JP4250765B2 - 冠状動脈疾患の予測 - Google Patents

Description

発明の背景
1．発明の属する技術分野
本発明は、冠状動脈疾患および関連する血管障害をより発生しやすい個体を初期に同定するための前徴候的なアッセイに関する。本発明は、遺伝子特異的、タンパク質特異的、およびエピトープ特異的プローブおよび分子遺伝的および生化学的アッセイについて記載する。
2．背景の記載
冠状動脈疾患：
アテローム性動脈硬化症（あるいは、動脈硬化症）は、進行性の管腔狭窄および動脈の硬化を記載するために使用する用語である。この疾患過程は、ヒトの体内のいずれの全身性動脈においても生じうる。例えば、脳への供給をする動脈におけるアテローム性動脈硬化症は、結果として発作を引き起こしうる。末梢の動脈が閉塞すると壊疽が生じる場合があり、そして心筋に酸素と栄養を供給している動脈が影響を受けると冠状動脈疾患が生じる。
冠状動脈疾患は、動脈アテローム塊の蓄積と心筋に供給をする動脈の進行性管腔狭窄を生じる、多因性の疾患である。この塊は、炎症性細胞と免疫細胞、線維性組織、および低密度脂肪（LDL）およびその修飾物やα-リポタンパク質などの脂肪性物質の混合物からなる。管腔狭窄または閉塞は、結果として心筋への酸素および栄養の送達能力を減衰させ、心筋梗塞、アンギナ、不安定性アンギナ、および心臓発作などの突然虚血死を引き起こす。閉塞は通常ゆっくりと進行するが、積層した動脈塊の一部がはがれ、動脈のどこかにつかえて動脈を一時的に閉塞する場合、あるいはもっと通常には、動脈管腔内で血栓症が生じた場合、血液供給は突然停止する場合がある。そのような発作の間に閉塞部位から遠位にある筋肉の量に依存して、心筋組織の一部が死ぬ場合があり、それにより心筋が弱まり、そしてしばしば個体の死亡を引き起こす。
動脈アテローム塊形成の原因および機構は、多くの仮説が存在するものの、完全にはわかっていない。アテローム性動脈硬化症の病因についての一つの仮説は、以下のステージを包含する：すなわち、（1）内皮細胞の機能不全および／または傷、（2）単球の補充とマクロファージの形成、（3）脂肪蓄積と修飾、（4）血管平滑筋細胞の増殖、および（5）細胞外マトリックスの合成である。この仮説によれば、アテローム性動脈硬化症の開始は、潜在的には、場合により物理学的ストレスまたは化学的ストレスによる傷の形成によって起こる。次いで、身体がこの傷に対してどのように応答するかが、アテローム性動脈硬化病変中で傷が悪化するかどうかそしてどのくらい急速に悪化するかを決定する。次いで、このことにより、動脈管腔狭窄が生じそして酸素および栄養の血液量に依存する心臓組織の損傷が起こる可能性がある。
心臓血管のケアにおける近年の進歩は、心臓動脈疾患の患者の生命に対する期待を増加させたが、このことは最初は脂質濃度を減少させ、疾患が生じた後の損傷を限定し、血液供給の外科的回復、不整脈の抑制と、再狭窄の阻害における進歩からであった。しかしながら、初期診断により、疾患の初期予防において若干の進歩が生じた。
冠状動脈疾患の治療における鍵となる問題は、適切な診断である。しばしば、疾患の最初の徴候は、心筋虚血または心筋梗塞による突然死である。冠状動脈疾患で死亡するすべての個体のおよそ半分は、突然死亡する。さらに、冠状動脈疾患を有すると実際に診断された患者の40〜60％では、心筋梗塞が疾患の第一の表象となる。残念ながら、初期イベントが始まった人のおよそ40％が患者とは気づかれていない。様々な理由のために、患者により症候が理解されることが冠状動脈疾患の全体の苦しみとはよく相関するわけではない（Anderson & Kin,Am.Heart J.,123（5）:1312-23（1992））。
アテローム性動脈硬化症の原因は未知なままであるが、感受性について適切な診断をすることは、患者に対して冠状動脈疾患が発生するリスクを減少するための十分な時間を提供する。冠状動脈疾患のリスクを減少するための一つの方法は、禁煙、運動、減量、およびストレスの軽減などの患者のライフスタイルを変化させることを介する。その他の方法には、高血圧、高コレステロール血症、および糖尿病を治療するための薬学的治療が含まれると同時に、アスピリンの使用が含まれる。最終的には、遺伝子療法により、心臓血管疾患（アポリポタンパク質代謝の改変など）の家族歴を引き起こす、まれな遺伝子的特徴を持つ個体を治療することを約束する。
高いリスクの個体を同定する能力により、医師は最大限の利益を受けることができる個体に対して予防的方法に集中することができ、そしてリスクのある個体がこのような方法に従うための強力なインセンティブを提供する。
炎症反応と冠状動脈疾患との相関
冠状動脈疾患および関連する血管障害は動脈の内皮において傷のいくらかの形成に対する反応として開始しうるということを示す事実が蓄積されてきた。傷は微妙なものであるかまたは明らかに内皮細胞の剥落であるかのいずれかであり得る。傷の焦点となる部位は、血漿構成成分の透過性の増大を引き起こし、そして血小板および単球が内皮組織あるいは内皮下の結合組織に接着するのを可能にする。活性化した血小板あるいは単球から放出される炎症因子は、その後、生活条件（media）から脈管内膜へ平滑筋細胞の移動を誘起し、その後これらの細胞は増殖する。平滑筋細胞による細胞外マトリックス構成成分の合成により、コラーゲン、弾性線維、およびプロテオグリカンの蓄積をひきおこす。単球もまた、脈管内膜へ入り、マクロファージに変換し、脂質を蓄積し、そして病変の展開に寄与する。短いまたは短命の有害なイベントに続いて、内皮細胞の再生、内皮機能の回復、そして病変の治癒が生じる。しかしながら、異常な炎症性イベントが動脈アテローム塊の発生を引き起こしうる。
長年の間、表皮学的研究により、個体の遺伝子構成は、冠状動脈疾患の発生に対する顕著なリスク因子であることを示してきた。心臓疾患の家族歴は、冠状動脈疾患を発生させる個体のリスクを増大させることに関与する。脂質およびコレステロール代謝は、歴史的に、冠状動脈疾患に対する主要な遺伝子的影響と考えられてきた。例えば、低密度脂質（LDL）に対する細胞受容体の欠損、例えば、家族性高コレステロール血症などが、高濃度の血症LDLおよびアテローム性動脈硬化の早発性の発生に関与する（Brown & Goldstein,Sci.,191（4223）:150-4（1976））。
現在一般的には、炎症はアテローム性動脈硬化症の病理学的過程の重要な構成成分であると考えられている（Munro,Lab Invest.,58:249-261（1988）;Badimon,et al.,Circulation,87:3-16（1993）;Liuzzo,et al.,N.E.J.M.,331（7）:417-24（1994）;Alexander,N.E.J.M.,331（7）:468-9（1994））。血管を内張りする内皮細胞の損傷は、IL-1、TNFαを含む炎症性サイトカインの蓄積、そしてプロスタグランジンI₂（PGI₂）、血小板由来成長因子（PDGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、および顆粒細胞-単球細胞刺激因子（GM-CSF）などのプロスタノイドおよび成長因子の放出を引き起こす。これらの因子は、単球などの炎症性細胞の蓄積と制御を引き起こし、単球は血管壁中に蓄積する。単球は、次いで、IL-1、TNF、プロスタグランジンE₂（PGE₂）、bFGFおよびトランスフォーム成長因子αおよびβ（TGFα、TGFβ）を含む、炎症性媒介物質をさらに放出する。これらの炎症性媒介物質のすべては、より多くの炎症性細胞を損傷領域に補充し、内皮細胞および平滑筋細胞の行動を制御し、そして動脈アテローム塊の蓄積を引き起こす。
IL-1βを含むいくつかの炎症性産物がアテローム性動脈硬化症病変において、または疾患のある冠状動脈の内皮において同定された（Galea,et al.,Ath.Thromb.Vasc.Biol.,16:1000-6（1996））。同様に、IL-1βの血清濃度は冠状動脈の疾患を有する患者において上昇する（Hasdai,et al.,Heart,76:24-8（1996））。歴史的に炎症性作用因の存在が傷または単球活性化に反応性であると考えられたため、異常な炎症性反応が冠状動脈疾患の原因であるかまたは疾患に対する感受性を増大させる原因となりうる可能性もある。したがって、そのような炎症性反応に関与するサイトカインIL-1およびTNFは、一部では、冠状動脈疾患の個体のリスクを決定しうる。
IL-1遺伝子クラスターの遺伝子：
IL-1遺伝子クラスターは、第二染色体の長腕（2q13）にあり、そして少なくともIL-1α（IL-1A）、IL-1β（IL-1B）、およびIL-1受容体アンタゴニスト（IL-1RN）の遺伝子を430Kbの領域内に含む（Nicklin,et al.,Genomics,19:382-4（1994））。アゴニスト分子であるIL-1αおよびIL-1βは、強力な前炎症性活性を有し、そして多くの炎症性カスケードの始まりである。それらの作用は、しばしばIL-6およびIL-8などのその他のサイトカインの誘導を介して、損傷組織中での白血球の活性化と補充、血管作用薬の局所的な産生、脳内での発熱応答および肝臓性急性相反応を引き起こす。IL-1分子の3つすべては、I型およびII型IL-1受容体に結合するが、I型受容体だけが細胞の内部へシグナルを伝達する。これと対照的に、II型受容体は、細胞膜から落ちてデコイ受容体として作用する。受容体アンタゴニストおよびII型受容体は、したがって、両方ともその作用において抗炎症性である。
IL-1の不適切な産生は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬などを含む多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病理において中心的な役割を果たす。さらに、IL-1の産生速度には、一定の個体差が存在し、そしてこの変量のいくらかはIL-1遺伝子座での遺伝子的相違が原因であり得る。したがって、IL-1遺伝子は、炎症性疾患に対する遺伝子的感受性の一部を決定するための程良い候補であり、それらのほとんどはポリジーンの構成分子を伴う多因性の病因を有している。実際、IL-1遺伝子の特定のアリルがこれらの疾患において過剰発現しているという事実が増えている。
遺伝子的診断：
遺伝性疾患の伝統的な診断方法は、異常な遺伝子産物（例えば、鎌形赤血球貧血）あるいは異常な表現型（例えば、精神遅滞）を同定するかいずれかに依存していた。これらの方法は、発病が遅く、容易に同定できる表現型を何ももたない遺伝性疾患、例えばアルツハイマー病などに対する限定的な効果を有する。遺伝子的試験の発達により、現在では疾患がポリジーンに由来するものである場合においても、疾患の発生に対する性質を示す遺伝子変異を同定することができる。多因性障害の遺伝的基礎についての理解がますにつれ、分子生物学的方法により診断することができる疾患の数が多くなり続けている（例えば、米国特許第4,582,788号;第4,666,828号;第4,801,531号;第5,11O,920号;そして第5,268,267号を参照）。
遺伝的試験（遺伝的スクリーニング、遺伝子型決定、または分子診断とも呼ばれる）は、患者が疾患状態を引き起こすかまたは疾患状態を引き起こす変異と“連鎖”するかのいずれかである変異（またはアリルあるいは多型）を含むかどうかを決定するために、分析的な能力において、患者の核酸を試験することとして幅広く定義することができる。連鎖は、ゲノム中で近接するDNA配列が一緒に遺伝しやすいという現象をいう。共遺伝のいくつかの選択的利点のため、2つの配列も連鎖しうる。
遺伝的疾患に対する素因の初期検出は、医学的治療に対する最良の機会を提供する。初期の遺伝的診断により、臨床的に検出可能な障害が発生する前に管理および初期治療をすることを通じて患者の予後診断を向上することができる。同様の徴候を有する患者を治療して、様々な成功を収める場合、洗練された遺伝的試験により個々の患者を微妙なまたは検出できない相違により区別することができ、そしてより適切な個体の治療を行うことができる。初期治療には、いつかは、遺伝子療法などの方法も関係しうる可能性すらある。
発明の概要
本発明は、冠状動脈疾患および関連する血管疾患を発生する性質を初期検出する、新規の方法を提供する。前記性質を初期検出するためのキットおよびこの疾患に関連する別のアリルを同定するための方法も提供する。
一般的には、冠状動脈疾患についてのリスクの増加を予測する方法は、IL-1RNアリル2およびIL-1βアリル2からなる群から選択されるアリルの少なくとも1のコピーの存在を検出することからなる。1またはそれ以上のこれらのアリルを有することは、冠状動脈疾患に対するリスクが増加していることを示す。アリルを検出することは、直接的にはIL-1領域由来のDNAを解析することにより、または間接的にはDNAの産物であるRNAまたはタンパク質を解析することにより、行うことができる。
別の態様においては、本発明を以下のこととして記載することができる：すなわち、患者から核酸を単離すること、IL-1遺伝子クラスター中に存在する1またはそれ以上のアリルを同定すること、そして対照サンプルと1またはそれ以上のアリルを比較することである。対照サンプルは、冠状動脈疾患に関与することが知られるIL-1遺伝子クラスター由来の少なくとも一つのアリルを含む。好ましい態様においては、対照サンプルはIL-1RN（VNTR）アリル2および／またはIL-1B（-511）アリル2を含む。同定された患者由来のアリルの対照サンプルに対する同一性から、冠状動脈疾患に対する患者の素因が示される。
本発明の別の態様は、冠状動脈疾患の予測となるアリルを検出するためのキットである。一般的に、キットはIL-1遺伝子ファミリー中のDNA配列に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および対照サンプルを含む。対照サンプルは、上述のように冠状動脈疾患に関与することが知られるアリルである。キットは、DNAサンプリング手段、DNA精製手段、およびPCR試薬も含んでよい。さらにオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含んでもよい。
本発明の別の態様は、冠状動脈疾患に関与するアリルを同定する方法を提供する。本方法は、冠状動脈疾患のない患者の第一のコーホートを集めること、冠状動脈疾患のある患者（血管造影所見から決定する）の第二のコーホートを集めること、および第一のコーホートおよび第二のコーホート中に存在するIL-1アリルを同定することからなる。第一のコーホートと比較して、第二のコーホート中で過剰に発現しているアリルを、冠状動脈疾患に関与するものとして同定する。
本発明のその他の態様および利点は、以下の詳細な説明中に一部記載し、そしてこの説明から明らかであり得るかまたは本発明の実施から学ぶことができる。
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中で具体化され、そして幅広く記載されているように、本発明は、冠状動脈疾患の発生に対する患者の性質を予測する方法、および診断キット、オリゴヌクレオチドプローブ、およびこれらの方法で使用することができるその他の試薬に関する。本発明はまた、冠状動脈疾患に関与する遺伝的マーカーを同定する方法にも関する.
本明細書中で使用されているように、冠状動脈疾患という用語は、一般的には、心臓に供給する大きなサイズの動脈および中程度のサイズの動脈中での動脈アテロームの蓄積に関連するものとして、当業者により認識される傷害および症状をいう。したがって、冠状動脈疾患は冠状動脈アテロームの病理に基づく臨床的症候群（アンギナ、心筋梗塞、不安定性アンギナ、および突然虚血死を含むが、これらに限定されない）を意味する。
マーカーという用語は、個体間で変化するDNAの領域を記載することを意味する。例えば、IL-1RN遺伝子由来の“VNTR”マーカーが本明細書中には記載されている。特定のマーカーにおける異なる配列変異体は、アリルまたは多型と呼ばれる。VNTRマーカーは、少なくとも5つの異なるアリルを有し、そのうちの3つはまれなものである。別個のアリルは、置換、挿入または欠失を含む単一塩基の変化を有するか、または。置換、挿入、欠失、反復、逆位およびそれらの組合せを含む、複数塩基に影響を与える変化を有する。アリルは、直接的には個体のDNA中で検出することも、間接的にはRNAまたはタンパク質中で検出することもできる。
本明細書中で使用するように、アリルの検出方法は、アリルまたは多型を遺伝子型決定すること、決定すること、または同定することとして、またはいずれかの同様な言い回しとして様々に記載される。実際に検出されるアリルは、疾患を引き起こす変異であっても、または疾患を引き起こす変異に連鎖する変異であってもよい。
本明細書中で使用されるように、IL-1遺伝子クラスターまたはIL-1遺伝子座位という用語は、少なくともIL-1A、IL-1BおよびIL-1RN遺伝子およびいずれかのその他の連鎖する配列を含む、第二染色体の2q13領域またはその付近のすべての核酸を含む。
IL-1RN（VNTR）アリル2という用語は、IL-1RN遺伝子のVNTRマーカーのアリル2のことを記述する。このアリルは、VNTR反復を2コピー有することにより特徴づけられ、そして本明細書中で記載されたプライマーで増幅する場合、240bpの産物を産生する。
IL-1B（-511）アリル2という用語は、IL-1B遺伝子の-511マーカーのアリル2を記載する。このアリルは、Bsu361部位を含み、そして本明細書中で記載するプライマーで増幅し、Bsu361で消化する場合、190および114bpの断片を産生する。
疾患に対する性質または素因または感受性により意味することは、それにより特定のアリルが、所定の疾患状態に関与すると発見されることをいう。したがって、それらは、健康な個体と比較して、疾患を有する個体中で過剰に発現する。したがって、このようなアリルの存在が、疾患に対してリスクを有する状態である個体を示している。
本発明は、IL-1遺伝子座位において患者のDNAについて遺伝子型決定することにより、患者の冠状動脈疾患に対する性質または素因を予測する方法に関する。患者の遺伝子型を疾患状態に相関するまたは関与することが知られている1またはそれ以上のIL-1アリル変異体を含む、対照サンプルと比較する。対照サンプルは、IL-1RNアリル2および／またはIL-1Bアリル2および連鎖するアリル、あるいは本明細書中で記載される方法により同定されるその他のアリルを含んでいてもよい。対照サンプル中のアリルは、IL-1遺伝子クラスター由来のゲノム配列またはクローニングされたDNA配列の形状であっても、または行うアッセイフォーマットに適した最終産物であってもよい。例えば、アッセイに特定のエピトープのモノクローナル検出を伴う場合、対照サンプルは、記載されたアリルに対応するエピトープまたはタンパク質を含みうる。
特定のマーカの存在を決定する技術は、ハイブリダイゼーション、サイズ、または配列に基づく、制限酵素断片長多型（RFLP）または核酸配列決定などの核酸技術などに基づく核酸技術であってもよい。
これらの技術は、解析する前に、核酸を増幅する工程を含んでもよい。増幅技術は、当業者には既知であり、そしてクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、特異的アリルのポリメラーゼ連鎖反応（PASA）、ポリメラーゼ連鎖ライゲーション、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応などが含まれる。増幅産物は、サイズ解析、制限酵素消化に続くサイズ解析、反応産物中での特異的にタグ付けされたオリゴヌクレオチドプライマーの検出、アリル特異的オリゴヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーション、配列決定などを含む、様々な方法でアッセイすることができる。
あるいは、アリル検出技術は、特定のアリルがアミノ酸変異体を含むタンパク質を産生する場合には、タンパク質を基礎としてもよい。例えば、アミノ酸変異体に対して特異的なエピトープは、モノクローナル抗体により検出することができる。
本発明はまた、冠状動脈疾患を発生しやすい性質がある別のIL-1アリルを同定する方法にも関する。疾患を有する患者において存在するIL-1アリルを、疾患を有さない患者に存在するものと比較し、いずれのアリルが疾患を有する患者において過剰発現されているかどうかを決定する。アリルは、現存する既知のIL-1アリルであってもよく、またはそれらの遺伝子に近接した領域のDNA配列決定を含む、当該技術分野において既知のいずれかの技術により、別のマーカーを同定してもよい。
本発明の別の態様は、患者において冠状動脈疾患に対する性質を検出するための診断キットに関する。キットは、前徴候的にまたは出生前に使用することができる。診断キットは、IL-1遺伝子クラスター由来の核酸にハイブリダイゼーションすることができる、1またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。多くのアッセイフォーマットが提供されるオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子型決定に対して有用である。もっとも一般的なフォーマットは、例えば、フィルター、ビーズ、またはマイクロタイタープレートなどに結合する核酸を含む。関連する技術としては、ドットブロット、RNAブロット、DNAブロット、PCR、FRLPなどが含まれる。
オリゴヌクレオチドは、例えば、合成オリゴヌクレオチド、制限酵素断片、cDNA、合成PNA（タンパク質核酸）など、様々な天然および合成の組成物であってもよい。アッセイは、標識したオリゴヌクレオチドを使用して、アッセイにおける同定を用意にすることもできる。使用することができる標識の例としては、放射標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁石成分、金属結合成分、抗原または抗体成分などが含まれる。
キットは、AmpliCard^TM（University of Sheffield,Sheffield,England S1O 2JF）などのDNAサンプリング手段を含んでもよく、これは本明細書中で参考文献として援用するTarlow JWら（Journal of Investigative Dermatology,103:387-389（1994））中にも記載される。その他の適したDNAサンプリング手段としては、DNA精製手段、および10×反応バッファー、熱安定性ポリメラーゼ、および／またはdNTPなどのPCR試薬を含む。
以下の実施例は、本発明の態様を説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものとして見るべきではない。
実施例１：単一血管冠状動脈疾患に対するマーカー
本研究の目的は、初期型の冠状動脈アテローム性動脈硬化症、すなわち単一血管冠状動脈疾患を有する患者が、次の遺伝子：すなわち、IL-1A（-889マーカー）、IL-1B（-511および+3953マーカー）、IL-1RN（VNTRマーカー）またはTNFα（-308マーカー）において特異的なアリルをより有しやすいかどうかを決定することであった。
一般的に、複数血管疾患は、データ解釈を複雑化させ得る多くの因子が関与する場合がある、疾患の最後のステージを示す。したがって、胸部痛の愁訴を示す患者を心臓血管学者が評価し、そして1より多い冠状動脈中で顕著なアテローム性動脈硬化症の血管造影所見を伴う患者は解析から除いた。
患者のコーホート：
大腿部動脈または上腕動脈のいずれか由来の血管造影を従来の方法を使用して行った。調べた患者のうち、85人は血管造影で明らかな管腔異常を何ら示さず、そして血管造影的に正常な冠状動脈を有する対照として分類された。3本の心外膜冠状血管のうちの1本が、肉眼所見として管腔径にして50％の減少を引き起こす心外膜狭窄を含む場合、患者は単一血管疾患を有するとして分類された。58人の患者は単一血管冠状動脈疾患を有することがわかった。複数血管疾患を有する患者は除いた。対照および単一血管疾患群は、それぞれ57.6±10.4歳および56.4±9.4歳と、同等の平均年齢を有した。対照群における女性に対する男性の比率は、1：1.7であり、疾患群では2.6：1であった。
一般的方法：
核酸技術に関する反応および操作は、特に述べない限り、一般的にSambrookらのMolecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））に記載されたように行った。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、一般的に、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications（Academic Pless,San Diego,CA（1990））に記載されたように行った。遺伝子型決定方法は、一般的には、米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号；そして第5,272,057号、およびMcDowellら（Arthritis & Rheumatism,38（2）:221-8（1995））に記載されるように行った。
DNA調製：
DNAは、塩析法（Nucleaon II^TM,Scotlab,UK）を改良したものを使用して、全血から抽出した。
IL-1RNの遺伝子型決定：
IL-1RN遺伝子に関与するアリルは、Tarlowら（Human Genetics,91:403-4（1993））に以前に記載された。PCRにおいて使用する酵素はPromega社（UK）から、そしてサーモサイクラーはMJリサーチDNAエンジンまたはBiometraから入手した。以下のプライマー：

をABIのDNA合成機を使用して作成した。PCR増幅は、1.75mMの最終マグネシウム濃度および96℃で1分を1サイクル；94℃で1分、60℃で1分、および70℃で1分を1サイクルとして30サイクル；そして70℃で2分を1サイクル行うというサイクルのプロトコルで行った。PCRの後、異なるアリルを2％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてUV光下で可視化しそして同定した。DNAを含まない陰性対照をそれぞれの実験で行った。
IL-1RN遺伝子のイントロン2には、以下の5アリル：
アリル1は4つの反復を含み、そして412bpのPCR産物を示す；
アリル2は2つの反復を含み、そして240bpのPCR産物を示す；
アリル3は3つの反復を含み、そして326bpのPCR産物を示す；
アリル4は5つの反復を含み、そして498bpのPCR産物を示す；および
アリル5は6つの反復を含み、そして584bpのPCR産物を示す；
を引き起こす可変数タンデム反復（VNTR）領域が含まれる。
IL-1B（-511）の遺伝子型決定
IL-1Bの-511マーカーは、diGiovne（Hum.Molec.Genet.,1（6）:450（1992））により記載された。IL-1B塩基-511番での単一塩基変異（C/T）マーカーは、アリル1（C）上のAvaI部位およびアリル2（T）上のBsu36I部位に基づいて同定された。PCRは、95℃で2分を1サイクル；95℃で1分、53℃で1分、および74℃で1分を1サイクルとして35サイクル；そして74℃で4分を1サイクルとして行った。PCR産物の解析は、37℃で8時間、AvaIおよびBsu36Iで制限酵素消化し、その後8％のPAGEにてサイズ解析を行った。以下のプライマー：

は、ABIのDNA合成機を使用して作成した（Clark,et al.,Nucl.Acids.Res.,14:7897-7914（1986）〔Nucleic Acids Res.,15（2）:868（1987）中で誤りとして刊行された〕；GENBANK X04500）。
結果：
IL-1A（-889マーカー）、IL-1B（+3953マーカー）またはTNα（-308マーカー）についての遺伝子中で、異なるアリルの頻度には、対照と疾患を有する患者の間で顕著な差はなかった。しかしながら、IL-1RN遺伝子中のVNTRマーカーのアリル2は、単一血管疾患を有する患者の41％で顕著に過剰発現していたのに対し、対照では22％であった。少なくとも1コピーのアリル2を有する個体は、アリル2に陰性の個体と比較して、単一血管冠状動脈疾患を有する傾向が2.44倍であった（差異率＝2.44、p＝0.003、95％の確度区間＝1.35-4.43）。
さらに、2コピー有する個体、すなわち、IL-1RNにおけるアリル2に関してホモ接合体である個体は、アリル2に陰性の個体と比較して、単一血管冠状動脈疾患を有する傾向が5.36倍であった（差異率＝5.36、p＝0.005、95％の確度区間＝1.6-17.97）。
IL-1B遺伝子の-511マーカーのアリル2を1コピー有することにより、対照における38％と比較して、単一血管冠状動脈疾患では52％に増加した。少なくとも1コピーのアリル2を有する個体は、アリル2に陰性の個体と比較して、単一血管疾患を有する傾向が1.74倍である（差異率＝1.74、p＝0.1、95％の確度区間＝0.86-3.52）。小さなサンプル規模のために研究が限定的であるものの、この知見は極めて顕著なものではない。
これらの知見は、IL-1RN遺伝子のアリル2が冠状動脈アテローム性動脈硬化症を発生する感受性に対するマーカーであることを示している。このアリルは、疾患に関与するアリルが1コピーであるか（ヘテロ接合体）または2コピーであるか（ホモ接合体）に依存して、冠状動脈疾患のリスクを2.4倍から5.4倍に増大させることに関与する。冠状動脈疾患に対するこのアリルのリスクを、その他の一般的リスク因子と比較して、表1に示す。
さらに、IL-1B遺伝子に対するアリルが、単一血管冠状動脈疾患に関与することがわかった。このアリルは、冠状動脈疾患のリスクを1.74倍に増大させることに関与する。

実施例２：複数血管冠状動脈疾患に対するマーカー
本研究の目的は、後期またはより広範性型の冠状動脈アテローム性動脈硬化症、すなわち、複数血管冠状動脈疾患を有する患者が、IL-1遺伝子クラスターまたはTNFαの遺伝子中の特定のアリルを有する傾向がより高いかどうかを決定することであった。
患者のコーホート：
1以上の心外膜冠状血管が、肉眼所見として管腔径にして50％以上の減少を引き起こす心外膜狭窄を含む場合、患者を複数血管疾患を有するとして分類する以外は、患者のコーホートは実施例１のように決定した。調べた患者のうち、86人は血管造影的に正常な冠状動脈を有する対照として分類され、そして315人の患者が複数血管冠状動脈疾患を有するとわかった。対照および単一血管疾患群の両方で、それぞれ57.6±10.4歳および60.8±1.13歳と、同等の平均年齢を有した。対照群における女性に対する男性の比率は、1：1.7であり、疾患群では3.7：1であった。
一般的方法：
反応および方法は、実施例１と同様である。
結果：
IL-1A（-889マーカー）、IL-1B（+3953マーカー）またはおよびIL-1RN（VNTRマーカー）についての遺伝子中で、異なるアリルの頻度には、対照と疾患を有する患者の間で顕著な差はなかった。しかしながら、IL-1B遺伝子中の-511マーカーのBsu36Iアリル（アリル2）を1コピーの保有が、対照では38％だったのに対して複数血管冠状動脈疾患では54％に増加した。少なくとも1コピーの-511マーカーのアリル2を有する個体は、アリル2に陰性の個体と比較して、複数血管冠状動脈疾患を有する傾向が1.92倍であった（差異率＝1.92、p＝0.009、95％の確度区間＝1.17-3.16）。これらから、この集団においては少なくとも、-511マーカーに対して容量依存的効果を何も示さない。
まとめると、IL-1B遺伝子についてのアリルは、複数血管冠状動脈疾患に関与することがわかった。このアリルは、冠状動脈疾患のリスクを1.92倍に増大することに関与する。
単一血管および複数血管冠状動脈疾患は、それぞれIL-1遺伝子クラスターの異なる遺伝子と連鎖するようである。このことから、IL-1R.A.がIL-1β効果を単一血管表現型を生成するという方法で修飾する場合に、真の生物学的識別として生じうる。あるいは、両方の遺伝子は、実際に、冠状動脈疾患に全体として関与し、そしてここで観察された関与から、この特定の集団が冠状動脈疾患を示す様式が得られる可能性がある。いずれの解釈をしても、IL-1生物学と冠状動脈疾患との間の強力な関係が確立された。
本発明のその他の態様および使用は、本明細書中で開示した発明の明細書および実施を考慮することから、当業者には明らかであろう。本明細書中で引用された全ての参考文献は、いかなる理由であれ、参考文献として具体的に援用する。明細書および実施例は、以下の請求の範囲により示唆される発明の真の範囲および精神のためのみの例示であると考えるべきである。

Claims (19)

1. 冠状動脈疾患に対する患者の素因を決定する方法であって：
   a．患者のIL-1遺伝子座由来の第一のアリルを検出すること；および
   b．第一のアリルを、IL-1RN遺伝子のVNTRマーカーのアリル2であってVNTR反復を2コピー有するIL-1RN（VNTR）アリル2およびIL-1B遺伝子の-511マーカーのアリル2であってBsu361部位を含むIL-1B（-511）アリル2からなる群から選択される第二のアリルと比較すること；
   ここで、第一のアリルが第二のアリルと同一である場合に患者が冠状動脈疾患に対する素因があること、
   を含む、前記方法。
2. 第一のアリルの検出が、核酸のRFLP解析を含む、請求項1に記載の方法。
3. 第一のアリルの検出が、核酸の増幅を含む、請求項1に記載の方法。
4. 増幅がPCR増幅である、請求項3に記載の方法。
5. 

   からなる群から選択されるPCRプライマーを用いてPCR増幅を行う、請求項4に記載の方法。
6. 冠状動脈疾患に対する患者の素因を決定する方法であって：
   a．患者から単離されたDNAを解析して、患者のIL-1遺伝子座由来の第一のアリルを決定すること；および
   b．第一のアリルを、IL-1RN（VNTR）アリル2およびIL-1B（-511）アリル2からなる群から選択される第二のアリルと比較すること；
   ここで、第一のアリルが第二のアリルと同一である場合に患者が冠状動脈疾患に対する素因があること
   を含む、前記方法。
7. a．ポリメラーゼ連鎖反応においてDNAを増幅し、増幅産物を産生すること；そして
   b．増幅産物のサイズ分画をすること；
   によりDNAを解析する、請求項6に記載の方法。
8. 

   からなる群から選択される1またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行う、請求項7に記載の方法。
9. 前記1またはそれ以上のオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている、請求項8に記載の方法。
10. 冠状動脈疾患に対する患者の傾向を決定する方法であって：
    IL-1遺伝子座での患者の核酸を分類し遺伝子型を決定すること；そして、ここで、IL-1RN（VNTR）アリル2またはIL-1B（-511）アリル2のいずれかを有することが、冠状動脈疾患に対する傾向の増大を示す；
    ことを含む、前記方法。
11. 前記冠状動脈疾患が単一血管冠状動脈疾患であり、そして前記IL-1の遺伝子型がIL-1RN（VNTR）アリル2である、請求項10に記載の方法。
12. 前記冠状動脈疾患が複数血管冠状動脈疾患であり、そして前記IL-1の遺伝子型がIL-1B（-511）アリル2である、請求項10に記載の方法。
13. 冠状動脈疾患に対する傾向の増大を予測する方法であって、IL-1RNアリル2およびIL-1Bアリル2からなる群から選択される少なくとも1コピーのアリルの存在を検出することを含み、ここで、前記アリルの検出が患者が冠状動脈疾患に対する性質の増大を示すことを示す、前記方法。
14. 1コピー以上の前記アリルを検出することが、1コピーの前記アリルを検出することと比較して、冠状動脈疾患の傾向がより高いことを示す、請求項11に記載の方法。
15. 冠状動脈疾患を予測するためのキットであって：
    a．IL-1遺伝子クラスター中のDNA配列に対して相補的である少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；および
    b．IL-1RN（VNTR）アリル2またはIL-1B（-511）アリル2である対照サンプル；
    を含む、前記キット。
16. DNAサンプリング手段、DNA精製手段、およびPCR反応バッファーをさらに含む、請求項15に記載のキット。
17. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが：
    

    

    からなる群から選択される、請求項15に記載のキット。
18. 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが検出可能な標識をさらに含む、請求項17に記載のキット。
19. DNAサンプリング手段、DNA精製手段、およびPCR反応バッファーをさらに含む、請求項18に記載のキット。