ES2325699B1 - Uso del factor de crecimiento de higado (lgf) como regenerador tisular pleiotropico. - Google Patents

Abstract

Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador tisular pleiotrópico. Se basa en el efecto mitogénico en general y estimulador de la angiogénesis en particular que el LGF presenta en diversos órganos, tales como el testículo, la médula espinal o la piel, así como su actividad antifibrótica en arterias coronarias, su capacidad de reestructuración de las paredes de arterias coronarias y arterias de la circulación mayor y menor, su capacidad estimuladora de enzimas anticolesterolémicas como la paraoxonasa1 y el efector inhibidor del crecimiento de células de hepatocarcinoma. Estos efectos del LGF posibilitan su uso para el tratamiento de patologías como aterosclerosis, enfermedad coronaria, trombosis o carcinoma hepático, así como para ayudar en la recuperación de tejidos lesionados tales como los de testículo, médula espinal, corazón infartado, hueso fracturado, piel dañada o cualquier otro tejido cuya recuperación se acelere por estimulación de la angiogénesis.

Description

Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador tisular pleiotrópico.

Campo técnico

La invención se refiere a la regeneración de tejidos dañados mediante la utilización de factores de crecimiento. Concretamente, la invención se refiere al uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador, total o parcial, de una gran diversidad de tejidos dañados (pleiotrópico).

Antecedentes de la técnica

El Factor de crecimiento de hígado, LGF (del inglés "liver growth factor"), descubierto hace ya algunos años (Díaz Gil y cols., 1986), es una molécula purificada de suero de ratas después de hepatectomía parcial del 70%, o bien en ratas con ligadura del conducto biliar que, inyectado a ratas o ratones tiene actividad "in vivo" como factor de crecimiento, incrementando la síntesis de ADN de hígado, el peso seco de hígado, el número de células "PCNA-positivas" (antígeno nuclear de proliferación celular), produciendo una hiperplasia transitoria sin que se detecten efectos agresivos, ni inmediatos ni permanentes: sin producción de fibrosis, amiloides, ni perturbaciones mitocondriales ni nucleares (Díaz Gil y cols., 1994).

Su estructura química fue definida por los mismos autores como un complejo albúmina-bilirrubina, después de un estudio de espectros de absorción, fluorescencia, dicroísmo circular, mapas trípticos, composición de aminoácidos, movilidad electroforética, inmunofluorescencia, formación de complejos albúmina-bilirrubina "in vitro", estudio de la actividad biológica tanto "in vivo" como "in vitro" e identificación por HPLC (Díaz Gil y cols., 1987; Díaz Gil y cols., 1988).

El LGF tiene asimismo actividad "in vitro", en cultivo primario de hepatocitos de rata, incrementando la síntesis de ADN, el número de células, la actividad del sistema A de transporte de membrana y otros (Díaz Gil y cols., 1986). El LGF se ha purificado igualmente de suero de humanos con hepatitis tipo B, con estructura y características casi idénticas que el de ratas (Díaz Gil y cols., 1989). Otros autores (Abakumova y cols., 1994) han corroborado la actividad de complejos albúmina-bilirrubina como factores de crecimiento de hígado.

Igualmente, se ha demostrado la capacidad del LGF para estimular la regeneración del hígado dañado por la acción de diversas hepatotoxinas (Díaz Gil y cols., 1994b; Díaz Gil y cols., 1999). En un modelo de cirrosis por CCl_{4}, una vez llegado a una situación irreversible, la inyección del LGF fue capaz de disminuir la fibrosis, produciendo una reestructuración sustancial del parénquima hepático, mejora de inflamación y necrosis, aumento de funcionalidad hepática y recuperación de diversas funciones hemodinámicas, como: presión portal, presión arterial, shunting portosistémico y resistencia vascular sistémica, así como reducción de la ascitis. Sin embargo, el complejísimo entramado que da lugar al establecimiento de fibrosis en los distintos tipos de órganos, aun teniendo diversas pautas en común, presenta tantas particularidades dependiendo del órgano de que se trate, que la acción antifibrótico del LGF en hígado no aseguraba que pudiera presentar la misma capacidad en otro órgano diferente.

Por otro lado, y en investigaciones realizadas por diversos grupos principalmente en células endoteliales, se han definido tres tipos de receptores de albúmina en membrana celular, las tres glicoproteínas: una gp60, con función principalmente de transcitosis, que se encargaría principalmente de pasar la albúmina de un lado a otro de las células endoteliales (Ghinea y cols., 1988), y dos con función de endocitosis, para introducir la albúmina al interior de la célula, gp18 y gp31. Estos últimos receptores ligan preferentemente las albúminas en las que se ha variado su conformación por "binding" a un ligando. La afinidad es 1000 veces comparada con la que se observa con albúmina nativa (Schnitzer y cols., 1992). Las gp18 y gp31 se expresan preferentemente en células endoteliales de tejidos fetales, recién nacidos o adultos, registrándose mayor concentración en los órganos de proliferación muy activa o en las fases de mayor crecimiento, en cerebro, pulmón, timo, corazón, músculo esquelético, hígado, médula espinal, bazo, páncreas, testículo, adenohipófisis, placenta, endometrio, miometrio y leucocitos (Morioanu y cols., 1990).

La hipótesis que utilizaron estos autores para explicar el porqué de la universalidad y abundancia de estos receptores gp18 y gp31 en casi todo tipo de órganos, fue que o bien sirven: 1) para metabolizar "albúminas modificadas" (albúmina que lleva ligados algunos otros compuestos, como anhídrido maleico, formaldehído u otros, y que cambia su conformación), que se sabe que existen en suero de humanos en concentraciones diversas, o 2) que sirven para transportar nutrientes necesarios para el crecimiento de casi todo tipo de células.

Teniendo en cuenta la abundancia de los receptores gp18 y gp31 en tejidos diversos, su alta concentración en órganos de proliferación muy activa y el hecho de que los ligandos naturales de los gp18 y gp31 son "albúminas modificadas" (albúminas con un cambio conformacional, lo mismo que sucede con el LGF, que es una albúmina con un cambio conformacional específico, ligado a una aparición de la actividad biológica, (véase Díaz Gil y cols., 1987)), los autores de la invención pensaron que tal vez el LGF podría actuar como factor de crecimiento y regeneración en una gran diversidad de tejidos, al igual que habían demostrado anteriormente en hígado; en definitiva, decidieron comprobar la hipótesis de la validez del LGF como un factor de regeneración tisular de tipo pleiotrópico, que era nueva con respecto a otras estrategias de utilización del LGF planteadas hasta ese momento. Así, por ejemplo, en el año 1989, se había concedido la patente "Procedimiento para diagnóstico y seguimiento de hepatopatías mediante determinación del Factor de crecimiento hepático en plasma y/o suero sanguíneo", núm. de publicación 2005259, pero en la correspondiente solicitud no se había contemplado el LGF como posible agente terapéutico.

Los autores de la invención demostraron recientemente que la acción mitogénica ejercida en el hígado por el LGF está mediada, al menos en parte, por el TNF-\alpha (Díaz Gil y cols., 2003). Este hecho les sirvió como un indicio de que el LGF podría presentar también acción mitogénica en otros tejidos en los que pueda expresarse la citada citoquina. Sin embargo, la elevación del TNF-\alpha no produce por sí misma efectos mitógenicos; de hecho, está íntimamente ligado a la fase aguda, independientemente de su etiología: isquemia, traumatismo, inflamación, toxicidad (tal como revisaron Ding WX y cols., 2004, y Trauner M y cols., 1999) e, incluso, su inyección a ratas puede dar lugar a trastornos endocrinos y hematológicos (Kettelhut I y cols, 1987); además, está íntimamente relacionado con la muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis (revisado por Malhi H y cols., 2006). Dado que la estimulación del TNF-\alpha está ligada tanto a efectos de estimulación mitogénica como a efectos de muerte celular, un aumento de su expresión inducido por LGF no describe de forma inequívoca la actividad del LGF. Además, el LGF es capaz de inducir mitosis en cultivo de hepatocitos (Díaz Gil y cols., 1986), en donde no hay células endoteliales presentes que pudiera producir TNF-\alpha. Por ello, su posible utilidad para inducir proliferación de tejidos distintos del hepático e, incluso, el efecto que podía tener sobre ellos estaban por demostrar.

Siguiendo la línea de la posible validez del LGF como factor de regeneración tisular, los autores de la invención demostraron recientemente la capacidad del LGF para reducir la hipertensión en ratas hipertensas produciendo una disminución de la fibrosis en la arteria carótida y aumentando el número de células de la musculatura lisa vascular pero sin alterar el diámetro interno o el espesor medio de dichas arterias (Somoza y cols., 2006). También demostraron la capacidad del LGF para aumentar el número de terminales dopaminérgicos en modelos animales de la enfermedad de Parkinson (Reimers D. y cols., 2006). Estos resultados abrieron una vía esperanzadora respecto a la posible utilidad del LGF en otros campos de gran interés.

Existían otros diversos campos en los que era de especial interés comprobar si era cierto que el LGF podía tener utilidad como factor de regeneración tisular, todos ellos campos de gran interés clínico en los que está pendiente de establecerse un tratamiento realmente eficaz:

a)

la ateriosclerosis, enfermedad causada por la deposición de colesterol en las paredes de las arterias a partir de las LDL, las lipoproteínas de baja densidad, que son, junto con las HDL, los dos tipos principales de lipoproteínas unido a las cuales se transporta el colesterol por la sangre. A partir de los depósitos de colesterol se forma una placa, que se recubre de tejido fibrótico, causando en algunos casos obstrucción y, en otros, rotura ocasional de la placa, con formación de trombos que viajan por la circulación sanguínea hasta su obstrucción y producción de isquemia. Las soluciones terapéuticas a esta situación son muy escasas y de baja eficacia.

b)

la enfermedad coronaria, un factor importante de mortandad entre la población occidental en cuya aparición la fibrosis cardiaca es un importante factor de riesgo (Watatsuki T. y cols., 2004; Poulsen S.H. y cols., 2005). La búsqueda de fármacos para prevenir o tratar dicha enfermedad no es sencilla, porque las particularidades de las arterias coronarias hacen difícil la extrapolación de los efectos que los compuestos ensayados puedan tener sobre ellas a partir de los datos obtenidos en otras arterias. Las arterias coronarias se encargan de la distribución de sangre al corazón y presentan características estructurales y funcionales diferentes de otras arterias: su lecho vascular es diferente, la composición de su pared es diferente y su diámetro cambia en función de las demandas metabólicas del corazón, siendo por ello la relación músculo/materia elástica mayor que en otras arterias, como por ejemplo la carótida. Además, su sensibilidad frente a determinados efectores, como por ejemplo frente al dilatador NO, es completamente diferente (Berne y Levy, 2001). Un factor diferenciador más lo constituye el hecho de que el corazón tiene capacidad angiogénica, de creación de vasos sanguíneos, cuando lo requieran sus necesidades de flujo sanguíneo. Dada la diferencia de estructura y función de las arterias coronarias con respecto a otras arterias, la búsqueda de compuestos activos para el tratamiento de las alteraciones que se produzcan en las mismas requiere de ensayos propios que no dan lugar necesariamente a resultados análogos a los obtenidos en otras arterias.

c)

la regeneración de tejidos lesionados que requiere o se ve favorecida por la estimulación de la angiogénesis, es decir, la formación de vasos sanguíneos, efecto que es importante para ayudar a reparar muchos tejidos lesionados, como puede ser un corazón dañado por un infarto, el tejido óseo fracturado, el tejido cutáneo en el que se han producido cortes y/o heridas o las lesiones cerebrales, procesos regenerativos que a menudo no son sencillos y que es importante favorecer. Además, se piensa que, en los casos de existencia de trombos, podrían facilitar vías alternativas a los mismos y mejorar la circulación, disminuyendo el riesgo de trombosis. Por todo ello, existe una necesidad también de agentes con capacidad para estimular la angiogénesis en distintos tejidos.

d)

la regeneración de otros tejidos dañados específicos, como el tejido del testículo, en el que las lesiones pueden dar lugar a disminución o pérdida total de la fertilidad, o la médula espinal, que puede producirse por traumatismo o bien por otras causas y que frecuentemente incapacita para el movimiento, al perderse la transmisión del impulso nervioso entre el cerebro y las zonas periféricas, efecto que va asociado a otras consecuencias derivadas de la falta de control mecánico y funcional. En ambos casos, las soluciones terapéuticas son muy escasas y frecuentemente de poca eficacia.

e)

el carcinoma hepático, un tipo de cáncer que posee características especiales que lo hacen bastante refractario a la terapia convencional (Venook y cols., 1994), lo cual conlleva un pronóstico incierto para los pacientes.

Los efectos del LGF; al venir mediados por múltiples factores, específicos de cada tejido u órgano, no son en absoluto predecibles. Así, en unos casos sus efectos van a ser eminentemente antifibróticos. En otros, su efecto principal va a ser angiogénico, con lo que se va a facilitar la regeneración de los tejidos dañados. En otros, su acción va a venir mediada por mecanismos enzimáticos. En otros, su acción viene mediada por VEGF-A. En otros, lo que produce es un aumento de la proliferación celular. En otros, tiene una acción mitogénica mediada por TNF-\alpha. En tejidos de hepatocarcinoma, sin embargo, la acción del LGF; la eliminación de células tumorales, es vía apoptosis, también mediada por TNF-\alpha. En varios de los órganos y tejidos considerados, la acción del LGF viene mediada por combinaciones de los factores anteriormente citados. Todo ello hace impredecible para un experto en la materia considerar qué efecto puede llegar a tener el LGF sobre un determinado órgano o tejido. De forma que, los efectos de LGF descritos en el Estado de la Técnica sobre regeneración de hígados hepatectomizados o su efecto antifibrótico en la arteria carótico no son extrapolables de forma obvia a otros tejidos u órganos. Sólo un diseño experimental específico para cada órgano o tejido a considerar, con elección del modelo experimental o el tipo celular más apropiado, así como los parámetros y condiciones de ensayo, puede llegar a mostrar resultados que demuestren si el LGF tiene algún efecto sobre el mismo, e identificar, en caso afirmativo, cuál sería dicho efecto y, eventualmente, a través de qué mecanismo celular, enzimático, metabólico, mediado por otros factores, es ejercido.

La presente invención responde a la necesidad de encontrar agentes terapéuticos útiles para las situaciones mencionadas. En la presente memoria se describe la capacidad del LGF para la regeneración de diversos órganos objeto de lesiones o agresiones, dando lugar a una mejoría de las situaciones patológicas descritas y un efecto estimulador de procesos regenerativos en distintos tejidos. La utilización del LGF en el tratamiento de tejidos lesionados o que estén sometidos a agresiones, tales como paredes arteriales aterioscleróticas, arterias miocárdicas fibróticas, tejidos lesionados cuya regeneración se vea favorecida por la estimulación de la angiogénesis, tejido testicular dañado, médula espinal dañada y carcinoma hepático, así como para la prevención y/o el tratamiento de los trastornos o enfermedades en las que dichos tejidos estén implicados (ateriosclerosis, enfermedad coronaria, infarto de miocardio, fracturas óseas, lesiones cutáneas, lesiones cerebrales, trombosis, infertilidad, discapacidad motriz o cáncer de hígado) es el objeto de esta solicitud de patente.

Descripción de la invención

La invención se refiere al uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de medicamentos útiles en la regeneración tisular de uno o más tejidos lesionados, tejido que se selecciona entre el tejido cardiovascular ateroesclerótico, las paredes de las arterias coronarias fibróticas, el tejido del tracto genito-urinario lesionado, el tejido de médula espinal lesionada, el carcinoma hepático y cualquier tejido lesionado, distinto de los mencionados, en cuya regeneración sea útil un incremento de la angiogénesis.

De acuerdo con esto, un objeto de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para la regeneración de tejido cardiovascular ateriosclerótico, gracias al efecto de disminución de la aterosclerosis que se demuestra más adelante en uno de los Ejemplos de la invención. En dicho Ejemplo se demuestra que la inyección de LGF por vía intraperitoneal produce una disminución significativa de la extensión de las placas ateroscleróticas, unido además a un incremento en la expresión de paraoxonasal, enzima clave en el metabolismo de lípidos plasmáticos oxidados, cuya estimulación presenta una relación estrictamente inversa con la desaparición de las placas de LDL y con la que se están ensayando en la actualidad posibles tratamientos terapéuticos de la aterosclerosis basados en la estimulación de este enzima (Durrington, y cols., 2001; Nackness y cols., 2002; Tward y cols., 2002). Por todo ello, es un objeto de la invención el uso del factor de crecimiento de hígado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la ateriosclerosis.

Otro aspecto de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para la regeneración de la estructura de arterias coronarias fibróticas, en especial de las arterias intramiocárdicas, con lo que se ayuda a disminuir el riesgo de que se produzca enfermedad coronaria. Tal como se demuestra más adelante en uno de los Ejemplos, el tratamiento con LGF de ratas espontáneamente hipertensas, un modelo de hipertensión esencial humana, el tratamiento con LGF produce una importante mejora estructural en las arterias intramiocárdicas que supone una importante recuperación de la arquitectura normal de las paredes de dichas arterias, observándose aumento del diámetro interno de las mismas, con disminución de la relación pared/luz, todo ello unido a una disminución de la cantidad de colágeno y matriz extracelular y de la relación área colágeno/luz, un aumento del número de núcleos de células musculares lisas por unidad de área en la media y, además, una disminución del área ocupada por las vacuolas en la pared arterial. Todo ello debería producir una mejora de la funcionalidad del corazón, disminuyendo el riesgo de enfermedad coronaria. Por esta razón, es un objeto de la invención el uso del factor de crecimiento de hígado para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad coronaria.

Siguiendo con el tejido cardiovascular, otro aspecto de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para la estimulación de la angiogénesis, la formación de capilares a partir de otros ya existentes, proceso que puede activarse en respuesta a un daño tisular y que puede ser un factor importante en la regeneración de un tejido dañado. Por ello, son objetos de la invención los usos del factor de crecimiento de hígado para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del corazón tras un infarto, las fracturas óseas, las lesiones cutáneas, las lesiones cerebrales, como ayuda para asegurar el éxito de trasplantes o para la prevención y/o el tratamiento de la trombosis.

Un aspecto más de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de tejido testicular dañado, gracias a la activación de la proliferación y posterior diferenciación de los precursores de las células de Leydig que se observa tras la administración de LGF a ratas utilizadas como modelo de agresión testicular. En dicho modelo, además, se observa una clara estimulación de la HSL (Hormone-sensitive lipase) en las ratas a las que se les inyectó LGF con respecto a las que no lo recibieron; puesto que se trata de una enzima que parece ser fundamental para la espermiogénesis, cuya deficiencia genética parece estar relacionada con la aparición de infertilidad (Osuga J y cols., 2000) que puede hacerse revertir en ratones transgénicos que expresan la forma testicular de la HSL en las células germinales postmeióticas (Valled-Erdtman V y cols., 2004; Wang SP y cols., 2004), la estimulación de dicha lipasa parece estar directamente relacionada con un aumento de fertilidad. Es por ello un objeto de la invención el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento para ser utilizado en tratamientos de aumento de la fertilidad.

Otro aspecto de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para la regeneración de tejido de médula espinal lesionado. Debido a la importancia que la lesión de este tejido tiene en la discapacidad o incapacidad total para mover los miembros, es también un objeto de la invención el uso del factor de crecimiento de hígado para la fabricación de un medicamento para mejorar la movilidad de personas con dificultades o con incapacidad total para mover los miembros, superiores y/o inferiores.

Asimismo, otro aspecto de la invención es el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del carcinoma hepático (hepatocarcinoma), gracias al efecto de inhibición del crecimiento que produce en las células de hepatocarcinoma.

Los efectos descritos se observan al administrar LGF, indistintamente por vía intraperitoneal o intravenosa, a ratas o ratones que constituyen modelos de distintos trastornos o enfermedades que afectan al ser humano o a otros animales y cuya gravedad o riesgo de empeoramiento disminuyen con la regeneración de uno o más tejidos en los que se manifiesta dicho trastorno o enfermedad. Constituye por ello un aspecto adicional de la invención un método para el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad que se selecciona entre aterosclerosis, enfermedad coronaria, infertilidad, lesión en la médula espinal, carcinoma hepático, infarto de miocardio incluyendo la prevención de infartos a pacientes que han sufrido infartos previos, fractura ósea incluyendo la aceleración de la regeneración de huesos fracturados, cortes o heridas superficiales en tejido cutáneo y lesiones en el cerebro, particularmente una trombosis cerebral, comprendiendo dicho método la administración a un ser humano o un animal de factor de crecimiento de hígado. Son realizaciones preferidas de dicho método de la invención aquellas en las que la administración del LGF se produce por vía intravenosa, así como aquellas en las que la administración es por vía intraperitoneal.

La invención se explicará ahora con más detalle mediante los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuación.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1a - 1f muestran gráficos en los que se comparan los resultados obtenidos al examinar distintos parámetros relacionados con la ateriosclerosis medidos en arterias intramiocárdicas de ratas normotensas control (WKY) (valores representados por las barras sin relleno, 100), ratas espontáneamente hipertensas sin tratar (SHR) (valores representados por las barras con relleno oscuro continuo, 101) y ratas espontáneamente hipertensas tratadas con LGF (SHR+LGF) (valores representados por barras rellenas con líneas inclinadas, //). La Fig. 1a representa el diámetro interno de las arterias miocárdicas, medido en micrómetros; la Fig. 1b representa el valor obtenido al calcular la relación entre la pared y la luz de dichas arterias; la Fig. 1c representa el área de colágeno, en micrómetros cuadrados, medida en cada uno de los casos; la Fig. 1d representa la relación entre la superficie de colágeno y la luz arterial; la Fig. 1e representa el número de núcleos de células de musculatura lisa medidos por cada milímetro cuadrado de media; la Fig. 1f representan el porcentaje que el área ocupada por las vacuolas representa con respecto al total del área de la pared arterial.

La Figura 2 muestra fotografías correspondientes a cortes de arterias coronarias teñidas con el tricrómico de Masson y rojo sirio, lo que permite la tinción de las fibras de colágeno y los núcleos de las células musculares; los espacios sin agente de tinción en la zona de las paredes corresponden a las vacuolas. Los cortes se tomaron de: fotografía superior, marcada como "A": ratas normotensas control; fotografía intermedia, marcada como "B": ratas espontáneamente hipertensas sin tratar; fotografía inferior, marcada como "C": ratas espontáneamente hipertensas tratadas con LGF.

La Figura 3 muestra la diferencia en el área de vascularización, expresada como la superficie ocupada por eritrocitos, en micrómetros cuadrados, medida en el tejido cutáneo de ratones tratados con esponjas subcutáneas impregnadas con albúmina de suero de rata (valor marcado como "Ctrl.", representado por una barra sin relleno, 100) o con LGF (valor marcado como "+LGF", representado por una barra con relleno oscuro continuo, 101).

La Figura 4 muestra los valores medios de número total de células positivas para bromodeoxiuridina (BrdU+) detectadas en ratas tras su sacrificio, efectuado transcurrido el número de días que se indica en abscisas desde que recibieron los siguientes tratamientos: Ctrl.: ratas control, a las que se inyectó solución salina; EDS: ratas a las que se inyectó sulfonato de etilen-dimetano en el tiempo 0; LGF/ratas que recibieron 5 \mug LGF/rata, dos inyecciones por semana durante un tiempo máximo de 4 semanas, dependiendo del momento de su sacrificio; EDS+LGF: ratas a las que recibieron una única inyección de sulfonato de etilen-dimetano en el tiempo 0 y dos inyecciones por semana con 5 \mug LGF/rata durante un tiempo máximo de 4 semanas, dependiendo del momento de su sacrificio.

La Figura 5 muestra el porcentaje de crecimiento con respecto a la cantidad inicial de células inducido por la adición de las distintas cantidades de LGF que se indican en el eje de abscisas, expresadas en pg/ml. Los distintos tipos de células examinados, de las que se partió en todos los casos de la misma cantidad inicial, eran: células de hígado normales (Clone-9) (datos indicados mediante triángulos con un vértice apuntando hacia arriba, \ding{115}); células de hepatoblastoma HepG2 (datos indicados mediante triángulos con un vértice apuntando hacia abajo, \ding{116}); células de hepatocarcinoma PLC/PRF/5 (datos indicados mediante círculos oscuros, \medbullet).

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Ejemplos

Ejemplo 1

Aterosclerosis

Como se ha comentado, esta enfermedad está causada por la deposición de colesterol en las paredes de las arterias, formación de la placa y recubrimiento de fibrosis, que causa en algunos casos obstrucción y en otros rotura ocasional de la placa, con formación de trombos que viajan por la circulación sanguínea hasta su obstrucción y producción de isquemia. Las soluciones terapéuticas a esta situación son muy escasas y de baja eficacia.

Se disponía de datos sobre la actividad del LGF en otros sistemas que apoyaba la posible actividad en aterosclerosis. Eran los siguientes:

a)

La inyección de LGF a ratas normales (4,5 \mug LGF/rata de 200 g) produce un descenso progresivo del colesterol total en suero, desde 95,33\pm7,77 a 71,33\pm7,69 mg/dl (n=6/grupo, p<0,01).

b)

El LGF tiene una marcada acción antifibrogénica, tanto en hígado (Díaz Gil y cols., 1994b; Díaz Gil y cols., 1999), como en fibrosis arterial en la pared de la carótida de ratas espontáneamente hipertensas, SHR (Somoza y cols., 2006). Sin embargo, tal como demuestran los resultados, el efecto de disminución de la aterosclerosis observado no es debido a un simple efecto fibrolítico, sino que el LGF activa otros mecanismos que producen una reducción de la placa aterosclerótica.

La actividad del LGF en aterosclerosis se ha manifestado en varios experimentos realizados en un modelo de ratones "knock-out" de Apoenzima E (Apo E, una proteína fundamental para el metabolismo de colesterol, al ser un ligando que permite la eliminación del colesterol remanente de lo absorbido en la dieta), modelo en el que se produce aterosclerosis por formación de placas de colesterol en las arterias de forma progresiva, a partir del tercer mes de vida aproximadamente. En estos ratones, una vez constatada la presencia de la placa de aterosclerosis, se inyectó LGF (por vía intraperitoneal, 1,7 pg LGF/ratón, dos veces por semana durante cuatro semanas). Transcurrido ese tiempo, se pudo constatar que el LGF tenía los siguientes efectos:

1) Se detectó un incremento en la expresión de Paraoxonasal en hígado de ratones macho de un 150% aproximadamente sobre los controles (4,16 frente a 1,70 U. A). Por ello, la administración de LGF aparece como una nueva opción para el tratamiento de la aterosclerosis por activación de la paraoxonasa 1.

2) Igualmente, en este tipo de ratones, se midió la extensión de la placa de aterosclerosis (realizándose una medición morfométrica, véase Paigen B y cols, 1987, para más detalles), mostrando los ratones inyectados con el LGF una reducción objetivable y estadísticamente significativa. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en la
Tabla 1:

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TABLA 1 Extensión de la placa de aterosclerosis en ratones "knock-out" para la ApoE

1

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Ejemplo 2

Reestructuración de las arterias intramiocárdicas

La rata espontáneamente hipertensa (SHR) es un modelo de hipertensión esencial humana. Las ratas SHR se caracterizan por presentar remodelado y fibrosis vascular, tanto en vasos de conducción como de resistencia. Asimismo, la hipertensión esencial está asociada con fibrosis cardiaca y es, como se ha comentado, un factor de riesgo de enfermedad coronaria (Watatsuki T. Y cols., 2004; Poulsen S.H. y cols., 2005).

Se utilizaron ratas SHR sin tratar (SHR), ratas normotensas control Wistar Kyoto sin tratar y ratas SHR tratadas con LGF (5 \mug/rata, 2 inyecciones por semana durante 2 semanas). Las ratas se sacrificaron después de este período de tratamiento, una vez medida la presión arterial.

Los corazones se fijaron con paraformaldehído al 10%, se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 10 \mum de grosor. Los cortes se tiñeron con Masson Tricrómico (que tiñe de azul o verde las fibras de colágeno) y con rojo sirio (que tiñe las fibras conectivas de un color rojo intenso, mientras que tiñe las estructuras citoplasmáticas y los núcleos de las células de rojo débil y amarillo brillante), y se obtuvieron imágenes de las arterias coronarias intramiocárdicas de diámetro externo <100 \mum (6-15 arterias por corazón). Las imágenes se analizaron con el programa de análisis de imagen Metamorph y se cuantificaron los parámetros relacionados con el remodelado (grosor de la pared, área de la sección de corte, relación pared:luz y diámetro interno), así como los relacionados con la fibrosis vascular (cantidad de matriz extracelular, cantidad de colágeno y número de células de la capa media).

En las arterias intramiocárdicas se obtuvieron los siguientes resultados, que se representan gráficamente en las Figuras 1a a 1f:

- Ratas SHR sin tratar

En comparación con las ratas normotensas control Wistar Kyoto (WKY, primera barra, sin relleno, en cada uno de los gráficos), las ratas SHR sin tratar (datos representados por la segunda barra de cada uno de los gráficos, rellenas con relleno oscuro continuo):

1) incremento del grosor de la pared, 2) disminución del diámetro interno, 3) aumento de la relación pared/luz, 4) disminución del número de células musculares lisas (CML), 5) aumento de la vacuolización celular, 6) aumento de la matriz extracelular y 7) colágeno abundante en las capas adventicia (la zona que rodea exteriormente la pared arterial) y media (la pared arterial, formada fundamentalmente por CML).

- Ratas SHR tratadas con LGF (SHR-LGF)

En comparación con las ratas SHR sin tratar, se observó que el LGF produjo:

1) aumento del diámetro interno (Fig. 1a) y disminución de la relación pared/luz (Figura 1b), parámetro este último característico de una mejora estructural. 2) disminución de la cantidad de colágeno y matriz extracelular (Fig. 1c), y de la relación área colágeno/luz (Fig. 1d). 3) aumento del número de núcleos de células musculares lisas por unidad de superficie (CML/mm.^{2}) de la media (Fig. 1e). 4) disminución del área ocupada por las vacuolas en la pared arterial (Fig. 1f). Un asterisco sobre una barra indica un valor de p<0,01 con respecto a SHR sin tratar.

En la Figura 2 pueden observarse fotografías correspondientes a cortes de arteria coronaria de las ratas normotensas control (fotografía superior), en ratas SHR sin tratar (fotografía intermedia) y en ratas SHR después del tratamiento con LGF (fotografía inferior). En ellas se pueden observar las diferencias en el diámetro interno, la cantidad de colágeno, los núcleos de las células musculares y el área correspondiente a las vacuolas.

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Ejemplo 3

Angiogénesis

Tal como se ha comentado anteriormente, la capacidad de estimulación de la formación de vasos sanguíneos es un factor importante en la regeneración de muchos tejidos. Podría, por ejemplo, ayudar a reparar un corazón dañado por un infarto, a reparar las fracturas óseas, podría minimizar las lesiones cerebrales, o podría facilitar vías alternativas a los trombos y mejoraría la circulación.

Las células endoteliales recubren la pared interior de los vasos. La actividad del LGF sobre células endoteliales de la vena porta en hígado, y la actividad del LGF sobre células endoteliales humanas de la vena umbilical en cultivo (Díaz Gil y cols., 2003), sugieren que las células endoteliales podrían ser el primer blanco de la acción del LGF. También puede interpretarse así la actividad del LGF sobre un modelo de ratas hipertensas, SHR (Somoza y cols., 2006), en el que produce una reestructuración de la pared de la arteria carótida, lo que llevó a los autores de la invención a comprobar si esta posible actividad del LGF podría traducirse en una estimulación de la angiogénesis.

Para ello, en un experimento en piel de ratones a los que se les colocó una pequeña esponja subcutánea impregnada con LGF (1,5 \mug/ratón) o con una sustancia sin actividad, la albúmina de suero (1,5 \mug/ratón), se midió por microscopía, después de 15 días, la superficie ocupada por los eritrocitos (área de angiogénesis). El LGF estimuló la angiogénesis 23 veces con respecto al control, impregnado con albúmina de suero de rata (n=10 ratones/grupo). Los resultados obtenidos se representan en la Figura 3.

Estos resultados se ven confirmados en los experimentos descritos a continuación en los Ejemplos 4 y 5, relativos, respectivamente, a la regeneración testicular en ratas tratadas con EDS y la regeneración de médula espinal lesionada. En ambos casos se detecta actividad angiogénica.

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Ejemplo 4

Regeneración del testículo

La administración de una única dosis de sulfonato de etilen-dimetano (EDS, 75 mg/kg peso corporal) origina una destrucción completa de las células de Leydig del intersticio testicular, por lo que se activa la proliferación y posterior diferenciación de los precursores de células de Leydig, con la aparición de una nueva población de células de Leydig funcionalmente activa en tres semanas. La pérdida total de las células de Leydig tras la administración de EDS origina una caída en la concentración sérica de testosterona además de cambios en los niveles de hormonas gonadotrópicas. A la caída de los niveles de testosterona le acompaña una pérdida de células germinales del epitelio seminífero y una completa descamación de espermátidas alargadas. Las células germinales producen como respuesta a un daño celular una citoquina proinflamatoria, el TNF-\alpha (factor de necrosis tumoral alfa). Esta citoquina afecta a la actividad de las células de Sertoli e inhibe la síntesis de hormonas esteroideas por las células de Leydig.

En este modelo de agresión testicular se ha inyectado LGF (5 \mug LGF/rata, dos inyecciones por semana durante 4 semanas) para tratar de acelerar la recuperación del testículo, tanto desde el punto de vista estructural como funcional. Se utilizaron tanto animales sanos, inyectados con solución salina, como ratas inyectadas con LGF solamente, EDS o EDS+LGF, sacrificándose a tiempos diferentes y comparando los resultados en los cuatro grupos (n=4 ratas/grupo en cada uno de los puntos).

Tras la observación microscópica de las muestras, se pudo comprobar que los cambios más significativos entre los distintos grupos se observan ya a los 10 días después de la inyección con EDS. En el grupo EDS la población de células de Leydig aún no ha comenzado el proceso de regeneración, por lo que su número es menor. Los túbulos seminíferos muestran descamación de células germinales y no aparecen espermátidas maduras y/o espermatozoides. En el grupo LGF se observa una situación muy similar a la del grupo control inyectado con solución salina, excepto que el intersticio muestra mayor capilaridad y un aumento en la población de células de Leydig. En el grupo EDS+LGF la situación es intermedia entre el grupo EDS y el LGF, es decir, hay una recuperación en la población de células de Leydig y la descamación de las células germinales es menor, pudiendo observarse incluso espermatogénesis completa en algunos túbulos seminíferos. En los días posteriores estas variaciones siguen observándose, aunque las diferencias entre los grupos son menores. Estos resultados sugieren que el LGF actúa favoreciendo la rápida regeneración de las células de Leydig, favorece la angiogénesis y en los testículos sin depleción se observa una mayor proliferación de células de Leydig. Estas células de Leydig de neoformación parecen ser funcionales, ya que se comprobó que tanto la glándula prostática como las vesículas seminales muestran un claro inicio de recuperación desde el comienzo del tratamiento con el LGF.

Para hacer un análisis preliminar de la proliferación celular, se valoró la misma a partir del número de número de células positivas para BrdU (bromo-deoxiuridina, que es un marcador de multiplicación celular) detectadas en el epitelio seminífero (Figura 4). El número de células positivas presenta un notable incremento con respecto al control salino ya a los 10 días post-inyección de EDS. Este aumento podría interpretarse como una respuesta natural al daño producido por el EDS para recuperar la población normal de células germinales. En el grupo de animales sometidos a depleción de células de Leydig e inyectados con LGF puede observarse que el aumento de células que replican su ADN no sólo ocurre en los 10 primeros días, sino que se sigue manteniendo a lo largo de toda la fase experimental. Aunque aún no se ha cuantificado, se puede ver que el número de células de Leydig, así como las células endoteliales y musculares de las arteriolas también experimentan un aumento significativo en los animales tratados con LGF.

Los resultados obtenidos confirman la estimulación de la angiogénesis. Así, se observó que:

1) el LGF indujo un aumento de la expresión de VEGF-A (factor de crecimiento del endotelio vascular de tipo A).

2) se produjo una mayor inducción de la expresión del receptor R1 del VEGF (que tiene una relación directa con la angiogénesis), y del receptor R3.

3) se detectaba un incremento en la incorporación de bromodeoxiuridina en arteriolas intratesticulares y en arterias aferentes.

También se ha observado que el número de células que sufren apoptosis disminuye sensiblemente en el grupo de ratas sometidas a depleción de células germinales y tratadas con LGF.

Con respecto al TNF-\alpha, se ha observado que en el grupo control las células que aparecen positivas para esta citoquina varían dependiendo del estadillo del ciclo del epitelio seminífero. Así, en los túbulos donde aparecen espermátidas alargadas son positivas las espermatogonias y algunos espermatocitos primarios. En los túbulos con espermátidas redondas, estas células son las que se marcan. En el grupo EDS la mayor parte de los túbulos muestran marcaje en espermátidas redondas. En el grupo LGF, el marcaje es similar al control aunque de menor intensidad y predominan los túbulos con marcaje en espermatogonias. Los animales del grupo EDS+LGF muestran también un marcaje predominante en espermatogonias. Además, hemos observado que el tratamiento con LGF disminuye la positividad en las células de Leydig.

Las pruebas inmunohistoquímicas demostraron también que las ratas inyectadas con LGF mostraban una clara estimulación de HSL con respecto a las no inyectadas tanto en el epitelio de los túbulos seminíferos como en las células de Leydig. Además, se observó una traslocación de la HSL presente en el epitelio de los túbulos semíniferos desde el citoplasma al núcleo.

En definitiva, el LGF parece ejercer una protección del túbulo seminífero frente al daño inducido por la depleción de andrógenos. Además, aumenta el número de células productoras de testosterona tanto en situación basal como tras el tratamiento con EDS. En líneas generales, la regeneración testicular es más rápida, lo que podría deberse a un aumento de la producción androgénica. Adicionalmente, se observa un aumento de la producción de HSL, lo que apoya la posible utilidad del LGF para estimular la espermiogénesis y aumentar la fertilidad en individuos que presenten un recuento de espermatozoides inferior a la media.

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Ejemplo 5

Médula espinal

En estudios anteriores con el LGF los autores de la invención han demostrado que, por infusión intraventricular en el cerebro de ratas con lesión en la sustancia negra (enfermedad de Parkinson), se incrementó la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU, marcador de multiplicación celular), y la expresión de los marcadores de células madre neurales (CMN) nestina y proteína ácida de glía, observándose células doblemente marcadas para BrdU y nestina en la zona subventricular y el parénquima estriatal (Bazán E. y cols, 2005). Igualmente, por infusión intraestriatal en ratas parkinsonianas, el LGF produjo un incremento de los terminales dopaminérgicos y una mejora conductal en las ratas, test de rotación por inyección con apomorfina (Reimers y cols., 2006). Todo ello hizo pensar que quizá el LGF podría servir también para la regeneración de la médula espinal, aunque el efecto fisiológico buscado fuera completamente diferente: mientras en los experimentos relacionados con la enfermedad de Parkinson hay que intentar contrarrestar la pérdida de terminales dopaminérgicos que, al perder la enzima tirosina hidroxilasa, sintetizan menos neurotransmisor, la dopamina, en el caso de la recuperación de lesiones de la médula espinal se trata, de alguna forma, de "rellenar el hueco" dejado por el traumatismo o hemisección, en el que intervienen neuronas, astrocitos, células de Schwann, células endoteliales y otras y, sobre todo, se trata de restablecer el impulso nervioso de un lado a otro de la lesión. La vía de administración del LGF que se propone es también distinta: mientras en el caso de la enfermedad de Parkinson el LGF se administró por infusión intraestratial o intraventricular por una minibomba osmótica, en el caso de los estudios para el tratamiento de las lesiones de la médula espinal se ha probado a administrar el LGF por inyección intraperitoneal.

Para comprobar el posible efecto del LGF para la regeneración de médula lesionada, se utilizó un modelo de lesión traumática de la médula espinal en ratas en el que, a los dos meses de estar estabilizada la lesión, las ratas están paralíticas de medio cuerpo para abajo. Se trasplantaron células fetales de rata a la zona dañada y se inyectó el LGF (4,5 \mug/rata, 2 inyecciones por semana durante dos semanas). Después se sacrificaron las ratas. La médula estaba completamente regenerada, sin necrosis, abundante vascularización y sin rastro de células fetales. Incluso el límite de la lesión se distinguía difícilmente.

Alternativamente, en modelos de lesión de médula espinal, bien por hemisección o por traumatismo, se ha inyectado el LGF a la semana de la lesión (4,5 \mug/rata, dos veces a la semana, durante dos semanas), sin trasplante de células para rellenar el hueco dejado por la lesión, observándose los siguientes efectos:

1) Aumento de la señal de nestina por inmunohistoquímica (marcador de células madre).

2) Crecimiento axonal.

3) Aumento de angiogénesis.

4) Incremento de la señal de BrdU (mayor número de células en división).

5) Recuperación de la capacidad de miccionar las ratas por sí mismas (las ratas lesionadas pierden esta capacidad, y requieren masajes diarios para evacuar la orina).

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Ejemplo 6

Carcinoma hepático

El carcinoma hepatocelular posee características especiales que lo hacen bastante refractario a la terapia convencional (Venook y cols., 1994), lo cual conlleva un pronóstico incierto. En modelos experimentales en ratas, se ha demostrado que la administración de TNF-\alpha después de hepatectomia parcial del 70% disminuye el desarrollo del tumor (Slooter y cols., 1995), lo cual parece indicar que este tipo de efecto podría ser un posible tratamiento de este tipo de cáncer.

Por otro lado, los autores de la invención demostraron recientemente que el LGF ejerce su acción mitogénica en hígado mediado, al menos en parte, por TNF-\alpha (Díaz Gil y cols., 2003), lo que les llevó a pensar que tal vez el LGF podría tener acción anticancerosa. Para demostrar esta posibilidad, se hicieron cultivos de células de hígado normales (Clone-9, células normales de epitelio de hígado de rata, con número de acceso en la ATCC CRL-1439), células de hepatoblastoma (HepG2, un tumor bien diferenciado, con número de acceso en la ATCC HB-8065) y células de hepatocarcinoma (PLC/PRF/5, un tumor desdiferenciado, con número de acceso en la EACC 85061113). Cuando se añadió LGF en cantidades variables (0-50 picogramos/ml), se detectó una estimulación del crecimiento de células normales y del hepatoblastoma y una inhibición del crecimiento de células del hepatocarcinoma (véase la Figura 5).

El mecanismo por el que el LGF elimina células de hepatocarcinoma es por apoptosis, dependiente de TNF-\alpha, y está basado en los siguientes hechos:

1)

El efecto inhibitorio promovido por LGF sobre cél. PLC/PRF/5 está acompañado por un incremento, dependiente de la concentración, de nucleosomas citosólicos, 4 hr después de la adición (fragmentación de ADN citosólico medido por un kit de muerte celular por ELISA). Paralelamente se produce secreción de TNF-\alpha al medio de cultivo. Ninguno de estos dos efectos se detectó en células normales o de hepatoblastoma.

2)

Un anti-TNF-\alpha revierte el efecto de fragmentación de ADN provocado por LGF, así como uno de los hechos que conforman la ruta de apoptosis, la externalización de fosfatidilserina en la membrana plasmática (medido por "binding" de Anexina V).

3)

El LGF modifica el potencial de membrana mitocondrial (medido por el compuesto JO-1, Molecular Probes OR, USA), otro de los pasos en el proceso de apoptosis. Asimismo, el LGF produce apertura de los poros de las mitocondrias (medido por acumulación de Rodamina 123), otro de los pasos de la ruta apoptótica.

4)

El LGF estimula las caspasas (enzimas fundamentales en el proceso de apoptosis), medido por sustratos fluorogénicos específicos (Research Biochemicals International). Principalmente la caspasa 3 (estimulación de más de 20 veces sobre los controles), y en menor medida la 8 y 9.

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Claims (20)

1. Uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de medicamentos útiles en la regeneración tisular pleiotrópica de uno o más tejidos lesionados que se seleccionan entre el tejido cardiovascular ateroesclerótico, las paredes de las arterias coronarias fibróticas, el tejido del testículo, el tejido de médula espinal, el tejido hepático invadido por un carcinoma hepático o cualquier tejido lesionado, distinto de los mencionados, cuya regeneración venga mediada por un incremento de la angiogénesis.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado es tejido cardiovascular ateroesclerótico.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento de la aterosclerosis.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado son las paredes de arterias coronarias fibróticas.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que el medicamento fabricado es útil en la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad coronaria.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado es tejido del testículo.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos de aumento de la fertilidad.

8. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado es tejido de la médula espinal.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento de una parálisis parcial o total de las extremidades superiores y/o inferiores debida a una lesión en la médula espinal.

10. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado es tejido hepático invadido por un carcinoma hepático.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado es útil en el tratamiento del carcinoma hepático.

12. Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido lesionado es un, tejido distinto de cualquiera de los mencionados en las reivindicaciones 2 a 11 cuya regeneración se provoca y/o acelera mediante la estimulación de la angiogénesis.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que tejido lesionado es tejido cardíaco de un individuo que ha sufrido un infarto.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que el medicamento fabricado es útil en la prevención de futuros infartos de miocardio en individuos que han padecido uno o más infartos previos.

15. Uso según la reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido óseo fracturado.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos que aceleran la regeneración de un hueso que ha sufrido una fractura.

17. Uso según la reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido cutáneo.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que el medicamento fabricado es útil en tratamientos que aceleran la curación de cortes o heridas superficiales.

19. Uso según la reivindicación 12, en el que el tejido lesionado es tejido cerebral.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el medicamento fabricado es útil en la prevención y/o el tratamiento de trombosis cerebral.