CZ20023913A3 - Kationtová diagnostická, zobrazovací a terapeutická činidla spojená s aktivovanými cévními místy - Google Patents

Kationtová diagnostická, zobrazovací a terapeutická činidla spojená s aktivovanými cévními místy Download PDF

Info

Publication number
CZ20023913A3
CZ20023913A3 CZ20023913A CZ20023913A CZ20023913A3 CZ 20023913 A3 CZ20023913 A3 CZ 20023913A3 CZ 20023913 A CZ20023913 A CZ 20023913A CZ 20023913 A CZ20023913 A CZ 20023913A CZ 20023913 A3 CZ20023913 A3 CZ 20023913A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
směs
zeta potential
cationic
composition
imaging
Prior art date
Application number
CZ20023913A
Other languages
English (en)
Inventor
Brita Schulze
Birgitta Sauer
Marc Dellian
Uwe Michaelis
Michael Teifel
Kurt W. Naujoks
Claudia Biro
Original Assignee
Munich Biotech Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Munich Biotech Ag filed Critical Munich Biotech Ag
Publication of CZ20023913A3 publication Critical patent/CZ20023913A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0076—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion
    • A61K49/0084—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion liposome, i.e. bilayered vesicular structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1806—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions
    • A61K49/1812—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions liposomes, polymersomes, e.g. immunoliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1821—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1824—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles
    • A61K49/1827—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle
    • A61K49/1851—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle having a (super)(para)magnetic core coated or functionalised with an organic macromolecular compound, i.e. oligomeric, polymeric, dendrimeric organic molecule
    • A61K49/1863—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle having a (super)(para)magnetic core coated or functionalised with an organic macromolecular compound, i.e. oligomeric, polymeric, dendrimeric organic molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or derivative thereof, e.g. chitosan, chitin, cellulose, pectin, starch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OBLAST TECHNIKY
Předkládaný vynález souvisí se složením a způsoby pro přednostní terapeutická, diagnostická a zobrazovací činidla, akumulovaná v blízkosti aktivovaných cévních míst. Konkrétně souvisí předkládaný vynález se složením a způsoby, které selektivně zaměřují taková činidla k cévním endoteliálním místům, kde jsou vystaveny nebo nahromaděny aniontové náboje na místech angiogeneze nebo zánětu. Konkrétněji předkládaný vynález souvisí se složením a způsoby užitečnými v léčbě onemocnění spojených s angiogenezí jako je rakovina, diabetická retinopatie nebo retrolentální fibroplazie. Kromě toho, souvisí předkládaný vynález s modifikací a balením diagnostických, zobrazujících a terapeutických činidel pro zvýšení jejich účinnosti ve spojení s aktivovanými cévními místy, jež jsou spojena s angiogenezí spojené s nemocemi a s procesem hojení rány. Vynález také souvisí s modifikacemi systémů nosiče léku, které mohou být upraveny pro jejich maximální cílový účinek s minimálními vedlejšími toxickými účinky.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Předkládaný vynález souvisí s objevem, že aktivovaná cévní místa jsou spojena se zvýšením záporného náboje ve srovnání s cévními endoteliálními buňkami v jejich klidovém stavu. Ve skutečnosti zvýšený záporný povrchový náboj aktivovaných endoteliálních buněk a s nimi spojená extracelulární matrixová vrstva může fungovat jako přirozená bariéra proti vniknutí záporně nabitých sloučenin z krve.
• ·
1. Cévní struktura a propustnost.
Krevní cévy, které rozvádějí v těle krev oběhovým systémem a oddělují krev od tkání a mimocévní tekutiny, jsou na své vnitřní stěně pokryty cévními endoteliálními buňkami. Kapiláry, nejmenší krevní cévy, jsou tenkostěnné mikroskopické cévy složené z jedné vrstvy cévních endoteliálních buněk. Stěny kapilár jsou zodpovědné za výměnu živin a metabolitů a za ustavení a udržování rovnováhy tekutin mezi nitrocévními a mimocévními kompartmenty pro tělní tekutiny. Ačkoliv lipofilní a nízkomolekulární hydrofilní molekuly difundují těmito stěnami snadno, pro makromolekuly jsou tyto stěny nepropustné. Cévní endoteliální buňky jsou spojeny s každou další pevným spojením, a tak zajišťují bariéru sloužící k ochraně orgánů proti nekontrolované výměně molekul.
Membrány krevních cév složené z endoteliálních buněk spojených pevným spojením jsou nepropustné. Například, velké množství makromolekul jako jsou protilátky, na proteiny navázané hormony, cytokiny mají přístup do intersticiálníhó prostoru a jsou nakonec vráceny do plasmy přes lymfatický systém. Na počátku padesátých let Pappenheimer a kol. naznačili, že póry, které mají poloměr přibližně 40 Á jsou přítomny v kapilárách a umožňují difusi malých hydrofilních látek (Rippe a kol., 1994). Later, Grotte a kol. publikovali přítomnost velkých pórů od 250 Á do 300 Á pro transkapilární průchod proteinů plasmy (Rippe a kol., 1994). Během let byla přítomnost pórů a kapilární selektivita, založená na velikosti, dostatečně potvrzena v četných tkáních (Rippe a kol., 1994).
Mozek je chráněn hematoencefalickou bariérou, která představuje relativní zvýšení lokálního negativního náboje na asociovaných endoteliálních buňkách a jejich přilehlé extracelulární matrix. Například, Taguchi a kol. (1998) ukázali, že v choroidním plexu mozkových komor u krys jsou luminální povrch a fenestrální přepážka kapilárního endotelu • ·
stejně jako jeho bazální membrány a epitel silně aniontové. Taguchi a kol. (1998) také naznačil, že záporně nabitá endotelová okénka bazálních membrán mohou působit jako nábojová bariéra při inhibici průchodu aniontových molekul.
Proto tedy se má za to, že fyzikálně-chemické vlastnosti molekuly jako její náboj, velikost, konfigurace a polarita ovlivňují její transport přes stěnu krevní cévy (Seno, 1983; Yuan, 1998). Obecně cévní propustnost molekuly nepřímo souvisí s její velikostí. Kromě toho, cévní stěny jsou relativně propustnější pro kationtové než pro aniontové molekuly, pravděpodobně proto, že bazální membrány a glykokalyx na luminálním povrchu cévních stěn jsou záporně nabité (Yuan, 1998) . V souladu s těmito zjištěními, Adamson a kol. (1988) publikovali, že cévní propustnost ribonukleasy (celkový náboj +4; MW 13 683) je dvakrát větší než pro α-laktalbumin, což je molekula o podobné velikosti (MW 14 176), ale záporně nabitá (celkový náboj -10).
Při studiu ontogeneze mikrocévní endoteliální bariéry vůči aniontovým makromolekulám zjistil Henry a kol. (1996), že během stárnutí kuřecí chorioalantoické membrány dochází ke snížení počtu endotelových aniontových míst. Henry a kol. pozorovali kontinuální vazbu kationtového feritinu na luminální endotel, štěrbina spoje a váčky buněčné membrány od 4,5 do 14 dne, ale 18. dne přešla vazba v diskontinuální. Cavallo a kol. (1980) studovali charakteristiky povrchových nábojů malých krevních cév a perivaskulárních složek v cévách krysích zvedačů varlete vystaveným serotoninu nebo mírnému tepelnému poranění a zjistili, že propustné cévy vykazovaly zvýšenou hustotu aniontových míst na luminální endotelové plasmatícké membráně.
• ·« ·-· ·· • · · * · ♦ · · · · ·
2. Zvýšený záporný náboj na angiogenních a aktivních cévních místech.
Angiogeneze je proces, kterým se tvoří nové krevní cévy (Folkman, a kol. 1992) . To je nezbytné pro normální tělesné aktivity jako reprodukce, vývoj a hojení rány. Ačkoliv celý proces angiogeneze není kompletně prozkoumán, má se za to, že tento proces zahrnuje komplexní sadu molekul, které spolu navzájem interagují, aby regulovaly růst endoteliálních buněk, základních buněk vlásečnicových krevních cév. Za normálních podmínek udržují tyto molekuly buňky v klidovém stavu, tj. ve stavu, kdy vlásečnice nerostou v dlouhotrvající časové periodě, která může trvat i týdny, v některých případech i desetiletí. Avšak, je-li nutné, jako třeba během hojení ran, budou tyto molekuly podporovat rychlou proliferaci a přeměnu buněk během periody pěti dnů (Folkman a kol., 1992; Folkman a kol., 1987).
Ačkoliv angiogeneze je za normálních podmínek vysoce regulovaný proces, mnoho onemocnění je charakterizováno trvalou neregulovanou angiogenezí. Například oční neovaskularizace je považována za nejčastější příčinu slepoty. Při onemocnění jako arthritida napadají nově vytvořené krevní vlásečnice klouby a ničí chrupavku. Při cukrovce nově vytvořené vlásečnice v sítnici pronikají do sklivce, krvácejí a způsobují slepotu. Růst a metastázy pevných nádorů jsou rovněž závislé na angiogenezí (Folkman a kol. 1986, Folkman a kol. 1989). Nádory, které se rozrůstají více něž do 2 mm musí získat vlastní zásobení krví, což zprostředkují indukcí tvorby nových krevních vlásečnic. Tyto nové krevní cévy obklopené nádorem poskytují nádorovým buňkám prostředky vstoupit do oběhu a metastázovat ve vzdálených místech jako v játrech, plicích nebo kostech (Weidner a kol., 1991).
Cévní propustnost v nádorech je obecně vyšší než v normální tkáni (Yuan a kol., 1994). Yuan a kol.,(1995) ukázáli, že nádorové cévy jsou propustnější než normální cévy • · _ 5 - ..···· ··· ···· ·· ···· díky přítomnosti velkých pórů o průměru přibližně 400 nm ve stěně cév. Má se za to, že propustnost během angiogeneze normální tkáně a nádorů je důsledkem rozvolnění endoteliálních buněk a rozvolnění jejich pevného spojení za účelem dělit se a rozmnožovat se. Jinak, bylo také naznačeno, že cévní propustnost je nutná pro pokračování angiogeneze (Dvorak a kol., 1995).
Avšak, v tom, co by mohlo být homeostatická odpověď na takovouto propustnost se zdá, že angiogenní endoteliální buňky v aktivních cévních místech exprimují vyšší množství nebo vyšší hustotu záporně nabitých povrchových molekul než ty, které jsou nalezeny v klidovém stavu na cévních místech. Toto zjištění je podpořena prací autorů Cavallo a kol., (1980), kteří ukázali, že propustné cévy vykazují zvýšenou hustotu aniontových míst na luminální endotelové plasmatické membráně v porovnání s kontrolami. Toto zvýšení negativního náboje působí jako přirozená bariéra proti proniknutí záporně nabitých molekul z krevního systému. Jak bylo poznamenáno výše, Taguchi a kol., (1998) ukázali, že zvýšení záporného náboje v endotelových okénkách a bazálních membránách může působit jako nábojová bariéra a inhibovat průchod aniontových molekul.
Bylo ukázáno, že kationtové liposomy mohou být přijaty endoteliálními buňkami a to orgánově specificky s nejvyšší akumulací v plicích (McLean a kol., 1997). Avšak angiogenní endoteliální buňky nádorů a chronických zánětů ukázaly přednostní příjem kationtových liposomů, s vysokým podílem spojeným s endoteliálními okénky (Thurston a kol., 1998). Endoteliální okénka se velmi často nacházejí na nádorovém endotelu (Robert & Palade, 1997; Hobbs a kol., 1998) a mohou tak být místem extravazace kationtových proteinů.
3. Cílení na angiogenní endoteliální buňky pomocí kationtových liposomů.
-6• · · ·
McDonald a kol., U.S.Patent 5,322,678 (1998) popsali selektivní cílení na angiogenní endoteliální buňky pomocí kationtových liposomů obsahujících činidlo, které ovlivňuje růst cílových buněk nebo které cílové buňky označuje. Kationtové liposomy se spojují s angiogenními endoteliálními buňkami po dostatečnou časovou periodu a takovým způsobem, že samotné liposomy anebo obsah liposomů vstupuje do angiogenních endoteliálních buněk. Tak tedy, činidlo, které vstupuje do buňky může inhibovat nebo podporovat angiogenezi buňky nebo pouze poskytuje značku a umožňuje detekci místa angiogeneze. Vynález McDonalda a kol., je založen na objevu, že se kationtové liposomy spojují s angiogenními endoteliálními buňkami v pětinásobném nebo vyšším poměru než se spojují s odpovídajícími endoteliálními buňkami v klidovém stavu.
Tento patent McDonalda a kol. popisuje použití kationtových liposomů, které mohou zahrnovat jak neutrální, tak kationtové lipidy, například obsahující 5 mol% nebo více kationtových lipidů nebo, konkrétněji obsahující neutrální lipidy v množství přibližně 45% a kationtové lipidy v množství přibližně 55%. Zatímco McDonald a kol. naznačují, že kationtové liposomy mají zeta potenciál vyšší než 0 mV, neposkytuje tento patent žádný určitý zeta potenciál nebo izoelektrický bod, nebo jejich rozmezí, které by bylo přednostní pro selektivní cílení angiogenních endoteliálních buněk. McDonald a kol. také nenaznačují přednostní horní limit kationtových lipidů pro použití ve složení kationtových liposomů pro selektivní cílení angiogenních endoteliálních buněk.
Thurston a kol. (1998) také popisují cílení endoteliálních buněk v nádorech a chronických zánětech u myší použitím kationtových liposomů. Thurston používá kationtové liposomy, které mají 55 mol% kationtových složek. Thurston nepopisuje určitý zeta potenciál nebo izoelektrický bod, nebo jejich
-Ί • * « · · · rozmezí pro selektivní cílení angiogenních endoteliálních buněk v nádorech nebo chronických zánětech u myší.
oblasti o vysvětlují, prakticky protonovány modifikací
4. Změna proteinových farmakokinetik.
Morgan a kol., U.S.Patent č.5,322,678(1994) a U.S.Patent č. 5,635,180 (1997), ukazují způsob změny farmakokinetik proteinů pomocí modifikace jejich náboje. Tyto patenty popisují způsoby jak měnit očišťovací schopnost ledvin od „cílících proteinů, konkrétně fragmenty protilátek, založené na zjištění, že protilátka nebo fragment s větším kationtovým nábojem jsou snadněji ukládány v glomerulární bazální membráně a proto jsou tedy rychleji odstraněny ze séra. Tak tedy podle Morgana a kol., může být celkový náboj proteinových činidel změněn buď zvýšením nebo snížením jejich rychlosti odstranění z krevního řečiště.
Patenty Morgana a kol. pozorovali, že nádorové buňky mají celkový záporný povrchový náboj a že normální buňky podobně mají klastry negativních nábojů. Nehledě na záporný náboj nádorových buněk, Morgan říká, že náboj cílového terapeutického proteinu by měl být negativnější (to je více aniontový, nebo jinými slovy mít izoelektrický bod méně než 7), aby snižoval očišťovací schopnost ledvin, zvyšoval poločas životnosti séra a minimalizoval nespecifické interakce s normálními buňkami. Tím je řečeno, že je umožněna zvýšená lokalizace činidla v cílovém místě jako je nádor. Morgan a kol. ukazují modifikaci terapeutického činidla, která má kyselejší izoelektrický bod s posunem do kyselé oblasti o alespoň jednu desetinu pH jednotky a ne více než čtyři pH jednotky, a přednostněji posun izoelektrického bodu do kyselé přibližně jednu pH jednotku. Morgan a kol. že při pí 4,0 nebo nižší (kyselejší), jsou všechny ionizovatelné skupiny v proteinu Jeden ze způsobů jak tohoto dosáhnout je náboje alespoň jednoho lysinového zbytku
-8v cílíécího proteinu z celkového kladného náboje na celkový záporný náboj. Viz, např. U.S.Patent č. 5,635,180 ve sl. 6-8 a a U.S.Patent č. 5,322,678 ve sl. 6-8.
Naproti tomu, pro diagnostické zobrazovací produkty ukazuje Morgan a kol., že neutrální nebo bazický fragment protilátky je nutný pro zlepšení čištění séra a pro vysoké poměry nádoru k pozadí v počátečních časových úsecích. Předpokládá se však, že relativně bazičtější (kationtové) fragmenty jsou přednostní pro izotopy s krátkým poločasem rozpadu zatímco relativně kyselejší (aniontové) fragmenty jsou přednostní pro izotopy, které mají dlouhý poločas rozpadu. Podle toho, Morgan a kol. ukazuje bazičtější izoelektrický bod pro diagnostická činidla a kyselejší izoelektrický bod pro terapeutická činidla. Nicméně Morgan a kol. neposkytuje návod pro upravení náboje nebo izoelektrického bodu, buď terapeutického nebo diagnostického činidla s maximálním cílením a minimální toxicitou.
Na rozdíl od Morgana a kol., popisuje Khawli a kol., U.S.Patent č 5,990,286 (1999) diagnostické použití protilátek se sníženým celkovým kladným nábojem (posun izoelektrického bodu do kyselé oblasti) spíše než zvýšení celkového kladného náboje. Podle Khawli a kol., účel tohoto je zvýšení vazebné specifity antigenu, snížení nespecifické vazby a snížení času na odstranění in vivo. Objevené způsoby zahrnují kroky získání intaktní protilátky, která má vazebnou specifitu pro antigen, jenž má být detekován, nativní protilátka obsahující rozmanité volné aminokyselinové skupiny reagující alespoň jednou z volných aminokyselinových skupin s chemickým činidlem zá tvorby modifikované protilátky tak, že modifikovaná protilátka má izoelektrický bod nižší než izoelektrický bod intaktní protilátky, a označení modifikované protilátky detekovatelnou značkou. Tento způsob by měl vytvořit značenou modifikovanou protilátku, která může být detekovatelná například imunoscintigrafií, pomocí gama kamery.
-9Podobně jako Khawli a kol., publikovali Rok a kol. článek v Renal Failure 20(2):211-217 (1998) s daty, která ukazují, že exkrece konjugátu lék-LMWP do moči může být zvýšena snížením kladného náboje (posun izoelektrického bodu do kyselé oblasti) na povrchu nosiče. Tak tedy takový nosič by měl být atraktivním kandidátem pro cílení léku do močového měchýře.
Tyto přednostní studie se zabývají modifikací náboje terapeutických činidel pro snížení jejich celkového náboje, což by mělo činit tato činidla více aniontovými, za účelem zvýšení jejich lokalizace v cílovém místě, na rozdíl od předkládaného vynálezu, který je částečně založen na překvapivém zjištění, že kladně nabitá terapeutická nebo diagnostická činidla jsou selektivně cílena k aktivovaným cévním místům, která jsou záporně nabita nebo vykazují shlukování záporných nábojů v porovnání s neaktivními cévními místy. Předkládaný vynález se týká modifikací terapeutických a diagnostických činidel pro zvýšení jejich celkového zeta potenciálu nebo izoelektrického bodu pro selektivní cílení k aktivovaným cévním místům. Předkládaný vynález poskytuje návody pro řadu zeta potenciálů a izoelektrických bodů pro selektivní cílení k aktivovaným cévním místům.
V současnosti, z nedostatku klinicky prokázaných způsobů pro selektivní přenos terapeutických nebo diagnostických činidel k cílovým místům, například k místům angiogeneze nebo zánětu, se takové případy řeší přímo fyzickými prostředky jako je chirurgické odstranění rakovinových tkání. Místa angiogeneze jsou také léčena chemickými prostředky. Například rakovina je léčena chemoterapeutickými činidly a pro léčbu chronických zánětlivých stavů se aplikují protizánětlivé léky. Tyto léčby však s sebou přináší obavy týkající se operačních rizik, vedlejších účinků, účinnosti a míře úspěchu. Dále, léčba jako chemoterapie není cílená a může mít za následek vedlejší účinky, jako úbytek kostní dřeně, gastroenteritidu, nevolnost, vypadávání vlasů, poškození jater nebo plic, a
-10* 9 9 4 4 449 444 ··· ·««» «« β sterilitu, vyplývající z chemoterapie. Proto je zde potřeba vývoj nových strategií, které budou selektivně přenášet terapeutická a diagnostická činidla k aktivovaným cévním místům nalezených v různých onemocněních asociovaných s angiogenezi.
Zvýšení záporného náboje v aktivovaných cévních místech, tj. místech, kde se vyskytuje angiogeneze, poskytuje prostředky pro rozlišení endoteliálních buněk v klidovém stavu od buněk aktivovaných. Taková záporně nabitá, aktivovaná cévní místa mohou sloužit jako cíle pro terapeutická a diagnostická činidla modifikovaná tak, že nesou celkový kladný náboj nebo kladný náboj v rozmezích popsaných níže. Terapeutická, zobrazovací a diagnostická činidla mohou být modifikována tak, že nesou kladný náboj a jsou cílena selektivně k aktivovaným cévním místům.
OBSAH VYNÁLEZU
Předkládaný vynález poskytuje způsob selektivně cílené terapeutické, diagnostické nebo další farmaceutické směsi k aktivovanému cévnímu místu, díky modifikaci náboje nebo nábojové hustoty této směsi. S takovou modifikací náboje léku nebo složení nosiče léku je těsně spjata změna v jeho toleranci. Kladně nabité systémy nosiče léku jsou často považovány za biologicky málo tolerovatelné; toxicita se typicky zvyšuje s množstvím kladně nabitých částí. Jak je ukázáno v příkladech, vynálezci překvapivě zjistili, že je lineární vztah mezi cílovým chováním systému nosiče léku a jeho zeta potenciálem. Tento vztah mezi zeta potenciálem a koncentrací kladných složek je však nejlépe vystižen hyperbolickou křivkou. To umožňuje identifikaci oblasti, kde cílení je téměř v maximu, ale nikoliv koncentrace kladných složek. Tento způsob selektivního cílení je přednostně praktikován podáváním směsi vybrané ze skupiny sestávající z: (a) částic, kromě liposomů, které mají zeta potenciál
·* v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5; (b) molekuly, které mají izoelektrický bod nad 7,5; a (c) liposomy obsahující kationtové lipidy v rozmezí od přibližně 25 mol% do 50 mol%;
(d) magnetosomy s vrstvou kationtových lipidů, která má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5; (e) emulze olej ve vodě nebo mikroemulze obsahující kationtové amfifily ve vnější vrstvě v rozmezí od přibližně 25 do 60 raol% nebo které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5. Uvažovaná aktivovaná cévní místa zahrnují: (a) místa angiogeneze; (b) místa zánětů; (c) místa hojení rány; a (d) hematoencefalická bariéra, a jiná další místa budou zřejmá osobám kvalifikovaným v oboru.
Přednostně, zobrazovací směs pro selektivní cílení k aktivovanému cévnímu místu zahrnuje zobrazovací činidlo a nosič. Terapeutická směs pro selektivní cílení k aktivovanému cévnímu místu by zahrnovala terapeuticky účinné množství aktivní látky a nosič a eventuálně také zobrazovací činidloUvažované nosiče zahrnují: (a) částice, kromě liposomů, které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5; (b) molekuly, které mají izoelektrický bod nad 7,5; a (c) liposomy obsahující kationtové lipidy v rozmezí od přibližně 25 mol% do 50 mol%; (d) magnetosomy s vrstvou kationtových lipidů, která má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV;
(e) emulze olej ve vodě nebo mikroemulze obsahující kationtové amfifily ve vnější vrstvě v rozmezí od přibližně 25 do 60 mol% nebo které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5. Vhodná zobrazovací činidla zahrnují částice oxidu železa, barviva, fluorescenční barviva, NMR značky, scintigerafické • 00 0 · 0 0
0 0 0 0
0 * 0 0 « « 0 0 0 0
0000000 ·· 0000 • 0 0
- 12značky, zlaté částice, PET značky, ultrazvuková kontrastní média a CT kontrastní média.
Terapeutické, diagnostické a zobrazovací způsoby používané na živočiších, včetně savců a konkrétně člověka, zahrnují podávání činidel podle protokolu, který dovoluje činidlu nebo aktivní složce se selektivně akumulovat v účinné hladině pro zobrazení nebo jiné diagnostické účely v blízkosti místa angiogeneze.
Uvažované způsoby podávání zahrnují orální podávání, nitrožilní podávání, transdermální podávání, podkožní podávání, intraperitoneální podávání, podávání do nádoru, podávání do tepny, nitrosvalové podávání, podávání po kapkách nebo aerosolem.
V přednostní formě je aktivní složka terapeutické směsi vybrána ze skupiny sestávající z cytostatických a cytotoxických činidel. Příklady cytostatických a cytotoxických činidel zahrnují, ale nejsou tím limitována na, taxany, anorganické komplexy, inhibitory mitosy, hormony, antracykliny, protilátky, inhibitory topoisomerasy, protizánětlivá činidla, alkaloidy, interleukiny, cytokiny, růstové faktory, proteiny, peptidy, tetracykliny a analoga nukleosidů. Konkrétní příklady takových činidel zahrnují, ale nejsou limitovány na, paclitaxel a jeho deriváty, docetaxel a jeho deriváty, epothilon A, B, D a jeho deriváty, camptotecin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, vincristin, navelbin, aktivní činidla proti mikrotubulům, trombospondin, angiostatin, cis-platinové sloučeniny a jiné platinové sloučeniny, gemcitabin, 5'-fluorouracil a jiné nukleosidové analogy.
Další stránka předkládaného vynálezu zahrnuje modifikaci různých směsí, které mají jednu nebo více z charakteristik vybraných ze skupiny obsahující: (a) zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 do +100 mV v roztoku přibližně 0,05 mM KCI o pH přibližně 7,5; a (b) izoelektrický bod nad 7,5.
*· * · ♦ · ··
Je uvažováno, že různé druhy nemocí mohou být léčeny výše uvedenými způsoby a směsmi. Takové nemoci například zahrnují diabetickou retinopatii, chronická zánětlivá onemocnění, revmatickou arthritidu, zánět, dermatitidu, žaludeční vředy, hematogenní a pevné nádory, případech svědčí identifikace cévního místa o spojené s onemocněním.
Uvažuje se, že buď aktivní činidlo nebo nosič mohou být modifikovány tak, aby byl zeta potenciál celkového produktu zvýšen nebo snížen aby bylo dosaženo zeta potenciálu v rozmezí přednostních rozsahů pro zeta potenciál. Takových modifikací může být dosaženo chemickými metodami známými osobám znalým oboru a přednostně zahrnují kationogenní činidla anebo kationtová činidla jako, ale nejsou tím omezeny na, ethylendiamin, hexamethylendiamin, triethylentetraamin, 4dimethylaminobutylamin, Ν,Ν-dimethylaminoethylamin, další kationtové polyaminy, dimethylaminobenzaldehyd, polylysin, další kationtové peptidy, chitosan a další kationtové polysacharidy. Takových modifikací může být také dosaženo reakcí aktivních činidel s kationtovou molekulou za vzniku kovalentní vazby mezi těmito dvěma molekulami. V jiném případě může být takových modifikací dosaženo komplexací (tj. tvorbou nekovalentní vazby) aktivního činidla s kationtovým činidlem nebo systémem nosiče. Některé směsi mohou obsahovat protein a různá činidla pro zvýšení nebo snížení zeta potenciálu budou známa proteinovým a lékařským chemikům.
V přednostní formě předkládaného vynálezu, budou diagnostické, zobrazovací a terapeutické směsi označeny nebo baleny s návodem pro dávkování směsi pro léčbu onemocnění spojeného s angiogenezí.
Uvažuje se, že aktivní přísada terapeutické směsi je vybrána ze skupiny skládající se z etherlipidu, alkyllysolecitinu, alkyllysofosfolipidu, lysolipidu, alkylfosfolipidu. Přednostně etherlipid ve směsi zahrnuje ale psoriasu, V některých angiogenezí
-14·· není omezen na, l-0-oktadecyl-2-0-methyl-rac-glycero-3fosfocholin, l-0-hexadecyl-2-0-methyl-sn-glycerol, hexadecylfosfocholin a oktadecylfosfocholin.
V přednostní formě vynálezu je terapeutická směs účinná pro inhibici zánětu, pro podporu opravy kostí anebo pro podporu hojení ran.
Je vhodné aby se zeta potenciál podávaných směsí pohyboval v rozmezí od přibližně +25 mV do +60 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 při pH přibližně 7,5, je vhodnější rozmezí od přibližně +30 do +50 mV v roztoku přibližně 0,05 mM roztoku KC1 při pH přibližně 7,5. V další formě vynálezu jsou známé diagnostické zobrazovací a terapeutické směsi modifikovány buď pro zvýšení nebo snížení účinného zeta potenciálu směsi takže spadají do přednostních rozmezí popsaných shora nebo v detailním popisu takových jako širší rozmezí od přibližně +25 mV do +60 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl při pH přibližně 7,5.
Kromě DOTAP jsou v předkládaném vynálezu uvažovány různé kationtové lipidy. Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na, DDAB (dioktadecyldimethylamoniumbromid), DC-Chol (3β[Ν',(Ν'~ dimethylaminomethan)-karbamoyl)]cholesterol, DOSPER (1,3dioleoyl-2-(6-karboxyspermyl)-propylamid).
Předkládaný vynález poskytuje způsob stanovení optimálního rozsahu zeta potenciálu pro směs pro cílení do specifického místa. Způsob zahrnuje i)měření zeta potenciálu směsi za různých koncentrací kationtových složek; ii) vynesení hodnot zeta potenciálu na y osu a koncentraci kationtových složek na x osu za získání hyperbolické křivky; iii) stanovení zeta potenciálu a koncentrace kationtové sloučeniny v oblasti, kde se hyperbolická křivka ohýbá, kde oblast ohybu hyperbolické křivky poskytuje optimální oblast zeta potenciálu pro směs. Předkládaný vynález poskytuje způsob pro identifikaci optimální rozmezí zeta potenciálu pro směs pro cílení k specifickému místu zahrnující vyčíslený zeta potenciál pro
-15• * 9 94 9» 94 «9 9« 99 9 9 · 9 ♦
9 4 9<99
99 9 49999
9 · 9 9 9 9
999 999 ··· 9499 99 9999 směs, kde směs je spojena s různým množstvím kationtových složek a identifikující optimální oblast zeta potenciálu. Předkládaný vynález také poskytuje způsob modifikace směsi pro zvýšení její účinnosti zahrnující spojující kationtové složky se směsí za vzniku směsi, která má optimální oblast zeta potenciálu.
STRUČNÝ POPIS OBRÁZKU
Obr.l ukazuje schematické znázornění zeta potenciálu
částice.
Obr .2 ukazuje změřené zeta potenciály pro různě složené
liposomy.
Obr.3 ukazuje zeta potenciál kationtových liposomů
proložených v hyperbolické křivce s zeta potenciálem závislým na koncentraci DOTAP (1,2-dioleoly-3-trimethylamonium propan) v mol%.
Obr.4 A-C ukazuje selektivitu neutrálních, záporně a kladně nabitých dextranů za čas v hodnotách relativních fluorescenčních intenzit v nádorových endoteliálních buňkách oproti jejich okolní tkáni.
Obr.5 A-B ukazuje příjem liposomů značených rhodaminem pomocí HUVEC. Obr. 5A ukazuje intenzitu fluorescence (cps) oproti DOTAP (molární %) . Obr. 5B ukazuje intenzitu fluorescence (cps) oproti zeta potenciálu (mVj.
DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZU
Předkládaný vynález je založen na zjištění, že molekuly, které mají přesně stanovenou celkovou kladnou oblast nebo náboj, mohou být selektivně cíleny k aktivovaným cévním
-16A 4 A AA A· A· «Α AA A A A A A · ·
A A A · A A A
A AA A A · « A A « A · A AAA '·» AAA AAA MM AA AAAA místům. Taková místa jsou nalezena ve spojení s angiogenními endoteliálními buňkami, s místy zánětu a místy hojení rány.
Předkládaný vynález je také založen na zjištěni, že zvýšení nebo změna celkového kladného náboje diagnostických, zobrazujících a terapeutických činidel vede k selektivní akumulaci takových činidel v aktivovaných cévních místech. Kromě toho, výběrem konkrétních nábojových rozmezí nebo nábojových hustot může být minimalizována akumulace takových činidel v místech zánětu, jež jsou chronicky nalezeny v plicích, při poskytnutí cílové selektivity mezi aktivovanými a neaktivovanými cévními místy v jiných tkáních. Z tohoto důvodu je uvažováno, že činidla, která mají celkový kladný náboj pod rozmezím uvedeným níže mohou být upravena, modifikována nebo sbalena za účelem zvýšení jejich zdánlivého celkového náboje. Je také uvažováno, že činidla, která mají celkový kladný náboj nad přednostním rozmezím popsaným níže, mohou být upravena, modifikována nebo sbalena za účelem snížení jejich zdánlivého celkového náboje pro zlepšení jejich biologické tolerance.
Kromě toho je předkládaný vynález založen na pozorování, že molekuly, které mají přesně stanovený celkový kladný náboj se selektivně váží a jsou přijímány angiogenními endoteliálními buňkami vzhledem k oběma, jak endoteliálním buňkám v klidovém stavu, tak k endoteliálním buňkám v relativně neměnných aktivovaných cévních místech jako plíce. Takovéto selektivní cílení a akumulace zvyšuje lokální vazbu těchto činidel k extracelulární matrix a k angiogenním endoteliálním buňkám. Kromě toho, toto selektivní cílení a lokální akumulace činidel se vyskytuje v blízkosti cévních endoteliálních buněk přítomných v aktivovaných cévních mí stech spojených se zánětem, a tím se odlišuje od míst neovaskularizace, které jsou indukované nádory. Taková akumulace, v kterémkoliv typu aktivovaného cévního místa, také vytváří vysoký koncentrační gradient těchto činidel v místech * ·« ·· ··
9 * · 9 9
9 9 9 9
9
999 999
9 9 9 • 99 99 9999 zánětu nebo metastatických nádorů. Pomoci extravazace nebo jinými podobnými procesy jsou taková činidla selektivně akumulována na takových místech pro terapeutické, zobrazovací a diagnostické účely.
Předkládaný vynález proto tedy poskytuje způsob selektivního cílení diagnostického, zobrazovacího a terapeutického činidla k aktivovaným cévním místům savců, včetně lidských pacientů. Obecně vynález obsahuje podávání činidel, která mají celkový kladný zeta potenciál nad 25 mV v přibližně 0,05 mM KCl o pH přibližně 7,5 nebo izoelektrický bod nad 7,5, vhodněji v rozmezích popsaných níže, a umožňující činidlu se selektivně akumulovat na jednom nebo více aktivovaných cévních místech.
Taková činidla mohou být cílena k cévním endoteliálním buňkám, nalezeným na místech zánětu a k angiogenním endoteliálním buňkám a jejich extracelulární matrix za čas, a takovým způsobem, že se činidlo akumuluje v blízkosti cílových cévních endoteliálních buněk. Předkládaný vynález také poskytuje činidla zahrnující nosič, který má přesně určený celkový kladný zeta potenciál nad 25 mV přibližně 0,05 mM KCl a pH přibližně 7,5 nebo izoelektrický bod nad 7,5 v rozmezích uvedených níže, a aktivní složku. Kromě toho, směsi a způsoby předkládaného vynálezu mohou být použity v aktivovaných cévních místech spojených s hojením rány, kde spojení mezi cévními endoteliálními buňkami se stalo propustnější a buňky a jejich extracelulární matrix si vyvinula zvýšený negativní náboj ve srovnání s klidovými nebo neaktivovanými místy.
V tomto ohledu, osoba znalá oboru porozumí, že zeta potenciál je měření platné pro náboj nebo nábojovou hustotu částic, zejména pro koloidní částice, jako jsou liposomy, magnetosomy nebo mikroemulze o velikosti větší než přibližně 3 až 10 nm. Podobně bude porozuměno tomu, že izoelektrický bod je měření platné pro nábojovou hustotu makromolekul zahrnujících proteiny, protilátky a Jcoloidy, jako dextrany.
9 9 9 99 *9 99
• 9 9 9 9 9 4
9 9 9 9 9 9 9 » 9
♦ 9 • 9 9 9 9
>99 999 •9 9999
1.Definice
Není-li uvedeno jinak, všechny technické a vědecké výrazy použité v této specifikaci budou mít stejný význam jako běžně používané těmi osobami znalými v oboru, jímž tento předkládaný vynález přísluší.
„Aktivované cévní místo· označuje cévní endoteliální místa vykazující aktivovaný fenotyp a kde pevná spojení, normálně nalezené mezi endoteliálními buňkami, mohou být následkem angiogeneze nebo zánětu rozvolněna, a propustnost tohoto místa se zvyšuje, což dovoluje extravazaci krve, plasmy a různých farmaceutických činidel.
„Aktivní složka označuje činidlo, které je diagnosticky nebo terapeuticky účinné.
„Angiogeneze označuje tvorbu nových krevních cév. Endoteliální buňky tvoří in vivo nové vlásečnice, jsou-li k tomu indukovány, třeba při hojení rány nebo při tvorbě nádoru, nebo za určitých dalších patologických podmínek, označovaných zde jako nemoci spojené s angiogenezí.
Termín „nemoc spojená s angiogenezí označuje určité patologické procesy v lidech, kde je angiogeneze abnormálně prodlužována nebo je patologicky indukována. Taková onemocnění spojená s angiogenezí zahrnují diabetickou retinopatii, chronická zánětlivá onemocnění, revmatickou arthritidu, dermatitidu, psoriasu, žaludeční vředy, hematogenní nádory nebo jiné typy lidských pevných nádorů.
„Angiogenní endoteliální buňky označují cévní endoteliální buňky podléhající angiogenezí, které proliferují mnohem vyšší rychlostí než je obecně normální proliferační rychlost pro cévní endoteliální buňky.
„Nosič obecně označuje ředidlo, adjuvans, masťový základ nebo prostředek, se kterým je diagnostické, zobrazovací nebo terapeutické činidlo podáváno. Jak je použito zde, termín nosič také označuje farmaceuticky přijatelnou složku(y), která obsahuje komplexy nebo je jinak spojena s aktivní složkou , za • 9 99
- 19• Μ *·· *
9» 9 9
9 » · 9 9 • 9
účelem usnadnit transport takového činidla k jeho zamýšlenému cílovému místu. Uvažované nosiče obsahují ty, jež jsou známy v oboru, liposomy, různé polymery, lipidové komplexy, sérový albumin, protilátky, cyklodextriny a dextrany, cheláty a jiné supramolekulové struktury.
„Kationtové označuje činidlo, které má celkový kladný náboj nebo kladný zeta potenciál (nebo izoelektrický bod nad 7) při fyziologickém pH.
„Koloidy nebo koloidní částice jsou částice rozptýlené v médiu, ve kterém jsou nerozpustné a mají velikost mezí 10 nm a 5000 nm.
„Kombinace nebo „spolu-podávání označuje podávači program, který je synchronní, postupný, překrývající se, měnící se, paralelní nebo jakýkoliv jiný léčebný program, ve kterém jsou podávána různá činidla nebo terapie jako součást jednoho léčebného režimu, předpisu nebo léčebného příkazu, nebo ve kterém časová perioda, kterou se různá činidla nebo terapie, která jsou podávána, jinak částečně nebo kryjí.
„Diagnostické nebo zobrazovací činidlo označuje farmaceuticky přijatelné činidlo, které může být použito pro lokalizaci nebo vizualizaci místa angiogeneze různými způsoby detekce, včetně MRI a scintigrafických technik. Uvažovaná diagnostická a zobrazovací činidla zahrnují ta, známá v oboru, jako barviva, fluorescenční barviva, částice zlata, částice oxidu železa a jiná kontrastní činidla včetně paramagnetických molekul, rentgenových zeslabujících sloučenin (pro CT a rentgen), kontrastních sloučenin pro ultrazvuk, izotopů emitujících γ-záření (scintigrafie) a izotopů emitujících pozitrony (PET).
„Diagnosticky účinné označuje činidlo, které je účinné pro lokalizování nebo jinak identifikuje místo angiogeneze nebo neovaskularizace pro monitorovací nebo zobrazovací účely.
„Emulze nebo „mikroemulze označují systém obsahující dvě nemísitelné kapaliny, ve kterém je jedna rozptýlena, ve formě
-2000 •
· »0
9 99 *0 00
00 0 0 0 0 0
0 0 * 0 0
0 0 0 0 » 0
0 0 0 0 0
00 00 0 0
velmi malých globulí (vnitřní fáze), ve druhé (vnější fáze), například olej ve vodě (mléko) nebo voda v oleji (majonéza) . Emulze nebo mikroemulze mohou být koloidní disperze dvou němísitelných kapalin (např.disperze kapalina-kapalina).
„Endoteliální buňky označují ty buňky vytvářející endotel, což jsou buňky v jedné vrstvě, která obklopuje vnitřní povrch krevních cév, srdce a lymfatických cév. Tyto buňky si ponechaly schopnost buněčného dělení, ačkoliv za normálních (to je, neangiogenních) proliferují velmi pomalu, podléhajíce buněčnému dělení pouze jednou za rok.
„Vysoce toxické nebo „vysoce toxické činidlo označuje protein nebo peptid, který je exprimován v cílových buňkách a inhibuje syntézu proteinu, DNA nebo RNA, nebo destabilizuje lipidový povrch nebo jinak způsobuje buněčnou smrt pomocí apoptosy nebo nekrosy. Taková činidla jsou popsána v související žádosti sériové číslo 60/163,250 podané 3.listopadu 1999.
„Zvýšení zeta potenciálu nebo „zvýšeni izoelektrického bodu označuje změnu nebo modifikaci aktivní složky nebo nosičové sloučeniny pro zvýšení jejího celkového kladného náboje množstvím, které má za následek statisticky významnou změnu v rychlosti nebo množství akumulace této složky nebo nosiče v aktivovaném cévním místě, jako je místo angiogeneze, což může být dosaženo derivatizací, kovalentní modifikací, substitucí nebo adicí aminokyselin, vytvořením komplexů nebo připojením nosiče nebo jiného substrátu, vztaženo k akumulaci této složky nebo nosiče před touto změnou nebo modifikací.
„Izoelektrický bod (pl nebo IEP) označuje pH, při kterém molekula nenese žádný celkový náboj.
„Magnetosomy také nazývané ferosomy, označuje magnetitové jádro o přibližně nanometrové velikosti obalené jednou nebo několika lipidovými vrstvami.
©© • · • · · • · ©·· ··©
-21©· ·♦ » ·· ·© ·♦ • · · · ♦ · · · © • · * · » © » · · © © • · ♦·«· ·© ·© © · „Emulze olej ve vodě je disperze koloidních kapiček hydrofobního oleje pokrytých vrstvou amfifilních lipidů ve vodném prostředí.
„Selektivně cílené nebo „selektivně spojené s odkazem na aktivované cévní místo, jako angiogenní kapilární cévy, označuje akumulaci činidla v blízkosti, nebo vazbu nebo příjem činidla angiogenními endoteliálními buňkami nebo jejich extracelulární matrix ve vyšší míře než by bylo zjištěno pro odpovídající normální (tj. neangiogenní) endoteliální buňky.
„Selektivita s odkazem na intenzitu fluorescence označuje poměr relativní intenzity fluorescence nádorových endoteliálních buněk k intenzitě fluorescence okolní tkáně. V Příkladu 5 je tedy selektivita měřena jako hodnota pro afinitu, se kterou se nabité dextranové molekuly váží k nádorovému endoteliu.
„Terapeuticky účinným se označuje činidlo, které je účinné pro snížení množství nebo rozsahu patologie zánětlivého onemocnění nebo onemocnění spojeného s angiogenezi, jako je rakovina, nebo pro snížení rychlosti procesu angiogeneze nebo neovaskularizace, vhodněji pro značné zabránění pokračování takovýchto procesů v existujících místech angiogeneze, nebo pro značné zabránění počátku angiogeneze na dalších nežádoucích místech angiogeneze. Například, v případě léčby angiogeneze související s nádorovými metastázami, terapeuticky aktivní činidlo by vykázalo značnou protinádorovou aktivitu nebo regresi nádoru, buď díky přímému působení na nádorové buňky, nebo díky inhibicí angiogeneze. Taková sloučenina by například mohla snižovat růst primárních nádorů a vhodněji metastatický potenciál rakoviny. Jinak může taková sloučenina snižovat nádorovou vaskularitu, například buď snížením velikosti nebo počtu mikrocév nebo snížením poměru hustot krevních cév.
„Regrese nádoru označuje snížení celkové velikosti, průměru, průřezu, hmoty nebo životnosti nádoru; snížení ·· • t
-22·· • · · • · 4 • · · * • · · ·· ·*»· nádorových markérů nebo pozitivní znaky z jiných obvyklých znaků rakovinové diagnózy a prognóza, která naznačuje snížení nebo zpomalení růstu rakovinových buněk v důsledku léčby pacienta s rakovinou pomocí směsí podle předkládaného vynálezu. Vhodněji, podávání takových sloučenin vede k alespoň přibližně 30 procentní až 50 procentní regresi nádoru, ještě vhodněji k alespoň přibližně 60 procentní až 75 procentní regresi nádoru a ještě více vhodněji k alespoň přibližně 80 procentní až 90 procentní regresi nádoru a nejvhodněji k alespoň přibližně 95 procentní až 99 procentní regresi nádoru v jednom nebo více nádorových míst u pacienta s rakovinou. V ideálním případě vede takovéto podávání k usmrcení nebo vymýcení živých nádorových buněk nebo zcela k vymýcení nádorových buněk v jednom nebo více nádorových místech u pacienta s rakovinou, vedoucí ke klinicky pozorovatelné remisi nebo jiném zlepšení zdravotního stavu pacienta.
„Blízkost místa angiogeneze označuje takovou fyzickou blízkost aktivní složky k angiogenním endoteliálním buňkám a neovasculatuře, že je dosaženo lokalizovaného koncentračního gradientu, který je schopen přenosu množství aktivní složky, které je diagnosticky i terapeuticky účinné s ohledem na onemocnění spojená s angiogenezi.
„Zeta potenciál označuje měřený elektrický potenciál částice, jako koloidní částice, měřený přístrojem jako Zetasizer 3000 použitím mikroelektroforesy Laser Doppler za specifikovaných podmínek. Zeta potenciál popisuje potenciál na rozmezí mezi většinou roztoku a oblastí hydrodynamické střižné nebo difúzní vrstvy (viz Obrázek 1). Tento termín je synonymem pro „elektrokinetický potenciál, protože je to potenciál částic, který působí navenek a je zodpovědný za elektrokinetické chování částice.
-232. Detailní popis
A.Příjem částic nabitého dextranu potažených oxidem, železa pomocí HUVEC.
Transport makromolekul do endoteliálních buněk je závislý nejen na velikosti ale také na náboji molekuly. Například, McDonald a kol. (U.S.Patent 5,837,283) uvádí, že kationtové liposomy selektivně cílí k angiogenním endoteliálním buňkám, které dodávají živiny nádoru. Kromě toho, Spragg a kol. (1997) uvádí, že aktivované lidské pupečníkové žilní endoteliální buňky (HUVEC) inkubované s imunoliposomy cílenými Eselektinem zahrnující cytotoxické činidlo doxorubicin, vykazují značné snížení v přežívání buněk, zatímco neaktivované HUVEC byly nezasaženy takovou úpravou. Eselectinem cílené imunoliposomy zahrnují kationtové liposomy konjugované s monokionální protilátkou specifickou k Eselectinu. E-selectin je endotelově specifická buněčná povrchová molekula exprimovaná v místech in vivo aktivace, indukovatelná v HUVEC pomocí úpravy cytokiny. Kvalifikovaným v oboru je známo, že buněčný povrch nebo glykokalyx nádorového endotelu je záporně nabitý.
Předkládaný vynález je založen částečně na zjištění, že v kulturách lidských pupečníkových cévních endoteliálních buněk je příjem kladně nabitého dextranu potaženého oxidem železa větší, než příjem neutrálního nebo záporně nabitého dextranu potaženého oxidem železa. Jak je ukázáno v Tabulce 1, byly-li HUVEC inkubovány s kladně nabitým dextranem potaženým oxidem železa, 51,8% oxidu železa bylo buňkami přijato a nalezeno v buněčném lyzátu, zatímco 48,2% zůstalo v médiu. Na druhé straně, byly-li HUVEC inkubovány se záporně nabitým dextranem potaženým oxidem železa, 28,7% oxidu železa bylo nalezeno v buněčném lyzátu, zatímco 71,3% zůstalo v médiu. Kromě toho, byly-li HUVEC inkubovány s neutrálním dextranem potaženým oxidem železa, 18,4% oxidu železa bylo nalezeno v buněčném lyzátu, zatímco 81,6% bylo nalezeno v médiu.
-24v kationtovém mikroemulzích makromolekuly liposomu, olej ve a j ej ímu
B. Vzájemný vztah kationtového náboje a cílení
Ačkoliv předcházející znalosti naznačují, že transport makromolekul, jako protilátek a liposomů, magnetosomů a mikroemulzi, k místu nádoru je závislý na náboji molekuly, předcházející znalosti neuvádí žádné konkrétní rozmezí zeta potenciálu nebo pozitivního náboje pro zvýšení selektivního cílení diagnostických, zobrazovacích a terapeutických činidel k aktivovaným cévním místům, jako angiogenním endoteliálním buňkám a jejich extracelulární matrix.
Předkládaný vynález je částečně založen na zjištění, že zvýšení molárního % DOTAP((1,2-Dioleoyl),sn-3-glycerotrimethylamonium propan) nebo jakékoliv jiného kladně nabitého lipidu (monovalentně nebo polyvalentně nabitého), nalezeného stejně jako v magnetosomech a vodě, odpovídá zeta potenciálu selektivnímu spojení v blízkosti angiogenních endoteliálních buněk. Jak je ukázáno v Tabulce 2 a 3, pro koncentrace DOTAP v rozmezí mezi 4 a 50 mol% je relativně konstantní zvýšení v zeta potenciálu. Avšak, pro koncentraci DOTAP vyšší než 50 mol% jsou hodnoty zeta potenciálu vyrovnány a dosahují maxima + 60mV při pH7-7,5. Grafy výsledků Tabulek 2 a 3 představují hyperbolické křivky (Obrázky 2 a 3), které jsou zachovány dokonce když je zeta potenciál měřen v odlišných pufrovacích systémech. Ačkoliv se absolutní zeta potenciál nepatrně liší v odlišném pufru, hyperbolický tvar grafu výsledků je zachován.
Tyto údaje naznačují, že poměr mezi celkovým kladným nábojem a kationtovou složkou v supramolekulární struktuře (např. liposom) není lineární (Obrázek 2) . Nad koncentrací DOTAP 60 mol% dosahuje zeta potenciál plata, tj. další zvyšování koncentrace kationtové složky nezvyšuje zeta potenciál. Toto se zdá být maximum nábojové hustoty, za kterým další přídavek kationtové složky není výhodný. Zvyšování zeta
-25potenciálu terapeutických, zobrazovacích nebo diagnostických činidel nad tento zeta potenciál bude pravděpodobně zvyšovat nespecifickou vazbu ke tkáním jiným než k cílovému místu(ům), a tím také toxicitu a vedlejší účinky. To může také zvyšovat rychlost odstraňování, čímž dochází ke snížení dosažitelné účinné dávky v cílovém místě.
Na základě těchto údajů, přednostní terapeutické, zobrazovací nebo diagnostické činidlo předkládaného vynálezu je vytvořeno tak, aby se optimalizovalo jeho selektivního spojení k aktivovanému cévnímu místu. Jak však bylo překvapivě zjištěno vynálezci předkládaného vynálezu, bylo by vhodné, aby zeta potenciál vytvořený v částici takových činidel zůstal pod bodem, ve kterém jakékoliv další zvýšení v zeta potenciálu již dále nevede k odpovídajícímu zvýšení v příjmu angiogenními endoteliálními buňkami nebo k akumulaci těchto činidel v aktivovaných cévních místech. Tímto způsobem jsou dosaženy výhody selektivní akumulace a může být minimalizováno množství nespecifických vazeb a vedlejších účinků těchto činidel.
Tak tedy například diagnostické, zobrazovací a terapeutické směsi podle předkládaného vynálezu vytváří celkový zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 do +100 mV v přibližně 0,05 mM KCl o pH přibližně 7,5 nebo mají kationtovou složku v rozmezí od přibližně 20 do 60 mol% za popsaných podmínek. Je vhodné, aby bylo použito rozmezí od přibližně +25 do +60 mV v přibližně 0,05 mM KCl o pH přibližně 7,5 nebo kationtovou složku od přibližně 25 do 50 mol%. Rozmezí od přibližně +25 do +55 mV v přibližně 0,05 mM KCl o pH přibližně 7,5 je vhodnější. Rozmezí od přibližně +30 do +50 mV v přibližně 0,05 mM KCl o pH přibližně 7,5 je nejvhodnější. Tak tedy je pro liposomy tvořené DOTAP a neutrálními lipidy optimální množství DOTAP v rozmezí od přibližně 20 do 60 mol%, a přibližně 35 až 50 mol% je vhodnější.
Obecně na základě výsledků ukázaných na Obrázcích 2 a 3, je vhodné mít alespoň 25 mol% a nejvíce 60 mol% kationtové
-26složky. Obrázky 2 a 3 ukazují, že od 0 do 50 mol% stoupá odpovídající zeta potenciál lineárně. Pod 25 mol% je odpovídající zeta potenciál ve spodní polovině křivky. Proto tedy cílení k angiogenním endoteliálním buňkám by nebylo vhodné pro zde uvažované účely. Nad 60 mol% není dosaženo selektivního cílení. Proto tedy je 60 mol% kationtové složky přednostní horní limit. Za Bod ohybu křivek příjmu může být také považováno poskytnutí optimálního složení. Je vhodné, když je optimální oblast ohybu křivky přibližně ± 10 mV od zeta potenciálu v bodě ohybu nebo přibližně ± 10 mol% od koncentrace kationtové složky v bodě ohybu.
Zatímco zeta potenciál se týká koloidních částic, je stejné cílící chování pozorováno pro kationtové molekuly. V předkládané žádosti je přednostní izoelektrický bod nad 7,5.
Příklady dalších kationtových lipidů, které jsou uvažovány předkládaným vynálezem zahrnují, ale nejsou tím limitovány na, DDAB (dioktadecyldimethylamoniumbromid), DC-Chol(3β[Ν-(Ν',N'dimethylaminoethan)karbamoyl)]cholesterol, DOSPER (1,3dioleoyl-2-(6-karboxyspermyl)propylamid).
C.Selektivní_cíleni pozitivně nabitých molekul k angiogenním endoteliálním buňkám in vivo
Předkládaný vynález je dále založen na zjištění, že vazebná afinita nabitých dextranů k jednomu typu aktivovaného cévního místa, konkrétně angiogenních cévních endoteliálních buněk lokalizovaných v místě nádoru in vivo, se zvyšuje s celkovým kladným nábojem molekuly. Jak je ukázáno na obrázcích 4A-C, selektivita molekul dextranů s celkovým kladným nábojem je větší, než je u odpovídajících molekul, které jsou neutrální nebo mají záporný náboj. Pro účely předkládaného vynálezu je možné předpokládat, že pí pro záporné dextrany je přibližně 3; pro neutrální dextrany přibližně 7 a pro kladné dextrany přibližně 10. Zde ukázané výsledky naznačují, že kationtové makromolekuly adherují
-27k záporně nabitým vazebným místům lokalizovaným na buněčném povrchu nebo na endotelovém glykokalyxu, což odráží zvýšenou lokální koncentraci takových činidel v aktivovaném cévním místě, stejně jako lokální koncentrační gradient, který upřednostňuje extravazaci takových konstruktů přes relativně propustné endoteliální buněčné stěny a do cílové tkáně.
D. Cévní propustnost v lidském nádorovém xenoimplantátu:
závislost na molekulovém náboji
V normálních tkáních je luminální endotelová membrána záporně nabitá (Curry a kol., 1987; Turner a kol., 1983; Baldwin a kol., 1991). Tak je tedy omezena extravazace aniontových makromolekul, jak bylo ukázáno in vivo v kulturách endoteliálních buněk v jedné vrstvě (Sahagun a kol., 1990) a různých normálních tkáních (Jain a kol., 1997). Jak bylo poznamenáno shora, Adamson a kol.(1988) ukázali, že mikrocévní propustnost pro α-laktalbumin (MW=14176; celkový náboj -10) je přibližně 50% ve srovnání s ribonukleasou (MW=13683; celkový náboj +4), což naznačuje, že mikrocévní propustnost pro kladně nabité molekuly je v normálních tkáních vyšší než propustnost pro záporné molekuly. Omezení transportu aniontových makromolekul je kritické pro udržení homeostáze tělních tekutin, díky osmotickému účinku (Curry, 1984).
Nádorové cévy jsou však značně odlišné od normálních cév. Úloha molekulárního náboje v transportu přes stěnu nádorové cévy je stále neznámá. Předkládaný vynález uvádí účinek molekulového náboje na transportní procesy přes bariéru nádorové cévy.
Předkládaný vynález je částečně založen na zjištění, že se kladně nabité molekuly mohou akumulovat ve vyšších koncentracích v angiogenních cévách pevných nádorů ve srovnání s podobně velkými sloučeninami s neutrálním nebo záporným nábojem. Následně po vyšší akumulaci mohou tyto kladně nabité molekuly rychleji prosáknou z nádorových cév do nádorové
tkáně. Tabulka 4 (Příklad 5) ukazuje, že nádorová cévní propustnost kationizovaného BSA (pl-rozmezí: 8,6-9,1) a IgG (pí: 8,6-9,3) je více než dvojnásobně vyšší (4,25 a 4,65 χ 107 cm/s) než anionizovaného BSA (pI*2,0; 1,11 χ 10’7 cm/s) a IgG (pI«3,0-3,9; 1,93 χ 10-7 cm/s). Proto tedy, kationizace, která zvyšuje pí nebo zeta potenciál molekuly může být účinným přístupem při zlepšení přenosu diagnostických nebo terapeutických činidel, stejně jako vektorů genové terapie, a dalších makromolekul k pevným nádorům.
E. Příjem neutrálních a kationtových liposomů značených rhodaminem kulturou lidských endoteliálních buněk (HUVEC)
Předkládaný vynález je dále založen na zjištění, že příjem neutrálních a kationtových liposomů značených rhodaminem buňkami HUVEC, je v souladu s údaji diskutovanými shora dávajícími do souvislosti zeta potenciál a mol% DOTAP. Jak je ukázáno na 0br.5A, je zde relativně konstantní zvýšení v intenzitě fluorescence od 0 do 50 mol% DOTAP. Při koncentracích vyšších než 50 mol% DOTAP, je intenzita fluorescence vyrovnána. Na základě těchto údajů uvažovali vynálezci předkládaného vynálezu, že bude vhodné, když liposomy zamýšlené pro použití ve způsobech a směsích předkládaného vynálezu budou zahrnovat přibližně 20 až 60 mol% DOTAP, nebo jiného kationtového lipidu pro cílení k endoteliálním buňkám za fyziologického pH, a bude vhodnější 50 mol%, jak je naznačeno výše. Obrázek 5B, který ukazuje měření intenzity fluorescence oproti zeta potenciálu naznačuje, že vztah mezi intenzitou fluorescence měřenou v HUVEC buňkách a zeta potenciálem je relativně lineární. Proto tedy, jestliže se zeta potenciál značeríého liposomů dále nezvyšuje, potom se nebude zvyšovat ani příjem značeného liposomů HUVEC buňkami.
F. Modifikace sloučenin za účelem zvýšení jejich náboje (tj. izoelektrického bodu nebo zeta potenciálu)
Pro zvýšení izoelektrického bodu nebo zeta potenciálu diagnostických, zobrazovacích a terapeutických činidel pomocí derivatizace nebo jinou modifikací těchto činidel jsou dostupné různé techniky. Například Morgan a kol. U.S.Patent č. 5,635,180 a U.S.Patent č.5,322,678 a Khawli a kol. U.S.Patent č. 5,990,286 popisují různé techniky modifikace směsi proteinů za účelem změnit jejich celkový náboj. Podobně, Rok a kol. v Renal Failure 20(2):211-217 (1998) ukazuje různé terapeutické seskupení, ve kterých byla modifikována molekula nosiče pro aktivní složku.
Takovéto techniky modifikace, derivatizace a rekombinantní exprese produktů jsou obecně aplikovatelné pro protilátky, fragmenty protilátek, růstové faktory, hormony nebo jiná proteinová aktivní činidla. Další techniky budou vhodné pro modifikaci derivatizaci za účelem zvýšení náboje (izoelektrického bodu) různých cílících a nosičových zbytků, ke kterým je připojena aktivní složka. Takové nosiče zahrnují například různé polymery, které zahrnují polyvinylpyrolidon, kopolymer pyranu, po1yhydroxypropylmethakryl amidfenol, polyhydroxyethylaspartamidfenol nebo polyethylen oxidpolylysin substituovaný palmitylovými zbytky. Užitečné kationt tvořící činidla zahrnují ethylen diamin přes EDCI reakci s karboxylovou skupinou na proteinu. Konkrétní příklad je hexamethylendiamin. Další kationtová činidla zahrnují, ale nejsou tím limitována na, triethylentetraamin, 4-dimethylaminobutylamin, dimethylaminoethylamin a dimethylaminobenzaldehyd.
Kromě toho, mohou být aktivní složky nesoucí vhodný celkový kladný zeta potenciál podle předkládaného vynálezu také spojeny se skupinou biodegradačních polymerů užitečných pro dosažení kontrolovaného uvolnění léku, například kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová, kopolymery polymléčné a hexamethylendiamin,
N,N-30-
polyglykolové kyseliny, polyepsilonkaprolakton, kyselina polyhydroxymáselná, polyorthoestery, polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a prokřížené nebo amfipatické bloky kopolymerů hydrogelů.
Polymery a polopropustné polymerní matrice mohou být vytvořeny do tvarů jako zúžení, hadiček a podobně.
Osobám znalým oboru modifikace sloučenin za účelem změnit jejich celkový náboj budou známy další příslušné modifikační techniky. Viz například U.S.Patent č. 5,990,179 (1999) až
Gyory a kol., který popisuje směsi a způsoby pro zvýšení kladného náboje léků, i když primárně zamýšlené pro zvýšení jejich transdermálního přenosu, ačkoliv předložené techniky jsou důležité pro směsi a způsoby předkládaného vynálezu.
Příklady diagnostických, zobrazovacích a terapeutických činidel, které by těžily z modifikací vedoucích ke zvýšení zahrnují, ale nejsou alkyllysolecitiny, lysolipidy, alkylfosfolipidy. Je třeba zdůraznit, že tato činidla jsou cytostatická a že mohou vytvářet část membránové dvojvrstvy liposomových směsí. Konkrétní příklady takových činidel zahrnují, ale nejsou tím limitovány na, 1-O-oktadecyl2-0-methyl-rac-glycero-3-fosfocholin, l-O-hexadecyl-2-0methyl-sn-glycerol, hexadecylfosfocholin, oktadecylfosfocholin.
jejich náboje etherlipidy, tím limitovány na, alkyllysofosfolipidy,
G. Diagnostické a zobrazovací značky
Jeden z aspektů předkládaného vynálezu tkví v tom, že kladně nabité molekuly mohou být použity jako diagnostické markéry pro zobrazování nádorů, které indukují růst angiogenních endoteliálních buněk. Přednostní využití předkládaného vynálezu pro zobrazovací účely zahrnuje použití magnetické rezonance jako diagnostického nástroje. Pro činidla vhodná pro podávání ve formě liposomů, jsou si ti kvalifikovaní v oboru vědomi různých protokolů pro přípravu
4 4 • 49 44 44
• 4 • • • 4
• • 4 4 4 4 4
44 4 • 44 • 4 4 4 4
liposomů, které mohou být vytvořeny s rozmezím kationtových a nekationtových složek za vzniku liposomů, které mají přednostní zeta potenciál, jak je popsáno shora (Szoka a kol, 1980). Magnetosomy cílící k endoteliálním buňkám mohou být také získány použitím stejných kationtových a nekationtových sloučenin, které jsou použity pro tvorbu liposomů, popsanou shora. Pro velké molekuly, zejména proteiny, mohou být použity jiné vhodné techniky, jak je uvedeno shora, pro přípravu činidel, které mají izoelektrické body v přednostních rozmezích. Nosiče, jako biopolymery, mikroemulze, částice oxidu železa mohou být použity pro přípravu činidel, které mají přednostní izoelektrické body. Nebo může být činidlo modifikováno kationizací.
Osoby kvalifikované v oboru si jsou vědomy, že zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) je v současnosti jeden z nejcitlivějších, ncinvazivních způsobů zobrazování měkkých tělních tkání. Na rozdíl od CT skeneru nebo běžného rentgenu, nepoužívá tento typ skenovacího zařízení záření; místo toho vytváří magnetické pole, které interaguje s vodíkovými atomy nacházejícími se ve vodě, která je obsažena v tělních tkáních a tekutinách. Během doby MRI skenování překládá počítač zvýšenou energii různých vodíkových jader do průřezových obrázků, které jsou studovány. Skenovací postup je velmi citlivý a může často stanovit nádory, které by mohly uniknout při CT skenování. Pomocí MRI může být zobrazeno mnoho odlišných typů tkáně a nádorů, včetně, ale bez omezení na, mozek, prsní žlázy a jakýkoliv pevný nádor nalezený v měkké tělní tkáni (včetně jater, pankreatu, vaječníků, atd.).
Pro zvýšení citlivosti MRI (a stejně i CT) snímků, jsou používána různá kontrastní média. Ačkoliv „makromolekulám! MRI kontrastní média (MMCM) jsou po určitý čas známy, našla tato média diagnostické uplatnění teprve nedávno (Kuwatsuru a kol., 1993). Takovou kapacitu jako kontrastní činidla MRI má několik tříd sloučenin. Tyto třídy zahrnují částice
9* »9 90
9« 9 9 9 9 9
9 9 9 9
9 9 « 9 9 ·
9 9 9 9 e V 9 9 9 99 99 99*9
-32• 999 supermagnetického oxidu železa, nitroxidy a paramagnetické kovové cheláty (Manu a kol., 1995). Obecně je preferován silný paramagnetický kov. Paramagnetické lanthanoidy a ionty přechodných kovů jsou in vivo normálně toxické. Proto je nutné inkorporovat tyto sloučeniny do chelátů s organickými ligandy. Zvýšením cílení takových kovových chelátů do blízkosti angiogenních endoteliálních buněk, podle předkládaného vynálezu, je možné snížit celkovou dávku jinak požadované zobrazovací směsi.
Přijatelné cheláty jsou v oboru známy. Zahrnují: 1,4,7,10tetraazacyklododekan-N,Ν',Ν'',N'’’-tetraoctová kyselina (DOTA); 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-N,N',N''-trioctové kyselina (DO3A); 1,4,7-tris(karboxymethyl)-10-(2hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan (HP-DO3A); diethylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA); DTPA připojená k polymerům {např. k poly-L-lysinu nebo polyethyleniminu); a mnoho dalších. Široká paleta paramagnetických kovů je vhodná pro chelataci. Vhodné kovy jsou ty, které mají atomová čísla 22-29 (včetně), 42, 44 a 58-70 (včetně), a které mají oxidační stavy 2 nebo 3. Ty, které mají atomová čísla 22-29 (včetně) a 58-70 (včetně) jsou přednostní a ty, které mají atomová čísla 24-29 (včetně) a 64-68 (včetně) jsou přednostnější. Příklady takovýchto kovů jsou chrom (III), mangan (II), železo (II), kobalt (II), nikl (II), měď (II), praseodym (III), neodym (III), samarium (III), gadolinium (III), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), erbium (III) a ytterbium (III). Zejména chrom (III), mangan (II), železo (III) a gadolinium (III) jsou přednostní a gadolinium (III) je nejpřednostnější. Viz, např. publikovanou PCT žádost WO/94/27498 pro další informace o těchto paramagnetických činidlech.
Kontrastní média pro zobrazování nádorů jsou typicky podávána mimostřevní cestou tj. nitrožilně, intraperitoneálně, podkožně, nitrokožně nebo nitrosvalově. Proto je kontrastní
* w 9 9 9 • 9 9 99 • «*» * · • • · « 9 99 9
9 • • 9 9 9
9 9 999 99 999
médium podáváno jako směs, zahrnující roztok kontrastního média rozpuštěného nebo resuspendovaného ve vhodném nosiči, obecně ve vodném nosiči. Koncentrace MMCM se liší v závislosti na síle kontrastního činidla, ale typické rozmezí je od přibližně 0,1 pmol/kg do přibližně 100 pmol/kg. Je známa celá řada vodných nosičů, např. voda, pufrovaná voda, 0,9% fyziologický roztok, 5% glukosa, 0,3% glycin, hyaluronová kyselina a podobně. Tyto směsi mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami nebo mohou být sterilně filtrovány.
Brasch a kol. (U.S.Patent č.6,009,342) ukazuje použití kontrastních činidel, připojených k velkému řetězci zobrazujícího makromolekulárního kontrastního média (MCMI), jako kvantitativní způsob pro odhad mikrocévní propustnosti nádorů, obzvláště prsních nádorů. Řetězec může být protein jako albumin, polypeptid jako poly-L-iysin, poiysacharid, dendrimer, nebo rigidní uhlovodík nebo jiná sloučenina s malou molekulovou hmotností ale s účinnější molekulovou velikostí. Přednostní řetězce jsou sloučeniny, které mají podobné chování jako 30 kDa peptid, když procházejí nosičem gelové filtrace.
Další způsoby pro zobrazování nádorů obsahují CT snímky, pozitronovou emisní tomografii (PET) a radionuklidové zobrazování. Kontrastní média pro CT vyšetření zahrnují všechny molekuly, které zeslabují rentgenové záření. Jak bude známé osobám kvalifikovaným v zobrazovacím oboru, pro pozitronovou emisní tomografii a radionuklidové zobrazování jsou přednostní radioizotopy s krátkým poločasem rozpadu. Podobně bude známo, že všechny pozitron emitující izotopy jsou užitečné jako kontrastní média pro pozitronovou emisní tomografii, a všechny izotopy emitující rentgenové záření jsou užitečné pro radionuklidové zobrazování.
Jiný způsob pro tělesné zobrazování pro diagnostické účely je ultrazvukové zobrazování. Existují dva obecné typy ultrazvukových kontrastních činidel; pozitivní kontrastní « ·
-34činidla a negativní kontrastní činidla. Pozitivní kontrastní činidla odrážejí ultrazvukovou energii a tak tedy vytvářejí pozitivní (světlý) obraz. Negativní kontrastní činidla odpovídajícím způsobem zvyšují přenosnost nebo vedení zvuku, a tím vytvářejí tmavý obraz. Byly zkoumány různé druhy látek plyny, kapaliny, pevné látky, a jejich směsi - jako potenciální činidla zvyšující kontrast. Příklady kontrastních činidel z pevných částic uvedených v U.S. Patentu č. 5,558,854 zahrnují, ale nejsou limitována na, IDE částice a SHU454. Evropská patentová žádost 0231091 zahrnuje emulze olej ve vodě obsahující vysoce fluorované organické sloučeniny pro poskytnutí vyššího kontrastu v ultrazvukovém obrazu. Jako ultrazvuková zobrazující činidla byly také zkoumány emulze obsahující perfluoroktylbromid (PFOB). U.S. Patent č. 4,900,540 popisuje použití liposomů založených na fosfolipidech, obsahujících plyn nebo plynný prekurzor jako činidlo zvyšující kontrast.
Kromě toho, pro lokalizaci nemocné nebo poškozené tkáně byly použity značené monoklonální protilátky. Použité značky zahrnují radioznačky (tj. radioizotopy), fluorescenční značky a biotinové značky. Mezi radioizotopy, které mohou být použity pro značení protilátek nebo fragmentů protilátek, jež jsou vhodné pro lokalizační studie, jsou emitory gama, emitory pozitronů, emitory rentgenového záření a emitory fluorescence. Vhodné radioizotopy pro značení protilátek zahrnuji jód-131, jód-123, jód-125, jód-126, jód-133, brom-77, indium-111, indium-113m, galium-67, galium-68, ruthenium-95, ruthenium-97, ruthenium-103, ruthenium-105, rtuť-107, rtuť-203, rhenium-99m, rhenium-105, rhenium-101, tellur-121m, tellur-122m, tellur125m, thulium-165, thulium-167, thulium-168, technecium-99m a fluor-18. Halogeny mohou být jako značky použity více nebo méně zaměnitelně, jelikož protilátky značené halogenem anebo normální imunoglobuliny, by měly do značné míry stejné kinetiky a distribuci a podobný metabolismus. Gama zářiče,
indium-111 a technecium-99m, jsou přednostní, protože takové radiokovy jsou detekovatelné gama kamerou a mají vhodný poločas rozpadu pro zobrazování in vivo. Protilátka může být značena indiem-111 nebo techneciem-99m přes konjugovaný kovový chelátor, jako DTPA (diethylentriaminpentaoctová kyselina). Viz např. Krejcarek a kol. (1977); Khaw a kol. (1980); U.S. Pat. č. 4,472,509; a U.S. Pat. č. 4,479,930). Fluorescenční sloučeniny, které jsou vhodné pro konjugaci k monoklonální protilátce zahrnují fluorescein sodný, fluoresceinisothiokyanát a sulfonyl chlorid Texaské červeně (DeBelder a kol., 1975).
Předkládaný vynález také uvažuje nefluorescenční barvivo, např. patentovou modř V. Hirnle a kol. (1988) popisují enkapsulaci patentové modři V do liposomů.
H. Terapeutické směsi a přenosové systémy
Směsi předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na terapeutické, diagnostické a zobrazovací směsi. Uvažované směsi mohou obsahovat takovou aktivní složku, jako cytostatické nebo cytotoxické činidlo. Příklady cytostatických a cytotoxických činidel obsahují, ale nejsou tím omezeny na, taxany, anorganické komplexy, inhibitory mitosy, hormony, antracykliny, protilátky, inhibitory topoisomerasy, protizánětlivá činidla, inhibitory angiogeneze, alkaloidy, interleukiny, cytokiny, růstové faktory, proteiny, peptidy, tetracykliny a analoga nukleosidů. Konkrétní příklady taxanů zahrnují paclitaxel a docetaxel. Konkrétní příklady anorganických komplexů zahrnují cisplatin. Specifické příklady antracyklinů zahrnují daunorubicin, doxorubicin a epirubicin. Specifické příklady inhibitorů angiogeneze zahrnují Specifické příklady vincristin, navelbin a příklady nukleosidových analogů zahrnují 5-fluoruracil a jiné. Jako další uvažovaná aktivní činidla jsou terapeuticky účinné angiostatin. vinblastin, alkaloidů vinorelbin.
zahrnuj i Specifické • · fragmenty cytokinů, interleukinů, růstových faktorů, proteinů a protilátek.
Jsou známé různé přenosové systémy a mohou být použity pro podávání terapeutických směsí, které zahrnují pozitivně nabité diagnostické zobrazovací nebo terapeutické činidlo nebo pozitivně nabitý nosič pro taková činidla. Pro početné diagnostické, zobrazovací a terapeutické produkty byla popsána například enkapsulace v liposomech, mikročásticích a mikrokapsulích a magnetosomech. V některých případech tyto směsi vedou k receptorem zprostředkované endocytose (Wu a Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Obecně, vhodné způsoby pro podávání takových směsí subjektu zahrnují ale nejsou tím omezeny na, intradermální, nitrosvalové, intraperitoneální, nitrožilní, podávání do tepny, podkožní, nosní, epidurální a orální cesty. Alternativní systémové podávání zahrnuje transmukosální a transdermální podávání použitím penetrantů, jako jsou žlučové soli nebo kyseliny fusidové nebo jiných detergentů. Kromě toho, mohou být terapeutické směsi podávány v místě nádoru přímou intranádorovou injekcí.
Směsi podle předkládaného vynálezu mohou být podávány jakoukoliv výhodnou cestou, například infusí nebo jednorázovou injekcí, absorpcí přes epiteliální nebo mukokutánní výstelky (například ústní výstelka, konečníková a střevní sliznice atd.), a mohou být podávány v kombinaci s dalšími biologicky aktivními činidly. Podávání může být systémové nebo lokální. Kromě toho, může být žádoucí, zavedení farmaceutických směsí vynálezu do centrálního nervového systému, jakoukoliv vhodnou cestou, včetně intraventrikulárního a intratekálního injikování; intraventrikulární injikování může být usnadněno intraventrikulární cévkou, například přichycenou k zásobníku jako je Ommaya zásobník. Může být také použito plicní podávání, např. použitím inhalátoru nebo rozprašovače, dle volby, s činidlem tvořícím aerosol. Může být žádoucí, podávat farmaceutické směsi předkládaného vynálezu lokálně do místa,
-37jež vyžaduje léčbu. Toho může být dosaženo například, a tento způsob není omezen na, lokální aplikací, injikováním, prostřednictvím katetru, prostřednictvím čípku nebo prostřednictvím implantátu, řečený implantát sestává z porézního, neporézního nebo gelovitého materiálu, včetně membrán, takových jako sialastické membrány nebo vlákna.
Směsi předkládaného vynálezu mohou být také přenášeny kontrolovaným systémem kontrolovaného uvolňování. Například může být použita pumpa (viz Langer, supra; Sevton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchvald a kol., Surgery 88:507 (1980); Saudek a kol., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). V další formě předkládaného vynálezu mohou být použity polymerní materiály (Medical Applications of Controlled Reelase, Langer a Wise (eds.), CRC Press., Boča Raton Fla (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Balí (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger a Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levý a kol., Science 228:190 (1985); During a kol., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard a kol., J. Neurosurg. 71:105 (1989). Kromě toho, systém pro kontrolované uvolnění může být umístěn v blízkosti terapeutického cíle, tj. mozku, vyžadující pouze frakci systémové dávky (viz např., Goodson v Medical Applications of Controlled Release , supra, sv. 2, str. 115-138 (1984)). Další systémy kontrolovaného uvolnění jsou diskutovány v přehledovém článku Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
Předkládaný vynález také uvažuje širokou paletu farmaceutických směsí a složenin, jež jsou v souladu se zde
Takové směsi zahrnují terapeutického činidla a uvedenými výzkumnými nálezy terapeuticky účinné množství farmaceuticky přijatelný nosič. Takové farmaceutické nosiče mohou být sterilní kapaliny, jako jsou voda a oleje, včetně takových jako petrolej, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu jako je arašídový olej, sojový olej, • ·
-38minerální olej, sezamový olej a podobné. Voda je přednostní nosič, je-li farmaceutická směs podávána nitrožilně. Jako kapalinové nosiče mohou být také použity fyziologické roztoky a vodné roztoky dextrosy a glycerolu, zejména pro injikovatelné roztoky. Vhodné farmaceutické látky pro přenos léčiva zahrnují škrob, glukosu, laktosu, sacharosu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, křemen, gel, stearát sodný, monostearát glycerolu, mastek, chlorid sodný, odtučněné sušené mléko, glycerol, propylen, glykol, vodu, ethanol a podobné. Je-li žádoucí, může směs také obsahovat minoritní množství zvlhčujících nebo emulgujících činidel nebo činidel pufrujících pH. Takové směsi mohou mít formu roztoků, suspenzí, emulzí, tablet, prášků, kapslí, prášku, směsí s podporovaným uvolňováním a podobné. Směsi mohou být vytvořeny jako čípek, s tradičními pojivý, a nosiči jako triglyceridy. Orální směsi mohou obsahovat standardní nosiče farmaceuticky čistého manitolu, laktosy, škrobu, stearátu hořečnatého, sacharinu sodného, celulosy, uhličitanu hořečnatého atd. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou popsány v „Remington's Pharmaceutical Sciences od E.W. Martina. Takové směsi budou obsahovat terapeuticky účinné množství terapeutické směsi, vhodně v purifikované formě, společně s vhodným množstvím nosiče tak, aby byl poskytnut ve formě pro správné podávání pacientu.
Celková směs by měla vyhovovat režimu podávání. Tak tedy jsou směsi podle předkládaného vynálezu vytvořeny v souladu s běžnými procedurami adaptovanými například pro nitrožilní podávání lidem. Směsi pro nitrožilní podávání jsou typicky roztoky ve sterilním izotonickém vodném pufru. Tam, kde je to vhodné, mohou směsi také obsahovat solubilizační činidlo a lokální anestetikum takové, jako lignokain pro snížení bolesti v místě vpichu. Obecně jsou složky dodávány buď odděleně nebo smíchané dohromady ve formě jednotné dávkovači formy, například jako suchý lyofilizovaný prášek nebo bezvodý
koncentrát v hermeticky uzavřené nádobce, takové jako ampule, označující množství aktivního činidla. Má-li být směs podávána infuzí, může být připravena v infúzní lahvi, obsahující sterilní vodu farmaceutické čistoty nebo fyziologický roztok. Má-li být směs podávána injekcí, může být pro injekci poskytnuta ampule sterilní vody nebo fyziologického roztoku tak, že složky mohou být smíchány před podáním.
Množství diagnostických zobrazovacích a terapeutických směsí předkládaného vynálezu, které bude účinné při diagnóze, monitorování, zobrazování a léčbě konkrétní poruchy nebo stavu, bude záviset na původu poruchy nebo stavu a může být stanoveno standardními klinickými technikami. Kromě toho, mohou být volitelně použita in vivo anebo in vitro stanovení pro usnadnění zjištění optimálních dávkovačích rozsahů. Přesná dávka, která má být použita v jakékoli určité směsi bude také záviset na způsobu podávání a vážnosti onemocnění nebo poruchy a měla by být rozhodnuta podle posouzení lékaře a stavu každého pacienta. Obecně však, jsou-li známé sloučeniny modifikovány za účelem zvýšení jejich celkového pozitivního zeta potenciálu podle zde popsaných způsobů, může být dávka aktivní složky nižší než dávka nemodifikované sloučeniny.
I. Podávání směsí pro zobrazování a léčbu nádorů
Aktivní složky předkládaného vynálezu mohou být podávány způsoby považovanými za vhodné ošetřujícím onkologem nebo jiným lékařem. Takový způsob by také obsahoval přímé injikování do hmoty nádoru nebo jakýmkoliv způsobem, který poskytuje přenos směsí předkládaného vynálezu do blízkosti angiogenních endoteliálních buněk. Podávaná dávka bude záviset na věku, na zdraví a váze příjemce, druhu současné léčby, jeli nějaká, frekvenci léčby a charakteru žádaného účinku, jak je dobře známo onkologům.
V praktikování způsobu tohoto vynálezu, mohou být sloučeniny tohoto vynálezu použity samotně nebo v kombinaci
» <· «· ♦ ♦ ♦ ♦ • · · * > · · · · • · ·
I · · · · · · · s dalšími diagnostickými, zobrazovacími a terapeutickými činidly. V určitých přednostních formách mohou být sloučeniny tohoto vynálezu podávány společně s dalšími sloučeninami typicky předepisovanými pro tyto stavy, podle obecně přijaté lékařské praktiky, včetně antiangiogenních činidel, takových jako expresní vektory pro angiostatin nebo endostatin nebo proteiny nebo jiná terapeutika proti rakovině. Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být využívány in vivo normálně v savcích takových jako lidé, ovce, koně, dobytek, prasata, psi, kočky, myši nebo in vitro.
Terapeuticky účinné dávky mohou být stanoveny buď in vitro nebo in vivo způsoby. Pro každou konkrétní sloučeninu předkládaného vynálezu by mělo být provedeno individuální stanovení pro zjištění optimálních požadovaných dávek. Rozmezí terapeutických účinných dávek bude ovlivněno způsobem podávání, terapeutickými záměry a stavem pacienta, stejně jako například původem, stupněm a velikostí nádoru. Pro injikování hypodermickou jehlou lze předpokládat, že dávka je přenesena do tělních tekutin. Pro jiné způsoby podávání musí být individuálně zjištěna účinnost absorpce pro každou sloučeninu metodami dobře známými ve farmakologii. Proto tedy může být nutné, aby terapeut titroval dávkování a modifikoval způsob podávání dle požadavků pro zajištění optimálního terapeutického účinku. Stanovení účinných hladin dávkování tj . hladin dávek pro dosažení požadovaného výsledku bude snadno zjištěno osobou znalou oboru. Typicky jsou aplikace zahájeny nižšími dávkovacími hladinami a hladiny dávek jsou zvyšovány pro dosažení požadovaného účinku.
Když se individuální potřeby liší, je stanovení optimálního rozmezí účinného množství každé složky v rámci znalosti oboru. Obecně bude optimální dávka stejná nebo nižší, než odpovídající dávka pro terapeutická činidla, která nebyla modifikována nebo derivatizována žádným způsobem tak, aby byl zvýšen jejich celkový zeta potenciál. Je zamýšleno, že
-41modifikovaná terapeutická činidla vykazují zvýšený celkový zeta potenciál pro selektivní cílení, mohou mít vyšší úroveň bezpečnosti a nižší hladinu toxicity a mohou být podávána ve vyšších dávkách. Obecněji, mohou být sloučeniny předkládaného vynálezu podávány nitrožilně nebo mimostřevně v účinném množství v dávkovacím rozmezí od přibližně 0,01 mg do přibližně 50 mg/kg, vhodně od přibližně 0,05 mg do přibližně 5 mg/kg, a vhodněji od přibližně 0,2 mg/kg do přibližně 1,5 mg/kg, v režimu jedné nebo 2 až 4 rozdělených denních dávek anebo kontinuálních infuzí.
onemocnění spoj ených epiteliálními buňkami,
J. Léčba zobrazování různých nemocí projevujících se aktivovanými cévními místy
Existuje několik neoplastických a neneoplastických s proliferací nebo angiogennimi jak bylo zjištěno v určitých typech aktivovaných cévních míst. Jak je diskutováno v Davis-Smyth a kol., U.S. Patent 5,952,199, zahrnují tato onemocnění pevné a metastatické nádory, a onemocnění taková, jako revmatoidní arthritida, psoriasa, arteriosklerosa, diabetická retinopatie, retrolentální fibroplasie, neovaskulární glaukom, s věkem spojená skvrnitá degenerace, hemangiomy, imunitní odmítnutí transplantované rohovkové nebo jiné tkáně a chronický zánět.
Obvyklé terapie pro tato onemocnění se liší. Například rakoviny mohou být léčeny širokou škálou chemoterapeutik. Revmatoidní artritida je často léčena aspirinem nebo substituenty aspirinu, jako je ibuprofen, kortikosteroidy nebo imunosupresivní terapií. Merck Manual (1992) 16. vydání, str.
1305-12. Léčba arteriosklerosy je zaměřena proti symptomatickým podmínkám nebo rizikovým faktorům, jako je snížení hladiny cirkulujícího cholesterolu nebo angioplastika. Merck Manual (1992) 16. vydání, str. 409-412. Diabetes mellitus může indukovat škálu stavů, zahrnujících diabetickou arteriosklerosu a diabetickou retinopatii, které mohou být »· ···» ·· léčeny kontrolou primární cukrovky nebo s ní spojených podmínek, jako je krevní tlak. Merck Manual (1992) 16. vydání, str. 412-413, 1106-1125, 2383-2385. Psoriasa je nejčastěji léčena místními aplikacemi mastí a steroidy. Merck Manual (1992) 16. vydání, str. 2435-2437. Retrolentální fibroplasie je nejlépe léčena preventivně kyslíkem a vitaminem E, může však být také vyžadováno kryoterapeutické odstranění. Merck Manual (1992) 16. vydání, str. 1975-1976. Z předcházejícího je zřejmé, že tato onemocnění spojená s angiogenezí nesdílejí společné rysy, přes jejich sdílenou souvislost s angiogenezí.
Jiná onemocnění spojená s aktivovanými cévními místy zahrnují zánětlivá onemocnění, jako zánět ledvin. Nedávno, Iruela-Arispe a kol. (1995) popsali účast glomerulárních endoteliálních buněk v opravě vlásečnic, indukované jako odezva na glomerulonefritidu. Při mnoha glomerulárních onemocněních může nastat závažné poranění mesangia, které vede k rozpuštění matrix a zničení glomerulárních vlásečnic. Přestože destrukce glomerulární stavby může vést ke stálému poranění, v některých případech dochází ke spontánnímu uzdravení. Iruela-Arispe a kol. ukázali proliferací endoteliálních buněk od 2 do 14 dne po těžkém poranění mesangiem, ve spojení s opravou glomerulárních vlásečnic.
proliferace endoteliálních buněk je spojena faktorem fibroblastu a pozdější proliferace glomerulárních endoteliálních buněk je spojena se zvýšením faktoru cévní propustnosti/růstovému faktoru endoteliálních buněk a zvýšením flk, VPF/VEGF receptoru. Toto naznačuje, že glomerulární endoteliální buňky hrají aktivní roli odezvě na poranění, a že terapeutické, diagnostické směsi předkládaného vynálezu by byly prospěšné ve spojení se zánětlivými stavy takovými, jako glomerulonefritida.
Kromě toho, inhibice nebo zabránění angiogenezí poskytuje relativně nový a globálnější mechanismus léčby různých
Počáteční s růstovým v glomerulární zobrazovací a
-43«· · · onemocnění spojených s angiogenezi. Aspektem předkládaného vynálezu je tedy cílení činidel, která se budou selektivně akumulovat na aktivovaných cévních místech, takových jako v blízkosti angiogenních nebo proliferujících endoteliálních buněk, a způsobovat smrt takových angiogenních buněk nebo nádorových buněk, které indukovali angiogenezi takových buněk a neovaskulátorů. V tomto ohledu byla popsána vysoce toxická činidla v podaném U.S. prozatímní patentové aplikaci sériové č. 60/163,250, která by mohla být vhodně vytvořena, například v liposomech, které mají přednostní zeta potenciál podle předkládané žádosti.
K. Terapie kombinací nebo terapie společného podávání Předkládaný vynález také souvisí s kombinací nebo se společným podáváním sloučenin, zde popsaných, pomocí spojených výzkumných způsobů, společně s podáváním dalších terapií, inhibitorů angiogeneze anebo dalších protinádorových činidel. Takové další terapie, inhibitory angiogeneze a činidla jsou dobře známy například očním lékařům a onkologům. Taková další činidla a spojené způsoby pro používání v kombinaci s konstrukty a způsoby předkládaného vynálezu zahrnují běžná chemoterapeutická činidla, ozařovací terapii, imunomodulační činidla, genovou terapii a použití různých dalších směsí, takových, jako imunotoxiny a antiangiogenní směsi, takové jako angiostatin nebo endostatin, jak je například popsáno v U.S.Patentu č.5,874,081 až Parish a kol. (1999) a U.S.Patentu č. 5,863,538 až Thorpe a kol. (1999), nebo jsou jinak známy v oboru. Terapie kombinací nebo terapie společného podávání založená na předkládaném vynálezu a běžných terapiích pro onemocnění spojená s angiogenezi, takových, jako jsou diskutovány výše, jsou také obzvláště uvažovány.
L. Hojení ran
-44• · » · · aaa ·
A A A A * fl » · A •flflfl A · AAAA
Je také zvláště uvažováno, že směsi a receptury předkládaného vynálezu mohou být selektivně cíleny pro zlepšení léčení ran nebo jiných takových aktivovaných cévních míst za účelem zlepšit hojící proces, na rozdíl od léčby patologických stavů spojených s aktivovanými cévními místy.
Růstové faktory, takové jako fibroblastový růstový faktor a růstový faktor cévních endoteliálních buněk, podporují buněčnou proliferaci a diferenciaci během normálního, ránu hojícího procesu. Rodina fibroblastového růstového faktoru zahrnuje alespoň sedm polypeptidů, u nichž bylo ukázáno, že stimulují proliferaci v různých buněčných liniích, včetně endoteliálních buněk, fibroblastů, buněk hladkého svalu a epidermálních buněk. Mezi členy této rodiny patří kyselý fibroblastový růstový hormon (FGF-1), bazický fibroblastový růstový hormon (FGF-2), int-2 (FGF-3), růstový faktor Kaposiho sarkomu (FGF-4), hst-1 (FGF-5), hst-2 (FGF-6) a keratinocytový růstový hormon (FGF-7); (Baird a Klagsbrun, Ann. N.Y. Acad.
Sci. 638:xiv, 1991). Cévní endoteliální růstový faktor (VEGF), také známý jako cévní propustný faktor (VPF), je vysoce selektivní mitogen pro cévní endoteliální buňky (Ferrara a kol., 1992). Bylo zjištěno, že VPF je zodpovědný za trvalou mikrocévní hyperpermeabilitu k plasmatickým proteinům, dokonce i po ukončeni zranění, což je charakteristickým znakem normálního hojení rány. Toto naznačuje, že VPF hraje důležitou roli v hojení rány (Brown a kol., 1992).
Pro hojení rány mohou být růstové faktory uzavřeny do liposomů a přeneseny k cílovému místu pomocí lokálního injikování liposomální směsi. Liposomy jsou komerčně dostupné od různých dodavatelů. Jinak mohou být liposomy také připraveny podle způsobů známých kvalifikovaným v oboru, jak je například popsáno v U.S.patentu č. 4,522,811. U.S.Patent č. 5,879,713 ukazuje přípravu liposomových směsí rozpuštěním vhodného(ých) lipidu(ů), (takových jako stearylfosfatidylethanolamin, stearylfosfatidylcholin, • »
-45arachadylfosfatidylcholin a cholesterol), v organickém rozpouštědle, které je potom odpařeno, zanechávaje za sebou na povrchu nádobky tenký film vysušeného lipidu. Vodný roztok aktivní sloučeniny nebo její monofosfátové, difosfátové anebo trifosfátové deriváty jsou vneseny do nádobky. Pomocí rukou je poté nádobkou otáčeno, za účelem uvolnění volného lipidového materiálu ze stěn nádobky a rozptýlení lipidových agregátů, čímž se vytvoří liposomální suspenze. Obecně, biologicky aktivní molekuly, takové jako FGF nebo VEGF, jsou smíchány s liposomem v koncentraci, která bude uvolňovat účinné množství v cílovém místě pacienta.
M. Další stavy spojené s poškozenou angiogenezí
Je také zvláště uvažováno, že směsi a receptury podle předkládaného vynálezu mohou být selektivně cíleny pro léčbu dalších stavů spojených s poškozenou angiogenezí.
se angiogeneze poškozuje publikovali, že zpoždění díky snížené migraci
Nedávno bylo ukázáno, že stárnutím. Reed a kol. (2000) neovaskularizace je částečně endoteliálních buněk jakožto následku snížené kolagenasové aktivity. Podle toho, perturbace vedoucí ke zvýšení kolagenasové aktivity, může zvyšovat migrační schopnost a angiogenní potenciál mikrocévních endoteliálních buněk. Rivard a kol. (1999) uvádí, že poškozená angiogeneze ve starých zvířatech byla výsledkem poškozené endoteliální funkce, včetně nižšího bazálního uvolnění NO, snížení rozšíření cév při odezvě na acetylcholin a nižší exprese VEGF v ischemických tkáních. Rivard a kol. (1999) tedy usuzují, že angiogeneze zodpovědná za kolaterální vývoj ischemie končetin, se poškozuje věkem jako následek endoteliální dysfunkce spojené s věkem a snížené exprese VEGF. Zdá se však, že pokročilý věk nezvyšuje kolaterální cévní vývoj a mohl by být ovlivněn exogenními angiogenními cytokiny.
-46·· · ·
Yamanaka a kol.(1999) publikovali, že regenerace poškozené glomerulární vlásečnicové sítě hraje důležitou roli v opravném procesu glomerulárních poškození. Poranění glomerulárních endoteliálních buněk ovlivňuje vývojový a opravný proces glomerulárních onemocnění. Je-li glomerulární poškození vážné, je angiogenezi zabráněno kvůli poranění endoteliálních buněk, s následnou sklerotizací v poškozené oblasti. Nevyhnutelně, poškození glomerulárních endoteliálních buněk, ovlivňuje mesangiální a epiteliální buňky. Je proto uvažováno, že vývoj ledvinového onemocnění může být měněn podporováním angiogeneze endoteliálních buněk.
Raynaudův jev je charakterizován citlivostí rukou ke studenému, díky křečím prstových artérií, vedoucích k blednutí a necitlivosti prstů. Jedná se o poruchu cirkulace, způsobenou nedostatečným krevním zásobením v rukou a nohou. Studie naznačily, že změny v nervovém systému, buď na periferní úrovni nebo na centrální úrovni, jsou spojeny s dysfunkcí endoteliálních buněk. Cerinic a kol. (1997) navrhli použití terapeutické angiogeneze (regenerace cév) při léčbě Raynaudova onemocnění a ztrátě angiogeneze v difúzní sklerodermii.
N. Léčba mozku
Je také zvláště uvažováno, že směsi a receptury podle předkládaného vynálezu mohou být selektivně cíleny, aby prošly hematoencefalickou bariérou pomocí vhodného celkového kladného náboje na endoteliálních buňkách v hematoencefalické bariéře.
Ve světle předcházející obecné diskuse, jsou níže předkládané specifické příklady pouze ilustrativní a nemají v úmyslu omezit rámec vynálezu. Další obecně použitelné a specifické konfigurace budou zřejmé těm osobám, které jsou kvalifikovány v oboru.
-ΑΊ 49··
PŘÍKLADY
Příklad 1: Syntéza částic oxidů železa potažených nabitým dextranem
Dextranem stabilizované částice oxidu železa byly připraveny jak je popsáno v literatuře (Papisov a kol., 1993). Oxidace částic (například pomocí jodistanu) vytvořila aldehydové skupiny na povrchu každého koloidu. Aldehydové skupiny mohou následně reagovat s aminovou skupinou různých činidel, za vzniku produktů s rozdílným celkovým nábojem. Například, spojením s fosfatidylethanolaminem (celkový náboj nula) nebo s jinou neutrální molekulou, mající volnou aminovou skupinu, poskytuje produkt s negativním nábojem. Spojení s dendrimerem, s polylysinem, s proteinem s celkovým kladným nábojem nebo s další vhodnou molekulou s přebytkem kladného náboje ve vhodném molárním poměru poskytuje produkt s celkovým kladným nábojem. Nemodifikované a neoxidované částice oxidu železa stabilizované dextranem byly použity jako zástupce molekul bez náboje.
1. Příprava částic (neutrálně nabitých) oxidů železa stabilizovaných dextranem.
Byl použit klasický přístup koprecipitace magnetitu v přítomnosti potahovacího materiálu takového jako dextran. Reakce probíhala ve dvou krocích. Prvně byly smíchány FeCl2 a FeCl3 s dextranem a precipitovány v alkalickém médiu, za zisku Fe(OH)2 a Fe2O3.nH2O. Po zahřátí byla odstraněna voda a byly získány supraparamagnetické krystaly Fe3O4. Částice byly znovu rozptýleny ve vodě za vzniku částic s různou velikostní distribucí. Byly použity částice se ΖρΓύκιΖΓηγιη (střední velikost částice ze souboru částic vyhovujících monomodálnímu rozdělení) od 80 do 120 nm (Zetasizer 3000, Malvern Instruments). Typicky jeden ml roztoku obsahuje přibližně 0,2 mmol dextranu a 31 mg což je 0,55 mmol Fe. Zeta potenciál
• 4 4 • 44
4 4 •4 44 44 >4 4« těchto částic je přibližně od 0 do -15 mV při pH 7 v 0,05 M
KC1.
2. Oxidace částic oxidu železa.
Oxidace částic oxidu železa potažených dextranem bylo dosaženo modifikací postupu Bogdanova a kol. (Bogdanov Jr. a kol. 1994) . Částice oxidu železa potažené dextranem byly smíchány s jodistanem sodným v přibližném molárním poměru 6 mol dextrosy na 1 mol IO4- ve vodném roztoku (30 min pH 6) . Reakce byla zastavena přidáním ethylenglykolu (v přibližně 300 krát nebo vyšším molárním přebytku). Následně byl roztok dialyzován proti 0,15 M roztoku NaCl.
3. Příprava kladně nabitých částic
Shora získané oxidované částice oxidu železa byly použity k přípravě pozitivně nabitých částic. Vodný roztok polylysinu (2 μπιοί) byl smíchán s přiblližně 20 μπιοί borátu sodného (pH 9) a modifikovanými částicemi oxidu železa z kroku 2, obsahujícími 300 μπιοί železa a 100 μπιοί dextrosy. Emulze byla dialyzována proti 0,15 M NaCl a byla použita pro experimenty s buněčnou kulturou. Zeta potenciál těchto částic byl přibližně +50 mV (pH 7,5).
4. Záporně nabité částice
Záporně nabité částice oxidu železa, které jsou potaženy dvojitou vrstvou kyseliny laurové, jsou komerčně dostupné od Berlin Heart AG. Zeta potenciál těchto částic je přibližně od -30 do -40 mV (při pH přibližně 7).
Příklad 2: Alternativní syntéza nabitých dextranových částic.
Neutrální polykationtový a polyaniontový dextran může být zakoupen od Amersham Pharmacia Biotech. Zatímco neutrální dextran může být získán v široké škále tříd velikosti (od 10 000 do 2 000 000 Daltonů), nabité dextrany jsou dostupné pouze v jedné velikosti (500 000 Daltonů). Kationtový dextran je derivát diethylaminoethyletheru (DEAE), aniontový dextran je síran. Jak je popsáno níže, DEAE dextran a dextran síran mající jiné molekulové hmotnosti byly syntetizovány modifikací pomocí dobře známých postupů.
· Příprava dextranových částic s definovanou velikostí
Před derivatizací byly dextranové molekuly rozděleny do různých tříd na základě jejich velikostí, což je způsob podobný tomu, jenž byl popsán Isaacs a kol. (1983). Následná charakterizace (např. hustota náboje, izoelektrická fokuzace) tak může být použita ke stanovení poměru nabitých funkčních skupin na molekulu dextranu.
Dextran byl zakoupen od Pharmacia Upsala, Švédsko ve třech různých velikostních třídách (10 000, 70 000 a 500 000 Daltonů), které byly v každém případě použity jako výchozí materiál. Molekulová velikost dextranu byla dále zkontrolována gelovou chromatografií. Aby toto bylo provedeno, byl dextran 10 000 Daltonů nanesen na kolonu naplněnou Sephacrylem S-200 (Pharmacia, délka 75 cm, vnitřní průměr 5 cm) a eluován 0,05 M hydrogenuhličitanem amonným (pH 8,2). Potom byly sbírány 20 ml frakce a byly analyzovány pro obsah hexosy, jak je popsáno v Mokrasch a kol. (1954). 70 000 Daltonový dextran byl podobně chromatograficky dělen na koloně AcA 22 (LKB, Bromma, Švédsko, 96 x 2,5 cm). Dále byly sbírány 9 ml frakce. 500 000 Daltonový dextran byl dělen chromatografií na koloně naplněné Sepharosou 6B (Pharmacia, 96 x 2,5 cm) a byly sbírány a analyzovány 9 ml frakce. Pro každý typ dextranu byly sbírány frakce s maximálním obsahem dextranu, které byly spojeny a tvořily přibližně 70% původního materiálu. Ze všech spojených dextranových frakcí byl materiál lyofilizován pro další použití.
Izoelektrický bod dextranových frakcí byl stanoven izoelektrickou fokuzací ve Pharmalyte gelu (Amersham Pharmacia ··
• © * »© ··
• • © • · ©
• • © © • · · •
• • • • © •
• · · • · · •
Biotech), pokrývajícím pH od 3 do 11, a byl zjištěn, že je kolem pH 7.
. Příprava polyaniontového dextranu
Síran dextranu byl připraven, jak je popsáno v Nagasawa a kol. (1974). Tak tedy 162 mg dextranu (1 mmol glukosy, 225 mg 8-chinolylsíranu (1 mmol) a 67 mg CUCI2 (0,5 mmol) byly rozmíchány v 10 ml bezvodého dimethylformamidu a míchány 5 hodin při 40°C. Následně byla reakční směs naředěna 50 ml vody, což vedlo k vytvoření precipitátu. Precipitát byl odstraněn filtrací a filtrát byl dělen na koloně Dowex 50W (X8, H+, 20-50 póry). Vyteklé a promyté podíly byly smíchány, neutralizovány 2 N NaOH a dialyzovány přes noc proti vodě. Dialyzovaný roztok byl dále koncentrován na 2,5 ml ve vakuu a byl po kapkách přidán ke 45 ml ethanolu, což vedlo k precipitaci síranu dextranu sodného. Tento precipitát byl oddělen centrifugací, promyt ethanolem, sušen přes P2O5 za vakua 3 hodiny při 80°C. Izoelektrický bod IEP každého komplexu byl stanoven izoelektrickou fokusací ve Pharmalyte gelu (Amersham Pharmacia Biotech) pokrývajícím pH od 2,5 do 5. Síran dextranu z frakce 10 000 Daltonů měl IEP při pH 3, frakce 70 000 Daltonů pod pH 2,5 a frakce 500 000 Daltonů při 2,8.
V každém produktu byl síran stanoven gravimetricky jako BaSO4 (Harris a kol. 1997), zatímco dextran byl kvantifikován pomocí anthronu (Mokrasch a kol. 1954). Molární poměr dextranu k síranu byl přibližně 46 pro 10 000 Daltonovou frakci, 190 pro 70 000 Daltonovou frakci a 54 pro 500 000 Daltonovou frakci.
. Příprava polykationtového dextranu
DEAE dextran byl připraven, jak je popsáno McKernanem a kol. (1960). Takže, 6 g dextranu bylo rozpuštěno v roztoku NaOH (4 g NaOH v 17 ml vody) a ochlazeno na 0°C. Za míchání
-51·«» ··· • 9* ♦· ·* *« « « « * · • · 9 · byl přidán 2-chlortriethylaminhydrochlorid (3,5 g ve 4,5 ml vody) a teplota byla zvýšena na 80°C po 35 min. Po ochlazení byl za míchání přidán ethanol, což vedlo k precipitaci DEAE dextranu. Produkt byl oddělen centrifugací, rozpuštěn ve vodě a znovu precipitován. Postup byl opakován dokud nebyl supernatant bezbarvý. Vodný roztok produktu byl nakonec neutralizován pomocí HCI, dialyzován a koncentrován ve vakuu. DEAE dextran byl izolován lyofilizaci.
Izoelektrický bod (IEP) každého komplexu byl stanoven na Pharmalyte gelu (Amersham Pahrmacia Biotech) pokrývajícím rozsah pH od 8 do 10,5. Frakce DEAE dextranu 10 000 a 70 000 Daltonů měly izoelektrický bod nad pH 10,5 a frakce 500 000 Daltonů měla IEP při pH 9,6.
V každém produktu byl stanoven dusík spalovací analýzou následovanou GC analýzou, zatímco dextran byl kvantifikován pomocí anthronu (Mokrach a kol. 1954). Molární poměr dextran/amin byl přibližně 2 pro frakci 10 000 Daltonů, 45 pro frakci 70 000 Daltonů a 590 pro frakci 500 000 Daltonů.
Příklad 3: Příjem částic oxidu železa potažených nabitým dextranem buňkami HUVEC
Kultury lidských endotelových buněk (HUVEC) byly očkovány v buněčné hustotě 2 x 104 buněk na cm2 do kultivačních misek potažených želatinou a byly kultivovány 48 h v endotheliálním růstovém médiu s 2% fetálního telecího séra při 37°C a 5% CO2 ve vlhké atmosféře. Kultivační médium bylo odstraněno, buňky byly promyty PBS a byl přidán 1 ml endotelového základního média bez séra. Částice oxidu železa potažené nabitým dextranem byly přidány ke kulturám v koncentraci 50 pg Fe3+/ml. Po 4 h kultivace bylo médium odstraněno a kultury byly promyty 1 ml PBS. Odstraněné kultivační médium a promývací roztok byly spojeny a byla změřena koncentrace železa pomocí thiokyanátové reakční metody popsané v Jander (1995). Buňky byly lyžovány 500 μΐ koncentrované HCI a kultivační misky byly promyty 500 μΐ ·
-52• · · · · • •4 ··*· ·· ····
PBS. Buněčný lyzát a promývací roztok byly spojeny a byla změřena koncentrace železa pomocí thiokyanátové reakční metody popsané v Jander (1995).
Výsledky předchozího experimentu jsou uvedeny v Tabulce 1, níže.
Tabulka 1. Koncentrace železa v buněčných lyzátech a kultivačním médiu kultur HUVEC po inkubaci s částicemi oxidu železa potaženými nabitým dextranem
Částice Náboj Buněčný lyzát Fe3+|pg| Médium Fe3+ [pg] Celkem Fe3+ [pg] Znovuzískání [%] Buněčný lyzát % z celku Médium %z celku
Fe potažené kys. laurovou negativní 11,04 27,35 38,39 78,48 28,7 71,3
FeDex-pLys pozitivní 16,80 15,59 32,39 61,09 51,8 48,2
FeDex neutrální 5,38 23,84 29,22 70,92 18,4 81,6
Stanovené koncentrace železa v buněčných lyzátech a kultivačním médiu jasně ukazují, že příjem částic oxidu železa potažených nabitým dextranem HUVEC je výrazně vyšší než příjem neutrálních nebo negativně nabitých částic.
Příklad 4: Měření zeta potenciálu liposomů.
1. Principy měření
Zeta potenciál byl měřen pomocí Zetasizeru 3000 (Malvern Instruments). V tomto experimentu závisí elektroforetická pohyblivost na hustotě náboje koloidních částic a je měřena pomocí Laserové Dopplerovy mikroelektroforézy. Částice jsou detekovány na základě jejich schopnosti rozptylovat světlo.
Měření byla prováděna při 25°C v několika opakováních. Vzorky a standardní roztok (latexové částice s definovaným zeta potenciálem) byly opakovaně měřeny pro ujištění se, že
-53• · · «* ·· ·· ·· »· ·· * · * 5 · .
• · · · · · · • ·· · · · · · » • · · · · · · ··· ··· ··· ···· ·· ···· systém pracuje správně. Byly připraveny liposomy (10 mM celkový lipidový obsah) s měnícím se obsahem kationtové složky (DOTAP).
2. Syntéza liposomů.
Za prvé je použita filmová metoda. Lipidy jsou rozpuštěny v chloroformu v baňce s kulatým dnem. Baňka je poté otáčena ve vakuu, dokud lipidy nevytvoří tenký film. Lipidový film je vysušen při 40°C ve vakuu při 3 až 5 mbar po dobu přibližně 60 minut. Následně jsou lipidy dispergovány ve vhodném objemu 5% glukosy za vzniku suspenze mnohovrstevných lipidových váčků (koncentrace lipidu 10 mM) . Další den jsou částice extrudovány (filtrace za tlaku) přes membrány o vhodné velikosti, typicky mezi 100 a 400 nm (pro zeta potenciál byly všechny liposomy extrudovány přes 100 nm membrány).
Pro měření zeta potenciálu, byly směsi ředěny (1:25) ve dvou různých rozpouštědlových systémech: a) Tris-HCl pufr (pH 6,8 nebo 8,0) a b) 0,05 M roztok KCl, pH 7,0 (zvýšeno na 7,5 až 7,7 po přidání vzorku).
Výsledky tohoto experimentu jsou popsány v Tabulkách 2 a 3 níže.
Tabulka 2: Měření sedmi směsí liposomů (měnící se obsah DOTAP, neutrálního lipidu DOPC (dioleoylfosfatidylcholin) nebo DOPE (dioleoylfosfatidylethanolamin) v Tris-HCl pufru.
Vodivost vzorku přibližně 3 mS/cm2 (pH 6,8) a 1 mS/cm2 (pH
8) .
Směs liposomů DOTAP Obsah [mol%] Zeta potenciál V mV (pH 6,8) Zeta potenciál v mV (pH 8) Zprům. v nm
DOTAP/DOPC = 4/96 4 +10,8 +7,0 148
DOTAP/DOPE = 20/80 20 +23, 6 +17,0 150
DOTAP/DOPC = 30/70 30 +46,3 +27,0 137
DOTAP/DOPE = 40/60 40 +33,1 140
DOTAP/DOPE = 55/45 55 +50,3 +42, 9 151
DOTAP/DOPE = 80/20 80 +51,4 +43, 0 130-135
DOTAP 100 +48, 9 140
Tabulka 3: Měření sedmi směsí liposomů (měnící se obsah DOTAP, kolipidu DOPC) v 0,05 M roztoku KC1 (pH 7,0 až 7,5).
Vodivost vzorku přibližně 2,65 mS/cm2.
Směs liposomu DOTAP koncentrace [mol%] Zeta potenciál v mV v 0,05 M KC1, pH 7,0 až 7,5
DOTAP/DOPC = 4/96 4 +16,6
DOTAP/DOPC = 15/85 15 +39, 6
DOTAP/DOPC = 30/70 30 +49,0
DOTAP/DOPC = 50/50 50 +59,9
DOTAP/DOPC = 55/45 55 +58,4
DOTAP/DOPC= 80/20 80 +59,4
DOTAP 96 +61,5
Tyto výsledky naznačují, že pro koncentrace DOTAP mezi 4 a přibližně 50 mol% existuje konstantní zvýšení v zeta potenciálu. Překvapivě však pro koncentrace DOTAP 50 mol% a vyšší se zeta potenciál zplošťuje a dosahuje hodnot mezi +40 a +62 mV, celkově vykazující tvar hyperbolické křivky. Tyto údaje ukazují, že tento hyperbolický tvar křivky je udržován v různých pufrovacích systémech, dokonce i když se absolutní hodnoty zeta potenciálu nepatrně liší. Zatímco křivka v KOH/HC1 (pH 7,5) představuje nejfyziologičtější situaci, dvě další křivky při pH 6,8 a 8,0 znázorňují, že dokonce i s určitými odchylkami od fyziologického pH, je tvar křivky stále udržován.
-55V tomto příkladu je DOTAP použit pro měření zeta potenciálu v liposomové směsi. Nahrazení DOTAP jinými kationtovými lipidy a změření zeta potenciálu liposomové směsi je v rámci dovednosti pracovníka.
Příklad 5: Selektivní cílení kladně nabitých molekul k angiogenním endoteliálním buňkám in vivo.
Transport a specifické interakce makromolekul k nádorové tkáni jsou závislé na různých parametrech, např. na velikosti a náboji molekul. Tento příklad ukazuje nábojovou závislost cílení k angiogenním endoteliálním buňkám in vivo. Byly použity fluorescenčně značené nabité dextrany od Molecular Probes nebo syntetizované pomocí způsobů popsaných níže. Zprostředkované nádorové cílení těchto nabitých molekul k angiogenním endoteliálním buňkám je ukázáno na modelu křeččí dutiny (Endrich a kol., 1980).
1. Fluorescenčně značené dextrany s odlišným celkovým nábojem.
Dextran-hydrofilní polysacharidy- jsou charakterizovány svou vysokou molekulovou hmotností, dobrou rozpustností ve, vodě, nízkou toxicitou a relativní inertností. Tyto vlastnosti dělají z dextranů účinné, ve vodě rozpustné nosiče pro barviva, např. fluorescenční barviva. Jejich biologicky neobvyklá <x-l,6-glykosidová vazba jsou rezistentní ke štěpení většinou endogenních buněčných glykosidas.
a. Fluorescenčně značené dextrany od Molecular Probes
Pro analýzu chování dextranů nesoucích kladný celkový náboj byly použity kationtové fluorescenčně značené dextrany od Molecular Probes. Příklady takových dextranů jsou Rhodamine Green™ spojený s dextrany, majícími molekulovou hmotnost mezi 3000 a 70000, nebo konjugované s lysinem, dextrany spojené s tetramethylrhodaminem, které bez ohledu na aniontovou skupinu připojenou ke každé molekule dextranů mají kladný
-56celkový náboj, zprostředkovaný pomocí konjugace s kationtovými lysinovými zbytky. Je také možné použít jiné fluorescenční dextrany, které obsahují lysinové zbytky, jež mají za následek kladný celkový náboj.
Pro fluorescenční dextrany se záporným celkovým nábojem byly použity fluorescenční aniontové nebo polyaniontové dextrany od Molecular Probes bez jakýchkoliv lysinových zbytků. Příklady aniontových a polyaniontových dextranů zahrnují dextran spojený s Cascade Blue®, s molekulovou hmotností mezi 3000 a 70000 nebo dextrany spojené s fluoresceinem nebo záporně nabité dextrany nesoucí jiné fluorescenční značky.
Pro neutrální dextrany s celkovým nábojem nula, byly použity dextrany od Molecular Probes takové jako neutrální dextrany spojené s rhodaminem B s molekulovou hmotností v rozmezí od 10000 do 70000 nebo jiné fluorescenční neutrální dextrany.
b. Syntéza nabitých nebo neutrálních fluorescenčně značených dextranů
Nabité nebo neutrální neznačené dextrany byly syntetizovány oxidací dextranových molekul (například jodistaném) za tvorby reaktivních aldehydových skupin. Následně tyto aldehydové skupiny reagovaly s aminovou skupinou různých činidel za vzniku molekul s odlišným celkovým nábojem. Nakonec byly tyto molekuly konjugovány s fluorescenčními barvivý.
i) Oxidace dextranů
Neznačené molekuly dextrany byly smíchány s jodistanem sodným ve vhodném molárním poměru až do 6 molů dextrosy k 1 molu IO4~ ve vodném roztoku (30 min, pH 6) . Reakce byla zastavena přidáním polyethylenglykolu (v přibližně 300 • · násobném molárním přebytku) a byla dialyzována proti 0,15 mol NaCl.
ii) Příprava kladně nabitých fluorescenčně značených dextranů
Modifikované oxidované dextrany byly smíchány s vodným roztokem polylysinu v pufru borátu sodného (pH~9) vhodným způsobem. Výsledný roztok byl dialyzován proti 0,15 M NaCl. Následně zbylé primární aminové skupiny polylysinu reagovaly v 0,1 M pufru uhličitanu sodného s příslušným sukcinimidylovým esterem nebo sulfonylchloridem fluorescenčního barviva, např. se zástupcem rodiny Cy-Dye od Amershamu nebo fluoresceinovým derivátem nebo s jakýmkoliv jinými reaktivními barvivý. Vybraný molární poměr fluoroforu k polylysinovému dextranů byl stanoven napřed tak, aby poskytnul výslednému reakčnímu produktu kladný celkový náboj. Volné barvivo bylo odděleno pomocí dialýzy vzorku proti 0,15 M NaCl. Izoelektrický bod reakčního produktu byl stanoven izoelektrickou fokuzací ve fyziologickém pufru, a byl nalezen v pH nad 8.
iii) Příprava fluorescenčních neutrálních dextranů
Oxidované dextrany reagovaly s příslušným peptidem nesoucím dvě primární aminoskupiny, např. alanin-alanin-lysin, za použití volné aminoskupiny peptidového řetězce pro spojení k dextranů. Následně 0,1 - 10 mol% primárních aminoskupin polylysinu reagovalo se sulfonyl chloridem nebo sukcinimidylesterem fluorescenčního barviva, např. Lissamin Rhodaminem B, deriváty Fluoresceinu nebo jakýmikoliv jinými reaktivními fluorescenčními barvivý, za vzniku molekuly nesoucí nulový celkový náboj. Izoelektrický bod reakčního produktu byl stanoven izoelektrickou fokuzací ve fyziologickém pufru, a byl nalezen v pH mezi 7 a 7,5.
iv) Příprava fluorescenčních záporně nabitých dextranů
Oxidované dextrany reagovaly s příslušným peptidem sestávajícím ze záporně nebo kladně nabitých aminokyselin, které mají celkový náboj nula nebo nižší např. glutamátglutamát-lysin. Jak peptidového N-konce oxidovaného dextranů lysinových zbytků je popsáno výše, volné aminoskupiny byly spojeny k aldehydovým skupinám 0,1-10 mol% alifatických aminoskupin poté reagovalo s vhodně reaktivním konjugátem fluorescenčního barviva (viz výše). Izoelektrický bod reakčního produktu byl stanoven izoelektrickou fokuzací ve fyziologickém pufru a byl typicky nalezen pod 5.
2. Cílení fluorescenčně značených dextranů k angiogenním endoteliálním buňkám in vivo.
Do samečků syrských zlatých křečků (40-50 g tělesné váhy) byly vloženy titanové komůrky do kožních záhybů. Příprava komůrek byla provedena za anesteze fenobarbitalem (50 mg kg-1 intraperitoneálně) . Po implantaci průhledné přístupové komůrky a 24 h době rekonvalescence z anesteze a mikrochirurgického zákroku, byly použity pro implantaci 2xl05 buněk křeččího amelanogenního melanomu (A-Mel-3) do komůrky (Fortner a kol. 1961) pouze preparáty, které splňovaly kriterium mikroskopicky neporušené mikrocirkulace. V předkládaném nádorovém modelu byla angiogeneze dobře charakterizována. Experimenty byly provedeny v 6 - 7 dni růstu nádoru, když bylo dosaženo mikrocirkulace. Vhodné množství fluorescenčně značených dextranů bylo injikováno do pravé krční žíly prostřednictvím jemného polyethylenového kateteru, který byl implantován 24 h před injekcí vzorku. Během pokusu byl probuzený křeček nesoucí komůrku imobilizován použitím hadičky Perspex na speciálně upravenou podložku. Nádorový endotel specificky obsahující fluorescenční dextrany byl analyzován fluorescenční mikroskopií angiogenní nádorové tkáně a okolní hostitelské tkáně v různých časových intervalech po injekci (0,5-360 min). Fluorescenční intenzity ve tkáních obou typů byly určeny jako • · · · • · · · · • · · · ··· ·· · ·· ·
-59procento referenčního fluorescenčního signálu referenčního vzorku (% standardu) přítomného v každé komůrce. Poměr % standardní fluorescence v nádoru a okolní tkáni, který je definován jako selektivita látky pro nádorovou tkáň je hodnota afinity, se kterou se váží nabité dextrany k nádorovému endotelu a je ukázána na Obrázku 4.
3.Závěr
Obecně, vazebná afinita nabitých dextranů k angiogennímu nádorovému endotelu se zvyšuje s celkovým kladným nábojem přenesevé molekuly (viz Obrázek 4 A-C). Toto naznačuje, že kationtové makromolekuly adherují k záporně nabitým vazebným místům na buněčném povrchu nebo glykokalyxu nádorového endotelu.
Příklad 6. Cévní nádorové cílení v lidských nádorových xenoimplantátech: závislost na molekulovém náboji
Jak bylo poznamenáno dříve, molekulový náboj je jedna z vlastností, které ovlivňují transport přes stěnu krevních cév. Neexistují však žádné údaje o účinnosti molekulového náboje na mikrocévní propustnost pro makromolekuly, následovanou vyšší akumulací v angiogenních nádorových cévách v pevných nádorech. Proto byla v tomto příkladu měřena nádorová mikrocévní propustnost pro odlišné proteiny, které mají stejnou velikost, ale různý náboj. Měření byla provedena v lidských adenokarcinomech tlustého střeva LS174T transplantovaných v průhledných komůrkách v zádových kožních záhybech v myši s těžkým kombinovaným defektem imunity (SCID). Hovězí sérový albumin (BSA) a IgG byly fluorescenčně značeny a byly buď kationizovány pomocí konjugací s hexamethylendiaminem nebo anionizovány pomocí sukcinylace. Molekuly byly injikovány
l.V. a fluorescence v nádorové tkáni byla kvantifikována intravitální fluorescenční mikroskopií. Pro výpočet mikrocévní ·« ·· ► * φ
-60propustnosti byla použita intenzita fluorescence a farmakokinetické údaje.
1. Zvířata a nádorový model
Komůrky zádových kožních záhybů nesoucí nádor LS174T byly připraveny v samcích myší s těžkým kombinovaným defektem imunity (SCID), jak bylo popsáno dříve (Leunig a kol. 1992). V krátkosti, titanové komůrky byly implantovány do kůže na zádech myší (samci, 6-8 týdnů staří, 25 - 35 g) pod anestezí (75 mg hydrochloridu ketaminu a 25 mg xylazinu na kg tělesné váhy, subkutánně). Po dvou dnech byla inokulována vrstva příčně pruhovaného svalu subkutánní tkáně v komůrkách 2 μΐ husté suspenze nádorových buněk lidského tračníku (přibližně 2 x 10s buněk ve fosfátem pufrovaném fysiologickém roztoku). Pokusy pro měření propustnosti byly provedeny 2 týdny po implantaci nádorových buněk.
2. Příprava BSA s modifikovaným nábojem
Hovězí sérový albumin (BSA; A7030; Sigma Chemical Co., St Louis, MO) byl nejprve fluorescenčně značen konjugací s sukcimidylesterem karboxytetramethylrhodaminu (C-1171; Molecular Probes, Eugene, OR) . Volné barvivo bylo odstraněno gelovou filtrací na koloně (Econo-Pac 10DG; Bio-Rad Laboratories, Herculaes, CA) ekvilibrované 50 mM fosfátem pufrovaným fysiologickým roztokem (PBS; Sigma), obsahujícím 0,002% azid sodný (Sigma). Tímto postupem byl získán molární poměr barviva/proteinu 1,3. Následně byly alikvoty roztoku BSA anionizovány pomocí sukcinylace, nebo kationizovány konjugací s hexamethylendiaminem. Při sukcinylaci (Klotz, 1967; Rennke&Venkatchalam, 1978) bylo 10 mg anhydridu sukcinátu (Sigma) v 50 ml dimethyl sulf oxidu (DMSO, Sigma) po kapkách v malých přídavcích přidáno k roztoku 10 mg proteinu ví ml 0,2 M hydrogenuhličitanového pufru, pH 8,0. Během inkubace (30 minut při pokojové teplotě) bylo pH udržováno na 8,0 až 8,5.
-61Při kationizaci (Triguero a kol., 1989; Kumagai a kol., 1987; Hoare&Koshland, 1967) byly volné karboxylové skupiny proteinu (10 mg v 1 ml 5mM MES, pH 5,3, bylo-li nutné, bylo pH udržováno při 5,3 pomocí IM HCI) aktivovány l-ethyl-3(3dimethylaminopropyl)karboximidem (CDI, Sigma). Pro tento účel byly k proteinovému roztoku přidány v 10 min intervalech dvě dávky CDI (každá obsahovala 10 mg CDI v 100 ml vody). Ihned po přidání druhé dávky CDI byl aktivovaný protein přidán za míchání k 2 ml 2 M hexamethylendiaminu (Sigma) ve vodě, pH roztoku bylo upraveno na 6,8 a směs byla inkubována 5 hodin při laboratorní teplotě. Po konjugaci byly produkty purifikovány pomocí dialýzy přes noc, a agregáty s vysokou molekulovou hmotností byly odstraněny elucí přes kolonu naplněnou Sepharosou CL-6B (Pharmacia). Hlavní proteinový vrchol byl spojen a skladován při 4°C.
3· Příprava nabitých modifikovaných IgG
Rozpouštědlo myší monokionální IgG protilátky (MOPC21; M9269, Sigma) bylo vyměněno za 0,2 M hydrogenuhl i čit ano vý pufr pomocí gelové filtrace na koloně (Econo-Pac 10DG; Bio-Rad) a roztok byl pomocí centrifugační filtrace koncentrován na 1 mg proteinu/ml (Ultrafree-CL; Millipore, Bedford, MA). Hodnota pH byla upravena na 9,3. Pro fluorescenční značení bylo použito Cyanine monofunkční barvivo (Cy3-Mono-Osu; PA13104; Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) pro dosažení vysoké intenzity fluorescence, která dovoluje in vivo experimenty s malým množstvím IgG (0,5 mg IgG/zvíře) . Cy3-Mono-Osu bylo přidáno v poměru 2 mg barviva/ 10 mg proteinu a roztok byl míchán 60 min při laboratorní teplotě. Volné barvivo bylo odstraněno gelovou filtrací na koloně (Econo-Pac 10DG; BioRad) ekvilibrované 50 mM PBS obsahujícím 0, 002% azid sodný (Sigma), a roztok byl pomocí centrifugační filtrace ((Ultrafree-CL; Millipore) koncentrován na 1,8 mg/ml.
·· ··
-62Aniontové a kationtové deriváty IgG byly následně připraveny, jak je popsáno shora pro BSA.
4. Měření molekulového náboje a hmotnosti
Izoelektrické body proteinů byly stanoveny izoelektrickou fokuzací použitím polyakrylamidových gelů ve vertikální elektrofokuzační aparatuře. Hodnota pí byla kvantifikována porovnáním s proteinovými standardy (Bio-Rad) po barvení gelů pomocí Coomassie Blue. Molekulové hmotnosti proteinů byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (Mini-Protean II; Bio-Rad) s a bez β-mercaptoethanolu, jako redukčního činidla ve vzorkovém pufru.
výše, a imobilizována mikroskopické podložce.
5. Měřeni nádorové mikrocévnl propustnosti
Účinná mikrocévní propustnost pro různé proteiny byla měřena použitím fluorescenční mikroskopie, jak je popsáno dříve (Yuan a kol., 1993; 1995). V krátkosti, zvířata byla znecitlivěna, jak je popsáno v polykarbonátové trubičce na
Fluorescenčně značený protein byl rozpuštěn v PBS a injikován do ocasní žíly jako jednorázová dávka (0,1 ml/25 g tělesné váhy). Intenzita fluorescence nádorové tkáně byla znázorněna objektivem 20x fluorescenčního mikroskopu, (Axioplan, Zeiss), a kvantifikována během časového úseku 20 minut pomocí fotonásobiče. Nepřímá analýza z videozáznamu plochy nádoru dovolila měřeni povrchu cévního nádoru a objemu. V oddělených experimentech za použiti třech zvířat pro vyhodnocení chování každého proteinu, byla časová konstanta vyčištění plasmy kvantifikována po odebrání arteriálních krevních vzorků během 30 minut po injikování proteinu. Z experimentů s 6 až 7 jednotlivými nádory pro každý z různých proteinů byla z těchto údajů vypočtena nádorová mikrocévní propustnost podle Yuan a kol. (Yuan a kol., 1993). Výsledky mikrocévní propustnosti jsou uvedeny jako střední hodnota + standardní odchylka od středu.
-63Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4, níže.
Tabulka 4. Charakteristiky značkovacích molekul a jejich mikrocévní propustnost v nádorech.
Anionizované a kationizované BSA a IgG byly připraveny
z nativních proteinů, jak je popsáno v materiálech a metodách.
Název Mr Pia (rozmezí) Střední K (rozmezí)(lOOs) Střední Pv (rozmezí)(10~ ’cm/s)
Nativní BSAb 66000 4,5 80,5 (77-130) 1,61 (0,65-1,93)
Anionizované BSA 64000 ~2,0 40,8 (37-45) 1,11 (0,95-2,38)
Kationizované BSA 64000 8,6-9,1 12,7 (12-13) 4,25 (3,57-5,34)
Nativní IgGb 160000 6,0 50,0 (34-82) 2,82 (1,47-4,07)
Anionizované IgG 155000 3,0-3,9 39,3 (37-44) 1,93 (1,11-2,53)
Kationizované IgG 155000 8,6-9,3 11,0 (5-15) 4,65 (4,25-5,27)
apl, izoelektrický bod; K, časová konstanta koncentračního úbytku v plasmě, Pv, mikrocévní propustnost. b Údaje jsou z Yuan a kol., (1995).
6. Závěr
Fluorescenční mikroskopie ukázala homogenní extravazaci různých proteinů podél cévní stěny. Nádorová mikrocévní propustnost (Pv) pro anionizované a kationizované BSA je ukázána v Tabulce 4. Hodnoty propustnosti byly nízké pro záporně nabité BSA, (Pv=l,ll + 0,44 x 10-7 cm/s; střední hodnota ± standardní odchylka od středu), a téměř 4 krát vyšší pro kladně nabité BSA (Pv=4,25 ± 0,26 x 10”6 7 cm/s).
Mikrocévní propustnost nádorů pro anionizované a kationizované IgG byl nepatrně nad hodnotami naměřenými pro
-64• * A » · • A
A · A A A
A A a a « • · •AA AAA A odpovídající BSA vzorky (Tabulka 4). Podobně jako pro nábojově modifikované BSA, ukázalo kationizované IgG nejvyšší propustnost (Pv=4,65 ± 0,29 χ 10’7 cm/s), a propustnost anionizovaného IgG (Pv=l,93 ± 0,41 χ 10“7 cm/s) byla pod hodnotami naměřenými pro nativní protein.
Příklad 7. Příjem neutrálních a kationtových rhodaminem značených liposomů kulturami lidských endoteliálních buněk (HUVEC)
HUVEC byly zaočkovány na buněčnou hustotu 2 χ 104 buněk/cm2 ve 24 jamkových kultivačních miskách potažených želatinou a kultivovány 48 h v endoteliálním růstovém médiu se 2% fetálním hovězím sérem při 37 °C a 5% CO2 ve zvlhčené atmosféře. Kultivační médium bylo odstraněno, buňky byly promyty PBS a bylo přidáno 500 μΐ endoteliálního základního média bez séra. Ke kultuře byly přidány rhodaminem značené liposomy (0,5 mM rhodaminová značka) o koncentraci celkového lipidu 100 μΜ. Po 4 h kultivaci bylo médium odstraněno a kultura byla dvakrát promyta 500 μΐ PBS. Buňky byly lyžovány pomocí 1,5 ml 1% Triton X-100 v PBS po dobu 30 min při laboratorní teplotě. Intenzita fluorescence byla měřena při excitační vlnové délce 560 nm a emisní vlnové délce 580 nm ve SPEX FluoroMax-2.
Výsledky jsou ukázány v Tabulce 5 níže.
*· AA
A A A
A A A
AAA A AAA
A A AAAA • 4 9
9 9
9 9 ····
Tabulka 5. Příjem rhodaminem značených liposomů HUVEC (celkové koncentrace lipidu 10 mM, složení liposomů jsou udávána v %)
Zeta potenciály byly měřeny za podmínek specifikovaných pro Tabulku 3.
DOTAP 0 30 40 50 80 95
DOPC 55 65 55 45 15 0
Chol 40 0 0 0 0 0
Rh-DOPE 5 5 5 5 5 5
Zeta potenciál (mV) — +27,0 +33,1 +42,9 + 43, 0 +48,8
Fluorescence Příjem (cps) — 124802 179961 230879 256276 271732
Příklad 8. Příprava kationtového zobrazovacího činidla
i) Příprava zobrazovacího činidla
Buněčná zobrazovací činidla jsou enkapsulována do kationtových liposomů obsahujících kationtové lipidy např. DOTAP. Například magnetit (Fe3O4) je znám v oboru, že je enkapsulován v kationtových liposomech pro zobrazování nebo léčbu hyperthermie. Oxidy železa mohou být zachyceny uvnitř kationtových liposomů provedením výše popsaných obecných metod, nebo například metodou popsanou v U.S. Pat. č. 5,088,499. Pro léčbu hyperthermie jsou částice oxidu železa aplikovány pacientovi s nádorem nitrožilně. Částice se hromadí v nádoru. Je li pacient vložen do magnetického pole, částice oxidu železa se zahřívají a následně je pevný nádor zničen.
Ve specifickém příkladu částice oxidu supermagnetického železa, které byly elektrostaticky stabilizovány pomocí H+ iontů (komerčně dostupných od Berlin Heat AG) , byly enkapsulovány do liposomů zahrnujících DOTAP a DOPC v poměru 50/50 a s původní celkovou koncentrací lipidů 15 mM. Taková
-Ó6saaěs je připravena následovně: DOTAP {0,075 iamol) a DOPC (0,075 romol) jsou rozpuštěny ve 20 ml chloroformu a umístěny do 500 ml baňky s kulatým dnem. Chloroform je za vakua odpařen a film je vysušen za sníženého tlaku 5 mbar po dobu 90 minut. Lipidový film je následně rehydratován 10 ml vodného roztoku částic oxidu železa o koncentraci 286 mM. Liposomální suspenze je jemně míchána a uskladněna v lednici. Po 24 hodinách byla suspenze odstředěna při 12 000 g při 10°C po dobu 30 minut. Toto vede k oddělení směsi do dvou fází: horní fáze, obsahující velký podíl liposomů s enkapsulovaným oxidem železa a dolní fáze zbavené liposomů ale obsahující neenkapsulovaný oxid železa. Horní frakce (10 ml) byla protlačena (Lipex extruder, nádobka o objemu 10 ml) pětkrát přes 400 nm polykarbonátovou membránu (Osmoics Inc.). V extrudovaném produktu byly analyzovány lipidy pomocí HPLC a železo fotometricky (thiokyanátová metoda).
ii) Aplikace zobrazovacího činidla
Pro studie se zvířaty byly C57BL/6 myši inkubovány s 106 Lewisových plicních rakovinových (LLC) buněk. Přibližně 10 dnů po inokulaci se u myší vyvinuly hmatatelné nádory. Když nádor dosáhne velikosti přibližně 5-8 nm, (měřeno ve dvou dimenzích), byla zvířata pod narkózou (inhalace isofluranu) položena do 2T MR tomografu (Bruker) a skenována pro anatomickou orientaci. Během tohoto skenování byly zaznamenávány TI a T2 relaxace pro pozdější porovnání. Následně bylo ocasní žíly injikováno 1,4 μΐ směsi zobrazujícího činidla (připraveného, jak je popsáno výše) na gram váhy zvířete. Myš byla znovu položena do tomografu a skenována v různých časových bodech po injikování. Tabulka 6 shrnuje údaje relaxace měřené typickým experimentem v nádoru zvířete, které obdrželo shora uvedenou směs. T2 relaxace normální tkáně (např. svalu) se neměnila (údaje nejsou ukázány).
• · ·· · ·
Tabulka 6. T2 hodnoty v nádorové tkáni před a po aplikací liposomálního kationtového kontrastního činidla
T2 před aplikací kontrastního činidla T2 po aplikaci kontrastního činidla
T2 po 15 min T2 po 60 min T2 po 4 hodinách
86,8 ms 81 ms (93% původního T2) 75 ms (86% původního T2) 68 ms (78% původního T2)
Příklad 9. Magnetosomy jako kationtové zobrazující činidla
Magnetosomy jsou složeny z magnetitového jádra o nanometrové velikosti, které je obaleno lipidovou vrstvou. K přípravě magnetosomů s kationtovou vnější vrstvou se může použít podobný způsob, který je popsán pro použití negativně nabitých nebo neutrálních fosřolipidů (De Cuyper a kol.f 1990). Testování magnetosomů in vivo bylo prováděno v C57BL/6 myších, které byly inokulovány Lewisovými plicními rakovinovými (LLC) buňkami o koncentraci 106. Pro zobrazovací účely byly T2 relaxace několika tkání měřeny pomocí MR.
1 · Příprava kladně nabitých magnetosomů
Magnetitová jádra obklopená lipidovou vrstvou mohou být například připravena náhradou monovrstvy kyseliny laurové částic oxidu železa pomocí lipidů. Výměna vrstvy se děje spontánně při inkubaci magnetitových částic obalených laurovou kyselinou s liposomy, které jsou složeny z 30-70 mol% fosfolipidů a 70 až 30 mol% kationtového lipidu. Předpokládá se, že se fosfolipid váže ke kyslíkovým atomům v Fe3O4, a tak nahrazuje kyselinu laurovou. Kationtová sloučenina se akumuluje přednostně ve vnější vrstvě magnetosomů a pak je magneticky stabilizuje. Přebytek kyseliny laurové je ze směsi oddialyzován. Produkt je následně purifikován.
Ve specifickém příkladu bylo 150 μΐ suspenze obsahující částice oxidu superparamagnetického železa potaženého kyselinou laurovou (koncentrace Fe 2 M) inkubováno při 37°C s 10 ml s 10 mM směsí liposomů zahrnující DOTAP a DOPC (Avanti Polar Lipids, lne., Alabastr) v molárním poměru 30/70 mol% (syntetizovaných, jak je popsáno v příkladu 4) . Směs byla následně dialyzována 5 dnů proti roztoku 5% glukosy. Odstranění kyseliny laurové během dialyzačního procesu bylo monitorováno po derivatizaci kyseliny laurové fenacylbromidem (Borch a kol. 1975) pomocí HPLC (LiChropher RP-select B 5 pm 250-4 (Merck), acetonitril/voda 75:25, průtok = 1 ml/min, λ = 254 nm, k'= 3,0, k' = (tr - t0) /t0) .
Neenkapsulované částice oxidu železa byly odděleny od magnetosomů a přebytku prázdných liposomů pomocí gelové chromatografie na Sephacrylu S-300 HR. Magnetosomy byly odděleny od prázdných liposomů na superparamagnetických MACS mikrokulÍčkách použitím silného permanentního magnetu (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach). Tabulka 7 shrnuje analýzu magnetosomů.
Tabulka 7. Analytické údaje magnetosomů měřené před a po purifikaci částic
Koncentrace lipidů v magnetosomech v mol% Celkový lipid v mM Železo v mM Velikost částic (nm) měřená jako Zprům. Index poly- dispersity Zeta potenciál (mV)
DOTAP/DOPC 30:70 mol% po inkubaci a dialýze 3,83 11,4 201,2 0,3 n.d.
DOTAP/DOPC 30:70 mol% po purifikaci (gelová chromatografie, MACS mikrokuličky 1,3 13,9 216,6 0,3 +41,5
-692. Zobrazeni C57BL/6 myši s Lewisovýnt plicnim nádorem
Pro studie se zvířaty byly C57BL/6 myši inokulovány LLC buňkami (přibližně 106 buněk ve fysiologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem). Přibližně 10 dnů po inokulaci se u myší vyvinuly hmatatelné nádory. Když nádor dosáhnul velikosti přibližně 5-8 nm, (měřeno ve dvou dimenzích), byla zvířata pod narkózou, (inhalací isofularanu), umístěna do 2T MR tomografu (Bruker) na termostatovanou podložku a skenována pro anatomickou orientaci. Během skenování byly zaznamenávány TI a T2 relaxace pro pozdější porovnání. Následně bylo do ocasní žíly injikováno 14 μΐ směsi zobrazujícího činidla (připraveného, jak je popsáno výše) na gram váhy zvířete. Myš byla znovu položena do tomografu a skenována v různých časových bodech po injikování. Tabulka 8 shrnuje údaje relaxace měřené pro různá zvířata, která obdržela shora popsanou směs.
Tabulka 8. T2 hodnoty v nádorových tkáních representativních zvířecích experimentů před a po aplikaci kationtových magnetosomů
Směs T2 před aplikací kontrastního činidla T2 po aplikaci kontrastního činidla
T2 po 30 min T2 po 3,5 hodinách
DOTAP/DOPC 30:70 mol% po dialýze 82 ms 65 ms (79%původního T2) 72 ms (88% původního T2)
DOTAP/DOPC 30:70 mol% po purifikaci 83 ms 71 ms (86% původního T2) 69 ms (83% původního T2)
-70Příklad 10. Kationtové mikroemulze obsahující lipofilní lék Paclitaxel jako nosič pro léky nerozpustné ve vodě
Stabilní emulze olej ve vodě (O/W), jako vhodné nosiče pro lipofilní léky (např. paclitaxel), byly získány homogenizací pomocí elektrického mixéru nebo sonikátoru (Tuchida a kol., 1992, Cavalli a kol., 2000). Olejová fáze složená z několika lipidů působila jako rozpouštědlo pro přibližně 2,1 mol% léku, zabraňujíce jeho krystalizací po několik měsíců. S ohledem na aplikace in vivo byly jako hlavní složky hydrofobní matrix vybrány biokompatibilní a biodegradovatelné lipidy jako triglyceridy (TG). Pro účely cílení jsou jako kationtové emulgátory nutné DOTAP a DDAB, v koncentraci pouze do 5 mol%, což odpovídá 50 % kationtového amfifilu ve vnější vrstvě. Velikost částice je ovlivněna váhovým poměrem lipofilních (TG)
ku amfifilním částem, množstvím TG. (TG/A) a koreluje se zvyšuj ícím se
Paclitaxel (10 mg) byl rozpuštěn v 560 mg
trioktadecylglyceridu. Dále byla lipidová směs zahrnující 25
mg DOTAP, 25 mg DOPC (poměr TG/A=11) dispergována
v TG/paclitaxelová směs pomocí homogenizace (IKA Ultra-Turrax T8, 10000 rpm) při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Poté bylo k olej-lipidové směsi přidáváno po kapkách 7 ml 5% roztoku glukosy za kontinuální homogenizace po dobu 15 minut. Hodnoty v Tabulce 9 znázorňují, že princip kationizace může být zároveň aplikován na mikroemulze s nebo bez léků a vede ke stabilní směsi s dostatečně vysokým zeta potenciálem pro angiogenní cílení. Tímto přístupem může být dosaženo vysokého poměru léku ke kationtové složce (zde: 1:2,5 váhových %), což vede ke značnému zlepšení tolerance systému přenášejícího lék.
-71• · · ·
Tabulka 9. Analytické hodnoty kationtových mikroemulzí složených z triglyceridů (TG), DOTAP, DOPC a Paclitaxelu po odstřeďování (500g, 10 min).
Kationtový DOPC TG Paclitaxel Poměr Zprům PI Zeta
lipid (mg) (mg) (mg) (mg) TG/amfifil v nm potenciál v mV
DOTAP:25 25 560 0 11 253 0,3 +60, 9
DOTAP:25 25 560 10 11 295 0,4 +56,3
DDAB:28 28 560 3 10 298 0,4 +58,8
Příklad 11. Příprava dalších enkapsulovaných zobrazujících činidel
Typické směsi zobrazujících činidel zahrnují kationtové liposomy s enkapsulovanými liposomálními magnetitovými částicemi (jak je popsáno v Příkladu 8), kationtové liposomy, kde magnetitové částice jsou kovalentně připojeny k lipidové dvojvrstvě, kationtové liposomy s Gd-DTPA, enkapsulované Gd komplexy, kationtové liposomy s Gd kovalentně připojenými k lipidové dvojvrstvě, kationtové liposomy s komplexy/molekulami zeslabujícími rentgenové záření, které jsou buď enkapsulovány uvnitř nebo jsou připojeny k membráně nebo jsou pro CT nebo rentgenové zobrazující studie. Použitím známých technik, z nichž několik typických je uvedeno níže, a přípravou směsí pro dosažení oblastí zeta potenciálu popsaných výše, by ti, kvalifikovaní v oboru, měli být schopni vytvořit a podávat širokou paletu zobrazujících činidel.
Techniky pro enkapsulování Gd-DTPA jsou kvalifikovaným v oboru dobře známy (viz Unger, E.C., P. MacDougall, P.Cullis a C. Tilcock, „Liposomální Gd-DTPA: účinek enkapsulace na vylepšení hepatomového modelu pomocí MRI. Magnetic Resonance Imaging 7:417-23. (1989)).
U.S.Patent č. 6,001,333 popisuje způsob přípravy liposomálního kontrastního činidla pro detekci nádorů pomocí CT zobrazováním. Způsob zahrnuje následující kroky: a)
smíchání maltosy s vodou v poměru přibližně 20 gramů maltosy ku 100 ml vody a míchání, dokud se maltosa nerozpustí a nevytvoří vodný roztok; b) smíchání vaječného fosfatidylcholinu s 99,6% ethanolem v poměru přibližně 4,2 g vaječného fosfatidylcholinu k 5 ml ethanolu, a míchání do rozpuštění a vytvoření alkoholového roztoku; c) přidání BHT k vodnému roztoku v poměru přibližně 6,2 mg BHT ke 20 g maltosy; d) přidání alkoholového roztoku k vodnému roztoku po kapkách za stálého míchání dokud není získán roztok, který obsahuje 5 ml ethanolu na každých 450 ml vody pro vytvoření roztoku pro enkapsulaci; e)vmíchání složky, která má být enkapsulována do roztoku pro enkapsulaci; f) přenesení směs z kroku e shora na mikrozkapalňovací zařízení pro vytvoření čirého roztoku; g) lyofilizace směsi z kroku f.
V rámci dovedností těch kvalifikovaných v oboru bude modifikace shora uvedeného způsobu nahrazením vhodného množství vaječného fosfatidylcholinu kationtovým lipidem pro získání liposomální směsi obsahující činidlo, která má žádaný zeta potenciál anebo izoelektrický bod, takže toto činidlo bude selektivně cílit k nádoru.
Další způsoby přípravy liposomálních směsí jsou kvalifikovaným v oboru dobře známy. Tyto způsoby zahrnují, ale nejsou tím omezeny na, hydratace lipidových filmů, injikování rozpouštědla, odpařování reverzní fáze a kombinace těchto způsobů s cykly zamrazování a tání. V rámci dovednosti kvalifikovaného pracovníka je také příprava liposomů pomocí sonikace, vezikulace indukovaná pH nebo rozpouštění pomocí detergentů. Kromě toho, jsou také dostupné různé způsoby pro oddělení enkapsulovaných a neenkapsulovaných molekul mezi něž patří, ale nejsou tím omezeny na, gelová filtrace, ultracentrifugace, filtrace příčným průtokem, odstřeďování v hustotním gradientu a dialýza.
• ·
-73····
Příklad 12: Regrese nádoru v nahých myších
Liposomální směs obecně připravená podle Příkladu 4 obsahuje toxin záškrtu, který je injikován do nahých testovacích myších nesoucích nádor. Jsou provedeny paralelní injekce do kontrolních nádorů nahých myší, s podobnou směsí, která nebyla derivatizována pro změnu jejího zeta potenciálu. Po dvou opakováních injekcí ve dvoudenních intervalech, jsou testovací a kontrolní myši čtrnáctý den po injikování obětovány a pomocí pitvy zkoumány. Testovací myši vykazují statisticky významné snížení hmoty nádoru, což ukazuje, že směs byla terapeuticky účinná a způsobila regresi nádoru.
Další směsi, které jsou prospěšné a způsobují regresi nádoru zahrnují liposomální směs zahrnující paclitaxel, docetaxel, nebo jiné taxany, vincristin, navelbin a jiné alkaloidy brčálu, gemcitabin a jiná nukleosidová analoga, cisplatinu a jiné platinové sloučeniny. Tyto směsi mohou být vytvořeny podle Příkladu 4.
Příklad 13: Znázornění nádoru močového měchýře u pacientů s rakovinou
Fluorescenční zobrazovací činidlo bylo připraveno podle protokolu popsaného v Příkladu 4 a bylo systematicky podáváno pacientům s rakovinou močového měchýře (urothelium carcinoma). Aplikované fluorescenční zobrazovací činidlo bylo vytvořeno jako liposomální suspenze, obsahující 50 mol% DOTAP, 45 mol% DOPC a 5 mol% rhodamin-DOPE v 5% glukose a celkový obsah lipidu 10 mM. Směs byla systematicky aplikována v dávce 0,5 mg celkového lipidu na kilogram tělesné váhy pomocí infúzní rychlosti 2 ml/min.
Během a po ošetření byla akumulace fluorescenční zobrazovací směsi detekována běžným endoskopem pro chirurgii močového měchýře vybaveným fluorescenčním filtrem, nastaveným specificky pro liposomální fluorescenční barvivo. Akumulace fluorescenčního barviva v nádorové tkáni byla vizualizována
4 · · ·
4 4 ·· 44·· zobrazením a pomocí spektroskopické identifikace barviva. Díky fluorescenčnímu značení okrajů nádoru, mohla být nádorová tkáň odlišena od normálního epitelu močového měchýře a nádor byl kompletně odstraněn.
Příklad 14: Zobrazování pevných nádorů u pacientů s rakovinou
MRI zobrazovací činidlo bylo připraveno podle protokolu popsaných v Příkladech 4 a 8 a bylo podáváno pacientu s rakovinou. MRI zobrazovací činidlo je vytvořeno do směsi liposomu obsahujícího 40 mol% DOTAP, 60 mol% DOPC (celková koncentrace lipidu 40 mM) a koncentrace Fe 9 mM. Deset ml směsi je podáno 80 kg pacientu, což je přibližně 5 mg Fe na pacienta, nebo přibližně 0,06 mg Fe/kg tělesné váhy (přibližně 10% běžně podáváného množství Fe).
Příklad 15: Léčba pevných nádorů u pacientů s rakovinou
Terapeutické činidlo připravené, jak je ukázáno v Příkladu
9, je připraveno a podáváno lidským pacientům pří léčbě nádoru. Terapeuticky účinná množství směsi jsou nitrožilně podávána pacientu, který trpí jedním nebo více rostoucími pevnými nádory. Terapie je udržována než se objeví regrese nádoru, jak se stanoví jedním nebo více regresními markéry, včetně obíhajících nádorových antigenů, anebo fyzikální resorpci. Následné kontinuální nebo periodické ošetření se směsí jsou označené jako profylaktikum nebo jako prostředek pro zajištění celkové regrese nádoru.
Příklad 16: Léčba pacientů s retrolentafibroplasií
Pacient trpící retrolentafibroplasií je léčen kryoterapeutickou ablací. Navíc je pacientu také podávána terapeutická směs, jak je popsáno v příkladu 11. Je zabráněno nebo je snížena revaskularizace ablatované oblasti.
0» » 0 · > 0 · ► 0 0 »00
0000
-75Příklad 17: Kombinační terapie
Pacient trpící jedním nebo více pevnými nádory je léčen podle příkladu 11. Pacient je následně po úvodní části terapie vystaven tradiční chemo nebo radiační terapii. Terapeutický progres je monitorován podle požadavků pomocí běžných onkologických protokolů. Použití kombinační terapie dovoluje sníženou exposici chemoterapeutikům.
pacienta radiačnímu záření nebo
Příklad 18: Spolupodávání terapeutických směsí s druhou aktivní složkou
Liposomální směs, jak je popsána v Příkladu 11 je spolutvořena s imunotoxinem, jak je popsáno v Thorpe a kol. U.S.Patent č. 5,965,132. Terapeuticky účinná množství spolutvořených liposomů jsou posávána pacientu trpícímu jedním nebo více pevnými nádory. Je pozorována regrese nádoru.
Příklad 19: Hojeni rány
Liposomální směs popsaná v U.S. Patentu 5,879,713 zahrnující bFGF nebo VEGF je vytvořena pro podporování hojení rány u pacienta. Terapeuticky účinné množství bFGF nebo VEGF je přidáno k liposomální směsi obsahující DOTAP:DOPC (40:60). Terapeuticky účinná množství liposomové směsi jsou podávána pacientu, který potřebuje zhojit ránu. Je pozorováno hojení rány.
Mělo by být zřejmé, že předcházející diskuse a příklady představují detailní popis pouze určitých přednostních forem. Těm kvalifikovaným v oboru by mělo být zřejmé, že mohou být provedeny různé modifikace a obdoby bez odloučení se od myšlenky a rámce vynálezu. Všechny odborné články, další reference, patenty a patentové žádosti, které jsou citovány v této patentové žádosti jsou vloženy referencí v celém jejich rozsahu.
-76·· ····
REFERENCE
Adamson a kol., Am. J. Phys. (1988) 254, H304.
Baird a kol., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1991) 638, 14.
Baldwin a kol., Microvasc. Res. (1991) 42, 160.
Bogdanov a kol., Biochim. et Biophys. Acta (1994) 1193,
212-218.
Borch a kol., Analytical Chem. (1992) 176, 1375.
Cavallo a kol., Virchows Arch. (Pathol. Anat.) (1980) 388,1.
Cavalli a kol., Eur. J. Pharm. Sci. (2000) 10, 305.
Cerinic a kol., Curr. Opin. Rhematol. (1997) 9, 544.
Curry a kol., Mechanisms and Thermodynamics of Transcaapillary Exchange. V Handbook of Physiology Séct. 2 The Cardiovascular System Díl IV, The Microcirculation, Renkin, (1984) E.M. & Michel, cc (eds.) str. 309-374. American Physiological Society: Bethesda.
Curry a kol., Am. J. Phýsiol. (1987) 257, H1354.
DeBelder a kol., Carbohydrate Research (1975) 44:254-257.
De Cuyper a kol., Biochim. Biophys. Acta (1990), 1027,
172.
Endrich a kol., Res. Exp. Med. (1980) 177, 125.
4» · • ·· ·· ··
• • • • · * ·
• • · • · · • ·
• • • • · • ·
♦ ·· • · « • · · ·
Ferrara a kol., Endocr. Rev. (1992) 13, 19.
Folkman a kol., J. Bio. Chem. (1992) 267, 10931.
Folkman a kol., Science (1987) 235, 442.
Folkman a kol., Cancer Research (1986) 46, 467.
Folkman a kol., Journal of the National Cancer Insitute (1989) 82, 4.
Fortner a kol., Cancer Res. (1961) 21, 161.
Grotte, G. Acta Chir. Scand. Suppl. (1956) 211, 1.
Harris, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 5. vydání. W.H. Freeman and Company. New York, 1997.
Henry a kol., Tissue Cell (1996) 28, 449.
Hirnle a kol., Lymphology (1988) 21, 187.
Hobbs a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1998), 95,
4607.
Iruela-Arispe a kol., Am. J. Pathol. (1995) 147, 1715.
Isaacs a kol., Am. J. Pathol. (1983) 111, 298.
Jain a kol., Microcirculation, (1997) 4, 1.
Jander, pinfíihring in das anorganisch-chemische Praktikuj. S, Hirzel Verlag, Stuttgart, 1995.
-78Khawl a kol., Science (1980) 209, 295.
Klotz I.M., Succinylation, v Methods in Enzymology (1967), Hirs, C.A. (ed.) str. 576-580. Academie Press: New York.
Krejcarek a kol., Biochem. Biophys. Res. Com. (1977) 77,
581.
Kuwatsuru a kol., Magn. Reson. Med. (1993) 30, 76.
Leunig a kol., Cancer Res. (1992) 52, 6553.
Mann a kol., v Handbook of Metal-Ligand Interactions in Biological Fluids: Bioorganic Medicine, sv. 2, Berthon, G., ed., Marcel Dekker, lne., New York, N.Y., 1995.
McKernan a kol., Biochem. J. (1960) 76, 117.
McLean a kol., Am. J. Physiol. (1977) 273, H387.
Mokrasch, J. Biol. Chem. (1954) 254, 55.
Nagasawa a kol., J. Org. Chem. (1974) 39, 1681.
Nyvestad a kol., Preparation and Structure-Activity Relationships of Particulate Magnetic Agents. v: Trend in Contrast Media. Springer Verlag: Berlin 1999, 37.
Pappenheimer a kol., Am. J. Phys. (1951) 167, 13.
Papisov a kol., J. Magn. Magn. Mater. (1993) 122, 383.
Redgrave a kol., Biochim. Biophys. Acta (1985) 835, 104.
• * • *· 99 0«
0 Λ • · 9 9
• • • · 9 · 0
000 • · » »0 0 0«
Reed a kol., J. Cell Biochem. (2000) 77, 116.
Rennke a kol., Kidney Int. (1978) 13, 278.
Rippe a kol., Physiological Reviews (1994) 74, 163.
Rivard a kol., Circulation (1999) 99, 111.
Roberts a kol., Cancer Res. (1997) 57, 765.
Sahagun a kol., Am. J. Physiol. (1990) 259, H162.
Seno a kol., Ann. Acad. Sci. (1983) 416, 410.
Spragg a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94,
8795.
Szoka a kol., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. (1980) 9, 467.
Taguichi a kol., Arch. Histol. Cytol. (1998) 61, 243.
Tuchida a kol. Biochim. Biophys. Acta (1992) 1108, 253.
Thurston a kol., J. Clin. Invest. (1998) 101, 1401.
Turner a kol., Microvasc. Res. (1983) 25, 205.
Unger a kol., Liposomal Gd-DTPA: effect of encapsulation on enhancement of hepatoma model by MRI in Magnetic
Resonance Imaging (1989) 7, 417.
Yamanaka a kol., Kidney Blood Press Res. (1999) 22, 13.
β 9 9 » 9 9
9 9
9 9
99*9 » · • ·
-809
Yuan a kol., Microvasc. Res. (1993) 45, 269.
Yuan a kol., Cancer Research (1994) 54, 3352.
Yuan a kol., Cancer Research (1995) 55, 3752.
Yuan, F., Seminars in Radiation Oncology (1998) 8, 164.
Weydner a kol., (1991) 324, 1.
The New England Journal of Medicine

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY ·Μ·
    1. Způsob zvýšení kapacity směsi pro selektivní cílení k aktivovanému cévnímu místu a akumulaci v diagnosticky účinné hladině v blízkosti aktivovaného cévního místa u živočicha, vyznačující se tím, že zahrnuje modifikaci směsi vedoucí k získání směsi s (a) zeta potenciálem v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5; a/nebo (b) izoelektrickým bodem nad 7,5; zvolené ze skupiny:
    (a) částic, kromě liposomů, které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5;
    (b) molekuly, které mají izoelektrický bod nad 7,5;
    (c) liposomy obsahující kationtové lipidy v rozmezí od přibližně 25 mol% do 50 mol% a mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně
    0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5;
    (d) magnetosomy s vrstvou kationtových lipidů, která má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5 nebo (e) emulze olej ve vodě nebo mikroemulze obsahující kationtové amfifily charakterizované tím, že mají dva řetězce mastné kyseliny nebo alkylové řetězce ve vnější vrstvě, v rozmezí od přibližně 25 do 60 mol% nebo které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 o pH přibližně 7,5.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +60 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KC1.a pH přibližně 7,5.
    .. ♦·«· ·· ··«· • · · ♦ • · ♦ * ·♦ «♦ že směs + 50 mV, ί * * · * ; ’ * · · · ·
    82 .. .:. *..· :
  3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +30 do v přibližně 0,05 mM roztoku KC1 a pH přibližně 7,5.
  4. 4. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že směsí je zobrazovací nebo terapeutická směs zahrnující zobrazovací činidlo nebo terapeuticky aktivní složku.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se zobrazující činidlo zvolí ze skupiny zahrnující částice oxidu železa, barviva, fluorescenční barviva, NMR značky, scíntigrafické značky, zlaté částice, PET značky, ultrazvuková kontrastní média a CT kontrastní média.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se terapeuticky aktivní složka zvolí ze skupiny obsahující cytostatika nebo cytotoxická činidla.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se cytostatika nebo cytotoxická činidla zvolí ze skupiny zahrnující taxany, epothilon A, B, D a jejich deriváty, camptothecin, anorganické komplexy, inhibitory mitosy, hormony, antracykliny, protilátky, inhibitory topoisomerasy, protizánětlivá činidla, alkaloidy, interleukiny, cytokiny, růstové faktory, proteiny, peptidy a tetracykliny.
  8. 8. Způsob podle jakéhokoliv z patentových nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se směs modifikuje pomocí reakce s činidlem vytvářejícím kation, který zvyšuje izoelektrický bod činidla vzhledem k nemodifikovanému činidlu na hodnotu nad 7,5.
    ♦ ••4 • · 4 • · 4 • · 4 • · · 4 ·· ··
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se směs modifikuje reakcí s činidlem vytvářejícím kation, vybraným ze skupiny sestávající z ethylendiaminu, hexamethylendiaminu, triethylentetraaminu, 4-dimethylaminobutylaminu,
    N,N-dimethylaminoethylaminu, dimethylaminobenzaldehydu, polylysinu a chitosanu.
  10. 10. Způsob podle jakéhokoliv z patentových nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že aktivované cévní místo je ukazatelem místa spojeného s angiogenezí a je vybráno ze skupiny zahrnující: (a) místa angiogeneze; (b) místa zánětu; (c) místa hojení rány; a (d) hematoenecefalickou bariéru.
  11. 11. Způsob podle jakéhokoliv z patentových nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že onemocnění spojené s angiogenezí je vybráno ze skupiny zahrnující diabetickou retinopatii, chronická · zánětlivá onemocnění, revmatickou arthritidu, dermatitidu, psoriasu, žaludeční vředy, hematogenní a pevné nádory a jejich metastasy.
  12. 12. Způsob podle jakéhokoliv z patentových nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že živočichem je savec.
  13. 13. Terapeutická směs připravená způsobem podle jakéhokoliv patentového nároku 1 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje aktivní složku, která je terapeuticky účinná pro léčbu nemoci spojené s angiogenezí anebo potlačuje zánět anebo podporuje obnovu kosti nebo hojení ran, směs mající zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v roztoku přibližně 0,05 mM KC1 a pH přibližně 7,5, nebo izoelektrický bod nad 7,5, přičemž tato směs může být dále značena nebo balena s instrukcemi pro podávání směsi pro léčbu nemocí spojených s angiogenezí.
    ·« 0···
    99 0 00 0 • · · • · · » » · 1 · · · ♦ ♦ 00 • · • · * «
  14. 14. Terapeutická směs podle nároku 13, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) částice, kromě liposomů, které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCI o pH přibližně 7,5;
    (b) molekuly, které mají izoelektrický bod nad 7,5;
    (c) liposomy obsahující kationtové lipidy v rozmezí od přibližně 25 mol% do 50 moll a mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCI o pH přibližně 7,5;
    (d) magnetosomy s vrstvou kationtových lipidů, která má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCI o pH přibližně 7,5 nebo (e) emulze olej ve vodě nebo mikroemulze obsahující kationtové amfifily charakterizované tím, že mají dva řetězce mastné kyseliny nebo alkylové řetězce ve vnější vrstvě v rozmezí od přibližně 25 do 60 mol% nebo které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCI o pH přibližně 7,5.
  15. 15. Terapeutická směs podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že aktivní složka je vybrána ze skupiny sestávající z etherlipidu, alkyllysolecitinu, alkyllysofosfolipidu, lysolipidu, alkylfosfolipidu.
  16. 16. Terapeutická směs podle jakéhokoliv z patentových nároků 13 až 15, kde etherlipid je vybrán ze skupiny sestávající z l-0-oktadecyl-2-0-methyl-rac-glycero-3-fosfocholin, 1-0-hexadecyl-2-O-methyl-sn-glycerol, hexadecylfosfocholin a oktadecylfosfocholin.
    9 9
    9 9
    9 0
    9 0 • · ·
  17. 17. Diagnostická směs připravená způsobem podle jakéhokoliv z patentových nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje aktivní složku, která je diagnostiky účinná pro diagnózu nebo zobrazení nemoci spojené s angiogenezí, přičemž diagnostická směs má zeta potenciál v rozmezí přibližně od + 25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl a pH přibližně 7,5 nebo izoelektrický bod nad 7,5, a může být dále značena nebo balena s instrukcemi pro podávání směsi pro diagnózu nebo zobrazení nemoci spojené s angiogenezí.
  18. 18. Diagnostická směs podle patentového nároku 17, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) částice, kromě liposomů, které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5;
    (b) molekuly, které mají izoelektrický bod nad 7,5;
    (c) liposomy obsahující kationtové lipidy v rozmezí od přibližně 25 mol% do 50 mol% a mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5;
    (d) magnetosomy s vrstvou kationtových lipidů, která má zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5 nebo (e) emulze olej ve vodě nebo mikroemulze obsahující kationtové amfifily charakterizované tím, že mají dva řetězce mastné kyseliny nebo alkylové řetězce ve vnější vrstvě v rozmezí od přibližně 25 do 60 mol%, nebo které mají zeta potenciál v rozmezí od přibližně +25 mV do +100 mV v přibližně 0,05 mM roztoku KCl o pH přibližně 7,5.
  19. 19. Použití terapeutické nebo diagnostické směsi podle jakéhokoliv patentového nároku 13 až 18 pro výrobu léků pro ©· ·· ©·©· • · • © ©
    selektivní cílení a akumulaci v diagnosticky účinné hladině v blízkosti aktivovaného cévního místa u živočicha.
  20. 20. Použití podle nároku 19, kde je živočichem savec.
  21. 21. Použití podle nároku 19 nebo 20, kde je terapeutická nebo diagnostická směs podávána způsobem vybraným ze skupiny zahrnující orální podávání, nitrožilní podávání, transdermální podávání, podkožní podávání, intraperitoneální podávání, podávání do nádoru, podávání do tepny, nitrosvalové podávání, podávání po kapkách nebo aerosolem.
  22. 22. Způsob stanovení optimálního zeta potenciálu směsi pro cílení ke specifickému místu vyznačující se tím, že zahrnuje:
    i) měření zeta potenciálu směsi za různých koncentrací kationtových složek ii) vynesení hodnot zeta potenciálu na y osu a koncentrací kationtových složek na x osu za získání hyperbolické křivky; a iii) stanovení zeta potenciálu a koncentrace kationtové složky v oblasti, kde se hyperbolická křivka ohýbá, kde oblast ohybu hyperbolické křivky poskytuje optimální zeta potenciál pro směs.
CZ20023913A 2000-05-03 2001-05-03 Kationtová diagnostická, zobrazovací a terapeutická činidla spojená s aktivovanými cévními místy CZ20023913A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20167300P 2000-05-03 2000-05-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20023913A3 true CZ20023913A3 (cs) 2003-09-17

Family

ID=22746804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023913A CZ20023913A3 (cs) 2000-05-03 2001-05-03 Kationtová diagnostická, zobrazovací a terapeutická činidla spojená s aktivovanými cévními místy

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20020034537A1 (cs)
EP (1) EP1278512A2 (cs)
JP (1) JP2004511426A (cs)
AU (2) AU6627201A (cs)
CA (1) CA2406650C (cs)
CZ (1) CZ20023913A3 (cs)
HU (1) HUP0301835A2 (cs)
MX (1) MXPA02010801A (cs)
PL (1) PL366025A1 (cs)
WO (1) WO2001082899A2 (cs)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8617514B2 (en) 1999-02-22 2013-12-31 Georgetown University Tumor-targeted nanodelivery systems to improve early MRI detection of cancer
AU2001253041A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Dendrimer composition for magnetic resonance analysis
US6551344B2 (en) * 2000-04-26 2003-04-22 Ev3 Inc. Septal defect occluder
AU2003249882B2 (en) * 2002-06-26 2008-09-18 Medigene Ag Novel method of stabilizing diagnostic and therapeutic compounds in a cationic carrier system
ES2331791T5 (es) * 2002-06-26 2016-01-21 Medigene Ag Método de producción de una preparación catiónica de liposomas que comprende un compuesto lipófilo
EP1374864A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-02 Munich Biotech AG Amphiphilic taxane compositions
PT2108362E (pt) * 2002-06-26 2013-07-11 Medigene Ag Preparação lipossomal catiónica que compreende um taxano
US20040024317A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Uzgiris Egidijus E. Method for assessing capillary permeability
JP4599292B2 (ja) * 2002-10-30 2010-12-15 エジソン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 物理的−化学的特性に基づく治療用化合物の同定
US7500953B2 (en) * 2003-01-25 2009-03-10 Seno Medical Instruments, Inc. High contrast optoacoustic imaging using nanoparticles
FR2855315B1 (fr) * 2003-05-23 2005-08-19 Centre Nat Rech Scient Ferrofluides stables en milieu neutre et ferrofluides modifies obtenus par modification de la surface des particules de ces ferrofluides
EP1663158A2 (en) 2003-06-24 2006-06-07 Baxter International Inc. Specific delivery of drugs to the brain
US8986736B2 (en) 2003-06-24 2015-03-24 Baxter International Inc. Method for delivering particulate drugs to tissues
BRPI0510271A (pt) 2004-06-15 2007-10-30 Baxter Int aplicações ex-vivo agentes terapêuticos microparticulados
WO2006028129A1 (ja) * 2004-09-10 2006-03-16 Toray Industries, Inc. 医薬品製剤
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
AU2006243337B2 (en) 2005-05-04 2011-09-29 Syncore Biotechnology Co., Ltd Method of administering a cationic liposomal preparation comprising paclitaxel
JP5478886B2 (ja) * 2005-10-20 2014-04-23 ジョージタウン・ユニバーシティ 癌の早期ｍｒｉ検出を改善するための腫瘍標的化ナノ送達系
MX2008011978A (es) 2006-03-22 2009-04-22 Medigene Ag Tratamiento del cancer de seno negativo al triple receptor.
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
JP5624276B2 (ja) * 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
ES2836184T3 (es) * 2006-05-02 2021-06-24 Univ Miami Formulaciones tópicas de co-enzima Q10 y tratamiento de heridas
WO2007133801A2 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Dmitri B Kirpotin Magnetic microparticles comprising organic substances
EP2040674B1 (en) * 2006-05-18 2010-07-07 MediGene AG Cationic liposomal preparations for the treatment of rheumatoid arthritis
CA2683137A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Squicor Compositions and methods for treating and diagnosing cancers
US20110002851A1 (en) * 2006-11-03 2011-01-06 Medigene Ag Cationic Colloidal Carriers for Delivery of Active Agents to the Blood-Brain Barrier in the Course of Neuroinflammatory Diseases
KR102225009B1 (ko) 2007-09-26 2021-03-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
BRPI0821110B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo
US9364443B2 (en) 2008-03-05 2016-06-14 Baxter International, Inc. Compositions and methods for drug delivery
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US8329161B2 (en) * 2008-05-01 2012-12-11 National Health Research Institutes Red blood cell-derived vesicles as a nanoparticle drug delivery system
JP5596027B2 (ja) * 2008-06-18 2014-09-24 レイセオン カンパニー カテーテル
US8486735B2 (en) 2008-07-30 2013-07-16 Raytheon Company Method and device for incremental wavelength variation to analyze tissue
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US9060704B2 (en) 2008-11-04 2015-06-23 Sarcos Lc Method and device for wavelength shifted imaging
US20100135912A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Gambhir Sanjiv S Magnetotactic bacteria mri positive contrast enhancement agent and methods of use
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
EP2409990A4 (en) 2009-03-19 2013-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANT OF A CONSTANT ANTIBODY REGION
US10952965B2 (en) * 2009-05-15 2021-03-23 Baxter International Inc. Compositions and methods for drug delivery
TW201041595A (en) 2009-05-15 2010-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-axl antibody
DE102009031274A1 (de) * 2009-06-30 2011-01-13 Justus-Liebig-Universität Giessen Liposomen zur pulmonalen Applikation
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2011041730A2 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Jacobsen Stephen C Light diffusion apparatus
US9144664B2 (en) 2009-10-01 2015-09-29 Sarcos Lc Method and apparatus for manipulating movement of a micro-catheter
US8828028B2 (en) 2009-11-03 2014-09-09 Raytheon Company Suture device and method for closing a planar opening
ES2539588T3 (es) * 2009-11-18 2015-07-02 Nanobacterie Tratamiento de cáncer o tumor inducido por la liberación de calor generado por diversas cadenas de magnetosomas extraídas de bacterias magnetotácticas y sometidas a un campo magnético alterno
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
KR101752944B1 (ko) 2010-05-03 2017-07-03 테이코쿠 팔마 유에스에이, 인코포레이티드 비수성의 탁산 프로에멀젼 제제, 및 그의 제조 및 사용 방법
TWI452136B (zh) 2010-11-17 2014-09-11 中外製藥股份有限公司 A multiple specific antigen-binding molecule that replaces the function of Factor VIII in blood coagulation
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP2679681B2 (en) 2011-02-25 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific FC antibody
US10029115B2 (en) * 2011-04-08 2018-07-24 Sanovas Intellectual Property, Llc Photodynamic therapy for tumors with localized delivery
CN102419370B (zh) * 2011-08-04 2014-08-27 武汉理工大学 用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
ES2667577T3 (es) * 2012-08-29 2018-05-11 Inguran, Llc Eliminación magnética o identificación de células o de estructuras celulares dañadas o comprometidas
US10379026B2 (en) 2012-08-29 2019-08-13 Inguran, Llc Cell processing using magnetic particles
JO3685B1 (ar) 2012-10-01 2020-08-27 Teikoku Pharma Usa Inc صيغ التشتيت الجسيمي للتاكسين غير المائي وطرق استخدامها
WO2015046467A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CN105873618B (zh) 2013-12-13 2019-07-26 迈究理资产管理有限公司 关节软骨成像组合物
EP3116392A4 (en) 2014-03-14 2018-02-14 Rhode Island Hospital Nanocarriers and their processing for diagnostics and therapeutics
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
KR102515796B1 (ko) 2014-12-19 2023-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 그의 사용 방법
KR20180054923A (ko) 2014-12-19 2018-05-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
MX2017008978A (es) 2015-02-05 2017-10-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que comprenden un dominio de union al antigeno dependiente de la concentracion ionica, variantes de la region fc, antiocuerpor de union a interleucina 8 (il-8) y usos de los mismos.
EP4269440A3 (en) 2015-02-27 2024-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
BR112018009312A8 (pt) 2015-12-28 2019-02-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd método para promover eficiência de purificação de polipeptídeo contendo região de fc
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
JP2020500020A (ja) 2016-11-14 2020-01-09 ノバルティス アーゲー 融合誘導性タンパク質ｍｉｎｉｏｎに関連する組成物、方法、および治療上の使用
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
MA52274A (fr) 2017-05-17 2021-02-24 Berg Llc Utilisation de formulations de coenzyme q10 dans le traitement et la prévention de l'épidermolyse bulleuse
CN108751397A (zh) * 2018-05-31 2018-11-06 北京北华中清环境工程技术有限公司 添加功能化磁性微球利用mbr进行煤制气废水处理的方法
JPWO2021221167A1 (cs) * 2020-04-30 2021-11-04
CN112754996B (zh) * 2021-03-16 2023-03-31 江西省科学院生物资源研究所 一种鱼精蛋白短肽修饰的紫杉醇脂质体及其制备方法
WO2023064316A1 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Composite ink formulations for endoscopic imaging

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5635180A (en) * 1988-02-17 1997-06-03 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US5230883A (en) * 1989-05-04 1993-07-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for localization and treatment of tumors using polylysine complexes
US5580575A (en) * 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
IL101241A (en) * 1992-03-16 1997-11-20 Yissum Res Dev Co Pharmaceutical or cosmetic composition comprising stabilized oil-in-water type emulsion as carrier
DE4428851C2 (de) * 1994-08-04 2000-05-04 Diagnostikforschung Inst Eisen enthaltende Nanopartikel, ihre Herstellung und Anwendung in der Diagnostik und Therapie
US5908635A (en) * 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
GB9416884D0 (en) * 1994-08-20 1994-10-12 Danbiosyst Uk Drug delivery compositions
DK0783325T3 (da) * 1994-09-27 2000-05-01 Nycomed Imaging As Kontrastmiddel
US5837283A (en) * 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
DE19912502A1 (de) * 1999-03-19 2000-09-21 Inst Neue Mat Gemein Gmbh Nanoskalige Teilchen, Komplexe mit Polynukleotiden und deren Verwendung
ES2258471T3 (es) * 1999-09-09 2006-09-01 The Regents Of The University Of California Suministro de liposomas cationicos de taxanos a vasos sanguineos angiogenicos.

Also Published As

Publication number Publication date
AU6627201A (en) 2001-11-12
WO2001082899A3 (en) 2002-06-13
US20020034537A1 (en) 2002-03-21
HUP0301835A2 (hu) 2003-09-29
PL366025A1 (en) 2005-01-24
WO2001082899A2 (en) 2001-11-08
WO2001082899A9 (en) 2003-05-08
AU2001266272B2 (en) 2005-09-15
EP1278512A2 (en) 2003-01-29
MXPA02010801A (es) 2004-09-06
JP2004511426A (ja) 2004-04-15
CA2406650C (en) 2009-07-21
CA2406650A1 (en) 2001-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20023913A3 (cs) Kationtová diagnostická, zobrazovací a terapeutická činidla spojená s aktivovanými cévními místy
AU2001266272A1 (en) Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites
US20240042063A1 (en) LINKED AND OTHER pH-TRIGGERED COMPOUNDS
Hoogenboezem et al. Harnessing albumin as a carrier for cancer therapies
Chen et al. Recent advances in nanomaterials for therapy and diagnosis for atherosclerosis
Morshed et al. Cell-penetrating peptide-modified gold nanoparticles for the delivery of doxorubicin to brain metastatic breast cancer
Wang et al. Bovine serum albumin as a versatile platform for cancer imaging and therapy
Zhang et al. Surface engineering of nanomaterials with phospholipid-polyethylene glycol-derived functional conjugates for molecular imaging and targeted therapy
JP5436363B2 (ja) 標的とする組織及び細胞の治療に有用なナノ粒子を含む薬剤組成物及び診断のための組成物
JP2004511426A5 (cs)
JP4813712B2 (ja) 薬物−担体複合体およびその使用方法
CN106794164A (zh) 脂质体包封的亲和性药物
de Lima et al. Liposome surface modification by phospholipid chemical reactions
Wang et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma
Sethi et al. Recent advances in drug delivery and targeting to the brain
US20190192686A1 (en) Targeted nanodroplet emulsions for treating cancer
Shi et al. Intelligent “Peptide-Gathering Mechanical Arm” tames wild “Trojan-Horse” peptides for the controlled delivery of cancer nanotherapeutics
Li et al. Regulation of protein corona on liposomes using albumin-binding peptide for targeted tumor therapy
JP2024053046A (ja) 抗がん剤の送達のためのステレオコンプレックス
Shabani et al. The brilliance of nanoscience over cancer therapy: Novel promising nanotechnology-based methods for eradicating glioblastoma
Shimizu et al. Development of tissue factor-targeted liposomes for effective drug delivery to stroma-rich tumors
US11160881B2 (en) Dendrimer compositions for use in angiography
JP2022505714A (ja) 腫瘍細胞の選択的イメージングのための融合性リポソーム
Zhang et al. Codelivery of anticancer drug and photosensitizer by PEGylated graphene oxide and cell penetrating peptide enhanced tumor-suppressing effect on osteosarcoma
Hunt Precision targeting of intraperitoneal tumors with peptideguided nanocarriers