PT1768691E - Composições contendo aequorina e métodos para sua utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES CONTENDO AEQUORINA E MÉTODOS PARA SUA UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se, de uma forma genérica, a composições úteis para a manutenção da homeostase do cálcio. Em particular, esta invenção é dirigida a composições farmacêuticas e nutracêuticas que contêm aequorina úteis na prevenção e/ou no alivio de doenças ou sintomas associados com o desequilíbrio de cálcio, tais como resultado isquémico a neurónios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cálcio é o quinto elemento mais abundante do corpo humano e ocorre principalmente no osso. Mais de 99% do cálcio no organismo está armazenado no esqueleto, que constantemente troca o sue fornecimento com o 1% restante dissolvido em fluidos do corpo e tecidos moles, tais como o sangue. 0 controlo desta troca é em grande medida ditado pelo sistema endócrino que detecta a concentração de cálcio ionizado no plasma e dirige troca de cálcio para manter esse equilíbrio crítico. Apenas uma pequena fracção do 1% do cálcio nos líquidos intersticiais e tecidos moles é ionizada e solúvel, sendo o restante ligado a proteínas, especialmente proteínas de ligação de cálcio (CaBPs). Estas CaBPs são conhecidas por funcionar na manutenção da homeostase do cálcio. Uma vez que o corpo necessita de concentrações específicas de ião de cálcio, a fim de levar a cabo os processos fisiológicos necessários, a manutenção da homeostase do cálcio é, portanto, de importância crítica para a saúde do corpo. Concentrações de cálcio iónico apropriadas no plasma e fluidos corporais são compreendidas pela comunidade médica como sendo críticas nas funções corporais, incluindo, mas não limitadas a 2 excitabilidade neuronal, contracção muscular, permeabilidade de membrana, divisão celular, secreção da hormona e mineralização óssea. Uma ruptura na homeostase do cálcio, isto é, um desequilíbrio de cálcio está associada a muitas doenças, síndromes e condições, incluindo, mas não limitadas a cancro, doença cardíaca e doença neurodegenerativa.

No passado, os antagonistas dos canais de cálcio, que bloqueiam o fluxo de cálcio entre os interiores das células e fluido intersticial, foram amplamente prescritos como agentes farmacêuticos úteis para a prevenção de distúrbios relacionadas com o cálcio, incluindo hipertensão, angina de peito, asma, enxaqueca e deterioração neuronal. Por exemplo, constatou-se que a nimidopina melhora a sintomatologia clínica e as funções cognitivas de pacientes com demência, aliviando um desequilíbrio de cálcio, que provoca a deterioração neuronal. No entanto, muitos destes antagonistas do canal de cálcio têm efeitos secundários indesejáveis, incluindo, mas não limitado a, mal-estar, retenção de líquidos, azia, batimento cardíaca irregular, tonturas, perturbações gástricas e, em casos raros, desmaios, febre e sangramento excessivo.

Existe, portanto, uma necessidade de novos e alternativos produtos terapêuticos que aliviam ou previnem o desequilíbrio do cálcio. Em particular, são desejadas composições, farmacêuticas ou nutracêuticas que tenham efeitos secundários reduzidos em comparação com os agentes anteriores e, se forem descobertas, iriam satisfazer uma necessidade há muito sentida nas comunidades médicas e nutricionais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 3 A presente invenção proporciona aequorina para utilização como medicamento. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas e nutracêuticas que são vantajosas para o alívio e/ou prevenção dos sintomas ou perturbações associados com o desequilíbrio de cálcio. Tais composições incluem a aequorina em combinação com veículos aceitáveis para administração a um indivíduo por uma variedade de vias. Por conseguinte, a presente invenção é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem quantidades eficazes de aequorina, em combinação com um veículo aceitável.

Em outra forma de realização, a invenção proporciona também métodos para tratar um sintoma ou distúrbio associado com o desequilíbrio do cálcio por meio da administração a um doente em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de aequorina.

Outros objectos, características e vantagens da presente invenção irão tornar-se evidentes após análise da memória descritiva e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma micrografia de fluorescência que mostra a captação de aequorina pelos neurónios do hipocampo. A Figura 2 mostra vídeo micrografias que ilustram que a aequorina é neuroprotectora quando administrada antes da isquemia. A Figura 3 ilustra um gráfico de barras do número médio de azul de tripano contendo neurónios (mortos) após a isquemia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. EM GERAL

Deve-se notar que, tal como utilizado neste contexto e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e 4 "o/a" incluem referência plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, os termos "um" (ou "uma") , "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser aqui utilizados como sinónimos. Deve-se também notar que os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" podem ser utilizados como sinónimos. A menos que seja definido ao contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que vulgarmente entendidos por um especialista na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

II. A INVENÇÃO A aequorina é uma fotoproteína isolada originalmente de água-viva luminescente e outros organismos marinhos. 0 complexo de aequorina compreende uma proteína apoaequorina de 22.000 Dalton, oxigénio molecular e o luminóforo coelenterazina. Quando três iões Ca2+ se ligam a este complexo, a coelenterazina é oxidada em coelenteramida, com uma concomitante libertação de dióxido de carbono e luz azul. A aequorina não é exportada ou segregada pelas células, nem é compartimentada ou sequestrada dentro das células. Por conseguinte, as medições de aequorina têm sido utilizadas para detectar alterações de Ca2+ que ocorrem durante períodos relativamente longos. Em vários sistemas experimentais, a luminescência da aequorina foi detectável muitas horas ou dias após o carregamento da célula. Sabe-se ainda que a aequorina também não perturbar as funções celulares ou o desenvolvimento do embrião.

Devido à sua luminescência dependente de Ca2+ , o complexo de Aequorina foi amplamente utilizado como um indicador de 5

Ca2+ intracelular. A aequorina Aequorea victoria foi especificamente utilizada para: (1) analisar a resposta de secreção de células cromafinas adrenais simples aos agonistas colinérgicos nicotínicos; (2) esclarecer o papel da libertação de Ca2+ em lesões do músculo cardíaco; (3) demonstrar a libertação em grande quantidade de Ca2+ durante a fertilização; (4) estudar a regulação da expressão da bomba de Ca2+ do retículo sarcoplasmático no desenvolvimento de mioblastos de pintinhos; e (5) calibrar micropipetas com volume de injecção de apenas 3 picolitros. A purificação convencional de aequorina da água-viva Aequorea victoria requer procedimentos de extracção laboriosos e, por vezes produz preparações que são substancialmente heterogéneas, ou que são tóxicas para os organismos em estudo. Duas toneladas de água-viva normalmente produzem -125 mg do fotoproteína purificada. Em contraste, a aequorina recombinante é de preferência produzida por meio de purificação da apoaequorina a partir de Escherichia coli geneticamente modificadas, seguido de reconstituição do complexo de aequorina in vitro com coelenterazina pura. Este método de preparação proporciona um complexo de aequorina puro, não-tóxico, totalmente carregado que é adequado para utilização na presente invenção. Uma preparação para uso comercial exemplificativa de aequorina útil na presente invenção está disponível de Molecular Probes, Inc., sob o nome comercial AQUALITE. A aequorina útil na presente invenção foi, portanto, descrita e pode ser obtida comercialmente através de esquemas de purificação e/ou sínteses conhecidas dos especialistas na técnica. A função da aequorina é distinguida por várias características: a aequorina é não-tóxica e não interfere 6 com a estequiometria celular interna. (Miller et al., Methods Cell Biol. 40:305-338 (1994)); a proteína não é tóxica quando introduzida em células estranhas (Blinks, J. Environ Health Persp 83:75-81 (1990)). Sabe-se que cada molécula de aequorina liga-se a três iões de cálcio (Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 82:3154-3158 (1985)) . A presente invenção é dirigida à administração de composições que contêm aequorina a um indivíduo a fim de corrigir ou manter o equilíbrio de cálcio naquele indivíduo. Entende-se que a manutenção de concentrações de cálcio iónico no plasma e fluidos corporais é crucial para uma vasta variedade de funções corporais, incluindo, mas não limitado a excitabilidade neuronal, contracção muscular, permeabilidade da membrana, divisão celular, secreção hormonal e mineralização óssea. Entende-se que a perturbação na homeostase do cálcio, isto é, um desequilíbrio de cálcio, causa e/ou correlaciona com muitas doenças, síndromes e condições. O estudo de CaBPs levou ao seu reconhecimento como factores de protecção que actuam na manutenção de níveis adequados de cálcio iónico. Em certas formas de realização, os métodos da presente invenção compreendem a administração da aequorina como o único ingrediente activo para o tratamento do desequilíbrio de cálcio, para retardar o avanço do desequilíbrio de cálcio, para prevenir o aparecimento de do desequilíbrio de cálcio, e para a prevenção e/ou tratamento da recorrência do desequilíbrio de cálcio. Em outras formas de realização, a invenção proporciona métodos que compreendem a administração da aequorina, em combinação com um ou mais agentes adicionais que tenham valor terapêutico conhecido. 7

Tal como aqui utilizado, o termo "tratamento" inclui tratamento preventivo assim como o tratamento remitente do distúrbio. Tal como aqui utilizados, os termos "reduzir", "aliviar", "suprimir" e "inibir" têm o seu significado normalmente entendido de reduzir ou diminuir. Tal como aqui utilizado, o termo "progressão" significa aumentar em escopo ou em gravidade, avançar, crescer ou ficar pior. Tal como aqui utilizado, o termo "recorrência" significa o regresso de uma doença depois de uma remissão.

Tal como aqui utilizado, o termo "administrar" refere-se à colocar um doente, tecido, órgão ou célula em contacto com a aequorina. Tal como aqui utilizado, a administração pode ser realizada in vitro, isto é, num tubo de ensaio, ou in vivo, ou seja, em células ou tecidos de organismos vivos, por exemplo, seres humanos. Em formas de realização preferidas, a presente invenção abrange a administração de moléculas úteis na presente invenção a um doente ou individuo. 0 termo "doente" ou "indivíduo", usados aqui de forma equivalente, refere-se a um mamífero, de preferência um ser humano, que: (1) tem um distúrbio relacionado com o desequilíbrio de cálcio que pode ser remediado ou tratado através da administração de aequorina; ou (2) é susceptível a um distúrbio relacionado com desequilíbrio de cálcio que pode ser prevenido pela administração de aequorina.

Tal como aqui utilizado, "composição farmacêutica" significa quantidades terapeuticamente eficazes de aequorina, juntamente com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, e adjuvantes adequados, colectivamente "veículos farmaceuticamente aceitáveis". Tal como aqui utilizados, os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se à quantidade de agente activo suficiente para proporcionar 8 uma resposta terapêutica desejada sem efeitos secundários adversos indevidos, tais como toxicidade, irritação ou resposta alérgica. A "quantidade eficaz" especifica irá, obviamente, variar com factores tais como o estado particular a ser tratado, o estado fisico do doente, o tipo de animal a ser tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente (se houver), e as formulações específicas empregues e a estrutura dos compostos ou seus derivados. Neste caso, uma quantidade seria ser considerada terapeuticamente eficaz se resultasse num ou mais dos seguintes: (a) a prevenção de um distúrbio relacionado com o desequilíbrio de cálcio; e (b) a reversão ou a estabilização de um distúrbio relacionado com o desequilíbrio de cálcio. As quantidades óptimas eficazes podem ser facilmente determinadas por um especialista na técnica utilizando experimentação de rotina.

As composições farmacêuticas são líquidas ou liofilizadas ou então são formulações secas e incluem diluentes com vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iónica, aditivos tais como albumina ou gelatina para evitar a absorção a superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, glicerol polietileno), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, Thimerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de volume ou modificadores de tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente de polímeros tais como polietileno glicol à proteína, complexação com iões metálicos, ou incorporação do material dentro ou sobre preparações em partículas de compostos poliméricos tais como ácido poliláctico, ácido 9 polglicólico, hidrogéis, etc., ou em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas milamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócitos, ou esferoplastos. Tais composições irão influenciar o estado físico, a solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo, e a taxa de depuração in vivo. Composições de liberação controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos gordos, ceras, óleos) . São também englobados pela invenção métodos de administração de composições em partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxámeros ou poloxaminas). Outras formas de realização das composições incorporam revestimentos protectores de formas em partículas, inibidores de protease ou intensificadores de permeação para várias vias de administração, incluindo parentérica, pulmonar, nasal e oral. Em certas formas de realização, a composição farmacêutica é administrada por via parentérica, paracanceral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, intracraniana ou intratumoral.

Além disso, tal como é aqui utilizado "veículos farmaceuticamente aceitáveis" são bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem, mas não estão limitados a, 0,01 a 0,1 M e, de preferência, tampão fosfato 0,05 M, ou 0,9% de solução salina. Além disso, tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções, suspensões, e emulsões aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções 10 aquosas/alcoólicas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados.

Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos, tais como agueles à base de dextrose de Ringer, e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tal como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de agrupamento, gases inertes e semelhantes.

As composições de libertação controlada ou sustentada gue podem ser administradas de acordo com a invenção incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos gordos, ceras, óleos). São também compreendidas pela invenção composições em partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxámeros ou poloxaminas) e o composto acoplado a anticorpos dirigidos contra receptores tecido-específicos, ligandos ou antigénios ou acoplados a ligandos de receptores tecido-específicos.

Outras formas de realização das composições administradas de acordo com a invenção incorporam formas em partículas, revestimentos protectores, inibidores de protease ou intensificadores de permeação para várias vias de administração, incluindo parentérica, pulmonar, nasal, oftálmica, e oral.

Os compostos modificados pela ligação covalente de polímeros solúveis em água tais como polietileno glicol, copolimeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinilico, polivinilpirrolidona ou poliprolina são conhecidos por apresentar semividas substancialmente mais longas no sangue a seguir a injecção intravenosa do que os compostos 11 não modificados correspondentes. Essas modificações também podem aumentar a solubilidade do composto em solução aquosa, eliminar a agregação, aumentar a estabilidade física e química do composto, e reduzir em muito a imunogenicidade e reactividade do composto. Como resultado, a actividade biológica desejada in vivo pode ser conseguida pela administração desse polímero - o composto sequestra menos frequentemente ou em doses mais baixas do que com o composto não modificado.

Em ainda outro método de acordo com a invenção, uma composição farmacêutica que pode ser administrada num sistema de libertação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado utilizando perfusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, um emplastro transdérmico, lipossomas, ou outros modos de administração. Numa forma de realização, pode ser utilizada uma bomba. Numa outra forma de realização, podem ser utilizados materiais poliméricos. Em ainda outra forma de realização, um sistema de libertação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo terapêutico, isto é, a próstata, requerendo assim só uma fracção da dose sistémica. A preparação farmacêutica pode compreender só aequorina, ou pode ainda incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, e pode estar na forma sólida ou líquida tal como comprimidos, pós, cápsulas, grânulos, soluções, suspensões, xaropes, elixires, bebidas, emulsões, cremes, géis, formulações oftálmicas, ou supositórios, incluindo supositórios rectais e uretrais. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem também gomas, amidos, açúcares, materiais celulósicos, e suas misturas. A preparação farmacêutica que contém aequorina pode ser administrada a um doente, por exemplo, por implantação subcutânea de um grânulo. Numa outra forma de realização, 12 um grânulo proporciona a libertação controlada de aequorina, durante um certo período de tempo. A preparação pode também ser administrado por injecção intravenosa, intra-arterial, ou intramuscular de uma preparação líquida, administração oral de uma preparação líquida ou sólida, ou por aplicação tópica. A administração pode também ser conseguida através da utilização de um supositório rectal ou um supositório uretral.

As preparações farmacêuticas que podem ser administradas pela invenção podem ser preparados por processos conhecidos de dissolução, mistura, granulação ou formação de comprimido. Para administração oral, a aequorina ou seus derivados fisiologicamente tolerados tais como sais, ésteres, N-óxidos, e semelhantes, são misturados com aditivos habituais para este fim, tais como veículos, estabilizantes ou diluentes inertes, e convertidos por métodos usuais em formas apropriadas para administração, tais como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas. Exemplos de veículos inertes adequados são bases de comprimidos convencionais tais como lactose, sacarose ou amido de milho em combinação com ligantes tais como acácia, amido de milho, gelatina, com agentes desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata, ácido algínico, ou com um lubrificante tal como ácido esteárico ou o estearato de magnésio.

Exemplos de veículos ou solventes oleosos adequados são óleos vegetais ou animais, tais como óleo de girassol ou óleo de fígado de peixe. As preparações podem ser realizadas tanto como grânulos secos como húmidos. Para administração parentérica (subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular), os compostos anti-andrógenos, ou seus derivados fisiologicamente tolerados tais como 13 sais, ésteres, N-óxidos e semelhantes são convertidos numa solução, suspensão ou a expulsão, se desejado com as substâncias usuais e adequadas para este fim, por exemplo, solubilizantes ou outros auxiliares. Exemplos são líquidos estéreis, tais como água e óleos, com ou sem a adição de um tensioactivo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Óleos ilustrativos são os de petróleo, animal, vegetal, ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo mineral. Em geral, água, soro fisiológico, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, e glicóis tais como propileno glicóis ou polietileno glicol são os veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injectáveis. A preparação de composições farmacêuticas que contêm um componente activo é bem compreendida na técnica. Tais composições podem ser preparadas como aerossóis administrados à nasofaringe ou como injectáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões; no entanto formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão em líquido antes da injecção podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, ou qualquer combinação destes. Além disso, a composição pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH que aumentam a eficácia do ingrediente activo.

Um componente activo pode ser formulado na composição como formas de sal farmaceuticamente aceitáveis neutralizadas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de 14 adição de ácido, que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácidos fosfóricos, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, e outros. Os sais formados a partir dos grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e semelhantes.

Para administração tópica à superfície do corpo utilizando, por exemplo, cremes, géis, gotas, e semelhantes, aequorina ou seus derivados fisiologicamente tolerados são preparados e aplicados como soluções, suspensões ou emulsões num diluente fisiologicamente aceitável, com ou sem um veículo farmacêutico.

Num outro método de acordo com a invenção, o composto activo pode ser administrado numa vesícula, em particular num lipossoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990);

Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infectious Desease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, NY, pp. 353-365 (1989)).

Para utilização em medicina, os sais de aequorina podem ser sais farmaceuticamente aceitáveis. Outros sais podem, contudo, ser úteis na preparação dos compostos de acordo com a invenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis adequados dos compostos incluem sais de adição de ácido que podem, por exemplo, ser formados por mistura de uma solução de aequorina com uma solução de um ácido farmaceuticamente aceitável tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido metanossulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzóico, ácido oxálico, 15 ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico ou ácido fosfórico.

Além disso, as composições aqui descritas que contêm aequorina podem ser fornecidas sob a forma de composições nutracêuticas em que a aequorina evita o aparecimento de ou reduz ou estabiliza vários distúrbios prejudiciais relacionados com o desequilíbrio de cálcio. 0 termo "nutracêutico" ou "composição nutracêutica", para os fins da presente memória descritiva, refere-se a um produto alimentar, ou parte de um produto alimentar, que oferece benefícios médicos para a saúde, incluindo a prevenção e/ou tratamento da doença. Uma composição nutracêutica de acordo com a presente invenção pode conter apenas aequorina de acordo com a presente invenção como um ingrediente activo ou, em alternativa, pode ainda compreender, em mistura com suplementos alimentares, incluindo vitaminas, coenzimas, minerais, ervas, aminoácidos e afins que complementam a dieta aumentando a ingestão total daquela substância.

Desse modo, a presente invenção proporciona métodos para proporcionar benefícios nutracêuticos para um doente que compreendem a etapa de administrar ao doente uma composição nutracêutica que contém aequorina. Estas composições em geral incluem um "veículo nutracêuticamente aceitável", que, tal como aqui referido, é qualquer veículo adequado para administração oral, incluindo os veículos farmaceuticamente aceitáveis acima mencionados adequados para a via oral. Em certas formas de realização, as composições nutracêuticas de acordo com a invenção compreendem suplementos dietéticos que, definidos numa base funcional, incluem agentes estimulantes do sistema imunológico, agentes anti-inflamatórios, agentes antioxidantes, agentes antivirais, ou misturas destes. 16

Os agentes estimulantes do sistema imunológico e/ou agentes antivirais são úteis para acelerar a cicatrização de feridas e melhorar a função imunológica; incluem extractos de flores-de-cone, ou ervas do género Echinacea, extractos de ervas do género Sambuca e extractos de Goldenseal. Ervas do género Astragalus também são eficazes estimulantes do sistema imunológico tanto na sua forma natural como processada. Astragalus estimula o desenvolvimento das células-tronco na medula e células imunitárias activas dos tecidos linfáticos. 0 zinco e seus sais bioactivos, tais como o gluconato de zinco e o acetato de zinco, também actuam como estimulantes do sistema imunológico no tratamento do resfriado comum. Antioxidantes incluem o aminoácido natural alicina que contém enxofre, que actua para aumentar o nivel de enzimas antioxidantes no sangue. Ervas ou extractos de ervas, como o alho, que contém alicina, também são antioxidantes eficazes. As catequinas e os extractos de ervas, como chá verde que contém catequinas, também são eficazes antioxidantes. Os extractos do género Astragalus também apresentam actividade antioxidante. Os bioflavonóides, como a quercetina, hesperidina, rutina, e suas misturas, são também eficazes como antioxidantes. 0 papel benéfico primário dos flavonóides podem ser proteger a vitamina C contra oxidação no organismo. Isto faz com que mais vitamina C, ou ácido ascórbico, fique disponível para utilização pelo corpo.

Os bioflavonóides, tais como a quercetina são também agentes anti-inflamatórios eficazes e podem ser utilizados como tal nas composições da invenção. Suplementos anti-inf lamatórios à base de ervas e anti-inflamatórios compostos derivados de plantas ou ervas também podem ser utilizados como agentes anti-inflamatórios da composição 17 inventiva. Estes incluem bromolaína, uma enzima proteolitica encontrada no ananás; chás e extractos de urtiga; açafrão-da-india, extractos de curcuma ou curcumina, um pigmento amarelo isolado do açafrão-da-índia .

Um outro complemento que pode ser utilizado na presente invenção é o gengibre, derivados de ervas do género Zingiber. Constatou-se que este possui actividade cardiotónica devida aos compostos tais como o gingerol e o composto relacionado shogaol, bem como proporciona benefícios no tratamento de vertigens e distúrbios vestibulares. 0 gengibre também é eficaz no tratamento de náuseas e outros distúrbios do estômago.

Os suplementos que ajudam na reconstrução das estruturas de tecidos moles, especialmente para a reconstrução da cartilagem, são úteis em composições para o tratamento da dor da artrite e outras doenças articulares. A glucosamina, sulfato de glucosamina, condroitina, sulfato de condroitina são particularmente úteis para esta finalidade. A condroitina pode ser derivada de uma variedade de fontes, tais como Chifre Aveludado de Uapiti. Complexos lipídicos marinhos, complexos de ácidos gordos ómega 3 de, e óleo de peixe são também conhecidos como sendo úteis no tratamento da dor associada com a artrite.

Os suplementos úteis no tratamento de enxaqueca incluem matricária e Gingko biloba. 0 principal ingrediente activo na matricária é o sesquiterpeno lactona partenolida, que inibe a secreção de prostaglandinas, que por sua vez causam dor através da actividade vasoespástica nos vasos sanguíneos. A matricária também exibe propriedades anti-inflamatórias. 0 óleo de peixe, devido às suas acções de estabilização de plaquetas e antivasospásticas, também pode ser útil no tratamento de dores de cabeça de 18 enxaqueca. A erva Gingko biloba também auxilia no tratamento de enxaquecas, estabilizando as artérias e melhorando a circulação do sanque.

Embora alguns dos suplementos acima mencionados tenham sido descritos quanto aos seus efeitos farmacológicos, outros suplementos podem também ser utilizados na presente invenção e os seus efeitos são bem documentadas na literatura cientifica.

III. EXEMPLOS

Exemplo 1. A aequorina é captada por neurónios do hipocampo. Numa série de estudos preliminares, aequorina foi bilateralmente injectada directamente no hipocampo de 3 ratos adultos diferentes. Os ratos foram levados de volta às suas gaiolas durante pelo menos 24 horas após o que foram anestesiados e os seus cérebros removidos, seccionados e corados para aequorina, utilizando um anticorpo monoclonal anti-aequorina. 0 anticorpo primário foi então visualizado utilizando um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594. A Figura 1 mostra um exemplo de neurónios do hipocampo marcados com aequorina usando a microscopia de fluorescência convencional. 0 painel da esquerda é uma fotomicrografia do hipocampo, mostrando a localização da ponta da cânula na região CAI. 0 rectângulo branco indica a localização dos dois neurónios piramidais CA3 marcados com Aequorina mostrados no painel da direita. Os dados mostram que a perfusão directa de aequorina no hipocampo (painel esquerdo) resulta na marcação dos neurónios piramidais em CAI e CA3. A aequorina (6% p/v), foi dissolvida em aCSF sem cálcio, na presença de 3% de DMSO. A solução foi injectada lentamente (taxa de ~1 pL/min) directamente no hipocampo utilizando uma bomba de seringa (volume de ~1 pL por lado) . Depois conclusão da injecção, a cânula de 19 administração permaneceu no lugar durante cerca de 1 minuto antes da remoção. Um exemplo de dois neurónios piramidais CA3 contendo aequorina é apresentado no painel da direita (aumentado 40X) . Os dados demonstram claramente a administração de aequorina directamente no cérebro e também que a aequorina se espalha em todo o hipocampo e é então captada pelos neurónios em CAI, CA3 e no giro dentado.

Exemplo 2. Efeitos da aequorina na morte celular após isquemia.

Foi realizada uma experiência para investigar os benefícios da proteína de ligação ao cálcio, a aequorina, em isquemia. A aequorina (4%) foi dissolvida no líquido cefalorraquidiano sem cálcio com 6% de DMSO (sulfóxido de dimetilo) . Duas a três horas mais tarde, um rato foi anestesiado com isofluorano e sacrificados por decapitação. Fatias de cérebro de quatrocentos micrómetros de espessura foram preparadas utilizando um Vibratome de temperatura controlada. As fatias foram imediatamente colocadas em fluido cefalorraquidiano artificial oxigenado (aCSF) (95% de 02/5% de C02) com a seguinte composição (em mM) : NaCl 124, KC1 2,8, MgS04 2, NaH2P04 2, CaCl2 2, NaHC03 26, ascorbato de sódio 0,4, D-glucose 10, pH 7,4, ~30 °C) . Após 1 hora de recuperação, as fatias foram submetidas a um episódio de 5 minutos de isquemia. A isquemia foi induzida substituindo a glicose por frutose, e substituindo o oxigénio por azoto. Após o desafio isquémico de 5 minutos, as fatias foram retornadas ao aCSF normal oxigenado contendo 0,04% de azul de tripano e incubadas em aCSF de azul de tripano durante 30 minutos. O método de exclusão de azul de tripano (as células saudáveis excluem o azul de tripano enquanto que as células mortas ou a morrer captam o azul de tripano e, 20 assim, aparecem em azul) é geralmente usado para avaliar a morte celular em cultura de células ou fatias de cérebro. Após incubação em azul de tripano, as secções foram removidas e colocadas em fixador de um dia para o outro, seguido por 3 horas de incubação em 30% de sacarose. As fatias de 400 pm de espessura foram então seccionadas a uma espessura de ~40 pm usando um criostato, montadas em lâminas e lamínulas revestidas com gelatina. Com referência à Fig. 2, é evidente gue há mais neurónios manchados com azul de tripano (mortos) no controle (painel superior) em relação aos neurónios injectados com aequorina (painel inferior). A Fig. 3 mostra um gráfico de barras do número médio de neurónios que contêm azul de tripano (mortos) após a isquemia. Esta experiência demonstra que a injecção de aequorina directamente no hipocampo confere neuroprotecção contra um insulto isquémico.

Lisboa

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Aequorina caracterizada por ser destinada à utilização como produto farmacêutico.

2. Composição caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de aequorina em combinação com um veiculo aceitável para utilização como produto farmacêutico.

3. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de aequorina em combinação com um veiculo aceitável. Lisboa,