WO2007122280A1 - Uso del factor de crecimiento de hígado (lgf) como regenerador tisular pleiotrópico - Google Patents

Uso del factor de crecimiento de hígado (lgf) como regenerador tisular pleiotrópico Download PDF

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WO2007122280A1
WO2007122280A1 PCT/ES2007/070080 ES2007070080W WO2007122280A1 WO 2007122280 A1 WO2007122280 A1 WO 2007122280A1 ES 2007070080 W ES2007070080 W ES 2007070080W WO 2007122280 A1 WO2007122280 A1 WO 2007122280A1
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Juan José DÍAZ GIL
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Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario Puerta De Hierro
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the invention relates to the regeneration of damaged tissues through the use of growth factors. Specifically, the invention relates to the use of liver growth factor (LGF) as a total or partial regenerator of a great diversity of damaged tissues (pleiotropic).
  • LGF liver growth factor
  • the Liver Growth Factor is a purified rat serum molecule after 70% partial hepatectomy, or either in rats with bile duct ligation that, injected into rats or mice, has "in vivo" activity as a growth factor, increasing the synthesis of liver DNA, dry liver weight, the number of "PCNA-positive” cells ( nuclear cell proliferation antigen), producing a transient hyperplasia without detecting aggressive, immediate or permanent effects: no fibrosis, amyloid production, nor mitochondrial or nuclear disturbances (D ⁇ az Gil et al., 1994).
  • albumin-bilirubin complex Its chemical structure was defined by the same authors as an albumin-bilirubin complex, after a study of absorption spectra, fluorescence, circular dichroism, triptych maps, amino acid composition, electrophoretic mobility, immunofluorescence, formation of albumin-bilirubin complexes "in vitro ", study of the biological activity both" in vivo "and in vitro” and identification by HPLC (D ⁇ az Gil et al., 1987; D ⁇ az GiI et al., 1988).
  • the LGF also has "in vitro" activity, in primary culture of rat hepatocytes, increasing the synthesis of DNA, the number of cells, the activity of the membrane transport system A and others (D ⁇ az Gil et al., 1986). LGF has also been purified from human serum with type B hepatitis, with structure and characteristics almost identical to that of rats (D ⁇ az Gil et al., 1989). Other authors (Abakumova et al., 1994) have corroborated Ia albumin-bilirubin complex activity as liver growth factors.
  • albumin receptors have been defined in the cell membrane, the three glycoproteins: a gp60, with a function mainly of transcytosis, which would mainly be responsible for passing the albumin from one side of the endothelial cells (Ghinea and cois., 1988), and two with endocytosis function, to introduce the albumin into the cell, gp18 and gp31.
  • the latter receptors preferably bind the albumins in which their conformation has been varied by "binding" to a ligand. The affinity is 1000 times compared to that observed with native albumin (Schnitzer et al., 1992).
  • the gp18 and gp31 are preferentially expressed in endothelial cells of fetal tissues, newborns or adults, registering greater concentration in the organs of very active proliferation or in the phases of greater growth, in brain, lung, thymus, heart, skeletal muscle, liver , spinal cord, spleen, pancreas, testis, adenohypophysis, placenta, endometrium, myometrium and leukocytes (Morioanu et al., 1990).
  • TNF- ⁇ does not in itself produce mitogenic effects; in fact, it is closely linked to the acute phase, regardless of its etiology: ischemia, trauma, inflammation, toxicity (as reviewed by Ding WX and cois., 2004, and Trauner M and cois., 1999) and, even, its injection rats can lead to endocrine and hematological disorders (Kettelhut I and cois, 1987); In addition, it is closely related to cell death, both due to necrosis and apoptosis (reviewed by Malhi H et al., 2006). Since the stimulation of TNF- ⁇ is linked to both mitogenic stimulation and cell death effects, an increase in its expression induced by LGF does not unequivocally describe the activity of LGF.
  • LGF is capable of inducing mitosis in hepatocyte culture (D ⁇ az Gil et al., 1986), where there are no endothelial cells present that could produce TNF- ⁇ . Therefore, its possible utility to induce proliferation of tissues other than liver and, even, the effect that could have on them were to be demonstrated.
  • LGF lipoprotein
  • a) atherosclerosis disease caused by the deposition of cholesterol in the walls of the arteries from LDL, low density lipoproteins, which are, together with HDL, the two main types of lipoproteins linked to which cholesterol is transported by Ia blood. From the cholesterol deposits a plaque is formed, which is covered with fibrotic tissue, causing in some cases obstruction and, in others, occasional rupture of the plaque, with thrombus formation that travels through the bloodstream to its obstruction and production of ischemia.
  • the therapeutic solutions to this situation are very scarce and of low efficacy.
  • Coronary heart disease an important mortality factor among the western population in whose appearance Ia cardiac fibrosis is an important risk factor (Watatsuki T. et al., 2004; Poulsen SH and cois., 2005).
  • the search for drugs to prevent or treat said disease is not simple, because the peculiarities of the coronary arteries make it difficult to extrapolate the effects that the tested compounds may have on them from the data obtained in other arteries.
  • the coronary arteries are responsible for the distribution of blood to the heart and have structural and functional characteristics different from other arteries: its vascular bed is different, the composition of its wall is different and its diameter changes depending on the metabolic demands of the heart, being Therefore, the muscle / elastic ratio is greater than in other arteries, such as the carotid.
  • liver carcinoma a type of cancer that has special characteristics that make it quite refractory to conventional therapy
  • LGF lymphothelial growth factor
  • the present invention responds to the need to find therapeutic agents useful for the mentioned situations.
  • the capacity of the LGF for the regeneration of various organs subject to lesions or aggressions is described, resulting in an improvement of the described pathological situations and a stimulating effect of regenerative processes in different tissues.
  • LGF LGF-like growth factor-1 fibrotic myocardial arteries
  • injured tissues whose regeneration is favored by the stimulation of angiogenesis, damaged testicular tissue, damaged spinal cord and carcinoma liver, as well as for the prevention and / or treatment of disorders or diseases in which said tissues are involved (atherosclerosis, coronary heart disease, myocardial infarction, bone fractures, skin lesions, brain lesions, thrombosis, infertility, motor disability or liver cancer) is the subject of this patent application.
  • the invention relates to the use of the liver growth factor in the manufacture of medicaments useful in the tissue regeneration of one or more injured tissues, tissue that is selected from the atherosclerotic cardiovascular tissue, the walls of the fibrotic coronary arteries, the tissue of the injured genito-urinary tract, injured spinal cord tissue, liver carcinoma and any injured tissue, other than those mentioned, in whose regeneration an increase in angiogenesis is useful.
  • an object of the invention is the use of the liver growth factor in the manufacture of a medicament useful for the regeneration of atherosclerotic cardiovascular tissue, thanks to the effect of decreasing atherosclerosis that is demonstrated later in one of the Examples of the invention.
  • LGF intraperitoneally produces a significant decrease in the extension of atherosclerotic plaques, together with an increase in the expression of paraoxonasai, a key enzyme in lipid metabolism.
  • oxidized plasma whose stimulation has a strictly inverse relationship with the disappearance of LDL plaques and with which possible therapeutic treatments of atherosclerosis based on the stimulation of this enzyme are currently being tested (Durrington, et al., 2001; Nackness et al., 2002; Tward et al., 2002). Therefore, it is an object of the invention to use the liver growth factor for the manufacture of a medicament for the treatment of atherosclerosis.
  • Another aspect of the invention is the use of the liver growth factor in the manufacture of a medicament useful for the regeneration of the structure of fibrotic coronary arteries, especially intramyocardial arteries, which helps to reduce the risk of coronary heart disease occurs.
  • the treatment with LGF of spontaneously hypertensive rats, a model of essential human hypertension the treatment with LGF produces an important structural improvement in the intramyocardial arteries that supposes an important recovery of the normal architecture of the walls of said arteries, observing an increase in the internal diameter of the arteries, with a decrease in the wall / light ratio, all coupled with a decrease in the amount of collagen and extracellular matrix and in the ratio of collagen / light area, an increase of the number of nuclei of smooth muscle cells per unit area in the middle and, in addition, a decrease in the area occupied by the vacuoles in the arterial wall. All this should produce an improvement in the functionality of the heart, reducing the risk of coronary heart disease. For this reason, it is an object of
  • liver growth factor in the manufacture of a medicament useful for the stimulation of angiogenesis, the formation of capillaries from existing ones, a process that can be activated in response to tissue damage and that may be an important factor in the regeneration of damaged tissue. Therefore, objects of the invention are the uses of the liver growth factor for the manufacture of medicaments for the treatment of the heart after a heart attack, bone fractures, skin lesions, lesions brain, as an aid to ensure the success of transplants or for the prevention and / or treatment of thrombosis.
  • a further aspect of the invention is the use of the liver growth factor in the manufacture of a medicament useful for the treatment of damaged testicular tissue, thanks to the activation of the proliferation and subsequent differentiation of the precursors of the Leydig cells that are It observes after the administration of LGF to rats used as a model of testicular aggression.
  • HSL Hemmone-sensitive Upase
  • liver growth factor in the manufacture of a medicament to be used in treatments to increase fertility.
  • Another aspect of the invention is the use of liver growth factor in the manufacture of a medicament useful for the regeneration of injured spinal cord tissue. Due to the importance that the lesion of this tissue has in the disability or total inability to move the limbs, it is also an object of the invention to use the liver growth factor for the manufacture of a medicament to improve the mobility of people with difficulties or with total inability to move the limbs, upper and / or lower.
  • liver growth factor in the manufacture of a medicament useful in the treatment of hepatic carcinoma (hepatocarcinoma), thanks to the effect of inhibition of the growth that it produces in hepatocarcinoma cells.
  • LGF LGF
  • rats or mice that constitute models of different disorders or diseases that affect humans or other animals and whose severity or risk of worsening decrease with Ia regeneration of one or more tissues in which said disorder or disease manifests. It is therefore an additional aspect of the invention a method for the treatment of a disorder or a disease that is selected from atherosclerosis, coronary heart disease, infertility, spinal cord injury, liver carcinoma, myocardial infarction including the prevention of heart attacks.
  • bone fracture including the acceleration of the regeneration of fractured bones, cuts or superficial wounds in skin tissue and brain lesions, particularly a cerebral thrombosis
  • said method comprising the administration to a human being or an animal of liver growth factor
  • Preferred embodiments of said method of the invention are those in which administration of LGF occurs intravenously, as well as those in which administration is intraperitoneally.
  • FIGURES Figures 1a - 1f show graphs in which the results obtained are compared when examining different parameters related to atherosclerosis measured in intramyocardial arteries of normotensive control rats (WKY) (values represented by unfilled bars,), spontaneously untreated hypertensive rats (SHR) (values represented by bars with continuous dark fill,
  • Fig. 1a represents the internal diameter of myocardial arteries, measured in micrometers;
  • Fig. 1 b represents the value obtained when calculating the relationship between the wall and the light of said arteries; Fig.
  • FIG. 1c represents the area of collagen, in square micrometers, measured in each case;
  • Fig. 1d represents the relationship between the collagen surface and the arterial lumen;
  • Fig. 1e represents the number of nuclei of smooth muscle cells measured per square millimeter on average;
  • Fig. 1f represent the percentage that the area occupied by the vacuoles represents with respect to the total area of the arterial wall.
  • Figure 2 shows photographs corresponding to sections of coronary arteries stained with Masson's trichrome and Syrian red, which allows staining of collagen fibers and muscle cell nuclei; The spaces without staining agent in the area of the walls correspond to the vacuoles. The cuts were taken from: top photograph, marked "A”: control normotensive rats; intermediate photograph, marked "B”: spontaneously untreated hypertensive rats; bottom photograph, marked "C”: spontaneously hypertensive rats treated with LGF.
  • Figure 3 shows the difference in the area of vascularization, expressed as the surface occupied by erythrocytes, in square micrometers, measured in the skin tissue of mice treated with subcutaneous sponges impregnated with rat serum albumin (value marked "Ctrl.” , represented by a bar without padding,) or with LGF (value marked "+ LGF", represented by a bar with continuous dark padding,
  • Figure 4 shows the average values of total number of cells positive for bromodeoxyuridine (BrdU +) detected in rats after slaughter, after the number of days indicated in abscissa since receiving the following treatments: Ctrl .: control rats, a those that saline was injected; EDS: rats in which ethylene dimethane sulfonate was injected at time 0; LGF / rats that received 5 ⁇ g LGF / rat, two injections per week for a maximum time of 4 weeks, depending on the time of slaughter; EDS + LGF: rats that received a single injection of ethylene dimethane sulphonate at time 0 and two injections per week with 5 ⁇ g LGF / rat for a maximum time of 4 weeks, depending on the time of sacrifice.
  • Ctrl . control rats, a those that saline was injected
  • EDS rats in which ethylene dimethane sulfonate was injected at time 0
  • LGF / rats
  • Figure 5 shows the percentage of growth with respect to the initial amount of cells induced by the addition of the different amounts of LGF indicated in the abscissa axis, expressed in pg / ml.
  • LGF The activity of LGF in atherosclerosis has been manifested in several experiments carried out in a model of "knock-out" mice of Apoenzyme E (Apo E, a fundamental protein for cholesterol metabolism, being a ligand that allows the elimination of remaining cholesterol of the absorbed in the diet), a model in which atherosclerosis occurs by the formation of cholesterol plaques in the arteries progressively, from the third month of life approximately.
  • Apo E Apo E, a fundamental protein for cholesterol metabolism, being a ligand that allows the elimination of remaining cholesterol of the absorbed in the diet
  • Example 2 Restructuring of intramyocardial arteries
  • the spontaneously hypertensive rat is a model of essential human hypertension.
  • SHR rats are characterized by remodeling and vascular fibrosis, both in conduction and resistance vessels.
  • essential hypertension is associated with cardiac fibrosis and is, as mentioned, a risk factor for coronary heart disease (Watatsuki T. Y cois., 2004; Poulsen S. H. et al., 2005).
  • Untreated SHR rats (SHR), normotensive control rats were used
  • the hearts were fixed with 10% paraformaldehyde, included in paraffin and 10 ⁇ m thick cuts were made.
  • the cuts were stained with Masson Trichrome (which stains the collagen fibers blue or green) and with Syrian red (which stains the connective fibers of an intense red color, while staining the cytoplasmic structures and nuclei of the weak red cells and bright yellow), and images of intramyocardial coronary arteries of external diameter ⁇ 100 ⁇ m (6-15 arteries per heart) were obtained.
  • the ability to stimulate the formation of blood vessels is an important factor in the regeneration of many tissues. It could, for example, help repair a heart damaged by a heart attack, repair bone fractures, could minimize brain injuries, or could facilitate alternative pathways to thrombi and improve circulation.
  • the endothelial cells line the inner wall of the vessels.
  • the activity of LGF on endothelial cells of the portal vein in the liver, and the activity of LGF on human endothelial cells of the umbilical vein in culture suggest that endothelial cells could be the first target of The action of the LGF.
  • the activity of the LGF on a model of hypertensive rats can also be interpreted, SHR (Somoza et al., 2006), in which it produces a restructuring of the wall of the carotid artery, which led the authors of the invention to verify If this possible activity of LGF could be translated into a stimulation of angiogenesis.
  • ethylene dimethane sulphonate 75 mg / kg body weight
  • the total loss of Leydig cells after the administration of EDS causes a drop in serum testosterone concentration in addition to changes in gonadotropic hormone levels.
  • Ie accompanies a loss of germ cells of the seminiferous epithelium and a complete desquamation of elongated spermatids.
  • Germ cells produce in response to cellular damage a proinflammatory cytokine, TNF- ⁇ (tumor necrosis factor alpha). This cytokine affects the activity of Sertoli cells and inhibits the synthesis of steroid hormones by Leydig cells.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • LGF 5 ⁇ g LGF / rat, two injections per week for 4 weeks
  • VEGF-A growth factor of vascular endothelium type A
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇
  • the cells that appear positive for this cytokine vary depending on the stage of the seminiferous epithelial cycle.
  • tubules where they appear elongated spermatids are positive spermatogonias and some primary spermatocytes.
  • tubules with round spermatids these cells are the ones that are marked.
  • EDS group most of the tubules show round sperm tide.
  • the mareaje is similar to the control although of less intensity and the tubules with spermatogonias are predominant.
  • the animals of the EDS + LGF group also show a predominant sperm tide.
  • the LGF seems to exert a protection of the seminiferous tubule against damage induced by androgen depletion.
  • the number of testosterone producing cells increases both at baseline and after treatment with EDS.
  • testicular regeneration is faster, which could be due to an increase in androgenic production.
  • HSL which supports the possible usefulness of LGF to stimulate spermiogenesis and increase fertility in individuals with a sperm count lower than the average.
  • LGF could also be used for the regeneration of the spinal cord, although the physiological effect sought was completely different: while in experiments related to Parkinson's disease we must try to counteract the loss of dopaminergic terminals that, when losing the tyrosine hydroxylase enzyme, synthesizing less neurotransmitter, dopamine, in the case of the recovery of spinal cord injuries, it is, in some way, "filling the gap" left by trauma or hemisection, in which neurons are involved , astrocytes, Schwann cells, endothelial cells and others and, above all, it is about restoring the nerve impulse from side to side of the lesion.
  • the route of administration of the LGF that is proposed is also different: while in the case of Parkinson's disease, the LGF was administered by intrastratial or intraventricular infusion by an osmotic minipump, in the case of studies for the treatment of lesions of Ia Spinal cord has been tested to administer LGF by intraperitoneal injection.
  • a traumatic spinal cord injury model was used in rats in which, two months after the lesion was stabilized, the rats are paralyzed from half body down . Rat fetal cells were transplanted to the damaged area and the LGF was injected (4.5 ⁇ g / rat, 2 injections per week for two weeks). Then the rats were sacrificed. The medulla was completely regenerated, without necrosis, abundant vascularization and no trace of fetal cells. Even the limit of the injury was difficult to distinguish.
  • the LGF has been injected one week after the injury (4.5 ⁇ g / rat, twice a week, for two weeks), without a transplant. cells to fill the gap left by the lesion, observing the following effects:
  • Example 6 Hepatic carcinoma Hepatocellular carcinoma has special characteristics that make it quite refractory to conventional therapy (Venook et al., 1994), which implies an uncertain prognosis. In experimental models in rats, it has been shown that the administration of TNF- ⁇ after 70% partial hepatectomy decreases tumor development (Slooter et al., 1995), which seems to indicate that this type of effect could be a possible Treatment of this type of cancer.
  • LGF exerts its mitogenic action on liver mediated, at least in part, by TNF- ⁇ (D ⁇ az Gil et al., 2003), which led them to think that perhaps LGF could have anticancer action.
  • normal liver cell cultures (Clone-9, normal rat liver epithelium cells, with access number in ATCC CRL-1439), hepatoblastoma cells (HepG2, a well differentiated tumor, were made, with access number in the ATCC HB-8065) and hepatocarcinoma cells (PLC / PRF / 5, a dedifferentiated tumor, with access number in EACC 85061113).
  • LGF was added in varying amounts (0-50 picograms / ml)
  • a stimulation of normal cell growth and hepatoblastoma was detected and an inhibition of hepatocarcinoma cell growth (see Figure 5).
  • LGF modifies the mitochondrial membrane potential (measured by the JC-1 compound, Molecular Probes OR, USA), another step in the apoptosis process. Likewise, the LGF produces opening of the pores of the mitochondria (measured by accumulation of Rhodamine 123), another step of the apoptotic route.
  • LGF stimulates caspases (fundamental enzymes in the apoptosis process), measured by specific fluorogenic substrates (Research Biochemicals International). Mainly caspase 3 (stimulation more than 20 times on the controls), and to a lesser extent Ia 8 and 9.

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Abstract

Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador tisular pleiotrópico. Se basa en el efecto mitogénico en general y estimulador de la angiogénesis en particular que el LGF presenta en diversos órganos, tales como el testículo, la médula espinal o la piel, así como su actividad antifibrótica en arterias coronarias, su capacidad de reestructuración de las paredes de arterias coronarias y arterias de la circulación mayor y menor, su capacidad estimuladora de enzimas anticolesterolémicas como la paraoxonasa y el efector inhibidor del crecimiento de células de hepatocarcinoma. Estos efectos del LGF posibilitan su uso para el tratamiento de patologías como aterosclerosis, enfermedad coronaria, trombosis o carcinoma hepático, así como para ayudar en la recuperación de tejidos lesionados tales como los de testículo, médula espinal, corazón infartado, hueso fracturado, piel dañada o cualquier otro tejido cuya recuperación se acelere por estimulación de la angiogénesis.

Description

USO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HÍGADO (LGF) COMO REGENERADOR TISULAR PLEIOTRÓPICO
Campo técnico
La invención se refiere a Ia regeneración de tejidos dañados mediante Ia utilización de factores de crecimiento. Concretamente, Ia invención se refiere al uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador, total o parcial, de una gran diversidad de tejidos dañados (pleiotrópico).
Antecedentes de Ia Técnica
El Factor de crecimiento de hígado, LGF (del inglés "liver growth factor"), descubierto hace ya algunos años (Díaz Gil y cois., 1986), es una molécula purificada de suero de ratas después de hepatectomía parcial del 70%, o bien en ratas con ligadura del conducto biliar que, inyectado a ratas o ratones tiene actividad "in vivo" como factor de crecimiento, incrementando Ia síntesis de ADN de hígado, el peso seco de hígado, el número de células "PCNA- positivas" (antígeno nuclear de proliferación celular), produciendo una hiperplasia transitoria sin que se detecten efectos agresivos, ni inmediatos ni permanentes: sin producción de fibrosis, amiloides, ni perturbaciones mitocondriales ni nucleares (Díaz Gil y cois., 1994).
Su estructura química fue definida por los mismos autores como un complejo albúmina-bilirrubina, después de un estudio de espectros de absorción, fluorescencia, dicroísmo circular, mapas trípticos, composición de aminoácidos, movilidad electroforética, inmunofluorescencia, formación de complejos albúmina-bilirrubina "in vitro", estudio de Ia actividad biológica tanto "in vivo" como in vitro" e identificación por HPLC (Díaz Gil y cois., 1987; Díaz GiI y cois., 1988).
El LGF tiene asimismo actividad "in vitro", en cultivo primario de hepatocitos de rata, incrementando Ia síntesis de ADN, el número de células, Ia actividad del sistema A de transporte de membrana y otros (Díaz Gil y cois., 1986). El LGF se ha purificado igualmente de suero de humanos con hepatitis tipo B, con estructura y características casi idénticas que el de ratas (Díaz Gil y cois., 1989). Otros autores (Abakumova y cois., 1994) han corroborado Ia actividad de complejos albúmina-bilirrubina como factores de crecimiento de hígado.
Igualmente, se ha demostrado Ia capacidad del LGF para estimular Ia regeneración del hígado dañado por Ia acción de diversas hepatotoxinas (Díaz Gil y cois., 1994b; Díaz Gil y cois., 1999). En un modelo de cirrosis por CCI4, una vez llegado a una situación irreversible, Ia inyección del LGF fue capaz de disminuir Ia fibrosis, produciendo una reestructuración sustancial del parénquima hepático, mejora de inflamación y necrosis, aumento de funcionalidad hepática y recuperación de diversas funciones hemodinámicas, como: presión portal, presión arterial, shunting portosistémico y resistencia vascular sistémica, así como reducción de Ia ascitis. Sin embargo, el complejísimo entramado que da lugar al establecimiento de fibrosis en los distintos tipos de órganos, aun teniendo diversas pautas en común, presenta tantas particularidades dependiendo del órgano de que se trate, que Ia acción antifibrótico del LGF en hígado no aseguraba que pudiera presentar Ia misma capacidad en otro órgano diferente.
Por otro lado, y en investigaciones realizadas por diversos grupos principalmente en células endoteliales, se han definido tres tipos de receptores de albúmina en membrana celular, las tres glicoproteínas: una gp60, con función principalmente de transcitosis, que se encargaría principalmente de pasar Ia albúmina de un lado a otro de las células endoteliales (Ghinea y cois., 1988), y dos con función de endocitosis, para introducir Ia albúmina al interior de Ia célula, gp18 y gp31. Estos últimos receptores ligan preferentemente las albúminas en las que se ha variado su conformación por "binding" a un ligando. La afinidad es 1000 veces comparada con Ia que se observa con albúmina nativa (Schnitzer y cois., 1992). Las gp18 y gp31 se expresan preferentemente en células endoteliales de tejidos fetales, recién nacidos o adultos, registrándose mayor concentración en los órganos de proliferación muy activa o en las fases de mayor crecimiento, en cerebro, pulmón, timo, corazón, músculo esquelético, hígado, médula espinal, bazo, páncreas, testículo, adenohipófisis, placenta, endometrio, miometrio y leucocitos (Morioanu y cois., 1990).
La hipótesis que utilizaron estos autores para explicar el porqué de Ia universalidad y abundancia de estos receptores gp18 y gp31 en casi todo tipo de órganos, fue que o bien sirven: 1 ) para metabolizar "albúminas modificadas" (albúmina que lleva ligados algunos otros compuestos, como anhídrido maleico, formaldehído u otros, y que cambia su conformación), que se sabe que existen en suero de humanos en concentraciones diversas, o 2) que sirven para transportar nutrientes necesarios para el crecimiento de casi todo tipo de células.
Teniendo en cuenta Ia abundancia de los receptores gp18 y gp31 en tejidos diversos, su alta concentración en órganos de proliferación muy activa y el hecho de que los ligandos naturales de los gp18 y gp31 son "albúminas modificadas" (albúminas con un cambio conformacional, Io mismo que sucede con el LGF, que es una albúmina con un cambio conformacional específico, ligado a una aparición de Ia actividad biológica, (véase Díaz Gil y cois., 1987)), los autores de Ia invención pensaron que tal vez el LGF podría actuar como factor de crecimiento y regeneración en una gran diversidad de tejidos, al igual que habían demostrado anteriormente en hígado; en definitiva, decidieron comprobar Ia hipótesis de Ia validez del LGF como un factor de regeneración tisular de tipo pleiotrópico, que era nueva con respecto a otras estrategias de utilización del LGF planteadas hasta ese momento. Así, por ejemplo, en el año 1989, se había concedido Ia patente "Procedimiento para diagnóstico y seguimiento de hepatopatías mediante determinación del Factor de crecimiento hepático en plasma y/o suero sanguíneo", núm. de publicación 2005259, pero en Ia correspondiente solicitud no se había contemplado el LGF como posible agente terapéutico.
Los autores de Ia invención demostraron recientemente que Ia acción mitogénica ejercida en el hígado por el LGF está mediada, al menos en parte, por el TNF-CC (Díaz Gil y cois., 2003). Este hecho les sirvió como un indicio de que el LGF podría presentar también acción mitogénica en otros tejidos en los que pueda expresarse Ia citada citoquina. Sin embargo, Ia elevación del TNF-α no produce por sí misma efectos mitógenicos; de hecho, está íntimamente ligado a Ia fase aguda, independientemente de su etiología: isquemia, traumatismo, inflamación, toxicidad (tal como revisaron Ding WX y cois., 2004, y Trauner M y cois., 1999) e, incluso, su inyección a ratas puede dar lugar a trastornos endocrinos y hematológicos (Kettelhut I y cois, 1987); además, está íntimamente relacionado con Ia muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis (revisado por Malhi H y cois., 2006). Dado que Ia estimulación del TNF-α está ligada tanto a efectos de estimulación mitogénica como a efectos de muerte celular, un aumento de su expresión inducido por LGF no describe de forma inequívoca Ia actividad del LGF. Además, el LGF es capaz de inducir mitosis en cultivo de hepatocitos (Díaz Gil y cois., 1986), en donde no hay células endoteliales presentes que pudiera producir TNF-α. Por ello, su posible utilidad para inducir proliferación de tejidos distintos del hepático e, incluso, el efecto que podía tener sobre ellos estaban por demostrar.
Siguiendo Ia línea de Ia posible validez del LGF como factor de regeneración tisular, los autores de Ia invención demostraron recientemente Ia capacidad del LGF para reducir Ia hipertensión en ratas hipertensas produciendo una disminución de Ia fibrosis en Ia arteria carótida y aumentando el número de células de Ia musculatura lisa vascular pero sin alterar el diámetro interno o el espesor medio de dichas arterias (Somoza y cois., 2006). También demostraron Ia capacidad del LGF para aumentar el número de terminales dopaminérgicos en modelos animales de Ia enfermedad de Parkinson (Reimers D. y cois., 2006). Estos resultados abrieron una vía esperanzadora respecto a Ia posible utilidad del LGF en otros campos de gran interés.
Existían otros diversos campos en los que era de especial interés comprobar si era cierto que el LGF podía tener utilidad como factor de regeneración tisular, todos ellos campos de gran interés clínico en los que está pendiente de establecerse un tratamiento realmente eficaz: a) Ia ateriosclerosis, enfermedad causada por Ia deposición de colesterol en las paredes de las arterias a partir de las LDL, las lipoproteínas de baja densidad, que son, junto con las HDL, los dos tipos principales de lipoproteínas unido a las cuales se transporta el colesterol por Ia sangre. A partir de los depósitos de colesterol se forma una placa, que se recubre de tejido fibrótico, causando en algunos casos obstrucción y, en otros, rotura ocasional de Ia placa, con formación de trombos que viajan por Ia circulación sanguínea hasta su obstrucción y producción de isquemia. Las soluciones terapéuticas a esta situación son muy escasas y de baja eficacia. b) Ia enfermedad coronaria, un factor importante de mortandad entre Ia población occidental en cuya aparición Ia fibrosis cardiaca es un importante factor de riesgo (Watatsuki T. y cois., 2004; Poulsen S. H. y cois., 2005). La búsqueda de fármacos para prevenir o tratar dicha enfermedad no es sencilla, porque las particularidades de las arterias coronarias hacen difícil Ia extrapolación de los efectos que los compuestos ensayados puedan tener sobre ellas a partir de los datos obtenidos en otras arterias. Las arterias coronarias se encargan de Ia distribución de sangre al corazón y presentan características estructurales y funcionales diferentes de otras arterias: su lecho vascular es diferente, Ia composición de su pared es diferente y su diámetro cambia en función de las demandas metabólicas del corazón, siendo por ello Ia relación músculo/materia elástica mayor que en otras arterias, como por ejemplo Ia carótida. Además, su sensibilidad frente a determinados efectores, como por ejemplo frente al dilatador NO, es completamente diferente (Berne y Levy, 2001 ). Un factor diferenciador más Io constituye el hecho de que el corazón tiene capacidad angiogénica, de creación de vasos sanguíneos, cuando Io requieran sus necesidades de flujo sanguíneo. Dada Ia diferencia de estructura y función de las arterias coronarias con respecto a otras arterias, Ia búsqueda de compuestos activos para el tratamiento de las alteraciones que se produzcan en las mismas requiere de ensayos propios que no dan lugar necesariamente a resultados análogos a los obtenidos en otras arterias. c) Ia regeneración de tejidos lesionados que requiere o se ve favorecida por Ia estimulación de Ia angiogénesis, es decir, Ia formación de vasos sanguíneos, efecto que es importante para ayudar a reparar muchos tejidos lesionados, como puede ser un corazón dañado por un infarto, el tejido óseo fracturado, el tejido cutáneo en el que se han producido cortes y/o heridas o las lesiones cerebrales, procesos regenerativos que a menudo no son sencillos y que es importante favorecer. Además, se piensa que, en los casos de existencia de trombos, podrían facilitar vías alternativas a los mismos y mejorar Ia circulación, disminuyendo el riesgo de trombosis. Por todo ello, existe una necesidad también de agentes con capacidad para estimular Ia angiogénesis en distintos tejidos. d) Ia regeneración de otros tejidos dañados específicos, como el tejido del testículo, en el que las lesiones pueden dar lugar a disminución o pérdida total de Ia fertilidad, o Ia médula espinal, que puede producirse por traumatismo o bien por otras causas y que frecuentemente incapacita para el movimiento, al perderse Ia transmisión del impulso nervioso entre el cerebro y las zonas periféricas, efecto que va asociado a otras consecuencias derivadas de Ia falta de control mecánico y funcional. En ambos casos, las soluciones terapéuticas son muy escasas y frecuentemente de poca eficacia. e) el carcinoma hepático, un tipo de cáncer que posee características especiales que Io hacen bastante refractario a Ia terapia convencional
(Venook y cois., 1994), Io cual conlleva un pronóstico incierto para los pacientes.
Los efectos del LGF; al venir mediados por múltiples factores, específicos de cada tejido u órgano, no son en absoluto predecibles . Así, en unos casos sus efectos van a ser eminentemente antifibróticos. En otros, su efecto principal va a ser angiogénico, con Io que se va a facilitar Ia regeneración de los tejidos dañados. En otros, su acción va a venir mediada por mecanismos enzimáticos. En otros, su acción viene mediada por VEGF-A. En otros, Io que produce es un aumento de Ia proliferación celular. En otros, tiene una acción mitogénica mediada por TNF-α. En tejidos de hepatocarcinoma, sin embargo, Ia acción del LGF; Ia eliminación de células tumorales, es vía apoptosis, también mediada por TNF-α. En varios de los órganos y tejidos considerados, Ia acción del LGF viene mediada por combinaciones de los factores anteriormente citados. Todo ello hace impredecible para un experto en Ia materia considerar qué efecto puede llegar a tener el LGF sobre un determinado órgano o tejido. De forma que, los efectos de LGF descritos en el Estado de Ia Técnica sobre regeneración de hígados hepatectomizados o su efecto antifibrótico en Ia arteria carótico no son extrapolables de forma obvia a otros tejidos u órganos. Sólo un diseño experimental específico para cada órgano o tejido a considerar, con elección del modelo experimental o el tipo celular más apropiado, así como los parámetros y condiciones de ensayo, puede llegar a mostrar resultados que demuestren si el LGF tiene algún efecto sobre el mismo, e identificar, en caso afirmativo, cuál sería dicho efecto y, eventualmente, a través de qué mecanismo celular, enzimático, metabólico, mediado por otros factores, es ejercido.
La presente invención responde a Ia necesidad de encontrar agentes terapéuticos útiles para las situaciones mencionadas. En Ia presente memoria se describe Ia capacidad del LGF para Ia regeneración de diversos órganos objeto de lesiones o agresiones, dando lugar a una mejoría de las situaciones patológicas descritas y un efecto estimulador de procesos regenerativos en distintos tejidos. La utilización del LGF en el tratamiento de tejidos lesionados o que estén sometidos a agresiones, tales como paredes arteriales aterioscleróticas, arterias miocárdicas fibróticas, tejidos lesionados cuya regeneración se vea favorecida por Ia estimulación de Ia angiogénesis, tejido testicular dañado, médula espinal dañada y carcinoma hepático, así como para Ia prevención y/o el tratamiento de los trastornos o enfermedades en las que dichos tejidos estén implicados (ateriosclerosis, enfermedad coronaria, infarto de miocardio, fracturas óseas, lesiones cutáneas, lesiones cerebrales, trombosis, infertilidad, discapacidad motriz o cáncer de hígado) es el objeto de esta solicitud de patente.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de medicamentos útiles en Ia regeneración tisular de uno o más tejidos lesionados, tejido que se selecciona entre el tejido cardiovascular ateroesclerótico, las paredes de las arterias coronarias fibróticas, el tejido del tracto genito-urinario lesionado, el tejido de médula espinal lesionada, el carcinoma hepático y cualquier tejido lesionado, distinto de los mencionados, en cuya regeneración sea útil un incremento de Ia angiogénesis .
De acuerdo con esto, un objeto de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil para Ia regeneración de tejido cardiovascular ateriosclerótico, gracias al efecto de disminución de Ia aterosclerosis que se demuestra más adelante en uno de los Ejemplos de Ia invención. En dicho Ejemplo se demuestra que Ia inyección de LGF por vía intraperitoneal produce una disminución significativa de Ia extensión de las placas ateroscleróticas, unido además a un incremento en Ia expresión de paraoxonasai , enzima clave en el metabolismo de lípidos plasmáticos oxidados, cuya estimulación presenta una relación estrictamente inversa con Ia desaparición de las placas de LDL y con Ia que se están ensayando en Ia actualidad posibles tratamientos terapéuticos de Ia aterosclerosis basados en Ia estimulación de este enzima (Durrington, y cois., 2001 ; Nackness y cois., 2002; Tward y cois., 2002). Por todo ello, es un objeto de Ia invención el uso del factor de crecimiento de hígado para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de Ia ateriosclerosis.
Otro aspecto de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil para Ia regeneración de Ia estructura de arterias coronarias fibróticas, en especial de las arterias intramiocárdicas, con Io que se ayuda a disminuir el riesgo de que se produzca enfermedad coronaria. Tal como se demuestra más adelante en uno de los Ejemplos, el tratamiento con LGF de ratas espontáneamente hipertensas, un modelo de hipertensión esencial humana, el tratamiento con LGF produce una importante mejora estructural en las arterias intramiocárdicas que supone una importante recuperación de Ia arquitectura normal de las paredes de dichas arterias, observándose aumento del diámetro interno de las mismas, con disminución de Ia relación pared/luz, todo ello unido a una disminución de Ia cantidad de colágeno y matriz extracelular y de Ia relación área colágeno/luz, un aumento del número de núcleos de células musculares lisas por unidad de área en Ia media y, además, una disminución del área ocupada por las vacuolas en Ia pared arterial. Todo ello debería producir una mejora de Ia funcionalidad del corazón, disminuyendo el riesgo de enfermedad coronaria. Por esta razón, es un objeto de Ia invención el uso del factor de crecimiento de hígado para Ia fabricación de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de Ia enfermedad coronaria.
Siguiendo con el tejido cardiovascular, otro aspecto de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil para Ia estimulación de Ia angiogénesis, Ia formación de capilares a partir de otros ya existentes, proceso que puede activarse en respuesta a un daño tisular y que puede ser un factor importante en Ia regeneración de un tejido dañado. Por ello, son objetos de Ia invención los usos del factor de crecimiento de hígado para Ia fabricación de medicamentos para el tratamiento del corazón tras un infarto, las fracturas óseas, las lesiones cutáneas, las lesiones cerebrales, como ayuda para asegurar el éxito de trasplantes o para Ia prevención y/o el tratamiento de Ia trombosis.
Un aspecto más de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de tejido testicular dañado, gracias a Ia activación de Ia proliferación y posterior diferenciación de los precursores de las células de Leydig que se observa tras Ia administración de LGF a ratas utilizadas como modelo de agresión testicular. En dicho modelo, además, se observa una clara estimulación de Ia HSL (Hormone-sensitive Upase) en las ratas a las que se les inyectó LGF con respecto a las que no Io recibieron; puesto que se trata de una enzima que parece ser fundamental para Ia espermiogénesis, cuya deficiencia genética parece estar relacionada con Ia aparición de infertilidad (Osuga J y cois., 2000) que puede hacerse revertir en ratones transgénicos que expresan Ia forma testicular de Ia HSL en las células germinales postmeióticas (Valled-Erdtman V y cois., 2004; Wang SP y cois., 2004), Ia estimulación de dicha lipasa parece estar directamente relacionada con un aumento de fertilidad. Es por ello un objeto de Ia invención el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento para ser utilizado en tratamientos de aumento de Ia fertilidad. Otro aspecto de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil para Ia regeneración de tejido de médula espinal lesionado. Debido a Ia importancia que Ia lesión de este tejido tiene en Ia discapacidad o incapacidad total para mover los miembros, es también un objeto de Ia invención el uso del factor de crecimiento de hígado para Ia fabricación de un medicamento para mejorar Ia movilidad de personas con dificultades o con incapacidad total para mover los miembros, superiores y/o inferiores.
Asimismo, otro aspecto de Ia invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del carcinoma hepático (hepatocarcinoma), gracias al efecto de inhibición del crecimiento que produce en las células de hepatocarcinoma.
Los efectos descritos se observan al administrar LGF, indistintamente por vía intraperitoneal o intravenosa, a ratas o ratones que constituyen modelos de distintos trastornos o enfermedades que afectan al ser humano o a otros animales y cuya gravedad o riesgo de empeoramiento disminuyen con Ia regeneración de uno o más tejidos en los que se manifiesta dicho trastorno o enfermedad. Constituye por ello un aspecto adicional de Ia invención un método para el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad que se selecciona entre aterosclerosis, enfermedad coronaria, infertilidad, lesión en Ia médula espinal, carcinoma hepático, infarto de miocardio incluyendo Ia prevención de infartos a pacientes que han sufrido infartos previos, fractura ósea incluyendo Ia aceleración de Ia regeneración de huesos fracturados, cortes o heridas superficiales en tejido cutáneo y lesiones en el cerebro, particularmente una trombosis cerebral, comprendiendo dicho método Ia administración a un ser humano o un animal de factor de crecimiento de hígado. Son realizaciones preferidas de dicho método de Ia invención aquellas en las que Ia administración del LGF se produce por vía intravenosa, así como aquellas en las que Ia administración es por vía intraperitoneal.
La invención se explicará ahora con más detalle mediante los Ejemplos y
Figuras que aparecen a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1a - 1f muestran gráficos en los que se comparan los resultados obtenidos al examinar distintos parámetros relacionados con Ia ateriosclerosis medidos en arterias intramiocárdicas de ratas normotensas control (WKY) (valores representados por las barras sin relleno, ), ratas espontáneamente hipertensas sin tratar (SHR) (valores representados por las barras con relleno oscuro continuo, |) y ratas espontáneamente hipertensas tratadas con LGF (SHR+LGF) (valores representados por barras rellenas con líneas inclinadas, //). La Fig. 1a representa el diámetro interno de las arterias miocárdicas, medido en micrómetros; Ia Fig. 1 b representa el valor obtenido al calcular Ia relación entre Ia pared y Ia luz de dichas arterias; Ia Fig. 1c representa el área de colágeno, en micrómetros cuadrados, medida en cada uno de los casos; Ia Fig. 1d representa Ia relación entre Ia superficie de colágeno y Ia luz arterial; Ia Fig. 1e representa el número de núcleos de células de musculatura lisa medidos por cada milímetro cuadrado de media; Ia Fig. 1f representan el porcentaje que el área ocupada por las vacuolas representa con respecto al total del área de Ia pared arterial. La Figura 2 muestra fotografías correspondientes a cortes de arterias coronarias teñidas con el tricrómico de Masson y rojo sirio, Io que permite Ia tinción de las fibras de colágeno y los núcleos de las células musculares; los espacios sin agente de tinción en Ia zona de las paredes corresponden a las vacuolas. Los cortes se tomaron de: fotografía superior, marcada como "A": ratas normotensas control; fotografía intermedia, marcada como "B": ratas espontáneamente hipertensas sin tratar; fotografía inferior, marcada como "C": ratas espontáneamente hipertensas tratadas con LGF.
La Figura 3 muestra Ia diferencia en el área de vascularización, expresada como Ia superficie ocupada por eritrocitos, en micrómetros cuadrados, medida en el tejido cutáneo de ratones tratados con esponjas subcutáneas impregnadas con albúmina de suero de rata (valor marcado como "Ctrl.", representado por una barra sin relleno, ) o con LGF (valor marcado como "+LGF", representado por una barra con relleno oscuro continuo, |). La Figura 4 muestra los valores medios de número total de células positivas para bromodeoxiuridina (BrdU+) detectadas en ratas tras su sacrificio, efectuado transcurrido el número de días que se indica en abscisas desde que recibieron los siguientes tratamientos: Ctrl.: ratas control, a las que se inyectó solución salina; EDS: ratas a las que se inyectó sulfonato de etilen-dimetano en el tiempo 0; LGF/ratas que recibieron 5 μg LGF/rata, dos inyecciones por semana durante un tiempo máximo de 4 semanas, dependiendo del momento de su sacrificio; EDS+LGF: ratas a las que recibieron una única inyección de sulfonato de etilen-dimetano en el tiempo 0 y dos inyecciones por semana con 5 μg LGF/rata durante un tiempo máximo de 4 semanas, dependiendo del momento de su sacrificio.
La Figura 5 muestra el porcentaje de crecimiento con respecto a Ia cantidad inicial de células inducido por Ia adición de las distintas cantidades de LGF que se indican en el eje de abscisas, expresadas en pg/ml. Los distintos tipos de células examinados, de las que se partió en todos los casos de Ia misma cantidad inicial, eran: células de hígado normales (Clone-9) (datos indicados mediante triángulos con un vértice apuntando hacia arriba, A); células de hepatoblastoma HepG2 (datos indicados mediante triángulos con un vértice apuntando hacia abajo, T); células de hepatocarcinoma PLC/PRF/5 (datos indicados mediante círculos oscuros, •). EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Aterosclerosis
Como se ha comentado, esta enfermedad está causada por Ia deposición de colesterol en las paredes de las arterias, formación de Ia placa y recubrimiento de fibrosis, que causa en algunos casos obstrucción y en otros rotura ocasional de Ia placa, con formación de trombos que viajan por Ia circulación sanguínea hasta su obstrucción y producción de isquemia. Las soluciones terapéuticas a esta situación son muy escasas y de baja eficacia. Se disponía de datos sobre Ia actividad del LGF en otros sistemas que apoyaba Ia posible actividad en aterosclerosis. Eran los siguientes: a) La inyección de LGF a ratas normales (4,5 μg LGF/rata de 200 g) produce un descenso progresivo del colesterol total en suero, desde 95,33±7,77 a 71 ,33±7,69 mg/dl (n=6/grupo, p<0,01 ). b) El LGF tiene una marcada acción antifibrogénica, tanto en hígado (Díaz
Gil y cois., 1994b; Díaz Gil y cois., 1999), como en fibrosis arterial en Ia pared de Ia carótida de ratas espontáneamente hipertensas, SHR (Somoza y cois., 2006). Sin embargo, tal como demuestran los resultados, el efecto de disminución de Ia aterosclerosis observado no es debido a un simple efecto fibrolítico, sino que el LGF activa otros mecanismos que producen una reducción de Ia placa aterosclerótica.
La actividad del LGF en aterosclerosis se ha manifestado en varios experimentos realizados en un modelo de ratones "knock-out" de Apoenzima E (Apo E, una proteína fundamental para el metabolismo de colesterol, al ser un ligando que permite Ia eliminación del colesterol remanente de Io absorbido en Ia dieta), modelo en el que se produce aterosclerosis por formación de placas de colesterol en las arterias de forma progresiva, a partir del tercer mes de vida aproximadamente. En estos ratones, una vez constatada Ia presencia de Ia placa de aterosclerosis, se inyectó LGF (por vía intraperitoneal, 1 ,7 μg LGF/ratón, dos veces por semana durante cuatro semanas). Transcurrido ese tiempo, se pudo constatar que el LGF tenía los siguientes efectos:
1 ) Se detectó un incremento en Ia expresión de Paraoxonasai en hígado de ratones macho de un 150% aproximadamente sobre los controles (4,16 frente a 1 ,70 U. A). Por ello, Ia administración de LGF aparece como una nueva opción para el tratamiento de Ia aterosclerosis por activación de Ia paraoxonasa 1.
2) Igualmente, en este tipo de ratones, se midió Ia extensión de Ia placa de aterosclerosis (realizándose una medición morfométrica, véase Paigen B y cois, 1987, para más detalles), mostrando los ratones inyectados con el LGF una reducción objetivable y estadísticamente significativa. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en Ia Tabla 1 :
Tabla 1.- Extensión de Ia placa de aterosclerosis en ratones "knock-out" para Ia ApoE
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Ejemplo 2: Reestructuración de las arterias intramiocárdicas
La rata espontáneamente hipertensa (SHR) es un modelo de hipertensión esencial humana. Las ratas SHR se caracterizan por presentar remodelado y fibrosis vascular, tanto en vasos de conducción como de resistencia. Asimismo, Ia hipertensión esencial está asociada con fibrosis cardiaca y es, como se ha comentado, un factor de riesgo de enfermedad coronaria (Watatsuki T. Y cois., 2004; Poulsen S. H. y cois., 2005). Se utilizaron ratas SHR sin tratar (SHR), ratas normotensas control
Wistar Kyoto sin tratar y ratas SHR tratadas con LGF (5μg /rata, 2 inyecciones por semana durante 2 semanas). Las ratas se sacrificaron después de este período de tratamiento, una vez medida Ia presión arterial.
Los corazones se fijaron con paraformaldehído al 10%, se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 10 μm de grosor. Los cortes se tiñeron con Masson Tricrómico (que tiñe de azul o verde las fibras de colágeno) y con rojo sirio (que tiñe las fibras conectivas de un color rojo intenso, mientras que tiñe las estructuras citoplasmáticas y los núcleos de las células de rojo débil y amarillo brillante), y se obtuvieron imágenes de las arterias coronarias intramiocárdicas de diámetro externo <100 μm (6-15 arterias por corazón). Las imágenes se analizaron con el programa de análisis de imagen Metamorph y se cuantificaron los parámetros relacionados con el remodelado (grosor de Ia pared, área de Ia sección de corte, relación pared:luz y diámetro interno), así como los relacionados con Ia fibrosis vascular (cantidad de matriz extracelular, cantidad de colágeno y número de células de Ia capa media). En las arterias intramiocárdicas se obtuvieron los siguientes resultados, que se representan gráficamente en las Figuras 1a a 1f:
- Ratas SHR sin tratar
En comparación con las ratas normotensas control Wistar Kyoto (WKY, primera barra, sin relleno, en cada uno de los gráficos), las ratas SHR sin tratar (datos representados por Ia segunda barra de cada uno de los gráficos, rellenas con relleno oscuro continuo):
1 ) incremento del grosor de Ia pared, 2) disminución del diámetro interno, 3) aumento de Ia relación pared/luz, 4) disminución del número de células musculares lisas (CML), 5) aumento de Ia vacuolización celular, 6) aumento de Ia matriz extracelular y 7) colágeno abundante en las capas adventicia (Ia zona que rodea exteriormente Ia pared arterial) y media (Ia pared arterial, formada fundamentalmente por CML).
- Ratas SHR tratadas con LGF (SHR-LGF)
En comparación con las ratas SHR sin tratar, se observó que el LGF produjo:
1 ) aumento del diámetro interno (Fig. 1a) y disminución de Ia relación pared/luz (Figura 1 b), parámetro este último característico de una mejora estructural. 2) disminución de Ia cantidad de colágeno y matriz extracelular (Fig. 1c), y de Ia relación área colágeno/luz (Fig. 1d). 3) aumento del número de núcleos de células musculares lisas por unidad de superficie (CML/mm.2) de Ia media (Fig. 1e). 4) disminución del área ocupada por las vacuolas en Ia pared arterial (Fig. 1f). Un asterisco sobre una barra indica un valor de p<0,01 con respecto a SHR sin tratar.
En Ia Figura 2 pueden observarse fotografías correspondientes a cortes de arteria coronaria de las ratas normotensas control (fotografía superior), en ratas SHR sin tratar (fotografía intermedia) y en ratas SHR después del tratamiento con LGF (fotografía inferior). En ellas se pueden observar las diferencias en el diámetro interno, Ia cantidad de colágeno, los núcleos de las células musculares y el área correspondiente a las vacuolas. Ejemplo 3: Angiogénesis
Tal como se ha comentado anteriormente, Ia capacidad de estimulación de Ia formación de vasos sanguíneos es un factor importante en Ia regeneración de muchos tejidos. Podría, por ejemplo, ayudar a reparar un corazón dañado por un infarto, a reparar las fracturas óseas, podría minimizar las lesiones cerebrales, o podría facilitar vías alternativas a los trombos y mejoraría Ia circulación.
Las células endoteliales recubren Ia pared interior de los vasos. La actividad del LGF sobre células endoteliales de Ia vena porta en hígado, y Ia actividad del LGF sobre células endoteliales humanas de Ia vena umbilical en cultivo (Díaz Gil y cois., 2003), sugieren que las células endoteliales podrían ser el primer blanco de Ia acción del LGF. También puede interpretarse así Ia actividad del LGF sobre un modelo de ratas hipertensas, SHR (Somoza y cois., 2006), en el que produce una reestructuración de Ia pared de Ia arteria carótida, Io que llevó a los autores de Ia invención a comprobar si esta posible actividad del LGF podría traducirse en una estimulación de Ia angiogénesis.
Para ello, en un experimento en piel de ratones a los que se les colocó una pequeña esponja subcutánea impregnada con LGF (1 ,5 μg/ratón) o con una sustancia sin actividad, Ia albúmina de suero (1 ,5 μg/ratón), se midió por microscopía, después de 15 días, Ia superficie ocupada por los eritrocitos (área de angiogénesis). El LGF estimuló Ia angiogénesis 23 veces con respecto al control, impregnado con albúmina de suero de rata (n=10 ratones/grupo). Los resultados obtenidos se representan en Ia Figura 3. Estos resultados se ven confirmados en los experimentos descritos a continuación en los Ejemplos 4 y 5, relativos, respectivamente, a Ia regeneración testicular en ratas tratadas con EDS y Ia regeneración de médula espinal lesionada. En ambos casos se detecta actividad angiogénica.
Ejemplo 4.- Regeneración del testículo
La administración de una única dosis de sulfonato de etilen-dimetano (EDS, 75 mg/kg peso corporal) origina una destrucción completa de las células de Leydig del intersticio testicular, por Io que se activa Ia proliferación y posterior diferenciación de los precursores de células de Leydig, con Ia aparición de una nueva población de células de Leydig funcionalmente activa en tres semanas. La pérdida total de las células de Leydig tras Ia administración de EDS origina una caída en Ia concentración sérica de testosterona además de cambios en los niveles de hormonas gonadotrópicas. A Ia caída de los niveles de testosterona Ie acompaña una pérdida de células germinales del epitelio seminífero y una completa descamación de espermátidas alargadas. Las células germinales producen como respuesta a un daño celular una citoquina proinflamatoria, el TNF-α (factor de necrosis tumoral alfa). Esta citoquina afecta a Ia actividad de las células de Sertoli e inhibe Ia síntesis de hormonas esteroideas por las células de Leydig.
En este modelo de agresión testicular se ha inyectado LGF (5 μg LGF/rata, dos inyecciones por semana durante 4 semanas) para tratar de acelerar Ia recuperación del testículo, tanto desde el punto de vista estructural como funcional. Se utilizaron tanto animales sanos, inyectados con solución salina, como ratas inyectadas con LGF solamente, EDS o EDS+LGF, sacrificándose a tiempos diferentes y comparando los resultados en los cuatro grupos (n=4 ratas/grupo en cada uno de los puntos).
Tras Ia observación microscópica de las muestras, se pudo comprobar que los cambios más significativos entre los distintos grupos se observan ya a los 10 días después de Ia inyección con EDS. En el grupo EDS Ia población de células de Leydig aún no ha comenzado el proceso de regeneración, por Io que su número es menor. Los túbulos seminíferos muestran descamación de células germinales y no aparecen espermátidas maduras y/o espermatozoides. En el grupo LGF se observa una situación muy similar a Ia del grupo control inyectado con solución salina, excepto que el intersticio muestra mayor capilaridad y un aumento en Ia población de células de Leydig. En el grupo EDS+LGF Ia situación es intermedia entre el grupo EDS y el LGF, es decir, hay una recuperación en Ia población de células de Leydig y Ia descamación de las células germinales es menor, pudiendo observarse incluso espermatogénesis completa en algunos túbulos seminíferos. En los días posteriores estas variaciones siguen observándose, aunque las diferencias entre los grupos son menores. Estos resultados sugieren que el LGF actúa favoreciendo Ia rápida regeneración de las células de Leydig, favorece Ia angiogénesis y en los testículos sin depleción se observa una mayor proliferación de células de Leydig. Estas células de Leydig de neoformación parecen ser funcionales, ya que se comprobó que tanto Ia glándula prostética como las vesículas seminales muestran un claro inicio de recuperación desde el comienzo del tratamiento con el LGF.
Para hacer un análisis preliminar de Ia proliferación celular, se valoró Ia misma a partir del número de número de células positivas para BrdU (bromo- deoxiuridina, que es un marcador de multiplicación celular) detectadas en el epitelio seminífero (Figura 4). El número de células positivas presenta un notable incremento con respecto al control salino ya a los 10 días postinyección de EDS. Este aumento podría interpretarse como una respuesta natural al daño producido por el EDS para recuperar Ia población normal de células germinales. En el grupo de animales sometidos a depleción de células de Leydig e inyectados con LGF puede observarse que el aumento de células que replican su ADN no sólo ocurre en los 10 primeros días, sino que se sigue manteniendo a Io largo de toda Ia fase experimental. Aunque aún no se ha cuantificado, se puede ver que el número de células de Leydig, así como las células endoteliales y musculares de las arteriolas también experimentan un aumento significativo en los animales tratados con LGF. Los resultados obtenidos confirman Ia estimulación de Ia angiogénesis.
Así, se observó que:
1 ) el LGF indujo un aumento de Ia expresión de VEGF-A (factor de crecimiento del endotelio vascular de tipo A).
2) se produjo una mayor inducción de Ia expresión del receptor R1 del VEGF (que tiene una relación directa con Ia angiogénesis), y del receptor
R3.
3) se detectaba un incremento en Ia incorporación de bromodeoxiuridina en arteriolas intratesticulares y en arterias aferentes.
También se ha observado que el número de células que sufren apoptosis disminuye sensiblemente en el grupo de ratas sometidas a depleción de células germinales y tratadas con LGF.
Con respecto al TNF-α, se ha observado que en el grupo control las células que aparecen positivas para esta citoquina varían dependiendo del estadillo del ciclo del epitelio seminífero. Así, en los túbulos donde aparecen espermátidas alargadas son positivas las espermatogonias y algunos espermatocitos primarios. En los túbulos con espermátidas redondas, estas células son las que se marcan. En el grupo EDS Ia mayor parte de los túbulos muestran mareaje en espermátidas redondas. En el grupo LGF, el mareaje es similar al control aunque de menor intensidad y predominan los túbulos con mareaje en espermatogonias. Los animales del grupo EDS+LGF muestran también un mareaje predominante en espermatogonias. Además, hemos observado que el tratamiento con LGF disminuye Ia positividad en las células de Leydig. Las pruebas inmunohistoquímicas demostraron también que las ratas inyectadas con LGF mostraban una clara estimulación de HSL con respecto a las no inyectadas tanto en el epitelio de los túbulos seminíferos como en las células de Leydig. Además, se observó una traslocación de Ia HSL presente en el epitelio de los túbulos seminíferos desde el citoplasma al núcleo.
En definitiva, el LGF parece ejercer una protección del túbulo seminífero frente al daño inducido por Ia depleción de andrógenos. Además, aumenta el número de células productoras de testosterona tanto en situación basal como tras el tratamiento con EDS. En líneas generales, Ia regeneración testicular es más rápida, Io que podría deberse a un aumento de Ia producción androgénica. Adicionalmente, se observa un aumento de Ia producción de HSL, Io que apoya Ia posible utilidad del LGF para estimular Ia espermiogénesis y aumentar Ia fertilidad en individuos que presenten un recuento de espermatozoides inferior a Ia media.
Ejemplo 5.- Médula espinal
En estudios anteriores con el LGF los autores de Ia invención han demostrado que, por infusión intraventricular en el cerebro de ratas con lesión en Ia sustancia negra (enfermedad de Parkinson), se incrementó Ia incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU, marcador de multiplicación celular), y Ia expresión de los marcadores de células madre neurales (CMN) nestina y proteína acida de glía, observándose células doblemente marcadas para BrdU y nestina en Ia zona subventricular y el parénquima estriatal (Bazán E. y cois, 2005). Igualmente, por infusión intraestriatal en ratas parkinsonianas, el LGF produjo un incremento de los terminales dopaminérgicos y una mejora conductal en las ratas, test de rotación por inyección con apomorfina (Reimers y cois., 2006). Todo ello hizo pensar que quizá el LGF podría servir también para Ia regeneración de Ia médula espinal, aunque el efecto fisiológico buscado fuera completamente diferente: mientras en los experimentos relacionados con Ia enfermedad de Parkinson hay que intentar contrarrestar Ia pérdida de terminales dopaminérgicos que, al perder Ia enzima tirosina hidroxilasa, sintetizan menos neurotransmisor, Ia dopamina, en el caso de Ia recuperación de lesiones de Ia médula espinal se trata, de alguna forma, de "rellenar el hueco" dejado por el traumatismo o hemisección, en el que intervienen neuronas, astrocitos, células de Schwann, células endoteliales y otras y, sobre todo, se trata de restablecer el impulso nervioso de un lado a otro de Ia lesión. La vía de administración del LGF que se propone es también distinta: mientras en el caso de Ia enfermedad de Parkinson el LGF se administró por infusión intraestratial o intraventricular por una minibomba osmótica, en el caso de los estudios para el tratamiento de las lesiones de Ia médula espinal se ha probado a administrar el LGF por inyección intraperitoneal.
Para comprobar el posible efecto del LGF para Ia regeneración de médula lesionada, se utilizó un modelo de lesión traumática de Ia médula espinal en ratas en el que, a los dos meses de estar estabilizada Ia lesión, las ratas están paralíticas de medio cuerpo para abajo. Se trasplantaron células fetales de rata a Ia zona dañada y se inyectó el LGF (4,5 μg/rata, 2 inyecciones por semana durante dos semanas). Después se sacrificaron las ratas. La médula estaba completamente regenerada, sin necrosis, abundante vascularización y sin rastro de células fetales. Incluso el límite de Ia lesión se distinguía difícilmente.
Alternativamente, en modelos de lesión de médula espinal, bien por hemisección o por traumatismo, se ha inyectado el LGF a Ia semana de Ia lesión (4,5 μg/rata, dos veces a Ia semana, durante dos semanas), sin trasplante de células para rellenar el hueco dejado por Ia lesión, observándose los siguientes efectos:
1 ) Aumento de Ia señal de nestina por inmunohistoquímica (marcador de células madre). 2) Crecimiento axonal. 3) Aumento de angiogénesis.
4) Incremento de Ia señal de BrdU (mayor número de células en división).
5) Recuperación de Ia capacidad de miccionar las ratas por sí mismas (las ratas lesionadas pierden esta capacidad, y requieren masajes diarios para evacuar Ia orina).
Ejemplo 6.- Carcinoma hepático El carcinoma hepatocelular posee características especiales que Io hacen bastante refractario a Ia terapia convencional (Venook y cois., 1994), Io cual conlleva un pronóstico incierto. En modelos experimentales en ratas, se ha demostrado que Ia administración de TNF-α después de hepatectomía parcial del 70% disminuye el desarrollo del tumor (Slooter y cois., 1995), Io cual parece indicar que este tipo de efecto podría ser un posible tratamiento de este tipo de cáncer.
Por otro lado, los autores de Ia invención demostraron recientemente que el LGF ejerce su acción mitogénica en hígado mediado, al menos en parte, por TNF-α (Díaz Gil y cois., 2003), Io que les llevó a pensar que tal vez el LGF podría tener acción anticancerosa. Para demostrar esta posibilidad, se hicieron cultivos de células de hígado normales (Clone-9, células normales de epitelio de hígado de rata, con número de acceso en Ia ATCC CRL-1439), células de hepatoblastoma (HepG2, un tumor bien diferenciado, con número de acceso en Ia ATCC HB-8065) y células de hepatocarcinoma (PLC/PRF/5, un tumor desdiferenciado, con número de acceso en Ia EACC 85061113). Cuando se añadió LGF en cantidades variables (0-50 picogramos/ml), se detectó una estimulación del crecimiento de células normales y del hepatoblastoma y una inhibición del crecimiento de células del hepatocarcinoma (véase Ia Figura 5).
El mecanismo por el que el LGF elimina células de hepatocarcinoma es por apoptosis, dependiente de TNF-α, y está basado en los siguientes hechos:
1 ) El efecto inhibitorio promovido por LGF sobre cél. PLC/PRF/5 está acompañado por un incremento, dependiente de Ia concentración, de nucleosomas citosólicos, 4 hr después de Ia adición (fragmentación de ADN citosólico medido por un kit de muerte celular por ELISA). Paralelamente se produce secreción de TNF-α al medio de cultivo. Ninguno de estos dos efectos se detectó en células normales o de hepatoblastoma.
2) Un anti-TNF-α revierte el efecto de fragmentación de ADN provocado por LGF, así como uno de los hechos que conforman Ia ruta de apoptosis, Ia externalización de fosfatidilserina en Ia membrana plasmática (medido por "binding" de Anexina V).
3) El LGF modifica el potencial de membrana mitocondrial (medido por el compuesto JC-1 , Molecular Probes OR, USA), otro de los pasos en el proceso de apoptosis. Asimismo, el LGF produce apertura de los poros de las mitocondrias (medido por acumulación de Rodamina 123), otro de los pasos de Ia ruta apoptótica.
4) El LGF estimula las caspasas (enzimas fundamentales en el proceso de apoptosis), medido por sustratos fluorogénicos específicos (Research Biochemicals International). Principalmente Ia caspasa 3 (estimulación de más de 20 veces sobre los controles), y en menor medida Ia 8 y 9.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del factor de crecimiento de hígado en Ia fabricación de medicamentos útiles en Ia regeneración tisular pleiotrópica de uno o más tejidos lesionados que se seleccionan entre el tejido cardiovascular ateroesclerótico, las paredes de las arterias coronarias fibróticas, el tejido del testículo, el tejido de médula espinal, el tejido hepático invadido por un carcinoma hepático o cualquier tejido lesionado, distinto de los mencionados, cuya regeneración venga mediada por un incremento de Ia angiogénesis.
2. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado es tejido cardiovascular ateroesclerótico.
3. Uso según Ia reivindicación 2, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento de Ia aterosclerosis.
4. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado son las paredes de arterias coronarias fibróticas.
5. Uso según Ia reivindicación 4, en el que el medicamento fabricado es útil en Ia prevención y/o el tratamiento de Ia enfermedad coronaria.
6. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado es tejido del testículo.
7. Uso según Ia reivindicación 6, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos de aumento de Ia fertilidad.
8. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado es tejido de Ia médula espinal.
9. Uso según Ia reivindicación 8, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento de una parálisis parcial o total de las extremidades superiores y/o inferiores debida a una lesión en Ia médula espinal.
10. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado es tejido hepático invadido por un carcinoma hepático.
11. Uso según Ia reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento del carcinoma hepático.
12. Uso según Ia reivindicación 1 , en el que el tejido lesionado es un tejido distinto de cualquiera de los mencionados en las reivindicaciones 2 a 11 cuya regeneración se provoca y/o acelera mediante Ia estimulación de Ia angiogénesis.
13. Uso según Ia reivindicación 12, en el que tejido lesionado es tejido cardíaco de un individuo que ha sufrido un infarto.
14. Uso según Ia reivindicación 13, en el que el medicamento fabricado es útil en Ia prevención de futuros infartos de miocardio en individuos que han padecido uno o más infartos previos.
15. Uso según Ia reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido óseo fracturado.
16. Uso según Ia reivindicación 15, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos que aceleran Ia regeneración de un hueso que ha sufrido una fractura.
17. Uso según Ia reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido cutáneo.
18. Uso según Ia reivindicación 17, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos que aceleran Ia curación de cortes o heridas superficiales.
19. Uso según Ia reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido cerebral.
20. Uso según Ia reivindicación 19, en el que el medicamento fabricado es útil en Ia prevención y/o el tratamiento de trombosis cerebral.
21. Método para tratamiento de un trastorno o enfermedad cuya gravedad o riesgo de empeoramiento disminuyen con Ia regeneración de uno o más tejidos en los que dicho trastorno o enfermedad se selecciona entre aterosclerosis, enfermedad coronaria, infertilidad, lesión en Ia médula espinal, carcinoma hepático, infarto de miocardio, fractura ósea, cortes o heridas superficiales y trombosis cerebral, comprendiendo dicho método Ia administración a un ser humano o un animal de factor de crecimiento de hígado.
22. Método según Ia reivindicación 21 , en el que el factor de crecimiento de hígado se administra por vía intravenosa.
23. Método según Ia reivindicación 22, en el que el factor de crecimiento de hígado se administra por vía intraperitoneal.
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