PT983381E - Previsão de doença de artéria coronária - Google Patents

Description

Descrição "Previsão de doença de artéria coronária" Antecedentes da Invenção 1. Cm#® da Invenção

Esta invenção diz respeito a um ensaio pré-sintomático para identificação precoce de indivíduos com maior tendência para desenvolverem uma doença de artéria coronaria e desordens vasculares relacionadas. 0 documento descreve sondas específicas para genes, para proteínas, e para epitopos e ensaios de genética molecular e bioquímicos. 2. Descrição dos amt da

Doença de artéria coronária: aterosclerose arteriosclerose) é o termo utilizado para descrever o estreitamento luminal progressivo e o endurecimento das artérias. Este processo de doença pode ocorrer em qualquer artéria sistémica no corpo humano. Por exemplo, a arteriosclerose nas artérias que irrigam o cérebro pode resultar num ataque. Pode ocorrer gangrena, quando as artérias periféricas estão bloqueadas, e ocorre a doença de artéria quando as artérias que fornecem oxigénio e nutrientes ao miocárdio são afectadas. A doença de artéria coronária é uma doença multifactorial que resulta na deposição de placa ateromatosa e estreitamento luminal progressivo das artérias que irrigam o músculo do coração. Esta placa consiste mxmã mistura de células inflamatórias e imunitárias, tecido fibroso, e material gordo, tais com lípidos de baixa densidade (LDL- do inglês Low Density Lípíds) e suas modificações, e α-lipoproteína. 0 estreitamento luminal ou bloqueamento resulta na capacidade reduzida de fornecer oxigénio e nutrientes ao músculo do coração que produz enfarte do miocárdio, angina, angina Instável e morte isquémica repentina, assim como falha do coração. Apesar da oclusão progredir geralmente lentamente, o fornecimento de sangue pode ser interrompido repentinamente, quando uma porção de placa arterial formada se quebra e se aloja nalgum sitio da artéria bloqueando-a temporariamente, ou mais geralmente, quando ocorre a trombose no lumen arterial. Dependendo do volume do músculo distai em relação ao bloqueio durante um tal ataque, pode morrer uma parte do tecido do miocárdio, enfraquecendo o músculo do coração e conduzindo frequentemente a morte do indivíduo.

As causas e mecanismos de formação da placa ateromatosa não são compreendidas completamente, apesar de existirem muitas teorias. Uma teoria da patogenese da arteriosclerose envolve as fases seguintes: (l)disfunção celular do endotélio e/ ou lesão, (2) recrutamento de monócitos e formação de macrófagos, (3) deposição lípidica e modificação (4) proliferação das células musculares lisas vasculares, e (5) síntese de matriz extracelular. De acordo com esta teoria, a iniciação da atercsclerose é potencialmente devida a uma forma de lesão, derivada possivelmente de stress mecânico, ou de suress químico. A forma como o corpo responde a esta Lesão define se a lesão se deteriora numa lesão arterosclerótica, e qual a rapidez. Isto por sua vez pode resultar em estreitamento arterial lordeai e danificação do tecido do que depende do fluxo de oxigénio e de nutrientes.

Atiúcês dás melhorias recentes nos cuidados hás::Ççix::d 11 is:terem melhorado a esperança de vide de doentes da doença de artéria coronária, isto resultou basicamente de melhorias na redução dos níveis lipidicos, limitação dos danos após terem ocorrido, restabelecimento cirúrgico do fornecimento de sangue, a supressão de ritmos anormais cardíacos e prevenção de novos enfartes. Contudo, ocorreram poucas melhorras na prevenção precoce da doença, através de diagnóstico precoce.

Um problema chave no tratamento da doenya de artéria coronária é um diagnóstico adequado. Frequentemente o primeiro sinal de doença é a morte repentina devido a isquémia do miocárdio ou enfarte do miocârdio. Aproximadamente metade de todos os indivíduos que morrem de doença de artéria coronária morrem repentinamente. Além disso, 40-60% dos doentes que são eventualmente diagnosticados como sofrendo de doença de artéria coronária, o enfarte do miocárdio é a primeira apresentação da doença. Infelizmente, aproximadamente 40% dos acontecimentos iniciais passam desapercebidos ao doente. Por várias razões, a percepção de sintomas pelo doente não correlaciona bem com a carga total da doença de artéria coronária (Anderson & Kin, Am. Heart J., 123(5): 1312-23 (1992)).

Enquanto as causas da arteriosclerose permanecem desconhecidas, o próprio diagnóstico de susceptibilidade pode fornecer aos doentes tempo suficiente para reduzir o seu risco de desenvolver doença de artéria coronária. Um método para reduzir o risco de doença de artéria coronária é através de alteração do estilo de vida do doente, tal coxo parar de fumar, exercício, perda de peso e redução de stress. Outros métodos incluem lâHMCêtitKúé para tratar hipertensão, hipercolesterolémia, e diabetes, assim come â ulilizâi^âú de aspirina. Finalmente, a terapia genética promete tratar aqueles roup;;;; genéticos raros ípp resultam numa história familiar de doença cardiovascular (por ex., metabolismo alterado da apolipoproteina). A capacidade em identificar indivíduos de alto risco iria permitir aos médicos focarem-se em medidas preventivas naqueles indivíduos que podem ganhar o maior benefício, e forneceriam incentivos mais fortes para os que estão em risco cumprirem tais estratégias.

Correlação da doença de artéria coronária com resposta inflamatória: foi acumulada evidência para mostrar que a doença de artéria coronária e desordens vasculares relacionadas podem ser iniciadas como uma resposta a alguma forma de lesão no endotélio arterial. A lesão pode ser subtil, ou pode envolver denudação celular endotelial completa. Locais focais de lesão conduzem a uma permeabilidade acrescida a constituintes do plasma e permitem as plaquetas sanguíneas e mcnócitos aderirem ao tecido conjuntivo endotelial e subendotelial. Factores inflamatórios libertados a partir das plaquetas activadas ou monócitos provocam então migração de células musculares lisas para a íntima seguindo-se proliferação destas células. Síntese de componentes matriciais extracelulares por células musculares lisas conduz I acumulação de colagénio, fibras elásticas e proteoglicanos. Os monócitos também entram na intima transformam-se em macrófagos, acumulam lípidos e contribuem para a sú-oIhoIí· da lesão. Acontecimentos curtos ou de curto tempo de vida em que ocorrem lesões são seguidos de regeneração de células endoteliais, restauração da função endotelial e cura da lesão. Contudo um acontecimento inflamatório anormal pode resultar no desenvolvimento de uma placa ateromatosa. Dúruírvw muitos anos estudos epidemiológicos itòicíiráí® que uma composição genética Individual é um faetor de risco significativo para o desenvolvimento de doença de artéria coronária. Uma história familiar de doença do coração encontra-se associada a \;t; risco mais elevado de desenvolvimento de doença de artéria coronária. 0 metabolismo dos lípidos e do colesterol foram considerados historicamente como a influência genética primária na doença de artéria coronária. Por exemplo, deficiência nos receptores da célula para lípidos de baixa densidade (LDL), tal como na hipercolesterolémia familiar encontra-se associada com níveis elevados de plasma LCL e desenvolvimento prematuro de arteriosclerose (Brown & Goldstein, Sei., 191 (4223):150-4 (1976)) . A inflamação é agora geralmente considerada como um componente importante do processo patogénico da arteriosclerose (Nunro, Lab Invest., 58:249-261 (1988); Badimon, et al., Circulation, 87:3-16 (1993); Liuzzo, et al., N E. J. M., 331(7): 417-24 (1994); Alexander, N.E.J.M., 331(7):468-9 (1994)). Danos nas células endoteliais que limitam os vasos conduzem a uma acumulação de citocinas inflamatórias, incluindo IL-1, TNFa, e a libertação de prostanoides e factores de crescimento, tais como prostaglandina I2 (PGI2) , factor de crescimento derivado das plaquetas (FDGF), factor de crescimento de fibrobiasto básico (bFGF), e factor de estimulação de crescimento granulócitos - monócitos (GM-CSF). Estes factores conduzem a acumulação e regulação de células inflamatórias, tais como monócitos, que se acumulam dentro das paredes dos vasos sanguíneos. Estes monócitos libertam então mediadores inflamatórios adicionais, incluindo IL-1, TNF, prostaglandina E;;, Lcíldíf., bFGF, e factores de crescimento transformadores a e P (TGa, Tffflu Todos estes mediadores inflamatórios recrutam mais células inflamatórias para a inova danificada, regulam o das cdduioa endoteliais e muscuiares lisas e conduzem a acumulação de placas ateronatosas. Vários produtos inflamatórios, incluindo IL-Ιβ foram identificados nas lesões .w rvsclerft Lear, ou no endotélio de artérias coronárias doentes (Galea, et al., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16:1000-6 (1996)). Também concentrações de soro de IL-Ιβ são elevadas em doentes com doença coronária (Hasdai, et al., Heart, 76:24-8 (1996)). Apesar de se considerar historicamente que a presença de agentes inflamatórios foi responsável pela lesão ou activação de monócitos, ê também possível que uma resposta anti-inflamatória anormal possa causar doença de artéria coronária ou crie uma susceptibilidade acrescida a doença. Assim, as citocinas IL-1 e TNF, implicadas numa tal reacção inflamatória pode determinar em parte um risco de um indivíduo de doença de artéria coronaria.

Genética do agregado genético de IL-1: 0 agregado genético de IL-1 encontra-se no braço comprido do cromossoma 2 (2ql3) e contém pelo menos os genes de IL-la I - A IL-Ιβ I - 1 e o antagonista do receptor IL-1 (IL-1RN), numa região de 430 Kb (Nicklin, et al., Genomics, 19:382-4 (1994)). As moléculas agonistas, IL-la e IL-Ιβ, possuem uma actividade pro-inflamatória potente e são a cabeça de muitas cascatas inflamatórias. As suas acções, muitas vezes, através da indução de outras citocinas tais como IL-6 e IL-8 conduzem a activação e recrutamento de leucócitos em tecido danificado, produção local de agenres ivosp resposta febril no cérebro e fase de resposta hepática aguda. Todas as três moléculas IL-1 ligam-se ao tipo I e ao receptores de IL-1 do tipo II, mas apenas o rtespiõ-t □<& tipv I faz a t ae um «irnsl para o interior da o-tluiim Em contraste, o receptor do tipo II é libertado da membrana celular e actua como um receptor armadilha. 0 antagonista do receptor e o receptor do tipo II são por isso ambos anti-inflamatórios nas suas acções.

Uma produção inadequada de IL-1 desempenha um papel central na patologia de muitas doenças autoimunitárias e incluindo artrite reunatoide, desordem inflamatória dos intestinos, psoriase e semelhantes. Além disso, estas são diferenças inter-individuais estáveis nas velocidades de produção de IL-1, e alguma desta variação pode ser atribuída a aiferenças genéticas no local do gene IL-1. Assim, os genes IL-1 são candidatos razoáveis para determinar parte da susceptibilidade genética a doenças inflamatórias, a maior parte das quais possui uma etiologia multifactorial com um componente poligénico. De facto, existe uma evidência acrescida de que determinados alelos dos genes IL-1 estão representados em excesso nestas doenyas.

Diagnóstico qenetico: métodos tradicionais para o diagnóstico de doenças herdadas dependeram da identificação dos produtos genéticos anormais (por ex. anemia das células falciformes), ou de um fenótipo anormal (por ex. atraso mental). Estes métodos são de utilidade limitada para doenças hereditárias com um início tardio e fenótipos não identificáveis facilmente, tais como por exemplo a doença de Alzheimer. O desenvolvimento de testes genéticos tornou possível a identificação de mutações genéticas que indicam uma propensão para desenvolver uma doença, mesmo quando a doença é origem poligénica. 0 número de doenças que podem ser diagnosticadas através de métodos da biologia molecular continua a crescer com uma compreensão acrescida da base genética de desordens multifactoriais (ver por ex. as patentes norte americanas n°s 4,582,788; 4,666,828; 4,801,531; 5,110,920; e 5,268,267).

Teste genético (também chamado pesquisa genética, genotipagem ou diagnóstico molecular), pode ser largamente definido como o teste do ácido nucleico de um doente numa capacidade anaiitica para determinar se um doente contém mutaçóes (ou alelos ca polimorfismos) que ou causam um estado de doença ou estão "ligados" a uma mutação que provoca um estado de doença. A ligação refere-se ao fenómeno de que sequências de ADN que estão perto uma das outras no genoma possuem uma tendência para ser herdadas em conjunto. Duas sequências podem estar também ligadas devido a alguma vantagem selectiva de co-herança. A detecção precoce de uma predisposição para doenças genéticas representa a melhor oportunidade para intervenção médica. Diagnóstico genético precoce pode melhorar o prognóstico para um doente, através de supervisão e intervenção precoce antes de ocorrer a desordem clinicamente detectável. Em casos em que doentes com sintomas semelhantes são tratados com sucesso variável, testes genéticos sofisticados podem diferenciar doentes individuais com diferenças subtis ou indetectáveis e podem conduzir a tratamentos individuais mais adequados. É mesmo possível que uma intervenção precoce possa um dia envolver métodos tais como terapia genética. A EP-A-0609059 diz respeito a polimorfismos dentro do gene da apolipoproteína e a utilização destes polimorfismos em estudos genéticos. A EP-A-0609059 também diz respeito a sondas que podem ser utilizadas para estudos de família ou de população para descobrir alelos associados com um risco acrescido de doença cardíaca.

Mansfield J C et ai.: "Novel Genetic Association Between Ulcerative Colitis and the Anti-Inflammatory Cytokine Interleukin-l Receptor Antagonist"

Gastroenterology, Saunders, Philadelphia, PA, US vol. 106, n° 3, 1 de Março de 1994, paginas 637-642 diz respeito à observação de que o antagonista da receptor da interleucina-1 pode desempenhar um papel na determinação na susceptibilidade genética e patogénese da colite ulcerativa.

Clay F £ et al. : "Novel Interleukin-1 Receptor Antagonist Exon Polymorphisms and Their Use in Allele-specific mRNA Assessment" Human Genetics, Berlin, DE, vol. 97, n° 6, 1 de Junho de 1996, páginas 723-726 diz respeito a um número variável de repetições ligadas em série (VNTR) polimorfismos descritos no intrão 2 do gene do antagonista do receptor da interleucina-1. Utilizando o polimorfismo do exão 2 como um marcador para o alelo associado a doença do intrão 2 foi analisado o mARN especifico do alelo em linhas celulares de queratinócitos heterozigóticos.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção disponibiliza-se um método para determinar a predisposição do doente para a doença de artéria coronaria, o dito método compreende: detecção do alelo 2 do mârcador -511 dc gene IL-1B contendo uma T na base -511 da IL-1B ou alelo 2 do marcador VNTR do gene IL-1RN contendo duas repetições VNTR; em que a presença do alto alelo indica que o dito doente encontra-se predisposto a uma doença de artéria ·:'· c·':: mriú ,·

Outras mm :::::· >;á 1e c tá n e aaaçayãts da ΐΰν«®Ιν são apresentadas am parte na dAttriç-ât que se segue, e será óbvio a partir desta descrição, ou pode ser aprendido com a prática da invenção.

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas

Como aqui incorporado e descrito na generalidade o presente documento encontra-se direccionado para métodos para prever a propensão de um doente em desenvolver doenças de artéria coronaria e a kits para diagnóstico, sondas oligonueleótidicas e outros reagentes que podem ser utiiizados com estes métodos. A invenção também está direccionada para um método para identificar marcadores genéticos associados com a doença de artéria coronária.

Quando aqui utilizada, a frase doença de artéria coronaria diz respeito a desordens e condições geralmente reconhecidas pelos peritos no estado da técnica relacionadas com a deposição de ateroma nas artérias de grandes e médias dimensões que abastecem o coração. Assim, doença de artéria coronária significa síndromas clínicos (incluindo, mas não limitado a angina, enfarte do miocárdio, angina instável, e morte isquémica repentina) que são baseadas na patologia do ateroma da artéria coronária.

Entende-se com o termo marcador a descrição de regiões de ADN que variam entre indivíduos. Por exemplo, o marcador "VNTR" do gene IL-1RN é aqui descrito. As diferentes variantes da sequência para um dado marcador são chamadas alalos cu polimorfismos. C marcador VNTR possui pelo menos cinco aielos diferentes, três dos quais são raros. Diferentes aielos podem possuir uma única de base, incluindo substituição, inserção, ou delecção, ou poderia ter uma alteração que afecta bases o n i u i j:; las, . hl; Imi b d o suostítuições, inserções, dv 1. e o ç d® o , repetições, inversões e suas combinações. Os aielos podem ser detectados directamente no ADN de um indivíduo, ou ser detectado indirectamente no ARN ou na proteína.

Quando aqui utilizado, o processo para detectar alelos e descrito de diferentes maneiras, tais como genotipagem, determinação ou identificação de um alelo ou polimorfismo, ou qualquer frase semelhante. 0 alelo realmente detectado pode ser uma mutação que causa a doença, ou uma mutação que esta ligada a uma mutação que ca ta a a doença.

Os termos agregado genético de IL-1 ou local IL-1, quando aqui utilizados incluem todo o acido nucleico na ou próximo da região 2ql3 do cromossoma 2, incluindo pelo menos os genes de IL-1B e IL-IRN e quaisquer outras sequências ligadas. 0 termo alelo 2 de IL-IRN (VNTR) descreve o alelo 2 do marcador VNTR do gene IL-1 RN. Este alelo é caracterizado por ter duas cópias da repetição VNTR e produzir um produto de 240 pb quando amplificado com os iniciadores aqui descritos. O termo alelo 2 do IL-1B (-511) descreve o alelo 2 do marcador -511 do gene IL-1B. Este alelo contém um local Bsu361 e produz fragmentos de 190 e 114 pb, quando amplificado com os iniciadores aqui descritos e digeridos com Bsu361.

Por propensão ou predisposição ou susceptibilidade a doença, pretende-se dizer que determinados alelos são descobertos como estondc associados a um dado estado de doença. Eles estão assim representados em. excesso em indivíduos com doença, quando comparados com hnixv;.dx;·:·>,$ SiddávsiJ, Por isso, a presença de tais alelos indica que um indivíduo se encontra em risco d* ter a daaaça* A invençâò αιζ respeito a um método de prever a propensão ou rrod.i ·>;κ·ο; çôo de um doente para doença de artéria coronária através de genotipagem do ADN do doente no local IL-1. O genotipo do doente é comparado com uma amostra de controlo que contém uma ou mais variantes alélicas de IL-1 que são conhecidas por se correlacionarem com, ou estarem associadas com o estado de doença, Amostras de controlo podem conter o alelo 2 de IL-1RN e/ ou o slolc 2 ae IL-1B e alelos ligados, ou outras alelos identificados por métodos aqui descritos. Os alelos na amostra de controlo podem estar na forma de sequências de ADN genómico, ou clonado do agregado genético de IL-1, ou podem ser os produtos finais adequados para o formato do ensaio utilizado. Por exemplo, quando o ensaio envolve detecção monoclonal de epitopos específicos, as amostras de controlo podem compreender os epitopos ou proteínas correspondentes aos alelos descritos. Técnicas para determinar a presença de marcadores particulares podem ser técnicas de ácido nucleico baseadas na hibridização, tamanho, ou sequência, tal como polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP -do inglês restriction fragment length polymorphism), ou sequenciação de acido nucleico.

Estas técnicas podem também compreender o passo de amplificar o ácido nucleico antes da analise. Técnicas de amplificação são conhecidas dos peritos no estado da técnica e Incluem clonagern, reacção em cadeia da polimerase (PCR -do inglês polvmerase chain reaction), reacção em cadeia de polimerase de alelos específicos (PASA - do inglês polymerase chain reaction of specific alleles), ligação em cadeia da polimerase, reacção em cadeia da polimerase em ninho e semelhantes. Os produtos amplificados podem ser ensaiados através de variedade de modos, incluindo análise por tamanho, digestão por rGSt Γ íçâo ::V % J .! Λ > :*£ p O r análise de tamanho para detectar Iniciadores oligonucleótidos marcados especificamente nos produtos de reacção, hibridização de oligonucleótidos específicos dos alelos (ASO -do inglês allele-specífic oligonucleotide), sequenciação e semelhantes,

Alternativamente, técnicas de detecção de alelos podem ser baseadas em proteínas se um alelo particular produzir uma proteína com uma variante de aminoácido. Por exemplo, epitopos específicos para a variante de aminoácido pode ser detectada com anticorpos monoclonais. 0 documento também se encontra direccionado para métodos de identificação de alelos de IL-1 adicivnais ligados a uma propensão para desenvolver uma doença de artéria coronária. Os alelos IL-1 presentes em doentes com a doença são comparados com aqueles presentes em doentes sem doença para determinar se algum dos alelos se encontra representado em excesso nos doentes com a doença. Os alelos podem ser os alelos de IL-1 conhecidos existentes, ou marcadores adicionais podem ser identificados através de qualquer técnica conhecida no estado da técnica, incluindo a sequenciação de ADN da região próxima daqueles genes.

Outra concretização do documento está direccionada para kits de diagnóstico que detectam uma propensão para doença de artéria coronária num doente. Os kits podem ser utilizados pré-sintomaticamente ou pre-natalmente. 0 kit de diagnóstico pode compreender um ou mais oligonucleótidos capazes de híbridízar com ácido nucleico do agregado genético de IL-1. Existem vários formatos de ensaio úteis para genotipagem utilizando os oligonucleótidos fornecidos. Os formatos mais comuns envolvem a Ligação a ácidos nucleicos, tal como por exemplo a filtros, esferas, ou placas microtituladoras e semelhantes. M técnicas envolvidas incluem dot Mhth-Sb· blots dt ARN, blots de ADN, PCR, FRLP e semelhantes,

Os oligonucleótidos podem ser uma variedade de composições naturais e sintéticas, tais como por exemplo oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restrição, cADNs, PNAs sintéticos (ácidos nucleicos ae proteínasj e semelhantes. 0 ensaio pode também utilizar oligonucleótidos marcados para permitir uma identificação fácil nos ensaios. Exemplos de marcadores que podem ser utilizados incluem marcâdores radioactivos, enzimas, compostos fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, resíduos magnéticos, resíduos que se ligam a metais, resíduos de antigénios, ou anticorpos e semelhantes. 0 kit pode também incluir meios de amostragem de ADN tais como o AmpliCardTrE (Universidade de Sheffield, Sheffield, Inglaterra S10 2JF), também descrito em Tarlow JW, et al., Journal of Investigative Dermatology, 103:387-389 (1994). Outros meios de amostragem de ADN adequados incluem meios de purificação de ADN e reagentes PCR, tais como lOx tampões de reacção, polimerase termoestável, e/ ou dNTPs.

Os exemplos seguintes ilustram concretizações da invenção, mas não deverão ser vistos como limitando o âmbito da invenção. vaso unico R doença de vasos múltiplos representa C objectivo deste estudo foi determinar se doentes com uma forma precoce de arteriosclerose coronária arterial, i.e da doença de artéria coronária de y&ao ârdob eram mais propensos a terem os alelos específicos ncs genes seguintes: IL-1A (marcador ·νρχρ( f IL-1B (-511 e marcadores Bolll , IL-1RN (marcador VNTR) ou TNFa (marcador -308) . geralmente um estado mais adiantado da doença que pode envolver muitos factores que poderiam complicar a interpretação do» dados. Por isso, os doentes que apresentavam uma queixa de dor no peito foram avaliados por um cardiologista, e aqueles com uma evidência ãngiográfica de arteriosclerose significativa em mais do que uma artéria coronária foram excluidos da analise. Grupos de doentes: foi efectuada angiografia da artéria femoral, ou braquial utilizando técnicas convencionais. Dos doentes examinados oitenta e cinco (85) não possuíam irregularidades luminais óbvias por angiografia e foram classificados como controlos possuindo artérias coronárias angiograficamente normais. Um doente foi classificado como possuindo uma doença de vaso único se um dos três vasos coronários epicardicos continha uma estenose epicárdica que provoca uma redução em 50% no diâmetro luminal, quando avaliado a olho nu. Foram encontrados cinquenta e oito doentes (58) como tendo doença de artéria coronária de vaso único. Doentes com doença em vasos múltiplos foram excluídos. Tanto os grupos de controlo e grupos com a doença de vaso único possuíam idades medias comparáveis, 57,6±10,4 anos e 56,4+9,4 anos; respectivamente. A proporção do sexo masculino em relação ao sexo feminino no grupo de controlo era de 1: 1,7 e 2,6:1 1 no grupo com doença. Métodos gerais: as reacções e manipulações envolvem técnicas de ácidos nucleicos, a não ser quando especificado em contrário, foram efectuadas como descrito em gera: em Sambrook et $2 „ Molecular Cloning: Ά.

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). A reacção em cadeia da polimerase (POR) ioi efectuada geralmente esmo descrito em protocolos f-C.Ps A íMiss to Mrtssds arsi Applications, Aeadssúr: Press, San Diego, CA QúsOo A metodologia de genotípagem iui como escrito de forma geral nas patentes de invenção norte americanas n°s 4,666,828; 4683,202, 4,801,531; 5,192,659; e 5,272,057 e McDowell, et al., Arthritis & Rheumatism, 38(2):221-8 (1995).

Preparação do ADN: o ADN foi extraído ao sangue completo utilizando uma modificação do método de gradiente de sal Itm igles "salt-out") Scotlab, RU) .

Genotipaqem de IL-1RN: os alelos associados com o gene de IL-1RN fcram descritos previamente por Tarlow, et al., Human Genetics, 91:403-4 (1993). Os enzimas utilizado na PCR foram da Promega (RU) e os equipamentos para efectuar os ciclos térmicos (''thermocyclers" em inglês) foram da MJ Reçearch DNA Engine ou Biometra. Os iniciadores seguintes foram produzidos num sintetizador de ADN ABI: 5'CTCAGCAACACTCCTAT 3' (SEQ ID N° 1) 5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (SEQ ID N° 2) A amplificação por PCR foi efectuada com uma concentração final de magnésio de 1,75 mM e um protocolo de ciclos de 1 ciclo a 96 °C durante 1 minuto; 30 ciclos de durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, e 70°C durante 1 minuto]; e 1 ciclo a 70°C durante 2 minutos. A seguir a PCR os diferentes alelos foram sujeitos a eleetroforese num gel de 2% de agarose corado com brometo de etídio e visualizado e identificado sob luz UV, Foram efectuados controlos negativos sem ADN em cada experiência. O intrão 2 do gene 1L-1RN contém um número variável de repetições ligada em série na região ÍVNTR- do inglês varlabile mmfomr tandem repeat) que dá origem a cinco (5) alelos como se segue: 0 alelo 1 contém quatro repetições e apresenta um produto da PCR eco; 412 pb; o alelo 2 contém duas repetições e apresenta um produto da OCR com 240 pb; o alelo 3 contem três repetições e apresenta um produto da PCR com 326 pb; o alelo 4 cinco repetições e apresenta um produto aa PCR com 498 pb; e 0 alelo 5 contém seis repetições e apresenta um produto da PCR com 584 pb;

Genotipaqem de IL-1B (-511) O marcador -511 de IL-1B foi descrito per diGiovine, Hum. Molec. Gent., 1(6): 450 (1992). O marcador (C/T) de variação de base única na base IL-1B -511 foi identificada na base de um local Aval no alelo 1( C), e num local Bsu36I no alelo 2(T). A PCR foi efectuada com 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos, 35 ciclos a [95°C durante 1 minuto, 53°C durante 1 minuto, e 74°C durante 1 minuto] e 1 ciclo a 74°C durante 4 minutos. A análise dos produtos de PCR foi efectuada por digestão com enzima de restrição com Aval e Bsu361 a 37°C durante 8 horas seguida por análise de tamanho com 8% de PAGE. Os iniciadores seguintes foram produzidos num sintetizador de ADN ABI (Clark, et al., Nucl. Acids. Res., 14:7897— 7914 (1986) [ a errata publicada aparece em Nucleic Acids Res., 15 (2):868 tláS'?)]; GENBANK XQ45G0) : ··: > .το «κ. v. .>: :· 3) â"\

Resultados: Não existia diferença significativa entre os doentes de controlo e doentes ccm a doença na frequência des diferentes alelos nos genes para IL-IA (marcador- TNa (marcador -308). 889) ,

Contudo, o alelo 2 do marcador VNTR no gene IL-1RN encontrava-se significativamente representado em excesso nos doentes com a doença de vaso único, 41% em relação a 22% nos controlos. Estima-se que indivíduos com pelo menos uma cópia do alelo 2 têm uma probabilidade de 2,44 vezes mais elevada de terem doença de artéria coronária de mas único do que aqueles que são negativos para o alelo 2 (razão de probabilidade = 2,44, p=0,0G3, intervalo de confiança de 95% = 3 f 3 3 -4 f - 3) . Méís disso, os indivíduos que possuíam duas cópias, i.e. eram homozigõticos para o alelo 2 no IL-1RN, era de 5,36 vezes mais provável terem a doença de artéria coronária de vaso único do que aqueles que eram negativos para o alelo 2 (razão de probabilidade = 5,36, p=0,005, intervalo de confiança de 95% = ],··:·· ;3f ,

Transporte de uma cópia do alelo 2 do marcador -511 do gene IL-1B foi aumentada na doença de artéria coronária de vaso único para 52%, quando comparado com 38% nos controlos. Estima-se que indivíduos com pelo menos uma cópia do alelo 2 seja 1,74 vezes mais provável terem doença de vaso único do que aqueles que são negativos para o alelo 2 (razão de probabilidade = 1,74, p=0,l, intervalo de confiança de 95% = 0, 86-3,52). Este facto não é bastante significativa, no entanto o tamanho limitado da amostra limitou o estudo.

Estes factos indicam que o alelo 2 do gene IL-1RN é um marcador para a susceptibilidade ao desenvolvimento da ateiosclerose coronária arterial. Este alelo enccntra-se associado com um risco acrescido de doença de artéria coronária de 2,4 a 5,4 vezes, dependendo do facto de existir uma cópia (heterozigótico) ou duas cópias tú5:çôçi;;p5tl€0:; do alelo associado com a doença. A Isirulúicáa deste alelo no risco de doença de artéria coronaria apresentada na Tabela 1 relativamente a outros factores de risco comuns.

Além disso, foi constatado que um alelo para o gene de IL-1B estava associado com a doença de artéria coronária de vaso único. Este alelo encontra-se associado com um risco acrescido de 1,74 vezes de doença de artéria coronária.

Tabela 1 fSSfcaç de Risco iM» Λ 4.«,. 4* artéria coronária Fumador (1 pacote/ dia) e * o Estilo de vida sedentário 1,9 obesidade grave 3,3 Hipertensão 2,1 Colesterol elevado (>240) 2f 4 Alelo 2 de IL-1RN (VNTR) - 2,4 Alelo 2 de IL-1RN (VNTR)- Λ·1· !> •S homozigótico

Exemplo 2: Marcadores para a doença de artéria coronária de vasos múltiplos D objectivo deste estudo foi para determinar se os doentes com uma forma mais avançada ou difusa de arteriosclerose arterial coronária, i.e. doença de artéria coronária de vasos múltiplos era mais provável possuir alelos específicos nos genes do agregado do gene IL-1 ou TNFa.

Grupos dê doentes: foram determina rios os grupos 2s doentes como no il>:τρί o i, ccm a eyj-spçi} de oves es doente foi classificado como tendo vèe çeeoe múltiplos se mais do que um dos vasos coronários epicárdicos continha uma estenose epicárdica que provoca uma redução > 50% no diâmetro luminal, quando avaliado a olho nu. Dos doentes examinados 86 foram classificados como controlos possuindo artérias coronárias angicgraficamente normais e foi verificado que 315 doentes possuíam doença de artéria coronária de vasos múltiplos. Tanto os grupes de controlo e grupos com a doença de vaso único possuíam idades médias comparáveis, 57,6±10,4 anos e 60,8±lf13 anos respectivamente. A proporção do sexo masculino em relação ao sexo feminino no grupo de controlo era de 1: 1,7 e 3,7:1 1 no grupo com doença. Métodos Gerais: Reacções e métodos foram como os do

Exemplo 1.

Resultados: Não existia diferença significativa entre os doentes de controlo e doentes com a doença na frequência dos diferentes alelos nos genes para IL-1A (marcador-889), il-IB (marcador +3953), e IL-1RN (marcador VNTR). Contudo, o transporte de uma cópia do alelo Bsu361 (alelo 2) do marcador -511 do gene IL-IB foi aumentada na doença de artéria coronária de vaso múltiplo para 548, quando comparado com 38% nos controlos. Estima-se que indivíduos com pelo menos uma cópia do alelo 2 do marcador -511 seja 1,92 vezes mais provável terem doença de vaso múltiplo do que aqueles que são negativos para c alelo 2 ibssâó de probabilidade + 1,92, p-0,013,. intervalo de confiança de 95% = 1,17-3,16). Parece não haver efeito de dose, pelo menos nesta população para c marcador -511. & resumo* Γ·ηο.η ··.? ..pu: o súsls imos o ;gooe Ί i. ·· 1B escava associado com a doença de artéria coronária de V3. S O Séc·.·:· ,v. liólsn Este alelo encontra-se associado a um risco acrescido de doença de artéria coronária de 1,92 vezes. A doença de artéria coronaria de vaso único e de vaso múltiplo cada uma parece estar ligada a diferentes genes do agregado genético de IL-1. Isto pode surgir com uma distinção verdadeiramente biológica em que IL-1R.A modula os efeitos d·* Hm-lp de modo a produzir c fenótipo de vaso único. Alternativamente pode ser que ambos os genes estejam de facto associados com doença de artéria coronária como um todo e que as associações aqui observadas resultem do modo como este população particular exibia a doença de artéria coronária. Com qualquer uma das interpretações, foi estabelecida uma forte associação entre biologia de IL-1 e doença de artéria coronária.

Lisboa, 13 de Novembro de 2007

Claims (5)

1. Reivindicações 1. Processo para determinar uma predisposição de um doente para uma doença da artéria coronária compreendendo o Cito prooos*·.:.; a auí.ooçÃo do alelo 2 do marcador -511 do gene IL-1B contendo uma T ao nível da base -511 da IL-1B ou do alelo 2 do marcador VNTR do gene IL-1RN coniendo duas repetições VNTR, em que a presença do dito alelo indica que o dito doente se encontra predisposto a uma doença da artéria coronária.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual a detecção compreende a análise RFLP de um ácido nucleico.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual a detecção compreende a amplificação por PCR de um ácido nucleico.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, no qual. a amplificação por PCR é efectuada com um iniciador de PCR escolhido no grupo constituído por:
5. 5'CTCAGCAACACTCCTAT 3' (SEQ ID N° 1); 5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (SEQ ID N° 2); 5' TGGCATTGATCTGGTTLATS 3' (SEQ ID N° : 3); e 5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (SEQ ID N°: 4). 2007 Lisboa, 13 de