CZ9903182A3 - Předpověď onemocnění věnčitých tepen - Google Patents

Abstract

Způsob předpovídání rizika onemocnění věnčitých tepen zahrnuje obdržení biologického vzorku od pacienta a stanovení přítomnosti či nepřítomnosti určité alely, která souvisí s onemocněním věnčitých tepen. Detekce této alely ukazuje na náchylnost k rozvoji onemocnění věnčitých tepen. Souprava pro detekci onemocnění věnčitých tepen obsahuje jako prostředek pro identifikaci přídavných alel souvisejících s onemocněním věnčitých tepen alespoň jeden oligonukleotid komplementární k sekvenci DNA ve shluku genů IL-1 a dále kontrolní vzorek, ve kterém je alespoň o jedné z alel známo, že souvisí s onemocněním věnčitých arterií.

Description

Předpověď onemocnění věnčitých tepen

Oblast techniky

Tento vynález se týká presymptomatické zkoušky pro časné určení jednotlivců se zvýšenou pravděpodobností rozvoje onemocnění věnčitých tepen a příbuzných cévních poruch. Popisuje sondy specifické pro gen, pro protein a pro epitop a molekulárně genetické a biochemické rozbory.

Dosavadní stav techniky

Onemocnění věnčitých tepen

Aterosklerosa (nebo arteriosklerosa) je termín používaný k popisu progresivního zužování průchodu a tvrdnutí arterií. Tento chorobný proces může nastat v kterékoliv systémové tepně v lidském těle. Například aterosklerosa v tepnách zásobujících mozek může vést k mrtvici. Gangrena může nastat při blokování periferních tepen a onemocnění věnčitých tepen nastává při postižení tepen dodávajících kyslík a živiny do srdečního svalu.

Onemocnění věnčitých tepen je vícefaktořovým onemocněním, které vede k ukládání ateromatózního plátu a k progresivnímu zúžení průchodu tepen zásobujících srdeční sval. Tento plát obsahuje směs zánětlivých a imunitních buněk, fibrózní tkáně a tukového materiálu, jako jsou lipidy o nízké hustotě (LDL) a jejich modifikace, a ot-lipoprotein. Zúžení průchodu nebo zablokování vede ke snížené schopnosti dodávat kyslík a živiny do srdečního svalu se vznikem infarktu myokardu, angíny pectoris, nestabilní anginy pectoris a náhlého ischemického úmrtí s následkem srdečního selhání.

nestabilní angíny pectoris a náhlého ischemického úmrtí s následkem srdečního selhání. I když okluse obvykle pokračuje pomalu, může se dodávka krve přerušit náhle, jestliže se část vzniklého arteriálního plátu odtrhne a uloží někde v arterii s jejím dočasným zablokováním nebo ještě častěji, jestliže v průchodu tepny dojde k trombóze. V závislosti na objemu svalu, který leží distálně od místa zablokování, může během tohoto ataku část srdeční tkáně odumřít, což způsobí oslabení srdečního svalu a často úmrtí dané osoby.

Způsoby a mechanizmy tvorby ateromatózního plátu nebyly dosud plně vysvětleny, i když existuje řada teorií. Jedna teorie o patogenesi aterosklerosy zahrnuje následující kroky:

(1) dysfunkce a/nebo poškození endotheliálních buněk, (2) mobilizace monocytů a tvorba makrofágů (3) ukládání a modifikace lipidů (4) proliferace buněk hladkého svalstva cév (5) syntéza extracelulární matrice.

Podle této teorie je zahájení aterosklerosy potenciálně následkem určité formy poškození, pravděpodobně mechanickým či chemickým stresem. Odpověď těla na toto poškození potom definuje, zda a jak rychle se toto poškození zhoršuje do aterosklerotického poškození. To může dále vést ke zužování průchodu a poškození srdeční tkáně, která závisí na proudu kyslíku a živin v krvi.

Nedávná zlepšení kardiovaskulární péče prodloužila dobu života pacientů s onemocněním věnčitých cév především zlešeními ve snížení hladin lipidů, omezení poškození po jeho výskytu, chirurgické obnově dodávky krve, potlačení d « · » • · · · • » » :

nenormálního srdečního rytmu a prevenci opakovaného infarktu. Málo zlepšení se však dosáhlo v časné prevenci onemocnění časnou diagnostikou.

Klíčovým problémem při léčení onemocnění věnčitých tepen je správná diagnosa. Často je první známkou onemocnění náhlé úmrtí s následkem srdeční ischemie nebo srdečního infarktu. Zhruba polovina všech osob, které umírají následkem onemocnění věnčitých tepen, umírá náhle. Dále u 40 až 60 % nemocných, kteří mají onemocnění věnčitých tepen, je infarkt myokardu prvním projevem jejich onemocnění. Naneštěstí zhruba 40 % těchto počátečních příhod pacient nezaznamená. Z různých příčin pociúování příznaků pacientem nekoreluje dobře s celkovou zátěží onemocněním věnčitých tepen [Anderson a Kin, Am. Heart J., 123, 1312-1323 (1992)].

I když příčiny aterosklerosy zůstávají neznámé, správná diagnosa náchylnosti k tomuto onemocnění může pacientům poskytnout dostatečnou dobu pro snížení jejich rizika rozvoje onemocnění koronárních tepen. Jeden způsob pro snížení rizika onemocnění koronárních tepen je změna způsobu života pacienta, jako je ukončení kouření, cvičení, snižování tělesné hmotnosti a omezování stresu. Další způsoby zahrnují farmaceutické zásahy pro léčení hypertense, hypercholesterolemie a diabetů stejně tak jako užívání aspirinu. Konečně genetická terapie nabízí léčení těch vzácných genetických znaků, které vedou k rozdílné anamnese kardiovaskulárního onemocnění (např. k pozměněnému metabolismu apolipoproteinu).

Možnost identifikace osob s vysokým rizikem by lékaři umožnila, aby se zaměřil na preventivní opatření u těch • » osob, které z toho mohou mít nejvyšší prospěch, a poskytla by silnou stimulaci těm, kteří vykazují toto riziko, aby jednali v souladu s těmito přístupy.

Korelace onemocnění věnčitých tepen se zánětlivou odpovědí

Shromáždily se důkazy poukazující na to, že onemocnění věnčitých tepen a příbuzné cévní choroby se mohou zahajovat jako odpověď na určitou formu poškození arteriálního endothelu. Poškození může být jemné nebo může zahrnovat zřejmé obnažení buněk endothelu. Ložisková místa poškození vedou ke zvýšené propustnosti pro složky krevní plasmy a umožňují adhesi krevních destiček a monocytů na pojivové tkáně endothelu nebo subendothelu. Zánětlivé faktory uvolňované z aktivovaných destiček či monocytů mohou poté způsobovat migraci buněk hladkého svalstva z medie do intimy s následnou proliferací těchto buněk. Syntéza složek extracelulární matrice buňkami hladkého svalstva vede k nahromadění kolagenu, elastických vláken a proteoglykanů. Monocyty též vstupují do intimy, přeměňují se na makrofagy, hromadí lipidy a přispívají k rozvoji poškození. Po krátkých či krátkodobých případech poškození následuje regenerace buněk endothelu, obnova funkce endothelu a zhojení poškození. Avšak abnormální zánětlivá příhoda může vést k rozvoji ateromatického plátu.

Epidemiologické studie po řadu let ukazují, že genetické složení jednotlivce je významným rizikovým faktorem pro rozvoj onemocnění věnčitých tepen. Rodinná anamnéza srdečního onemocnění se spojuje se zvýšeným individuálním rizikem rozvoje onemocnění věnčitých tepen. Metabolismus lipidů a cholesterolu se historicky uvažuje jako primární genetický vliv na onemocnění věnčitých tepen. Například nedostatek buněčných receptorů pro lipidy o nízké hustotě (LDL) , jako při familiární hypercholesterolemii, se spojuje s vysokými hladinami plasmatických LDL a předčasným rozvojem aterosklerosy [Brown a Goldstein, Sci., 191, 150-154 (1976)].

Zánět se nyní považuje za důležitou složku patogenního procesu aterosklerosy [Munro, Lab. Invest., 58., 249-261 (1988), Badimon, a kol., Circulation 87, 3-16 (1993),

Luizo a kol., 331, 417-424 (1994), Alexander, N.E.J.M.,

331. 468-469 (1994)].

Poškození buněk endothelu, který tvoří výstelku cév, vede k nahromadění zánětlivých cytokinů včetně IL-1, TNF oía uvolňování prostanoidů a růstových faktorů, jako je prostagladin I₂ (PGI₂), růstový faktor odvozený od destiček (PDGF), basický fibroblastový růstový faktor (bFGF) a faktor stimulace granulocytů-monocytů (GM-CSF). Tyto faktory vedou k nahromadění a regulaci zánětlivých buněk, jako jsou monocyty, které se hromadí v cévních stěnách. Monocyty potom uvolňují další zánětlivé mediátory včetně IL1, TNF, prostagladinu E₂ (PGE₂), bFGF, a transformačních růstových faktorů oC a β (TGFoč , TGF β) . Všechny tyto zánětlivé mediátory mobilizují další zánětlivé buňky k poškozené oblasti, regulují chování buněk endothelu a buněk hladkého svalstva a vedou k hromadění ateromatických plátů.

V aterosklerotických lezích nebo v endothelu poškozených věnčitých tepen bylo identifikováno několik zánětlivých produktů včetně IL-Ιβ [Galea a kol., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16, 1000-1006 (1996)]. Sérové • · · · · koncentrace IL-lS jsou také zvýšené u nemocných s koronárním onemocněním [Hasdai a kol. Heart, 76, 24-28 (1996)]. I když se historicky uvažuje, že přítomnost zánětlivých faktorů je odpovědná za poškození nebo za aktivaci monocytů, je též možné, že příčinou onemocnění věnčitých tepen nebo vytvoření zvýšené citlivosti na toto onemocnění může být abnormální zánětlivá odpověď. Proto cytokiny IL-1 a TNF, které se účastní této zánětlivé odpovědi, mohou částečně určovat riziko onemocnění věnčitých tepen u dané osoby.

Genetika shluku genů IL-1

Shluk genů IL-1 je na dlouhém raménku chromozomu 2 (2ql3) a obsahuje nejméně geny pro IL-lc< (IL-1A) , IL-lS (IL-1B) a antagonisty receptorů IL-1 (IL-1RN) v oblasti 430 Kb [Nicklin a kol., Genomics, 19, 382-384 (1994)] . Molekuly agonistů, IL-loč a IL-lE vykazují vysokou protizánětlivou účinnost a jsou na čele mnoha zánětlivých kaskád. Jejich působení, často indukcí ostatních cytokinů, jako jsou IL-6 a IL-8, vede k aktivaci a mobilizaci leukocytů do poškozené tkáně, k místní produkci vasoaktivních faktorů, k horečnaté odpovědi v mozku a k odpovědi akutní fáze v játrech. Všechny tři molekuly IL-1 se váží na receptory typu I a typu II IL-1, avšak pouze receptor typu I přenáší signál do vnitřního prostředí buňky. Oproti tomu receptor typu II je odstíněn buněčnou membránou a působí jako provokující receptor. Jak antagonista receptorů tak receptor typu II tedy působí protizánětlivě.

Nesprávná tvorba IL-1 hraje ústřední úlohu v patologii mnoha autoimunitních a zánětlivých onemocnění včetně ·« «« ·· · · • « * · » · · i «4 · · · · ·

revmatické artritidy, zánětlivých střevních poruch, psoriasy apod. Navíc existují stabilní interindividuální rozdíly ve tvorbě IL-1 a některé z těchto odchylek lze přisoudit genetickým rozdílnostem v místech genu IL-1. Proto jsou geny IL-1 rozumnými kandidáty pro stanovení části genetické náchylnosti k zánětlivým onemocněním, z nichž mnohé mají vícefaktorovou etiologii s polygenní složkou. Skutečně rostou důkazy o tom, že některé alely genu IL-1 jsou v těchto onemocněních nadměrně zastoupeny.

Genetická diagnosa

Tradiční způsob diagnosy dědičných onemocnění závisí buď na stanovení abnormálních genových produktů (např. srpkovitost) nebo na abnormálním fenotypu (například mentální retardace). Tyto metody mají omezené použití pro dědičná onemocnění s pozdním nástupem a nemají žádné snadno určitelné fenotypy, jako je tomu v případě Alzheimerovy choroby. Rozvoj genetického testování nyní umožňuje identifikaci genových mutací, které indikují sklon k rozvoji onemocnění, dokonce i když je nemoc polygenního původu. Počet onemocnění, která lze diagnostikovat molekulárními biologickými způsoby, stále roste s rostoucím poznáním genetické základny vícefaktorových poruch (viz například US Patent č. 4 582 788, 4 666 828, 4 801 531, 5 110 920, 5 268 267).

Genetické testování, (též zvané genetický screening, stanovení genotypu či molekulární diagnostika), se může široce definovat jako testování nukleové kyseliny pacienta s analytickou schopností stanovit, zda pacient vykazuje mutace (nebo alely či polymorfismus), které buď způsobují chorobný stav nebo jsou spřaženy s mutacemi způsobujícími chorobný stav. Toto spřažení se týká jevů, při kterých sekvence DNA, které jsou v genomu blízko sebe, mají snahu být společně zděděny. Dvě sekvence mohou být též spřažený následkem určité selektivní výhody společné dědičnosti.

Časná detekce predispozice ke genetickým onemocněním představuje nej lepší příležitost pro lékařský zásah. Časná diagnosa může zlepšit prognózu pro pacienta s dohledem a časným zásahem dříve, než se objeví klinicky detekovatelná porucha. V případech, kdy se pacienti s podobnými příznaky léčí s různým úspěchem, může vyspělé genetické testování odlišit jednotlivé pacienty s jemnými či neděkovatelnými rozdíly a to může vést ke vhodnějším individuálním způsobům léčby. Je dokonce možné použití časné intervence včetně metod tzv. genové terapie.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsob časné detekce náchylnosti k rozvoji onemocnění věnčitých tepen a příbuzných cévních poruch. Rovněž poskytuje soupravy pro časnou detekci této náchylnosti a způsoby identifikace přídavných alel spojených s tímto onemocnění.

Obecně způsob předpovědi zvýšeného rizika onemocnění věnčitých cév zahrnuje detekci přítomnosti alespoň jedné kopie alely zvolené ze skupiny obsahující alelu 2 IL-1RN a alelu 2 IL-1B. Přítomnost jedné či více z těchto alel ukazuje na zvýšené riziko onemocnění věnčitých arterií. Detekci alel lze provést přímo analýzou DNA z oblasti IL-1 nebo nepřímo analýzou RAN či proteinových produktů

DNA.

• · ··· · » · · _tt« a* «· ♦··· ·♦ ·»

V dalším ztělesnění lze vynález popsat následujícím způsobem: isolace nukleové kyseliny z pacienta, identifikace jedné či více alel přítomných ve shluku genu IL-1 a srovnávání jedné či více alel s kontrolním vzorkem. Kontrolní vzorek obsahuje alespoň jednu alelu ze shluku genů IL-1, o kterých je známo, že souvisí s onemocněním věnčitých tepen. V jednom preferovaném ztělesnění obsahuje kontrolní vzorek alelu 2 IL-RN a/nebo alelu 2 IL-1B (-511) . Podobnost identifikovaných alel od pacienta s kontrolním vzorkem ukazuje na náchylnost pacienta k onemocnění věnčitých tepen.

Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je souprava pro detekci alely, která může předpovídat onemocnění věnčitých tepen. Tato souprava obecně obsahuje alespoň jeden oligonukleotid komplementární k sekvenci DNA ve skupině genů IL-1 a kontrolní vzorek. Kontrolní vzorek je alela, o které je známo, že souvisí s onemocněním věnčitých tepen, jak se uvádí výše. Tato souprava může též obsahovat pomůcky pro odběr DNA, prostředky pro čištění DNA a činidla PCR. Dále může oligonukleotid obsahovat detekovatelnou značku.

Další ztělesnění tohoto vynálezu poskytuje způsob identifikace alel souvisejících s onemocněním věnčitých tepen. Tento způsob obsahuje shromáždění první kohorty pacientů bez onemocnění věnčitých tepen, shromáždění kohorty pacientů s onemocněním věnčitých tepen (jak se stanoví angiografickým průkazem) a identifikaci alel IL-1 přítomných v první a druhé kohortě. Ta alela, která je nadměrně zastoupená ve druhé kohortě ve srovnání s první kohortou, se identifikuje jako alela související s onemocněním věnčitých tepen.

Další ztělesnění a výhody tohoto vynálezu se částečně popisují v následujícím textu a budou z něj zřejmé nebo je lze poznat z praktického provádění tohoto vynálezu.

Následuje podrobný popis preferovaných ztělesnění.

Vynález, jak se zde ztělesňuje a široce popisuje, se zaměřuje na způsob předpovídání náchylnosti pacienta k rozvoji onemocnění věnčitých tepen a na diagnostické soupravy, oligonukleotidové sondy a další prostředky, které lze použít při těchto způsobech. Tento vynález se též zaměřuje na způsob identifikace genetických markérů spojených s onemocněním věnčitých tepen.

Pojem onemocnění věnčitých tepen, jak se zde používá, se vztahuje k poruchám a stavům, o kterých ti, kteří mají zkušenost v oboru, obecně předpokládají, že se vztahují k ukládání ateromu ve velkých a středních tepnách zásobujících srdce. Proto onemocnění věnčitých tepen znamená klinické syndromy (včetně, avšak bez omezení na tyto případy, angíny pectoris, infarktu myokardu, nestabilní angíny pectoris a náhlého ischemického úmrtí), které se zakládají na patologii ateromu věnčitých tepen.

Pojem markér se používá pro popis oblastí DNA, které jsou u jednotlivců různé. Například markér VNTR pro gen IL-1RN se popisuje zde. Různé varianty sekvencí pro daný markér se nazývají alely nebo polymorfismy. Markér VNTR má alespoň pět různých.alel, z nichž tři jsou vzácné. Různé alely by mohly mít jednu změnu báze včetně substituce, vložení či vypuštění nebo by mohly mít změnu ovlivňující více bází včetně substitucí, vložení, opakování, inverzí a jejich kombinací. Alely se mohou v DNA jednotlivce přímo

detekovat nebo se mohou detekovat nepřímo v RNA nebo proteinu.

Způsob detekce alel, jak se zde užívá, se různě popisuje jako stanovení genotypu, stanovení či identifikace alely či polymorfismu nebo podobně.

Detekovaná alela může skutečně být mutací způsobující onemocnění nebo mutací, která souvisí s mutací způsobující onemocnění.

Termín shluk genů IL-1 nebo míst IL-1, jak se zde používá, zahrnuje veškerou nukleovou kyselinu při oblasti nebo blízko oblasti 2ql3 chromosomu 2 včetně alespoň genů IL-1A, IL-ΙΒ a IL-1 RN a všech dalších spřažených sekvencí. Pojem alela 2 IL-1RN (VNTR) popisuje alelu markéru VNTR genu IL-1RN. tato alela se vyznačuje tím, že má dvě kopie opakování VNTR a poskytuje produkt 240 bp při amplifikaci zde popisovanými primery.

Pojem alela IL-1B (-511) znamená alelu 2 markeru-511 genu IL-ΙΒ. Tato alela obsahuje místo Bsu 361 a poskytuje fragmenty 190 a 114 bp při amplifikaci zde popisovanými primery a zpracování Bsu 361.

Náchylností, predispozicí či vnímavostí vůči onemocnění se míní, že se objevily určité alely, které souvisí s daným chorobným stavem. Ty jsou proto nadměrně zastoupeny u jednotlivců s onemocněním ve srovnáním se zdravými jednotlivci. Proto přítomnost těchto alel indikuje riziko onemocnění určitého jednotlivce.

Tento vynález se zaměřuje na způsob předpovídání náchylnosti či predispozice pacienta k onemocnění í

věnčitých tepen určením genotypu pacientovy DNA v místech IL-1. Genotyp pacienta se srovnává s kontrolním vzorkem, který obsahuje jednu či více variant alel IL-1, o kterých je známo, že korelují nebo souvisí s daným chorobným stavem. Kontrolní vzorky mohou obsahovat alelu 2 IL-1RN a/nebo alelu 2 IL-1B a spřažené alely nebo další alely identifikované podle způsobů, které se zde popisují. Alely v kontrolním vzorku mohou být ve formě genomových či klonovaných sekvencí DNA ze shluku genů IL-1 nebo mohou být na konci produktů vhodných pro použitý formát rozboru. Například, jestliže rozbor zahrnuje monoklonální detekci specifických epitopů, mohou kontrolní vzorky obsahovat epitopy či proteiny odpovídající popisovaným alelám.

Způsoby stanovení přítomnosti daných markérů mohou být způsoby pro nukleové kyseliny založené na hybridizaci, velikosti či sekvenci, jako je polymorfismus s restrikcí délky fragmentu (RFLP) nebo sekvenování nukleových kyselin.

Tyto způsoby mohou též zahrnovat krok amplifikace nukleové kyseliny před analýzou. Amplifikační způsoby jsou známé pro toho, kdo má zkušenost v oboru a zahrnují klonování, polymerasovou řetězovou reakci (PCR), polymerasovou řetězovou reakci specifických alel (PASA), polymerasovou řetězovou ligaci, hnízdovou polymerasovou reakci apod. Amplifikační produkty se mohou analyzovat různými způsoby, včetně analýzy velikosti, restrikční digesce s následnou, analýzou velikosti, detekce specifického označeného oligonukleotidového primeru v reakčních produktech, hybridizace oligonukleotidu specifického pro alelu (ASO) sekvenování apod.

• 9 • · • · ·

Alternativně se mohou způsoby detekce zakládat na proteinu, pokud příslušná alela poskytuje protein s některým pozměněním aminokyseliny. Například epitopy specifické pro variantu aminokyseliny se mohou detekovat monoklonálními protilátkami.

Tento vynález se též zaměřuje na způsoby identifikace dalších alel IL-1 spojených s náchylností k rozvoji onemocnění věnčitých tepen. Alely IL-1 přítomné u osoby s onemocněním se srovnávají s alelami u osoby bez onemocnění pro zjištění, zda je některá alela u osoby s onemocněním nadměrně zastoupena. Alely mohou být existující známé alely IL-1 nebo lze identifikovat další markéry kterýmkoliv ze způsobů známých v oboru včetně sekvenování DNA v oblasti blízké těmto genům.

Další ztělesnění tohoto vynálezu se zaměřuje na diagnostické soupravy pro detekci náchylnosti pacienta k onemocnění věnčitých tepen. Tyto soupravy se mohou používat presymptomaticky nebo prenatálně. Tato diagnostická souprava může obsahovat jeden či více oligonukleotidů schopných hybridizace s nukleovou kyselinou ze shluku genů IL-1. Hodnota formátu v rozboru se může užít pro určení genotypu s použitím poskytnutých oligonukleotidů. Nejběžnější formáty zahrnují vazbu nukleových kyselin, například na filtry, kuličky, apod. Použité způsoby zahrnují bodové skvrny, skvrny RNA, skvrny DNA, PCR, FRLP apod.

Oligonukleotidy mohou být různé přírodní a syntetické směsi, jako jsou například syntetické oligonukleotidy, restrikční fragmenty, cDNA, syntetické PNA (proteinové nukleové kyseliny apod.). Tento rozbor může též používat

značené oligonukleotidy umožňující identifikaci. Příklady použitelných značek zahrnují radioaktivní značky, enzymy, fluorescenční sloučeniny, streptavidin, avidin, biotin, magnetické zbytky, zbytky schopné vázat kovy, zbytky antigenů či protilátek apod.

Tato souprava může též zahrnovat prostředky pro odběr DNA jako je AmpliCard™ (University of Sheffield,

Sheffield, England S10 2JF), které též popisuje Tarlow J.W. a kol. Journal of Investigative Dermatology, 103,

387 až 389 (1994), a tato práce se zde zahrnuje formou odkazu. Další vhodné prostředky pro odběr vzorku DNA zahrnují prostředky pro purifikaci DNA a činidla PCR, jako jsou reakční pufry 10X , termostabilní polymerasa, a/nebo dNTP.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují ztělesnění tohoto vynálezu, avšak neměly by se považovat za omezení jeho obsahu.

Příklad 1

Markéry pro onemocnění jedné věnčité tepny

Záměrem této studie je stanovit, zda nemocní s časnou formou ateroklerosy věnčité tepny, to jest s onemocněním jedné věnčité tepny, mají vyšší pravděpodobnost výskytu specifických alel v následujících genech: IL-1A (markér -889), IL-1B (markéry -511 a +3953) a IL-1RN (markér VNTR) nebo TNF (markér -308) .

Onemocnění více cév obecně představuje pozdější stádium choroby, která může zahrnovat řadu faktorů, jež by mohly komplikovat výklad údajů. Proto nemocné, kteří si stěžují na bolest na hrudníku, hodnotí kardiolog a ti, kteří mají angiografický průkaz významné aterosklerosy ve více než jedné věnčité tepně, se vylučují z rozboru.

Kohorty pacientů

Angiografie se provede konvenčními způsoby z femorální či brachiální arterie. Z 85 vyšetřovaných pacientů nemá při angiografii žádný nepravidelnosti průchodu a lze je charakterizovat jako kontroly s angiograficky normálními věnčitými arteriemi. Pacient se klasifikuje jako nemocný s onemocněním jedné cévy, jestliže jedna ze tří epikardiálních věnčitých cév s epikardiálním zúžením vykazuje 50% snížení průměru průchodu při vizuálním hodnocení. 58 nemocných má onemocnění jedné věnčité cévy. Nemocní s onemocněním více cév se vylučují. Kontrolní skupina a skupina s onemocněním jedné cévy má srovnatelné věkové průměry - 57,6*10,4 let a 56,4^-9,4 let. Poměr mužů k ženám v kontrolní skupině je 1:1,7 a ve skupině nemocných 2,6:1.

Obecné způsoby

Reakce a manipulace včetně způsobů zaměřených na nukleové kyseliny se provádí, pokud není uvedeno jinak, podle obecného popisu v Sambrook, a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Polymerasová řetězová reakce (PCR) se obecně provede podle popisu v PCR Protocols:

A Guide to Methods and Applications, Academie Press, San • · · · · ·

9 9 · 9 9 9 9 • « · · · · ·· 99 · · · · · ·

Diego, CA (1990) . Způsob určení genotypu se provede podle obecného popisu v US patentech č.4 666 828, 4 683 202,

801 531, 5 192 659 a 5 272 057 a McDowell, a kol., Arthritis & Rheumatism, 38., 221-228 (1995) .

Příprava DNA

DNA se extrahuje z celkové krve modifikací vysolovacího způsobu (Nukleon II™, Scotlab, UK) .

Určení genotypu IL-1RN

Alely spojené s genem IL-1RN popisuje Tarlow, a kol., Human Genetics, 91, 403-404 (1993) . Enzymy použité v PCR jsou od Promega (UK) a termocyklační prostředky jsou buď od MJ Research DNA Engine nebo Biometra. Na syntetizačním zařízení ABI DNA se obdrží následující primery:

5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (číslo identifikace sekvence 1)

5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (číslo identifikace sekvence 2)

Amplifikace PCR se provede při konečné koncentraci hořčíku 1,75 mM a cyklizace se provede způsobem jeden cyklus při 96 °C po dobu 1 min, 30 cyklů [ při 94 °C po dobu 1 min, 60 °C po dobu 1 min a 70 °C po dobu 1 min], a 1 cyklus při 70 °C po dobu 2 min. Po PCR se různé alely podrobí elektroforese na 2% agarosovém gelu obarveném ethidiumbromidem a visualizují a identifikují pod ultrafialovým světlem. Při každém pokusu se použijí negativní kontroly bez DNA.

Intron 2 genu IL-1RN obsahuje oblast variabilního • 9 počtu opakování tandemu (VNTR) poskytující až 5 následujících alel:

Alela 1 obsahuje čtyři opakování a vykazuje produkt PCR

412 bp,

99 99 « 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 « • 99 9· 9999

Alela	2	obsahuj e	dvě	opakování	a	vykazuje	produkt	PCR	240
bp,
Alela	3	obsahuj e	tři	opakování	a	vykazuje	produkt	PCR	326
bp,
Alela	4	obsahuj e	pět	opakování	a	vykazuje	produkt	PCR	498

bp a

Alela 5 obsahuje šest opakování a vykazuje produkt PCR 584 bp.

Určení genotypu IL-1B (-511)

Markér -511 IL-1B popisuje diGiovine, Hum. Molec. Genet., 1., 450 (1992) . Markér variace jedné báze (C/T) při bázi -511 I1-1B se identifikuje na základě místa alel na alele 1 (C) a místa Bsu361 na alele 2 (T). PCR se provede jedním cyklem při 95 °C po dobu 2 min, 35 cykly při [95 °C po dobu 1 min, 53 °C po dobu 1 min a 74 °C po dobu 1 min] a jedním cyklem při 74 °C po dobu 4 min. Analýza produktu PCR se provede digescí restrikčním enzymem Aval a Bsu361 při 37 °C po dobu 8 h s následující analýzou velikosti s 8% PAGE. Následující primery se připraví v syntetizačním zařízení ABI DNA [ Clark, a kol. Nucl. Acids. Res., 14, 7897-7914 (1986) [publikovaná oprava vyšla v Nucleic Acids Res., 15, 868 (1987)], GENBANK X04500]:

5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (-702/-682) (číslo identifikace sekvence 3)

5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (-417/-397) (číslo • · · · · · • · · · · · · · • · · · » · · • · · · · · · «· · · ·» ·· ·· identifikace sekvence 4)

Výsledky

Není žádný významný rozdíl mezi kontrolními osobami a nemocnými ve frekvenci různých alel v genech pro IL-1A ( markér -899), IL-1B (markér +3953)nebo TNo6 (markér -308). Avšak alela 2 markéru VNTR v genu IL-1RN je významně nadměrně zastoupená u nemocných s onemocněním jedné cévy (41 % oproti 22 % u kontrol). Zjišťuje se, že u jednotlivců's alespoň jednou kopií alely 2 je 2,44 krát vyšší pravděpodobnost onemocnění jedné věnčité arterie než u osob, které jsou negativní na alelu 2 ( poměr pravděpodobnosti 2,44, p=0,003, 95 % interval spolehlivosti = = 1,35 až 4,43) .

Navíc jednotlivci se dvěma kopiemi, to jest ti, kteří jsou homozygótní pro alelu 2 v IL-1RN, měli 5,36 krát vyšší pravděpodobnost onemocnění jedné věnčité cévy než nemocní vykazující negativitu pro alelu 2 (poměr pravděpodobnosti = 5,36, p=0,005, 95 % interval spolehlivosti = = 1,6 až 17,97) .

Přenášení jedné kopie alely 2 markéru -511 genu IL-1B se zvyšuje při onemocnění jedné věnčité cévy na 52 % oproti 38 % u kontrol. Zjišťuje se , že jednotlivci s alespoň jednou kopií alely 2 mají 1,74 krát vyšší pravděpodobnost onemocnění jedné cévy než nemocní vykazující negativitu pro alelu 2 (poměr pravděpodobnosti = 1,74, p=0,l, 95 % interval spolehlivosti = 0,86 až 3,52). Tento nález není zcela významný, avšak studie je omezená malým počtem.

·· »· • · · · • » · ·

Tyto nálezy ukazují, že alela 2 genu IL1-RN je markérem pro náchylnost k rozvoji aterosklerosy věnčitých arterií. Tato alela souvisí se zvýšeným rizikem onemocnění věnčitých tepen v poměru 2,4 až 5,4 v závislosti na tom, zda existuje jedna kopie (heterozygótní) nebo 2 kopie (homozygótní) alely související s onemocněním. Vliv této alely na riziko onemocnění věnčitých tepen ukazuje tabulka 1 ve vztahu k ostatním běžným rizikovým faktorům.

Navíc se objevuje, že alela pro gen IL-1B souvisí s onemocněním'jedné věnčité tepny. Tato alela souvisí se zvýšeným rizikem onemocnění věnčité tepny v poměru 1,74.

Tabulka 1

1- | Rizikový faktor	i i | Zvýšené riziko | | onemocnění věnčité| | tepny | I I
|Kouření (1 krabička /denně)	1 1 1 2,5 1
|Sedavý způsob života	1 1,9 1
|Závažná obezita (ženy)	1 3,3 1
|Hypertense	1 2,1 |
|Vysoká hladina cholesterolu	1 2,4 |
|(více než 240)	1 1
|alela 2 IL-1RN (VNTR)-heterozygótní	1 2,4 |
|alela 2 IL-1RN (VNTR)-homozygótní	1 5,4 |
|alela 2 IL-1B (-511) 1	| 1,74 až 1,92 | J_1

φφ »φ φ * φφ φφ • φφφφ · · · · « φ · ·

C » φ Φ · φ · « *

Φ· φφ φφφ*

Příklad 2

Markéry pro onemocnění více věnčitých tepen

Záměrem této studie je stanovit, zda pacienti s pozdnější či difusní formou aterosklerosy věnčitých arterií, to jest s onemocněním více věnčitých aterií, mají výší pravděpodobnost specifických alel v genech shluku genů IL-1 nebo TNFoC.

Kohorty pacientů

Kohorty pacientů se stanoví stejně jako v příkladu 1 kromě toho, že se nemocní klasifikují jako pacienti s onemocněním více cév, jestliže více než 1 epikardiální věnčitá céva trpí epikardiální stenosou způsobující více než 50% zmenšení průměru průchodu při visuálním hodnocení. Z vyšetřovaných pacientů se 86 klasifikuje jako kontroly mající angiograficky normální koronární arterie a 315 pacientů jako nemocní s onemocněním více věnčitých tepen. Kontroly a nemocní s onemocněním jedné cévy mají srovnatelné věkové průměry, 57,6 ±10,4 let a 60,8±l,13 let. Poměr mužů k ženám v kontrolní skupině je 1:1,7 a ve skupině nemocných 3,7:1.

Obecné způsoby

Reakce a způsoby jsou stejné jako v příkladu 1.

Výsledky

Není žádný významný rozdíl mezi kontrolními a nemocnými osobami ve výskytu různých alel v genech pro • · ♦ · · · ···· · · · ·

IL-1A (markér -889), IL-1B (markér +3953) a IL-1RN (markér VNTR). Avšak přenášení jedné kopie alely Bsu361 (alela 2) markéru -511 genu I1-1B se zvyšuje při onemocnění více cév na 54 % oproti 38 % u kontrol. Zjišťuje se, že jednotlivci s alespoň jednou kopií alely 2 markéru -511 mají 1,92 krát vyšší pravděpodobnost onemocnění více věnčitých tepen než osoby vykazující negativitu pro alelu 2 (poměr pravděpodobnosti + 1,92, p = 0,009, 95% interval spolehlivosti = 1,17 až 3,16). Neobjevuje se žádný dávkový efekt alespoň v této populaci pro markér -511.

Souhrnem se zjišťuje, že alela pro gen IL-1B souvisí s onemocněním více koronárních arterií. Tato alela souvisí úzce se zvýšením rizika onemocnění koronární tepny násobkem 1,92.

Onemocnění jedné a více věnčitých tepen je tedy spojené s různými geny shluku genů IL-1. To může vznikat jako skutečné biologické rozlišení, kde IL-1 R.A. moduluje účinky IL-lS takovým způsobem, že poskytuje fenotyp jedné cévy. Alternativně je možné, že oba geny ve skutečnosti souvisí s onemocněním věnčité tepny jako celkem a že souvislosti, které se zde pozorují, vyplývají ze způsobu, kterým tato konkrétní populace vykazuje onemocnění věnčitých tepen. Při obou výkladech se zjišťuje silná souvislost mezi biologií IL-1 a onemocněním věnčitých tepen.

Další ztělesnění a použití tohoto vynálezu jsou zřejmá tomu, kdo má zkušenost v oboru, na základě úvahy, specifikace a praxe zde uveřejněného vynálezu. Veškeré zde citované odkazy použité pro jakýkoliv účel se zde specificky zahrnují formou odkazu. Specifikace a příklady «« ·« ·* »· ·· je třeba uvažovat pouze jako příklady při skutečném obsahu a duchu vynálezu uvedeném v následujících nárocích.

Claims (25)

1. Způsob stanovení predispozice pacienta k onemocnění věnčitých tepen, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a. detekci první alely z míst IL-1 pacienta a

b. srovnání první alely s druhou alelou,

1. kde je známo, že druhá alela souvisí s onemocněním věnčité tepny a ii. kde podobnost první alely s druhou alelou ukazuje na predispozici k onemocnění věnčitých tepen.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se druhá alela zvolí ze skupiny obsahující alelu 2 IL-1RN (VNTR) a alelu 2 IL-1B (-511) .

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že detekce první alely zahrnuje analýzu RFLP nukleové kyseliny.

4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že detekce první alely zahrnuje amplifikaci PCR nukleové kyseliny.

5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že detekce první alely zahrnuje stanovení epitopu proteinu.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že amplifikace PCR se provádí s primerem PCR • · ··· ·· · ··· • · · · · · · * · ·· ··· · · · ··· • · · ·· · ♦ · · · · · *

- 24 zvoleným ze skupiny zahrnující:

5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (číslo identifikace sekvence 1),

5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (číslo identifikace sekvence 2),

5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (číslo identifikace sekvence 3) a

5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (číslo identifikace sekvence 4).

7. Způsob stanovení predispozice pacienta k onemocnění věnčitých tepen, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

a. isolaci DNA od pacienta,

b. analýzu této DNA pro stanovení první alely a

c. srovnání této první alely s druhou alelou, která je schopná použití pro předpověď onemocnění věnčitých arterii, kde podobnost této první alely s touto druhou alelou ukazuje na predispozici k onemocnění věnčitých tepen.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že druhá alela je z míst IL-1.

9. Způsob podle nároku 8,vyznačuj ící se tím, že druhá alela je alela 2 IL-1RN (VNTR) a alela 2 IL-1B (-511) .

10. Způsob podle nároku 8, vyznačuj ící se t í m, že se analýza provádí způsobem zahrnujícím:

a. amplifikací DNA v polymerasové řetězové reakci s poskytnutím produktu amplifikace a

b. frakcionaci podle velikosti produktu amplifikace.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící setím, že se polymerasová řetězová reakce provádí s jedním či více oligonukleotidy zvolenými ze skupiny obsahující:

5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (číslo identifikace sekvence 1) ,

5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (číslo identifikace sekvence 2),

5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (číslo identifikace sekvence 3) a

5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (číslo identifikace sekvence 4).

12. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m, že se alespoň jeden z oligonukleotidů značí tak, aby se mohl detekovat.

13. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m, že druhá alela je alela 2 IL-1RN (VNTR) nebo alela 2 IL-1B (-511).

14. Souprava umožňující předpovídání onemocnění věnčitých tepen, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

« · · · · · · ·«· · · ·· · · ·· · r · · ·· · ···· • * · ··· ···· • · » ·· · · «·«· « · ··

a. alespoň jeden oligonukleotid komplementární k sekvenci DNA ve shluku genů IL-1 a

b. kontrolní vzorek, ve kterém je alespoň o jedné alel známo, že souvisí s onemocněním věnčitých arterií.

15. Souprava podle nároku 14, d á 1 e se vyznačující tím, že obsahuje prostředky pro odběr vzorku DNA, prostředky pro purifikaci DNA a reakční pufr PCR.

16. Souprava podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že se alespoň jeden oligonukleotid volí ze skupiny zahrnuj ící:

5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (číslo identifikace sekvence 1),

5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (číslo identifikace sekvence 2),

5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (číslo identifikace sekvence 3) a

5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (číslo identifikace sekvence 4).

17. Souprava podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že alespoň jeden oligonukleotid dále obsahuje značku, kterou lze detekovat.

18. Souprava podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že alespoň jedna alela, o které je známo, že souvisí s onemocněním koronárních arterií, je alela 2 IL-1RN (VNTR) nebo alela 2 IL-1B (-511).

• ·

19. Souprava podle nároku 18, vyznačuj ící se t í m, še dále obsahuje prostředky pro odběr vzorků DNA, prostředky pro purifikaci DNA a reakční pufr PCR.

20. Způsob stanovení náchylnosti pacienta k onemocnění věnčitých arterií, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

a. určení typu nukleová kyseliny pacienta v místech IL-1 pro stanovení genotypu a

b. srovnání tohoto genotypu s kontrolním vzorkem,

i. kde tento kontrolní vzorek obsahuje alelu IL-1 související s onemocněním věnčitých arterií a ii. kde podobnost tohoto genotypu s tímto kontrolním vzorkem ukazuje na zvýšenou náchylnost k onemocnění věnčitých arterií.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se t í m, že touto alelou IL-1 související s onemocněním věnčitých tepen je alela 2 IL-1RN (VNTR) nebo alela 2 IL-1B (-511).

22. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se t í m, že toto onemocnění věnčitých arterií je onemocněním jedné věnčité arterie a tato alela IL-1 je alela 2 IL-1RN (VNTR).

23. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se t í m, že toto onemocnění věnčitých tepen je onemocněním více věnčitých tepen a touto alelou IL-1 je alela 2 IL-1B (-511).

• «* ·« ·» · · • · * β · · · · · · · ··· ·· η ···

24. Způsob umožňující předpovídání zvýšené náchylnosti k onemocnění věnčitých tepen, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci přítomnosti alespoň jedné kopie alely zvolené ze skupiny zahrnující alelu 2 IL-1RN a alelu 2 IL-1B, kde detekce této alely ukazuje na zvýšenou náchylnost k onemocnění věnčitých tepen.

25. Způsob identifikace alel souvisejících s onemocněním věnčitých tepen, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a. shromáždění první kohorty pacientů bez onemocnění věnčitých tepen,

b. shromáždění druhé kohorty pacientů s onemocněním věnčitých tepen,

c. detekci alely shluku genů IL-1 z první a druhé kohorty,

d. identifikaci této alely, která je nadměrně zastoupena ve druhé kohortě ve srování s první kohortou s podmínkou, že tato alela souvisí s onemocněním věnčitých tepen.