CN115976208A

CN115976208A - 环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115976208A
Application number: CN202211307239.4A
Authority: CN
Inventors: 钟加滕; 胡育涵; 丁爽; 赵瑶; 张馨予; 苏蔚; 郜庆祖
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明属于分子标志物技术领域，本发明提供了环状RNAcirc_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。本发明所述环状RNA circ_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的研究结果表明，环状RNAcirc_0000615的表达水平与结直肠癌呈现负相关关系，是一个在CRC组织中表达显著下调的RNA，可以作为癌症的诊断标志物。同时，环状RNAcirc_0000615过表达后，可显著抑制结直肠癌的增殖能力，抑制肿瘤的发生和发展，可作为癌症治疗的潜在方式。

Description

环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及分子标志物技术领域，尤其涉及环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一；CRC病例数量逐年增加，对人类生命健康构成严重威胁。这病因不明、早期症状不明显、转移率高是导致大肠癌患者预后差、死亡率高的重要因素。尽管在诊断和治疗策略方面取得了进展，但患有晚期疾病的大肠癌患者的临床结果和预后仍然很差。

环状RNA(circularRNA，circRNA)是非编码RNA领域的新星，因其 5′末端和3′末端首尾相连形成闭合环状结构而得名，在真核细胞中广泛表达。环状RNA分子呈现封闭环状结构，具有更高的核酸酶稳定性，不受RNA外切酶的影响，不易降解，可作为miRNA分子海绵，调节基因表达，与蛋白质发挥重要的相互作用。目前，有关环状RNAcirc_0000615对于结直肠癌的影响及其在肿瘤中的应用尚未见报道。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了环状RNAcirc_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用，所述环状RNAcirc_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

本发明还提供了一种用于检测上述环状RNAcirc_0000615的PCR引物对，所述PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种用于检测上述环状RNAcirc_0000615的线性引物 ZNF609引物对，所述线性引物ZNF609引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种结直肠癌检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的PCR 引物对和线性引物ZNF609引物对。

优选的，所述试剂盒还包括内参引物对。

优选的，所述内参引物对包括GAPDH扩增引物对，所述GAPDH扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了环状RNA circ_0000615过表达载体在抑制结直肠癌细胞增殖中的应用。

本发明还提供了环状RNA circ_0000615过表达载体在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

优选的，所述环状RNA circ_0000615过表达载体包括上述的环状RNA circ_0000615和原始载体，所述原始载体包括pGC-FU。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的研究结果表明，环状RNA circ_0000615的表达水平与结直肠癌呈现负相关关系，是一个在CRC组织中表达显著下调的RNA，可以作为癌症的诊断标志物。同时，环状RNA circ_0000615过表达后，可显著抑制结直肠癌的增殖能力，抑制肿瘤的发生和发展，可作为癌症治疗的潜在方式。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为circ_0000615扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图以及Sanger测序结果图；

图2为RNA酶R消化实验通过PCR以及qPCR来验证circ_0000615的稳定性(注：****表示p＜0.0001)；

图3为circ_0000615在8株结直肠癌细胞和正常肠上皮细胞FHC中的表达结果图(注：***表示p＜0.001；****表示p＜0.0001)；

图4为circ_0000615在28对结直肠癌组织与癌旁组织中表达的倍比关系图以及平均表达水平图(注：****表示p＜0.0001)；

图5为干扰circ_0000615的稳定株的构建；

图6表示CCK8法检测circ_0000615干扰后对细胞增殖能力的影响；

图7为平板克隆实验检测circ_0000615干扰后对细胞增殖能力的影响；

图8为EDU增殖实验检测circ_0000615干扰后对细胞增殖能力的影响；

图9为细胞划痕实验以及Transwell实验来检测circ_0000615干扰后对细胞迁移能力的影响(注：**表示p＜0.01；***表示p＜0.001)；

图10为过表达circ_0000615的稳定株的构建(注：**表示p＜0.01；*** 表示p＜0.001)；

图11表示CCK8法检测circ_0000615过表达后对细胞增殖能力的影响 (注：****表示p＜0.0001)；

图12为平板克隆实验检测circ_0000615过表达后对细胞增殖能力的影响(注：**表示p＜0.01)；

图13为EDU增殖实验检测circ_0000615过表达后对细胞增殖能力的影响；

图14为细胞划痕实验以及Transwell实验来检测circ_0000615过表达后对细胞迁移能力的影响(注：**表示p＜0.01；***表示p＜0.001)；

图15为老鼠皮下瘤实验来检测circ_0000615过表达后对细胞增殖能力的影响(注：**表示p＜0.01)。

具体实施方式

本发明提供了环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用，所述环状RNA circ_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

本发明还提供了一种用于检测上述环状RNA circ_0000615的PCR引物对，所述PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种用于检测上述环状RNA circ_0000615的线性引物 ZNF609引物对，所述线性引物ZNF609引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括内参引物对。

在本发明中，所述内参引物对优选包括GAPDH扩增引物对，所述 GAPDH扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7 所示。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂优选为Trizol试剂。

在本发明中，所述环状RNA circ_0000615过表达载体包括上述的环状 RNA circ_0000615和原始载体，所述原始载体优选包括pGC-FU。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、细胞RNA的提取

收集生长状态良好SW480细胞(购买于湖北省普诺赛生物科技有限公司)的沉淀，加入1ml TRIzol裂解。裂解完全后，加入0.2ml氯仿，加入氯仿后盖紧离心管，用力上下剧烈震荡15秒，以保证水相和有机相能够充分接触，室温放置10分钟。将离心管置于低温离心机中离心，4℃，12000rpm，离心10分钟。离心后混合液出现分层，上面一层为基本无色的水相，取上层水相加入到另一个EP管中。在离心管中加入与水相液体等体积预冷的异丙醇，温和上下充分混匀，室温静置10分钟。4℃12000rpm离心15分钟，小心弃去上清。加入1ml预冷的75％乙醇(无水乙醇用DEPC水稀释)。 4℃12000rpm离心5分钟，弃上清。室温干燥RNA沉淀，加入20μl的DEPC 水，DEPC水溶解。

RNA浓度和纯度测定，用移液枪取RNA样品1μl至缓冲液中，测定其在260nm和280nm处吸光值。根据OD260/OD280比值，估测RNA质量。 OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，可以满足实验要求。当OD260/OD280 ＜1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显；当OD260/OD280＞2.2时，说明RNA 已经降解。

二、RNA逆转录

1.RNA逆转录按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书进行，首先去除RNA里可能污染的gDNA，按照表1 配置反应体系：

表1 RNA逆转录反应体系

试剂	体积(μL)
		5×gDNA Eraser Buffer	2
gDNA Eraser	1
		RNA	2(500ng/μL)
<![CDATA[RNase Free dH<sub>2</sub>O]]>	upto10

2.去除gDNA程序：42℃，2min；

3.按照表2在冰上加入如下试剂到已去除gDNA的前述反应体系内：

表2试剂及加入量

试剂	体积(μL)
		5×PrimeScript Buffer	4
PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ	1
		Random 6mers(100μM)	1
<![CDATA[RNase Free dH<sub>2</sub>O]]>	4

逆转录程序：37℃，15min：85℃，5sec；

逆转录产物用无菌超纯水稀释20倍，-20℃保存尽快使用或者直接进行PCR及qRT-PCR反应。

4.RNA酶R消化验证cirITGA7稳定性：

提取结直肠癌癌旁组织RNA，并分成1μg×4份，1份不加RNA酶R，另3份各加入0.05μl RNA酶R和RNA酶Rbuffer0.7μl，加无核酸酶的灭菌水补至7μl，消化反应在PCR仪内进行，37℃分别消化10min、20min、30 min，消化完成后，与未消化的RNA一起分别在每管内加入gDNAbuffer2μl 和gDNA Eraser 1μl，42℃，2min去除RNA内可能会污染的gDNA，后续步骤与方法逆转录反应相同，逆转录成的cDNA用灭菌水稀释4倍，取2μl 进行PCR及qRT-PCR，circ_0000615、ZNF609及GAPDH mRNA水平均与未消化的前的RNA进行比较。

三、聚合酶链式反应(polymer chain reaction,PCR)

1.根据PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(TaKaRa，RO50Q)试剂盒说明书进行，首先在冰上配置如表3所示反应体系。

表3 PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		5×PrimeSTAR GXL Buffer	10
dNTP Mixture(2.5mM each)	4
		Forward Primer	1.5
Reverse Primer	1.5
		cDNA or DNA	1
PrimeSTAR GXL DNAPolymerase	1
		灭菌蒸馏水	Up to50

2.PCR反应程序：98℃，10sec变性；55℃or 60℃，15sec退火(引物 Tm值小于55℃设为55℃，大于55℃设为60℃)；68℃，18sec延伸(按产物1Kb设为1min计算)；35个循环。

3.PCR产物结束后放在4℃保存，并尽快进行琼脂糖凝胶电泳。

四、糖凝胶电泳及Sanger测序

根据产物片段长度，选择配置2％的琼脂糖凝胶，即2g琼脂粉加入到 100ml 1×TAE中，微波反复加热至完全溶解，溶液澄清，注意避免过度沸腾导致的液体蒸发而影响终浓度，冷却至60℃，加入10μl GelStain，摇匀后倒入已插好梳子的配胶槽内，室温约凝固40min，拔掉梳子，将胶放入电泳槽内，注意上样孔在负极侧，将1×TAE倒入槽内没过胶面约1mm，每孔上样10μl已加入loading buffer的PCR产物，5μl DNAmarker加于最左侧孔内，100v电压，电泳35min，电泳结束后在凝胶成像系统内采集图像，切胶送测序，Sanger测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。进一步证明了 circ_0000615的反向剪切序列。结果如图1所示。此步骤用到的引物如SEQ ID NO.2(GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3(GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ ID NO.4 (CCCGGTTGAGACATACGACA)，SEQ ID NO.5(CACCTCCTTTGAGCCTGACA)，SEQ ID NO.6 (AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7(GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

五、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)

1.根据SybrGreen qPCRMastermix(DBI)说明书进行，避光条件下在冰上配置qRT-PCR反应体系如表4所示。

表4 qRT-PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		SybrGreen qPCR mastermix	5
Forward primer(10μM)	0.25
		Reverse primer(10μM)	0.25
cDNA	1
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O(灭菌超纯水)]]>	3.5
Total	10

每个样本加3个复孔，充分混匀后瞬时离心，八连管放入ABI7500荧光定量PCR仪中。

2.qRT-PCR反应程序：95℃，预变性1min；95℃，变性15sec；60℃，退火及延伸34sec；40个循环；

数据分析用2^-△△Ct方法进行数据整理分析，将各样品的Ct值(Ct值指所测反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时总共经历的循环次数)减去内参的Ct值(△Ct＝Ct目的基因-Ct内参)即△Ct值，以GAPDH为内参，△△Ct＝△Ct实验组-△Ct对照组，以公式2^-△△Ct计算，相对表达量。比较结直肠癌组织及癌旁组织中circ_0000615表达量时，以FHC细胞△Ct作为对照；实验均重复3次，计算3次平均值及标准差。

3.RNA酶R消化及放线菌素D处理验证circ_0000615的稳定性：

环状RNA因为是闭合环状结构，没有游离的5’末端和3’末端，因此能够耐受核酸外切酶RNA酶R(Rnase R)的消化作用，通常用RNA酶R消化实验来验证环状RNA的稳定性从而间接证明其具有环状结构。本发明应用RNA酶R消化处理结直肠RNA标本不同时间后，用PCR及qRT-PCR方法分别检测circ_0000615、ZNF609及GAPDH的mRNA水平，结果与mRNA 相比，circ_0000615的确能够耐受RNA酶R的消化作用，结果如图2所示。此步骤用到的引物如SEQ IDNO.2(GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3(GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ ID NO.4(CCCGGTTGAGACATACGACA)，SEQ ID NO.5 (CACCTCCTTTGAGCCTGACA)，SEQ ID NO.6(AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7 (GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

4.circ_0000615在28例配对结直肠癌组织与癌旁组织中表达的倍比关系图如图4所示(T/N，N代表正常结直肠组织，T代表结直肠癌组织)，结果显示circ_0000615在结直肠癌组织中表达下调，circ_0000615在29例配对结直肠癌组织和癌旁组织中的平均表达水平如图4所示，Normal代表正常结直肠组织，Tumor代表结直肠癌组织，结果表明circ_0000615在结直肠癌组织的表达水平显著低于癌旁组织。此步骤用到的引物如SEQ ID NO.2(GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3 (GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ ID NO.6(AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7 (GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

5.进一步应用qRT-PCR技术检测circ_0000615在8株结直肠癌细胞株及其正常结肠上皮细胞株FHC中的表达。结果如图3所示，与FHC相比， circ_0000615在8株结直肠癌表达降低。此步骤用到的引物如SEQ ID NO.2 (GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3(GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ ID NO.6 (AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7(GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

六、CCK8实验检测稳定干扰circ_0000615对细胞增殖的影响

1.建立稳定干扰circ_0000615的细胞株：

干扰病毒由上海吉凯公司进行慢病毒载体制备及慢病毒包装，通过稳转入RKO和LoVo细胞后，通过qRT-PCR转验证其过表达效率及准确性，分装避免反复冻融，保存于-80℃。病毒滴度为3×10⁹，对照病毒的滴度为4 ×10⁹，待感染病毒的结直肠癌细胞经胰酶消化收集，PBS洗涤后均匀铺于6 孔板中，密度为20％，24h后，细胞密度为40％，查询不同细胞株的MOI 值，计算每种细胞所加病毒量(按MOI值＝10，加20μl 1×10⁸滴度病毒)，或者正式感染前用24孔板摸索最佳病毒剂量，按照病毒说明书进行感染操作，向6孔板内加入病毒、polybrene及全培的混合液，操作过程关闭细胞台吹风，感染结束后全部物品紫外照8h以上。感染后24h细胞换液，如细胞状态不佳可提前至16h换液，感染后第3天将6孔板内细胞胰酶消化收集，移入培养瓶中继续培养，24h完全贴壁后加入嘌呤霉素进行稳转株筛选， (RKO和LoVo为2μg/ml)，当细胞不再出现死亡时，应用活体成像仪观察细胞荧光素酶产生情况(病毒载体带有荧光素酶报告基因)，收集细胞提取 RNA鉴定过表达效率。结果如图5所示。由图5可知，与对照组相比，稳定干扰circ_0000615效率显著降低。此步骤用到的引物如SEQID NO.2 (GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3 (GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ IDNO.4 (CCCGGTTGAGACATACGACA)，SEQ ID NO.5 (CACCTCCTTTGAGCCTGACA)，SEQ ID NO.6(AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7 (GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

2.培养的稳定干扰细胞株，按照0，24，48，72，96小时，采用CCK8 方法检测细胞增殖，并绘制细胞生长曲线，评估circ_0000615干扰细胞株对肿瘤细胞增殖的影响。结果如图6所示，由此说明肿瘤细胞的生长受到了促进。

3.平板克隆形成实验检测稳定干扰circ_0000615对细胞克隆形成能力的影响：

(1)胰酶消化收集生长状态好的稳定干扰细胞株，PBS洗2次，重悬于培养基中，充分轻柔吹打使细胞分散均匀，计数后以每孔500个细胞接种于6孔板内，每个样本铺3个复孔，晃动培养板使细胞分散均匀；

(2)37℃、5％CO₂培养箱中培养，接种后14天，肉眼可见克隆，镜下克隆数≥50个细胞数时终止培养；

(3)弃掉培养基，用PBS洗3次，甲醇室温固定15min，弃掉甲醇，加入吉姆萨A液0.5ml，B液1ml，13s后见克隆染上颜色而背景干净时倒掉染液，流水充分冲洗；

(4)干燥后，拍照，计数每孔的克隆数。结果如图7所示，稳定干扰 circ_0000615后细胞克隆形成能力增强。

4.5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)增殖实验：

96孔板中每孔加入含有终浓度为50μM的EdU 100含有完全培养基，孵育2h。弃培养液，每孔加入100μl含4％多聚甲酵的PBS，室温孵育30min， 2mg/ml甘氨酸孵育10min，PBS清洗，每孔加入含0.5％TritonX-100的PBS 100μl，10min后PBS清洗。每孔加入100μl的

染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，0.5％TritonX-100的PBS100μl脱色摇床清洗3 次，每次10min。每孔加入100μl 1X Hoechst 33342反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，PBS清洗1次10min。荧光显微镜下，观察高倍视野下阳性细胞数占细胞总数的比例。结果如图8所示，稳定干扰circ_0000615后细胞增殖形成能力增强。

5.划痕愈合实验：

(1)将稳定干扰circ_0000615的细胞及对照细胞以1.25×10⁶个/孔铺入 6孔板；

(2)待细胞贴壁成单层细胞后，用无菌的10μl枪头均匀划线，PBS轻柔洗去划掉的细胞，换成1％FBS的培养基在37℃、5％CO₂培养箱内培养；

(3)分别在0h、12h、36h、48h用倒置显微镜200倍视野下随机选取5个视野观察划痕愈合情况并拍照，测量并计算细胞迁移距离；

(4)每组实验重复3次。

6.Transwell体外迁移实验：

(1)细胞用胰酶消化收集制成单细胞悬液，细胞计数后每个小室接种 250μl无血清培养基稀释的细胞悬液(约1～5×10⁵个/室)，下室加入600μl 含20％血清的1640培养基；

(2)37℃、5％CO₂培养箱内培养48h；

(3)用镊子取出小室，甲醇或4％多聚甲醛固定30min，用棉签擦去上室内的细胞，水洗后用吉姆萨染液染色20min，充分水洗后擦去内室及壁上染液，晾干；

(4)将小室倒放于载玻片上，在200倍光镜下随机采取5～7个视野拍照，计数细胞数，取平均值进行统计作图；结果如图9所示，稳定干扰 circ_0000615后细胞迁移形成能力增强。

七、CCK8实验检测稳定过表达circ_0000615对细胞增殖的影响

1.建立稳定过表达circ_0000615的细胞株：

稳定过表达病毒由上海吉凯公司进行慢病毒载体制备及慢病毒包装，通过稳转入HCT116和DLD1细胞后，通过qRT-PCR转验证其过表达效率及准确性，分装避免反复冻融，保存于-80℃。病毒滴度为3×10⁹，对照病毒的滴度为4×10⁹，待感染病毒的结直肠癌细胞经胰酶消化收集，PBS洗涤后均匀铺于6孔板中，密度为20％，24h后，细胞密度为40％，查询不同细胞株的MOI值，计算每种细胞所加病毒量(按MOI值＝10，加20μl 1×10⁸滴度病毒)，或者正式感染前用24孔板摸索最佳病毒剂量，按照病毒说明书进行感染操作，向6孔板内加入病毒、polybrene及全培的混合液，操作过程关闭细胞台吹风，感染结束后全部物品紫外照8h以上。感染后24h细胞换液，如细胞状态不佳可提前至16h换液，感染后第3天将6孔板内细胞胰酶消化收集，移入培养瓶中继续培养，24h完全贴壁后加入嘌呤霉素进行稳转株筛选，(HCT116和DLD1为2μg/ml)，当细胞不再出现死亡时，应用活体成像仪观察细胞荧光素酶产生情况(病毒载体带有荧光素酶报告基因)，收集细胞提取RNA鉴定过表达效率。结果如图10所示，与对照组相比，稳定过表达circ_0000615效率显著增高。此步骤用到的引物如SEQ IDNO.2 (GAACTAAACCGGAGCCAGAGG)，SEQ ID NO.3 (GTTCTCAGACCTGCCACATTG)，SEQ ID NO.6(AGAAGGCTGGGGCTCATTTG)，SEQ ID NO.7 (GCAGGAGGCATTGCTGATGAT)所示。

2.培养的稳定过表达细胞株，按照0，24，48，72，96小时，采用CCK8 方法检测细胞增殖，并绘制细胞生长曲线，评估circ_0000615过表达细胞株对肿瘤细胞增殖的影响。结果如图11所示，由此说明肿瘤细胞的生长受到了抑制。

3.平板克隆形成实验检测稳定过表达circ_0000615对细胞克隆形成能力的影响：

(1)胰酶消化收集生长状态好的稳定过表达细胞株，PBS洗2次，重悬于培基中，充分轻柔吹打使细胞分散均匀，计数后以每孔，500个细胞接种于6孔板内，每个样本铺3个复孔，晃动培养板使细胞分散均匀；

(3)弃掉培养基，用PBS洗3次，甲醇室温固定15min，弃掉甲醇，加入吉姆萨A液0.5ml，B液1ml，13秒后见克隆染上颜色而背景干净时倒掉染液，流水充分冲洗；

(4)干燥后，拍照，计数每孔的克隆数。结果如图12所示，稳定过表达circ_0000615后细胞克隆形成能力受到抑制。

4.5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)增殖实验：

96孔板中每孔加入含有终浓度为50uM的EdU 100含有完全培养基，孵育2h。弃培养液，每孔加入100μl含4％多聚甲酵的PBS，室温孵育30min， 2mg/ml甘氨酸孵育10min，PBS清洗，每孔加入含0.5％TritonX-100的PBS 100μl，10min后PBS清洗。每孔加入100μl的

染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，0.5％TritonX-100的PBS100μl脱色摇床清洗3次，每次10min。每孔加入100μl 1X Hoechst 33342反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，PBS清洗1次10min。荧光显微镜下，观察高倍视野下阳性细胞数占细胞总数的比例。结果如图13所示，稳定过表达circ_0000615后细胞增殖形成能力受到抑制。

5.划痕愈合实验：

(1)将稳定过表达circ_0000615的细胞及对照细胞以1.25×106个/孔铺入6孔板；

(4)每组实验重复3次。

6.Transwell体外迁移实验：

(2)37℃、5％CO₂培养箱内培养48h；

(4)将小室倒放于载玻片上，在200倍光镜下随机采取5-7个视野拍照，计数细胞数，取平均值进行统计作图；结果如图14所示，稳定过表达 circ_0000615后细胞迁移能力受到抑制。

7.裸鼠皮下瘤模型：

(1)稳定过表达circ_0000615的细胞及对照细胞，分别用胰酶消化收集制成单细胞悬液，用无血清的培养基洗3次，PBS重悬，计数后调整细胞浓度为5×10⁶个/100μl；

(2)取3周龄裸鼠6只，消毒腋下，用1ml注射器将100μl实验组及对照组细胞悬液分别注射至裸鼠左右腋下；

(3)每3天用游标卡尺测量皮下瘤体积，按公式(长径乘以短径的平方除以2)计算肿瘤体积，连续测量至收集肿瘤为止，绘制生长曲线；

(4)当裸鼠出现恶病质或皮下瘤长径小于1.5cm时处死裸鼠，处死前腹腔注射10μl/1g裸鼠体重的D荧光素钾盐于活体成像仪内拍照(因皮下瘤位于腋下，肉眼不好比较两组肿瘤大小)，剥离皮下瘤，皮下瘤大体观察并拍照，一部分固定于10％中性福尔马林中，制作石蜡切片及进行HE染色；结果如图15所示，稳定过表达circ_0000615后细胞增殖能力受到抑制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.环状RNA circ_0000615作为标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA circ_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于检测权利要求1所述环状RNA circ_0000615的PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种用于检测权利要求1所述环状RNA circ_0000615的线性引物ZNF609引物对，其特征在于，所述线性引物ZNF609引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的PCR引物对和权利要求3所述的线性引物ZNF609引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参引物对。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物对包括GAPDH扩增引物对，所述GAPDH扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.环状RNA circ_0000615过表达载体在抑制结直肠癌细胞增殖中的应用。

8.环状RNA circ_0000615过表达载体在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述环状RNA circ_0000615过表达载体包括权利要求1所述的环状RNA circ_0000615和原始载体，所述原始载体包括pGC-FU。