酸加成盐，它们是与无机酸如盐酸或磷酸形成的盐，或者是与有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等形成的盐。由游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，来源于这类有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

为了使用例如乳膏、凝胶剂、滴剂等向体表面局部给药，制备水母发光蛋白或其生理学上耐受的衍生物，并以在生理学可接受的稀释剂(含或不含药物载体)中的溶液、悬浮液或乳液形式使用。

在本发明的另一个方法中，活性化合物可以以囊泡，尤其是脂质体给药(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，N.Y.，第353-365页(1989)中)。

为了在医学中应用，水母发光蛋白的盐可以是药物上可接受的盐。然而，其它盐在制备本发明的化合物或它们的药物上可接受的盐中可能有用。本发明的化合物的适宜的药物上可接受的盐包括酸加成盐，其可以，例如通过使水母发光蛋白的溶液与药物上可接受的酸的溶液混合而制得，所述药学可接受的酸如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、醋酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

此外，本文所述的含水母发光蛋白的组合物可以营养制品组合物的形式提供，其中水母发光蛋白防止各种有害的钙失调有关的紊乱的开始或减少或稳定各种有害的钙失调有关的紊乱。为了本说明书的目的，术语“营养制品”或“营养制品组合物”指的是食品、或食品的一部分，其提供医学健康益处，包括预防和/或治疗疾病。本发明的营养制品组合物可以仅含有本发明作为活性剂的水母发光蛋白，或选择性地可进一步含有，与饮食添加剂包括维生素、辅酶、矿物质、草药、氨基酸等的混合物，它们通过增加该物质的总摄取来补充饮食。

因此，本发明提供了向患者提供营养制品益处的方法，该方法包括向该患者给予含水母发光蛋白的营养制品组合物的步骤。此类组合物通常包含“营养制品可接受的载体”，如本文所称的，其是适于口服给药的任何载体，包括上述适于口服途径的药物上接受的载体。在某些实施方案中，本发明的营养制品组合物含有基于功能基础定义的膳食补充剂，其包括免疫加强剂、抗炎剂、抗氧剂、抗病毒剂或其混合物。

免疫加强剂和/或抗病毒剂对加速伤口愈合和改善免疫功能是有用的；其包括金光菊或叶紫锥花属的草本的提取物、接骨木属草本的提取物以及白毛茛的提取物。天然或加工形式的黄芪属草本的也是有效的免疫加强剂。黄芪刺激骨髓和淋巴组织中的干细胞发育成活性免疫细胞。锌及其生物活性盐如葡萄糖酸锌和醋酸锌，也可以用作治疗感冒的免疫加强剂。

抗氧化剂包括天然的、含硫的氨基酸蒜素，其用于提高血液中抗氧化酶的水平。全草或草药的提取物如大蒜，其含有蒜素，也是有效的抗氧化剂。儿茶素，和草本植物如含儿茶素的绿茶的提取物也是有效的抗氧化剂。黄芪属的提取物还显示了抗氧化活性。生物类黄酮如槲皮素、橙皮苷、芦丁及其混合物，作为抗氧化剂也是有效的。生物类黄酮的主要的有益作用可能在于防止维生素C在体内的氧化。这就使更多的维生素C或抗坏血酸可被身体利用。

生物类黄酮如槲皮素还是有效的抗炎药，而且本身可以用于本发明的组合物中。源自植物或草本的抗炎的草本补充剂和抗炎化合物还可以作为抗炎药用于本发明的组合物中。这些包括bromolain，其是在菠萝中发现的一种蛋白水解酶，茶以及荨麻的提取物、姜黄、姜黄的提取物、或姜黄素，一种从姜黄中分离的黄色色素。

另一个可以用于本发明的补充剂是姜，源自姜属的草本植物。其已发现具有强心的活性(由化合物如姜酚和相关的化合物姜烯酚引起)，以及在头晕和前庭障碍的治疗中提供益处。姜在恶心和其它胃病的治疗中也是有效的。

有助于重建软组织结构，特别是重建软骨的补充剂，在治疗关节疼痛和其它关节病的组合物中是有用的。氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、软骨素和硫酸软骨素特别适用于这个目的。软骨素可以源自多种来源，如Elk Velvet Antler.海生的脂质的复合物，Ω3脂肪酸复合物和鱼油也已知在治疗与关节炎有关的疼痛中是有用的。

在治疗偏头痛中有用的补充剂包括小白菊和银杏。小白菊中的主要有效成分是倍半萜内酯小白菊内酯，其抑制前列腺素的分泌，前列腺素依次通过血管中的血管痉挛活性引起疼痛。小白菊还显示了抗炎的性质。鱼油，由于其血小板稳定和抗血管痉挛作用，还可以用于治疗偏头痛。草本银杏通过稳定动脉和改善血液循环也有助于治疗偏头痛。

尽管描述了以上列出的一些补充剂的药理学作用，其它的补充剂也可以用于本发明中而且它们的作用在科学文献中被证明了。

III.实施例

实施例1.水母发光蛋白被海马神经元摄取。在一组初步的研究中，水母发光蛋白双侧直接注射到3只不同成年大鼠的海马中。把大鼠送回它们的生活笼子至少24小时，此后将它们麻醉并摘除它们的脑，切片和使用单克隆抗水母发光蛋白抗体染色水母发光蛋白。再使用缀合Alexa Fluor 594的二抗使一抗显影。图1显示了使用常规荧光显微术的水母发光蛋白标记的海马神经元的实例。左图是海马的显微照片，显示了在CA1区域的插管尖端的定位。白色的矩形显示了右图中所示的两个水母发光蛋白标记的CA3锥体神经元的定位。数据说明了水母发光蛋白直接输注入海马(左图)产生了标记CA1和CA3中的锥体神经元。将水母发光蛋白(6w/v)溶解于存在3％DMSO的不含钙的aCSF中。使用注射器泵(体积每侧～1μL)把该溶液缓慢地(速率～1μl/min)直接注射进海马。注射完成后，输送插管在移走之前，在原处停留约1分钟。两个含水母发光蛋白CA3锥体神经元的实例显示在右图中(4OX物镜)。该数据清楚地证明了水母发光蛋白直接传送进脑部，还证明了水母发光蛋白扩散到整个海马，并被CA1、CA3和齿状回中的神经元摄取。

实施例2.水母发光蛋白对缺血后细胞死亡的作用

进行实验来研究钙结合蛋白水母发光蛋白对缺血的益处。将水母发光蛋白(4％)溶解于无钙的含6％DMSO(二甲亚砜)脑脊髓液中。2-3小时之后，用异氟烷麻醉大鼠，并断头处死。使用控温的振动切片机制得400微米厚度的脑切片。切片立即放入充氧的(95％O₂/5％CO₂)以下组成(以niM计)的人造脑脊髓液(aCSF)中：124 NaCl、2.8 KCl、2 MgSO₄、2 NaH₂PO₄、2 CaCl₂、26 NaHCO₃、0.4抗坏血酸钠、10右旋葡萄糖、pH 7.4，～30℃)。在1小时恢复后，切片接受5分钟的缺血事件。通过用果糖代替葡萄糖，用氮气代替氧气诱导缺血。5分钟缺血攻击后，切片回到正常的充氧的含0.04％的锥虫蓝的aCSF中，在锥虫蓝aCSF中孵育30分钟。锥虫蓝排除法(健康的细胞排除锥虫蓝，而死亡的或死亡中的细胞将吸收锥虫蓝，因此显现蓝色)通常用于评估细胞培养物或脑切片中的细胞死亡。在锥虫蓝中孵育后，取出切片，并放置于固定剂中整夜，接着在30％的蔗糖中孵育3小时。然后将400μm厚度的切片使用恒冷切片机切至～40μm的厚度，固定在明胶包封的载玻片上并盖上载玻片。关于图2，显而易见的是相对于注射水母发光蛋白的神经元(下图)，对照(上图)中存在更多的锥虫蓝染色的(死亡的)神经元。图3显示了缺血后含锥虫蓝的(死亡的)神经元平均数的棒图。这一实验证明了水母发光蛋白直接注射到海马中赋予了抵抗缺血损伤的神经保护作用。

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅为举例说明的目的，并且根据这些实施例和实施方案的不同的修改或变化将被提示给本领域技术人员并且将被包括于本申请及附加的权利要求的范围和精神之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此以全文并入作为参考用于所有目的。

Claims (8)

1、用于预防或减轻与钙失调有关的症状或障碍的组合物，它包含：(a)有效量的水母发光蛋白；和(b)可接受的载体。

2、根据权利要求1的组合物，它还含有免疫加强剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗病毒剂或其混合物。

3、根据权利要求1的组合物，其中所述组合物呈单位剂型形式，该单位剂型选自片剂、胶囊、溶液、混悬剂、糖浆、饮料、口服或眼用制剂和注射剂。

4、根据权利要求1的组合物，其中所述组合物是营养制品。

5、预防或减轻与钙失调有关的症状或障碍的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者给予有效量的水母发光蛋白。

6、根据权利要求5的方法，其中所述症状或障碍与神经元兴奋性、肌肉收缩、膜通透性、细胞分裂、激素分泌和骨矿化有关。

7、根据权利要求5的方法，其中所述症状或障碍是缺血后的细胞死亡。

8、根据权利要求5的方法，其中所述有效量的水母发光蛋白是营养制品。

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