ES2290950T3 - Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias especificas. - Google Patents

Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias especificas. Download PDF

Info

Publication number
ES2290950T3
ES2290950T3 ES93911775T ES93911775T ES2290950T3 ES 2290950 T3 ES2290950 T3 ES 2290950T3 ES 93911775 T ES93911775 T ES 93911775T ES 93911775 T ES93911775 T ES 93911775T ES 2290950 T3 ES2290950 T3 ES 2290950T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
epitope
gene
composition according
cyaa
baselineskip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES93911775T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel Ladant
Claude Leclerc
Peter Sebo
Agnes Ullman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur de Lille filed Critical Institut Pasteur de Lille
Application granted granted Critical
Publication of ES2290950T3 publication Critical patent/ES2290950T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

UN PLASMIDIO RECOMBINANTE CONSTA DE GENES DE BORDETELLA CYAC Y CYAA QUE DIRIGEN LA EXPRESION DE BORDETELLA, CYCLASE DE ADENYLATE EN UNA CELULA HUESPED TRANSFORMADA. UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTES PUEDE CONSTAR DE GENES BORDETELLA CYAA QUE CONTIENEN AL MENOS UNA INSERCION DE UNA SECUENCIA DE ADN HETEROLOGA EN AL MENOS UN EMPLAZAMIENTO PERMISIVO. SE PROPORCIONAN METODOS PARA INDUCIR UNA CELULA ESPECIFICA B, CELULA DE AYUDA T, Y RESPUESTA INMUNE A CELULAS TCL.

Description

Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias específicas.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a una composición para inducir una respuesta inmunitaria, en la que dicha composición comprende una adenilato ciclasa recombinante obtenida mediante la expresión del gen cyaC de Bordetella sp. unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, y de un gen cyaA recombinante de Bordetella sp. que codifica para la adenilato ciclasa unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, en la que dicho gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo y en la que la adenilato ciclasa carece de actividad catalítica: y en la que dicha expresión adicional se realiza en una célula huésped seleccionada del grupo de bacterias, células eucariotas y levaduras.
Esta solicitud describe una molécula de ADN recombinante que comprende el gen de la toxina de adenilato ciclasa (cyaA) o un fragmento del mismo que contiene una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en un sitio permisivo, en la que el fragmento codifica para un polipéptido que muestra las mismas propiedades inmunológicas que el producto génico CyaA. En realizaciones específicas de esta invención, la secuencia de ADN heteróloga codifica para un epítopo inmunológico. Puede obtenerse CyaA a partir de cualquier microorganismo o de otra manera.
Esta solicitud también describe una adenilato ciclasa recombinante que comprende un epítopo heterólogo en un sitio permisivo. En realizaciones específicas de esta invención, el epítopo heterólogo se inserta en el dominio catalítico N-terminal de la adenilato ciclasa recombinante y puede presentarse al sistema inmunitario, en asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I. En otras realizaciones de esta invención, el epítopo heterólogo se inserta en el dominio catalítico C-terminal y puede presentarse al sistema inmunitario en asociación con el CMH de clase II.
También se describen métodos para inducir respuestas inmunitarias específicas en animales inmunizados con composiciones inmunológicas que comprenden adenilato ciclasas recombinantes. En realizaciones específicas de esta invención, se inducen específicamente respuestas de células B, CD4^{+} y células T citotóxicas. Con la llegada de las técnicas de ADN recombinante para modificar secuencias de proteínas, se ha dirigido un trabajo considerable hacia alterar o mejorar específicamente proteínas existentes. Se ha logrado la modificación de aminoácidos específicos de enzimas de estructura conocida para alterar la especificidad mediante mutagénesis dirigida al sitio. Aunque el conocimiento de la estructura tridimensional se restringe a un número limitado de proteínas, las comparaciones de secuencia entre miembros de familias de proteínas homólogas, así como las predicciones cada vez más precisas de las estructuras secundaria y terciaria, ofrecen una base útil para rediseñar la función de la enzima.
Otro enfoque de gran interés potencial es la inserción de nuevas secuencias peptídicas dentro de una proteína definida. Se ha usado eficazmente la mutagénesis por inserción para estudiar la topología de proteínas de membrana (Charbit et al., 1986, 1991) y, en el caso de proteínas solubles, para determinar regiones de flexibilidad natural (Barany, 1985a, 1985b; Freimuth y Ginseberg, 1986; Starzyk et al., 1989; Freimuth et al., 1990; Kumar y Black, 1991). Además, la inserción de un péptido exógeno específico dentro de una enzima podría alterar sus propiedades catalíticas o reguladoras, proporcionando así una base racional para la ingeniería proteica. Adicionalmente, puede usarse la ingeniería proteica para alterar o dirigir específicamente la respuesta inmunitaria hacia un epítopo definido alterando el entorno del epítopo.
La respuesta inmunitaria puede dividirse en dos sistemas distintos, inmunidad celular e inmunidad humoral. La inmunidad humoral está mediada por moléculas solubles, principalmente anticuerpos. En cambio, la inmunidad celular está mediada por células intactas, principalmente linfocitos T. La respuesta inmunitaria exacta generada por un antígeno extraño depende de la naturaleza del antígeno y del entorno en el que se presenta el antígeno o un epítopo del antígeno al sistema inmunitario.
El acontecimiento iniciador en una respuesta inmunitaria humoral es la unión de un epítopo B a una inmunoglobulina (Ig) asociada a membrana en un subconjunto específico de células B. Esta unión estimula la entrada de las células B en el ciclo celular, dando como resultado finalmente la producción de anticuerpos que reconocen específicamente el epítopo B. La respuesta de anticuerpos provocada por un epítopo B puede ser dependiente de células T o independiente de células T. Las respuestas dependientes de células T se caracterizan por una respuesta primaria muy baja seguida por una respuesta de memoria de IgG. La respuesta independiente de células T, en cambio, se caracteriza por una respuesta de anticuerpos IgM rápida, intensa y prolongada.
La respuesta inmunitaria mediada por células se activa mediante epítopos T. Los epítopos T se encuentran generalmente en dos categorías. Muchos epítopos pueden activar tanto células T como células B y, por tanto, son tanto epítopos T como epítopos B. Otros epítopos son formas desnaturalizadas de determinantes antigénicos naturales y no pueden activar una respuesta inmunitaria humoral mediada por células B.
Para activar una respuesta inmunitaria mediada por células, el epítopo T debe asociarse con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El CMH es una región de genes altamente polimórficos cuyos productos se expresan sobre la superficie de diversas células. Existen en principio dos grupos de CMH. El CMH de clase I es una proteína transmembrana compuesta de dos cadenas polipeptídicas. La molécula contiene una región de unión a péptido extracelular que es polimórfica en el sitio de unión al péptido, una región similar a inmunoglobulina, una región transmembrana y un dominio citoplasmático que contiene sitios de fosforilación para una proteína cinasa dependiente de AMPc.
El CMH de clase I se encuentra en prácticamente todas las células nucleadas. El CMH de clase I se asocia generalmente con epítopos T sintetizados endógenamente para la presentación al sistema inmunitario mediado por células. Dado que esta asociación del CMH de clase I con antígenos específicos se produce en el retículo endoplasmático, los antígenos que se internalizan mediante una célula presentadora de antígenos por medio de la ruta endocitótica generalmente no se asociarán con el CMH de clase I. La asociación de un epítopo T específico con el CMH de clase I y la incorporación del complejo antígeno-CMH de clase I sobre la superficie de una célula estimula a linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos. Entonces, los linfocitos T citotóxicos estimulados pueden destruir las células que expresan el complejo antígeno-CMH mediante exocitosis por gránulos de una proteína formadora de poros de membrana que provoca la lisis celular y la secreción de una toxina celular que activa enzimas que degradan el ADN. Sin embargo, la activación de las células CTL también requiere la activación de células T cooperadoras en determinados
casos.
La otra clase principal de proteínas del CMH es el CMH de clase II. El CMH de clase II también tiene proteínas transmembrana. Como el CMH de clase I, el CMH de clase II comprende dos cadenas polipeptídicas e incluye una región de unión a péptido polimórfica, una región similar a inmunoglobulina, una región transmembrana y un dominio citoplasmático. Sin embargo, a diferencia del CMH de clase I, las moléculas de clase II se expresan sólo sobre "células presentadoras de antígeno" tales como linfocitos B, macrófagos, células dendríticas, células endoteliales y otras pocas. Los epítopos T se asocian con el CMH de clase II cuando un antígeno que comprende el epítopo T se une a la superficie de una célula presentadora de antígeno. El antígeno entra en la célula por fagocitosis o mediante endocitosis mediada por receptor en vesículas recubiertas de clatrina. Alternativamente, pueden internalizarse antígenos solubles mediante pinocitosis en fase fluida. Una vez que el antígeno se internaliza, se procesa mediante proteasas celulares en vesículas ácidas dando como resultado péptidos de 10-20 aminoácidos de longitud. Estos epítopos se unen a moléculas del CMH de clase II en vesículas intracelulares y el complejo se transporta a la superficie celular. La presencia del complejo CMH de clase II-antígeno sobre la superficie de células presentadoras de antígeno da como resultado la estimulación de subpoblaciones de células T cooperadoras. Estas células ayudan en la función de los CTL así como en las respuestas de células B. Además, las células T cooperadoras pueden mediar respuestas inflamatorias.
Dos factores importantes para determinar el carácter de una respuesta inmunitaria son la naturaleza del antígeno que se reconoce y la selección como diana intracelular o extracelular del antígeno. Por tanto, un epítopo de célula T que puede seleccionarse como diana para entrar en una célula presentadora de antígeno de una forma dependiente de endocitosis mediada por receptor se asociará con el CMH de clase II y activará células T cooperadoras pero no células CTL. Además, si un epítopo de célula T extraño puede dirigirse al citoplasma de una célula diana de una manera independiente de endocitosis mediada por receptor, el epítopo se asociará con el CMH de clase I y permitirá la activación de células CTL. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de seleccionar epítopos como diana específicamente con el fin de activar selectivamente una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células.
Sumario de la invención
La invención se refiere a una composición para inducir una respuesta inmunitaria, en la que dicha composición comprende una adenilato ciclasa recombinante obtenida mediante la expresión del gen cyaC de Bordetella sp. funcionalmente unido a una secuencia de control de la expresión, y de un gen cyaA recombinante de Bordetella sp. que codifica para la adenilato ciclasa funcionalmente unido a una secuencia de control de la expresión, en la que dicho gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo y en la que la adenilato ciclasa carece de actividad catalítica; y en la que dicha expresión adicional se realiza en una célula huésped seleccionada del grupo de bacterias, células eucariotas y levaduras.
Se describe un plásmido recombinante útil para expresar adenilato ciclasa, en el que el plásmido comprende los genes cyaA y cyaC de la adenilato ciclasa de Bordetella sp., u homólogos de los mismos, unidos funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, en el que el plásmido recombinante dirige la expresión de la adenilato ciclasa de Bordetella sp. en una célula huésped transformada seleccionada del grupo que consiste en bacterias, células eucariotas y levaduras. En una realización específica de esta invención, el gen cyaA y el gen cyaC son el gen cyaA y el gen cyaC de Bordetella pertussis. En otras realizaciones específicas de esta invención, la célula huésped es E. coli, la secuencia de control de la expresión comprende el promotor lac, o el gen cyaA comprende ADN que codifica para un epítopo heterólogo. En una realización específica, el plásmido recombinante es pCACT3.
Esta solicitud también describe una molécula de ADN recombinante que comprende el gen de la adenilato ciclasa cyaA de Bordetella sp. u homólogos del mismo, en la que el gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo. En realizaciones de esta invención, la secuencia de ADN heteróloga codifica para menos de 25 aminoácidos, entre 10-20 aminoácidos y 16 aminoácidos. En realizaciones específicas de esta invención, la secuencia de ADN heteróloga es un epítopo del virus de la poliomelitis, virus VIH, virus de la gripe; o virus de la coriomeningitis linfocítica y se inserta en el dominio catalítico N-terminal o el dominio C-terminal.
Esta solicitud describe además una adenilato ciclasa de Bordetella pertussis recombinante que comprende un epítopo heterólogo en un sitio permisivo. En una realización de esta invención, la adenilato ciclasa está en forma detoxificada. En realizaciones específicas de esta invención, el epítopo heterólogo se inserta en el dominio catalítico N-terminal y el epítopo heterólogo se presenta a linfocitos T CD8^{+} en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I. En otras realizaciones específicas de esta invención, el epítopo heterólogo se inserta en el dominio C-terminal y se presenta a linfocitos T CD4^{+} en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II.
En una realización específica de esta invención, el sitio permisivo de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis se selecciona del grupo que consiste en los residuos 137-138, los residuos 224-225, los residuos 228-229, los residuos 235-236 y los residuos 317-318. En otras realizaciones específicas de esta invención, el epítopo heterólogo de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis recombinante es el epítopo 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica, un epítopo del virus VIH, en particular el epítopo incluido en el bucle V3, un epítopo del virus de la gripe, o un epítopo del virus de la poliomelitis, en particular el epítopo 103-116 del virus de la poliomelitis.
Además, esta solicitud describe un método para inducir una respuesta inmunitaria de células B que comprende inmunizar animales con bacterias vivas que expresan una adenilato ciclasa recombinante o una composición inmunológica que comprende una adenilato ciclasa recombinante o un fragmento de AC, en el que la adenilato ciclasa recombinante comprende un epítopo B heterólogo.
En realizaciones específicas de esta invención, las bacterias usadas en el método para inducir una respuesta inmunitaria de células B son E. coli. En una realización adicional, los animales inmunizados con la composición inmunológica o las bacterias son seres humanos. En realizaciones específicas, el epítopo B heterólogo es un epítopo B del virus de la poliomelitis, un epítopo B de VIH, un epítopo B del virus de la coriomeningitis linfocítica, o un epítopo B del virus de la gripe.
También se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria de células T CD4^{+}, en el que el método comprende inmunizar animales con una composición inmunológica que comprende una adenilato ciclasa recombinante, en el que la adenilato ciclasa recombinante comprende un epítopo T heterólogo en un sitio permisivo en el dominio C-terminal de dicha adenilato ciclasa recombinante.
En una realización específica de esta invención, la composición inmunológica comprende además un adyuvante adecuado. En una realización adicional, el epítopo T heterólogo es un epítopo T del virus de la poliomelitis, VIH, virus de la gripe o virus de la coriomeningitis linfocítica.
Esta solicitud describe además un método para inducir una respuesta inmunitaria de células T CD8^{+}, en el que el método comprende inmunizar animales con una composición inmunológica que comprende una adenilato ciclasa recombinante, en el que la adenilato ciclasa recombinante comprende al menos un epítopo de CTL heterólogo en al menos un sitio permisivo en el dominio catalítico N-terminal de la adenilato ciclasa recombinante.
En una realización específica de esta invención, la composición inmunológica comprende además un adyuvante adecuado, tal como hidróxido de aluminio. En una realización adicional, el epítopo T heterólogo es un epítopo T del virus de la poliomelitis, VIH, virus de la coriomeningitis, particularmente el epítopo 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis, o virus de la gripe.
Breve descripción de la figura
La figura representa esquemáticamente un método para construir el plásmido pCACT3.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La invención se refiere a una composición para inducir una respuesta inmunitaria, en la que dicha composición comprende una adenilato ciclasa recombinante obtenida mediante la expresión del gen cyaC de Bordetella sp. unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, y de un gen cyaA recombinante de Bordetella sp. que codifica para la adenilato ciclasa unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, en la que dicho gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo y en la que la adenilato ciclasa carece de actividad catalítica: y en la que además dicha expresión se realiza en una célula huésped seleccionada del grupo de bacterias, células eucariotas y levaduras.
Esta solicitud describe moléculas de ADN recombinante que comprenden el gen cyaA de Bordetella pertussis, en las que el gen cyaA contiene una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en un sitio permisivo. Esta invención también se refiere a una adenilato ciclasa recombinante de Bordetella pertussis que comprende un epítopo heterólogo en un sitio permisivo.
También se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria de células T CD4^{+} que comprende inmunizar animales con una composición inmunológica, en el que la composición inmunológica comprende una adenilato ciclasa recombinante de Bordetella pertussis con un epítopo T heterólogo en un sitio permisivo dentro del dominio C-terminal. También se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria de células T CD8^{+} que comprende inmunizar animales con una composición inmunológica en el que la composición inmunológica comprende una adenilato ciclasa recombinante de Bordetella pertussis con un epítopo T heterólogo en un sitio permisivo dentro del dominio catalítico N-terminal.
Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción y/o la traducción de un gen estructural. Esta regulación puede ser directa o indirecta. Por tanto, los ejemplos de secuencias de control de la expresión incluyen promotores, operadores, sitios de unión a ribosomas y ADN que codifica para sitios de unión a ribosomas.
Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia de ADN heteróloga" se refiere a una secuencia de ADN derivada del ADN de una especie distinta al ADN del resto de la molécula o gen en el que se ubica la secuencia heteróloga. La secuencia de ADN heteróloga puede sintetizarse enzimática o químicamente. Alternativamente, la secuencia de ADN heteróloga puede aislarse directamente de un microorganismo fuente.
Tal como se usa en el presente documento con referencia a una proteína, el término "sitio permisivo" se refiere a un sitio dentro de la molécula de proteína, en el que pueden añadirse aminoácidos exógenos sin afectar apreciablemente a las propiedades funcionales de la proteína.
Tal como se usa en el presente documento con referencia a un ácido nucleico, el término "sitio permisivo" se refiere a un sitio dentro del ácido nucleico, en el que pueden añadirse nucleótidos exógenos mientras se mantiene el marco de lectura sin afectar apreciablemente a las propiedades funcionales de una proteína expresada a partir del ácido nucleico.
Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a una secuencia de aminoácidos, u otra molécula o fragmento de la misma, que puede inducir una respuesta inmunitaria.
Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo B" se refiere a una secuencia de aminoácidos, u otra molécula o fragmento de la misma, que puede inducir una respuesta inmunitaria que implica a los linfocitos B.
Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo heterólogo" se refiere a un epítopo que puede insertarse en una proteína mediante técnicas recombinantes en el que el epítopo insertado no se encuentra de manera natural en esta proteína.
La cepa XL-1 de E. coli que contiene pCACT3 se depositó con la Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (Colección nacional de cultivos de microorganismos) del Instituto Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 París, Distrito 15, Francia, con el número de registro I-1201 el 8 de abril de 1992.
Los mecanismos por los que se controla la inmunogenicidad de los epítopos peptídicos definidos implican tanto las características intrínsecas de un epítopo dado como factores medioambientales. Estos factores medioambientales incluyen si el epítopo se expone como parte de estructuras complejas y organizadas, tales como parásitos o bacterias. Mediante la expresión de un epítopo peptídico dado en diferentes sitios permisivos de diversas proteínas bacterianas, es posible alterar los factores medioambientales y, por tanto, modificar específicamente la inmunogenicidad del epítopo peptídico.
La adenilato ciclasa de Bordetella pertussis representa un vehículo adecuado para especificar la respuesta inmunogénica de un epítopo peptídico heterólogo en las realizaciones de esta invención. La adenilato ciclasa de Bordetella pertussis constituye una de las toxinas esenciales de este microorganismo que es el agente causante de la tos ferina. La adenilato ciclasa se secreta por Bordetella pertussis y posee la capacidad de entrar en células eucariotas diana en las que, activada mediante la calmodulina (CaM), cataliza la síntesis del AMP cíclico (AMPc) afectando así al metabolismo celular. La adenilato ciclasa (AC) se sintetiza y secreta en forma de un polipéptido de 1706 aminoácidos: la actividad catalítica dependiente de calmodulina se localiza en los primeros 400 aminoácidos. La parte C-terminal de aproximadamente 1300 residuos es responsable de la unión a las células diana y de la translocación del dominio catalítico N-terminal a través de la membrana citoplasmática de estas células. Además, esta parte C-terminal posee una actividad hemolítica débil.
Varias características de la AC de Bordetella pertussis indican que esta toxina puede usarse como vehículo para inducir una respuesta inmunogénica específica:
1)
esta adenilato ciclasa puede entrar en muchas células diferentes, especialmente en diversos tipos de células asociadas con el sistema inmunitario;
2)
la adenilato ciclasa puede internalizarse por las células diana independientes de un proceso de endocitosis mediado por receptor, lo que sugiere que el dominio catalítico de la toxina puede penetrar directamente a través de la membrana citoplasmática de las células diana;
3)
el dominio catalítico N-terminal experimenta una rápida proteolisis dentro de las células diana lo que permite que los epítopos asociados con este dominio entren en la ruta del CMH de clase I de la presentación de antígenos; y
4)
están identificados varios aminoácidos implicados en la actividad catalítica de la AC, lo que permite la construcción de toxinas de AC modificadas que carecen de actividad enzimática y, por tanto, ya no son citotóxicas. Véase Sakamoto, H., Sebo, P., Ladant., J. Biol. Chem., 267:13598-13602 (1992).
El locus genético (cya) que codifica para la toxina de adenilato ciclasa (Cya) de Bordetella pertussis está compuesto de cinco genes (cyaA-E). El gen cyaA codifica para la adenilato ciclasa. La expresión del gen cyaA en E. coli conduce a la producción de un producto génico de 200 kDa que muestra actividad catalítica, pero que carece de actividades invasivas y hemolíticas. Sin embargo, la coexpresión del producto génico cyaC produce la holotoxina de cyaA invasiva y hemolítica en un sistema de expresión reconstituido en E. coli. La coexpresión de los genes cyaB, D, y E en posición trans con respecto a cyaA no confiere invasividad ni actividad hemolítica sobre la holotoxina, ni potencia las actividades provocadas por el producto génico cyaC.
Se cree que la activación mediada por CyaC de CyaA resulta de una modificación tras la traducción. Esta modificación no se pierde durante la purificación de la toxina a partir de B. pertussis mediante un procedimiento que incluye la extracción en urea 8 M o la separación en SDS-PAGE (Hewlett et al., 1989). Este hallazgo indica que la modificación es covalente.
Se compararon las actividades invasivas y hemolíticas de las toxinas de CyaA producidas de manera recombinante en E. coli o de manera natural en B. pertussis. Los resultados indican que las proteínas activadas por CyaC producidas en E. coli muestran una actividad hemolítica 5 veces menor que la toxina producida en B. pertussis. La razón de actividad hemolítica frente a invasiva no cambió significativamente con la purificación de las proteínas, lo que indica que la disminución de la actividad hemolítica no se debe a algún factor inhibitorio presente en los extractos de E. coli, sino que más bien refleja una propiedad intrínseca de las toxinas producidas en E. coli. Dos argumentos adicionales apoyan esta interpretación. En primer lugar, el transcurso de tiempo de la hemolisis es casi lineal, independientemente de la fuente de las toxinas, lo que indica que las estabilidades de las proteínas purificadas a partir de E. coli y B. pertussis son similares. En segundo lugar, pueden descartarse las posibles diferencias en la conformación inicial de las toxinas producidas en los dos microorganismos ya que los procedimientos de purificación suponen la desnaturalización completa en urea 8 M.
Estos datos indican que pueden separarse las actividades invasiva y hemolítica de la toxina de CyaA. Esto sugiere que distintos determinantes estructurales dentro de la toxina de CyaA están implicados en las actividades invasivas y hemolíticas. La disminución de la actividad hemolítica de la toxina producida en E. coli también podría explicarse mediante una diferencia en la naturaleza de las modificaciones tras la traducción que tienen lugar en los dos microorganismos o mediante la presencia de un factor adicional presente en B. pertussis que es necesario para conferir una actividad hemolítica completa a la toxina.
Se construyeron vectores de expresión que dirigían la expresión tanto del gen cyaA como del gen cyaC (Sebo et al., 1991). Adicionalmente, se construyó otro vector de expresión plasmídico, pCACT3, que contiene ambos genes cyaA y cyaC. Este vector de expresión permite que un segundo plásmido compatible lleve los genes necesarios para la secreción de la AC citotóxica en E. coli, tales como hlyB y hlyD, tal como se describe en Meckman et al., 1985.
El plásmido pCACT3 se construyó en varias etapas (véase la figura 1):
1)
Se construyó el plásmido pAHL1 mediante la inserción entre los sitios individuales PstI y EcoRI del plásmido pACM384, del oligonucleótido 5' CTG CAGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCT AAG TAAC TAA GAA TTC 3';
2)
se subclonó el fragmento PvuII-EcoRI de 1,4 kb de pAHL1 en un sitio de clonación múltiple del fagémido pTZ19R (Pharmacia) entre el sitio PstI (transformado en un extremo romo con la polimerasa de T4) y el sitio de EcoRI. El plásmido resultante es pACDL21;
3)
se insertó un fragmento Bell-Seal de 5,4 kb a partir del plásmido pACT7 (Sebo et al., 1991) entre los sitios individuales Bell-Seal de pACDL21 para dar el plásmido pDLACT1;
4)
se subclonó un fragmento NaeI-DdeI de 0,636 kb del plásmido pDIA4 (Glaser et al., 1988) que contenía el gen cyaC en el sitio SmaI del vector pTZ18R (Pharmacia) para dar el plásmido pCYACI en el que el gen cyaC está bajo el control del promotor lac;
5)
se subclonó el fragmento HindIII-ScaI de pDLACT1 que contenía el gen cyaA (6,2 kb) entre los sitios HindIII y ScaI de pCYAC1 para dar el plásmido pCACT3.
Por tanto, la toxina de AC puede expresarse en E. coli y/o secretarse mediante esta bacteria en grandes cantidades, y se purifica fácilmente (cromatografía de afinidad sobre resina CaM Affi-Gel).
Se ha desarrollado una metodología que posibilita identificar fácilmente, usando una selección doble (resistencia a un antibiótico y prueba calorimétrica sobre placas mediante \alpha-complementación), inserciones de oligonucleótidos (que conservan el marco de lectura) en la parte del gen que codifica para el dominio catalítico N-terminal de la toxina. Las consecuencias funcionales de estas mutaciones sobre la actividad catalítica de la toxina pueden analizarse fácilmente, tanto genética (complementación funcional de una cepa cya de E. coli) como bioquímicamente (caracterización de la estabilidad de las AC modificadas, de su actividad enzimática, de su interacción con CaM, etc.). Esta metodología ha permitido que se examinen un gran número de mutaciones con el fin de identificar los sitios que son potencialmente ventajosos para la inserción de determinantes antigénicos. Los plásmidos que se utilizan para esta identificación fueron derivados de pDIA5240 (P. Sebo, P. Glaser, H. Sakamoto y A. Ullman, Gene 1991, 104, 19-24, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia) que contenían los primeros 459 codones del gen cyaA y que expresaban la parte N-terminal de la AC (399 aminoácidos), desprovista de toda actividad invasiva o
citotóxica.
Específicamente, se ligó un fragmento PvuII-Bst de pDIA5240 que comprende codones de 373 bp de CyaA a la parte 3' terminal del gen (3999 pares de bases - 1333 codones). La proteína resultante recobra así, en presencia del producto del gen cyaC, su poder invasivo. Entonces se insertaron secuencias peptídicas adicionales de 10 a 20 aminoácidos en los sitios identificados anteriormente con el fin de analizar la citotoxicidad de las toxinas recombinantes. En realizaciones específicas de esta invención, esta inserción se produce en los sitios de restricción del gen cyaA. Las toxinas modificadas que conservan su citotoxicidad (es decir, cuyo dominio catalítico N-terminal se transporta normalmente hacia el citoplasma de las células diana) pueden usarse como vehículo para la presentación de determinantes antigénicos. Véase Ladant et al., 1992, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia. De esta manera, se han definido cinco sitios permisivos en la parte N-terminal de la AC (inserción entre los aminoácidos 137-138, 224-225, 228-236, 228-229, 235-236 y 317-318). Un mapeo más exhaustivo permitirá al experto habitual en la técnica localizar otros sitios permisivos usando los métodos descritos en el presente documento.
Se ha desarrollado una segunda metodología (resistencia a un antibiótico y prueba de hemolisis en placas Petri que contienen sangre), lo que permite inserciones de oligonucleótidos en marco en la parte del gen que codifica para la parte C-terminal hemolítica de la toxina que va a identificarse. Estas inserciones se llevan a cabo en un plásmido que permite la coexpresión de ambos genes cyaA y cyaC, tal como pCACT3. Véase anteriormente. La ventaja de caracterizar los sitios "permisivos" para la inserción de secuencias peptídicas adicionales en la parte carboxilo terminal de la toxina reside en el hecho de que, a diferencia del dominio N-terminal, este dominio permanece asociado con la superficie externa de la membrana citoplasmática. Por tanto, los epítopos insertados en esta región de la toxina podrían dirigirse hacia la ruta de la presentación antigénica específica del CMH de clase II. Por tanto, pueden construirse toxinas que están doblemente modificadas (en el dominio catalítico N-terminal y en el domino C-terminal) y que pueden poseer ambos epítopos dirigidos hacia el CMH de clase I y otros epítopos dirigidos hacia el CMH de clase II.
A/ Adenilato ciclasas recombinantes que expresan epítopos heterólogos: aplicaciones en vacunas 1. Inserción de epítopos B o T
La toxina de AC de B. pertussis se utiliza para presentar epítopos de importancia en vacunas al sistema inmunitario. Esta toxina recombinante puede utilizarse como un componente de la vacuna, o bien solo o en presencia de otra(s) preparación(es) antigénica(s). Puede utilizarse en forma tóxica o en forma detoxificada. La forma detoxificada puede obtenerse mediante mutagénesis dirigida. Por ejemplo, mediante la sustitución de la Lys58 o la Lys65 (Glaser et al., 1989, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia) por un residuo de Gln. Alternativamente, la forma detoxificada puede obtenerse mediante la inserción del oligonucleótido CTG CAG en el sitio EcoRV en la posición 564 de la fase codificante del gen cyaA. Véase Ladant et al., 1992.
El ADN que codifica para el derivado de adenilato ciclasa de B. pertussis de la invención puede obtenerse, a modo de ejemplo, de la siguiente forma.
Se lineariza el plásmido pDIA5240 en un sitio de restricción en el que va a insertarse el ADN que codifica para un epítopo heterólogo. En las realizaciones específicas de esta invención, el sitio de restricción es NruI cuando el sitio permisivo está en los residuos 137-138 o en los residuos 235-236. En otras realizaciones el sitio de restricción es HindIII cuando el sitio permisivo está en los residuos 224-225, en los residuos 228-229, o en los residuos 317-318. El derivado de pDIA5240 resultante que contiene el/los epítopo(s) heterólogo(s) en un sitio permisivo está limitado con PvuII y BstBI. Se aísla un fragmento de 1,4 Kb que contiene la parte del gen de la adenilato ciclasa que codifica para el dominio catalítico N-terminal y que comprende un epítopo heterólogo. Entonces se fusiona el fragmento de restricción al resto del gen cyaA insertándolo entre el sitio HindIII (conectado a un extremo romo mediante la ADN polimerasa de T4) y el sitio BstBI de pCACT3. El epítopo heterólogo puede insertarse en pDIA5240 como parte de un ligador que es compatible con un sitio permisivo apropiado. En realizaciones específicas de esta invención, el ligador codifica para aproximadamente 16 aminoácidos.
Puede introducirse cualquier epítopo reconocido por las células del sistema inmunitario, los linfocitos B o T, en los sitios permisivos de la AC. Cada molécula de toxina puede comprender una o más copias del mismo epítopo, o una combinación de epítopos diferentes, B o T, situados en diversos sitios de la toxina.
1.1 Epítopos B
Puede introducirse en la toxina cualquier epítopo reconocido por los linfocitos B y capaz de inducir anticuerpos que poseen actividad biológica. Por tanto, por ejemplo, se introducirá en la toxina el epítopo C3 del virus de la poliomielitis o el epítopo V3 del virus VIH, que pueden inducir anticuerpos que neutralizan estos virus. En una realización preferida de esta invención, el epítopo V3 del virus VIH que va a insertarse es RIQRGPGRAFVTIGK (residuos 315-329). En el caso del epítopo V3, pueden introducirse epítopos V3 que corresponden a los diversos aislados del virus en diversos sitios de la toxina.
De manera similar, pueden prepararse toxinas recombinantes que poseen otros epítopos del virus VIH (y en particular epítopos conservados). Cada molécula de toxina puede presentar, por tanto, diferentes epítopos B, en presencia o ausencia de otros epítopos (y en particular de epítopos T). Las preparaciones de vacuna pueden comprender moléculas de toxina recombinante que poseen diferentes epítopos T.
Alternativamente, estos epítopos pueden expresarse dentro de otras proteínas vectores. Por ejemplo, pueden usarse las dos proteínas de la envuelta de E. coli, LamB y MalE. Cuando el epítopo se expresa en la superficie de bacterias transformadas como parte de la proteína de membrana externa LamB, se induce una respuesta de anticuerpos independiente de células T caracterizada por una rápida inducción de anticuerpos IgM e IgG. Por el contrario, cuando el epítopo se expresa como parte de la proteína periplásmica MalE, se induce una respuesta de anticuerpo dependiente de células T, que pertenecen a la clase IgG.
La inmunización con las moléculas de toxinas recombinantes y la detección de los anticuerpos se lleva a cabo tal como se describe en Leclerc et al., 1991, que se incorpora al presente documento como referencia.
1.2 Epítopos T cooperadores (CD4^{+})
Las moléculas de toxina recombinante también pueden usarse para presentar epítopos reconocidos por linfocitos T CD4'. Estos epítopos se insertarán o bien solos o en combinación con otros epítopos T o B. Por tanto, pueden insertarse los epítopos T 103-116 del virus de la poliomielitis, solos o en continuidad con el epítopo B 93-103, los epítopos T del virus VIH, y en particular el epítopo T incluido en el bucle V3, o el epítopo T del virus de la coriomeningitis linfocítica incluido en la región 118-132 de la nucleoproteína. La secuencia de la región 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica es RPQASGVYMGNLTAQ.
La secuencia del epítopo B 93-103 del virus de la poliomielitis (Epítopo C3) es:
DNPASTTNKDK
La secuencia del epítopo T es:
KLFAVWKITYKDT.
Para la generación de las respuestas T cooperadoras CD4^{+}, los epítopos T se insertarán preferiblemente en la región C-terminal de la toxina que puede introducirse en la célula presentadora mediante una ruta de endocitosis. Pueden usarse moléculas de toxina que poseen actividad AC o que están mutadas para perder esta actividad, dependiendo del tipo de respuesta CD4^{+} deseada. La molécula recombinante puede consistir en un fragmento de la proteína adenilato ciclasa completa que expresa epítopo(s) extraño(s).
1.3 La detección de las respuestas CD4^{+} tras la inmunización con moléculas de adenilato ciclasa que presentan uno o más epítopos T reconocidos por linfocitos CD4^{+}
Se inmunizan animales, tales como ratones de diferentes variedades, con las moléculas de toxina recombinante en presencia de un adyuvante adecuado, tale como el adyuvante completo de Freunds, el adyuvante incompleto de Freunds o hidróxido de aluminio. Dos semanas después, se determinan las respuestas T CD4^{+} mediante la proliferación de linfocitos (ganglio linfático de drenaje o bazo), cultivados con el péptido correspondiente al epítopo T insertado, tal como se describió anteriormente. Véase Fayolle, et al., 1991. A la inversa, se determina el reconocimiento por los linfocitos de los ratones inmunizados con péptidos de moléculas de toxina recombinante in vitro mediante la incorporación de timidina. Véase Leclerc, et al. 1991.
1.4 Inserción de epítopos T reconocidos por linfocitos T citotóxicos
La toxina de AC posee la capacidad de entrar en el citoplasma de las células diana. Esto posibilita suministrar epítopos T reconocidos por linfocitos T CD8^{+} al citoplasma de estas células y permitir la asociación de estos epítopos con moléculas del CMH de clase I. Las fuentes de AC son Bordetella sp., homologues de la misma, u otros microorganismos que expresan AC. En realizaciones de esta invención, la adenilato ciclasa es una AC dependiente de calmodulina. En realizaciones específicas, la AC es AC de Bordetella pertussis.
1.5 Inducción de células T citotóxicas
Pueden obtenerse respuestas T citotóxicas mediante la inmunización con la toxina recombinante, sola o en presencia de un adyuvante tal como el hidróxido de aluminio. Las vías pueden ser la vía oral, la vía subcutánea o la intramuscular.
\newpage
La toxina recombinante expresa uno o más epítopos reconocidos por células T citotóxicas. Pueden insertarse otros epítopos, en particular epítopos reconocidos por linfocitos T cooperadores CD4^{+}, en la misma molécula de toxina. La identificación de un epítopo como un epítopo CTL o un epítopo T cooperador se determina experimentalmente.
Como ejemplo, se ha insertado en la toxina el epítopo 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica (Aichele, et al. 1990), que es tanto un epítopo CTL como T cooperador. La secuencia de aminoácidos de este epítopo es: RPQASGVYMGNLTAQ. Pueden insertarse epítopos de otros patógenos y en particular del VIH (epítopos CTL de las proteínas env, gag, nef, etc.). Ejemplos de epítopos adecuados se describen en Nixon et al., 1992, que se incorpora expresamente al presente documento como referencia. Pueden introducirse en la misma molécula de toxina varios epítopos que representan la secuencias de los diversos aislados del virus VIH. De manera similar, es posible usar una mezcla de moléculas de toxina recombinante, presentando cada una un epítopo CTL correspondiente a un aislado dado del virus VIH.
1.6 Detección de Respuestas T citotóxicas
Se estimulan linfocitos obtenidos de animales inmunizados con la toxina recombinante durante 5 días con células singénicas recubiertas con el péptido correspondiente al epítopo insertado, o en presencia de la toxina recombinante. La detección de los efectores T citotóxicos se lleva a cabo tal como se describió anteriormente (Fayolle et al., 1991). Las células diana, marcadas con cromo 51 ([^{51}Cr]) y que poseen las moléculas de clase I compatibles con las células efectoras, se incuban de antemano con el péptido correspondiente al epítopo CTL insertado en la toxina recombinante. Se calcula la respuesta T citotóxica mediante la liberación de ([^{51}Cr]) por las células diana lisadas.
B/ Adenilato ciclasas recombinantes que expresan epítopos heterólogos o un ligando para un receptor dado: aplicaciones de inmunotoxinas
La toxina de AC recombinante puede usarse para seleccionar como diana antígenos y receptores celulares. A continuación se facilitan ejemplos de varias construcciones que pueden concebirse:
1) Construcción de proteínas de fusión que contienen los primeros 1490 aminoácidos de la AC (esta forma truncada de la toxina no puede unirse a las células diana y, por tanto, no es tóxica), fusionada con un factor de crecimiento tal como TGF-\alpha (en el que la diana es el receptor del EGF (factor de crecimiento epidérmico)), con IL-2, IL-4 o IL-6 o cualquier otra linfocina, con regiones variables de anticuerpos que tienen una fuerte afinidad por receptores o antígenos que van a seleccionarse como diana, por ejemplo antígenos tumorales;
2) inserción de epítopos B en la AC para seleccionar como diana células B específicas, o inserción de cualquier otro ligando peptídico que reconoce receptores específicos;
3) construcción de una AC que lleva una cisteína adicional en el extremo C-terminal de la proteína, que permitirá que un polipéptido específico se fusione a la AC mediante acoplamiento químico. Debe recordarse que la AC es una proteína que no contiene cisteína.
La posible importancia de la toxina de AC de B. pertussis en comparación con otras inmunotoxinas reside en el hecho de que el envenenamiento de las células diana por la AC depende de un proceso de endocitosis mediado por receptor. Por tanto, cualquier marcador de superficie específico para una célula dada podría servir como un receptor para seleccionar como diana la toxina de AC recombinante que comprende una toxina de AC truncada fusionada con un ligando específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Bibliografía
Aichele, P., H. Hengartner, R. M. Zinkernagel y M. Schultz (1990), J. Exp. Med., 171, 1815-1820.
Barany, F. (1985a) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4202-4206.
Barany, F. (1985b) Gene (Amst.) 37, 111-123.
Charbit, A., Ronco, J. Michel, V., Werts, C. y Hofnung, M. (1991) J. Bacteriol. 173, 262-275.
Fayolle, C., Deriaud, E., Leclerc, C. (1991) J. Immunol. 147, 4069-4073.
Freimuth, P.I. y Ginsberg, H.S. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7816-7820.
Freimuth, P.I., Taylor, J.W., y Kaiser E.T. (1990) J. Biol. Chem. 265, 896-901.
Glaser, P., Ladant, D., Sezer, O., Pichot, F., Ullmann, A., y Danchin, A. (1988) Microbiol. 2, 19-30.
Glaser, P., Ladant, D., Sezer, O., Pichot, F., Ullmann, A., y Danchin, A. (1989) EMBO J. 8, 967-972.
Glaser, P., Munier, H. Gilles, A.M. Krin, E., Porumb, T., Barzu, O., Sarfati, R., Pellecuer, C., y Danchin, A. (1991) EMBO J 10, 1683-1688.
Hewlett, E.L., Gordon, V.M., McCaffery, J.D., Sutherland, W.M., y Gray, M.C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 19379-19384.
Kumar, G.B., y Black, P.N. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1348-1353.
Ladant, D., Glaser, P., Ullmann, A. (1992) J. Biol. Chem. 267, 2244-2250.
Leclerc, C., Charbit, A., Martineau, P., Deriaud, E., Hofnung, M. (1991) J. Immunol. 147, 3545-3552.
Meckman, N., Nicaud, J.H., Gray, L. y Holland, I.B. (1985) Mol. Gen. Genet. 201, 282-288.
Nixon, D.F., Broliden, V., Ogg, G. y Biolider, P.A. (1992), Immunology, 76:515-534.
Sebo, P., Glaser, P., Sakamoto, H., y Ullmann, A. (1991) Gene (Amst.) 104, 19-24.
Starzyk, R.M., Burbaum, J.J., y Schimmel, P. (1989) Biochemistry 28, 8479-8484.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: INSTITUTO PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 25-28 rue du Dr. Roux
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: PARÍS DISTRITO 15
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75724
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES RECOMBINANTES PARA INDUCIR RESPUESTAS INMUNITARIAS ESPECÍFICAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP93/00977
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = PstI
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 7..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = SalI
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 13..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = XbaI
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 19..24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = BamHI
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 24..30
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = SmaI
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 28..33
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = KpnI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCTAAGTAA CTAAGAATTC 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 33..35
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = terminación
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 37..39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = terminación
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 41..43
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = Terminación
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGTCCAGCT GAGATCTCCT AGGGGCCCAT GGATTCATTG ATTCTTAA 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Asp Thr}

Claims (24)

  1. \global\parskip0.970000\baselineskip
    1. Composición para inducir una respuesta inmunitaria, en la que dicha composición comprende una adenilato ciclasa recombinante obtenida mediante la expresión del gen cyaC de Bordetella sp. unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión y de un gen cyaA recombinante de Bordetella sp. que codifica para la adenilato ciclasa unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión, en la que dicho gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo y en la que la adenilato ciclasa carece de actividad catalítica; y en la que dicha expresión adicional se realiza en una célula huésped seleccionada del grupo de bacterias, células eucariotas y levaduras.
  2. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria de células T y dicha secuencia de ADN heteróloga es un epítopo T heterólogo.
  3. 3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha adenilato ciclasa recombinante es parte de una proteína de fusión que comprende linfocina, particularmente una linfocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-4 e IL-6.
  4. 4. Composición según las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha célula huésped es E. coli.
  5. 5. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria de células B y dicha secuencia de ADN heteróloga es un epítopo B heterólogo.
  6. 6. Composición según la reivindicación 5, en la que dicha composición comprende bacterias vivas que expresan el gen cyaC de Bordetella sp., y un gen cyaA recombinante de Bordetella sp. que codifica para la adenilato ciclasa, en la que dicho gen cyaA contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en al menos un sitio permisivo.
  7. 7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el gen cyaA es el gen cyaA de Bordetella pertussis.
  8. 8. Composición según la reivindicación 7, en la que el gen cyaC es el gen cyaC de Bordetella pertussis.
  9. 9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dichos genes cyaA y cyaC están en el plásmido recombinante pCACT3 depositado con la CNCM con el número de registro I-1201 el 8 de abril de 1992.
  10. 10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha secuencia de ADN heteróloga codifica para menos de 25 aminoácidos.
  11. 11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho sitio permisivo se selecciona del grupo que consiste en ADN que codifica para los residuos 137-138 del producto génico de dicho gen cyaA, ADN que codifica para los residuos 224-225 del producto génico de dicho gen cyaA, ADN que codifica para los residuos 228-229 del producto génico de dicho gen cyaA, ADN que codifica para los residuos 235-236 del producto génico de dicho gen cyaA y ADN que codifica para los residuos 317-318 del producto génico de dicho gen cyaA.
  12. 12. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho sitio permisivo es ADN que codifica para los residuos 235-236 del producto génico de dicho gen cyaA.
  13. 13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha secuencia de ADN heteróloga codifica para el epítopo C3 del virus de la poliomelitis humano.
  14. 14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha secuencia de ADN heteróloga codifica para un epítopo del VIH.
  15. 15. Composición según la reivindicación 14, en la que dicho epítopo es el epítopo V3 del virus VIH.
  16. 16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha secuencia de ADN heteróloga son los residuos 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica.
  17. 17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho gen de la adenilato ciclasa contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en el ADN que codifica para los residuos 235-236 del producto génico de dicho gen de la adenilato ciclasa y en la que dicha secuencia de ADN heteróloga codifica para el epítopo C3 del virus de la poliomelitis humano o un epítopo del virus VIH.
  18. 18. Composición según la reivindicación 17, en la que dicho epítopo es el epítopo V3 de VIH.
  19. 19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho gen de la adenilato ciclasa contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en un sitio permisivo ubicado en una secuencia de ADN que codifica para el dominio N-terminal del producto génico de dicho gen cyaA.
    \global\parskip1.000000\baselineskip
  20. 20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho gen de la adenilato ciclasa contiene al menos una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en un sitio permisivo ubicado en una secuencia de ADN que codifica para el dominio C-terminal del producto génico de dicho gen cyaA.
  21. 21. Composición según la reivindicación 20, en la que dicha secuencia de ADN heteróloga codifica o bien para un epítopo T del virus de la poliomelitis, o bien para un epítopo T del virus VIH, particularmente un epítopo T cooperador tal como el epítopo T V3 del virus VIH, o además un epítopo T del virus de la gripe.
  22. 22. Composición según la reivindicación 21, en la que dicho gen cyaA recombinante comprende una segunda secuencia de ADN heteróloga que codifica para un epítopo seleccionado del grupo que consiste en un epítopo del virus de la poliomelitis, un epítopo del virus VIH y un epítopo del virus de la gripe.
  23. 23. Composición según la reivindicación 20, en la que dicho epítopo T es el epítopo T del virus de la coriomeningitis linfocítica incluido en la región 118-132 de la nucleoproteína de dicho virus de la coriomeningitis.
  24. 24. Composición según la reivindicación 17, en la que dicho gen cyaA comprende además una mutación que suprime la actividad catalítica del producto génico de cyaA.
ES93911775T 1992-04-21 1993-04-21 Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias especificas. Expired - Lifetime ES2290950T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87179592A 1992-04-21 1992-04-21
US871795 1992-04-21
US1164493A 1993-01-29 1993-01-29
US11644 1993-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2290950T3 true ES2290950T3 (es) 2008-02-16

Family

ID=26682623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES93911775T Expired - Lifetime ES2290950T3 (es) 1992-04-21 1993-04-21 Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias especificas.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US5503829A (es)
EP (2) EP1715047A3 (es)
AT (1) ATE368113T1 (es)
CA (1) CA2133999A1 (es)
DE (1) DE69334155T2 (es)
DK (1) DK0637335T3 (es)
ES (1) ES2290950T3 (es)
PT (1) PT637335E (es)
WO (1) WO1993021324A1 (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110097352A9 (en) * 1992-01-29 2011-04-28 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US7611713B2 (en) * 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US9340577B2 (en) * 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
US6534482B1 (en) * 1998-05-13 2003-03-18 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20070020327A1 (en) * 1998-11-10 2007-01-25 John Fikes Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide and nucleic acid compositions
CA2377525A1 (en) * 1999-07-19 2001-03-29 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis c virus using peptide and nucleic acid compositions
US8128922B2 (en) * 1999-10-20 2012-03-06 Johns Hopkins University Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen
ATE445643T1 (de) * 1999-11-18 2009-10-15 Pharmexa Inc Heteroklitische analoga von klasse-i epitopen
CA2393662A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to p53 using peptide and nucleic acid compositions
US7026443B1 (en) * 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
US20070098776A1 (en) * 1999-12-13 2007-05-03 Fikes John D HLA class I A2 tumor associated antigen peptides and vaccine compositions
CA2394741A1 (en) * 1999-12-21 2001-06-28 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide and nucleic acid compositions
US7462354B2 (en) * 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
US20040248113A1 (en) * 1999-12-28 2004-12-09 Alessandro Sette Method and system for optimizing multi-epitope nucleic acid constructs and peptides encoded thereby
FR2805544B1 (fr) * 2000-02-28 2004-07-16 Pasteur Institut Adenylcyclase recombinante et procede de tri de molecules a activite proteolytique utilisant cette adenylcyclase
CN1454082A (zh) * 2000-09-08 2003-11-05 艾普免疫公司 使用肽和核酸组合物诱导针对乙型肝炎病毒的细胞免疫应答
ES2331348T3 (es) * 2000-09-15 2009-12-30 Pasteur Institut Vectores proteinicos para el suministro de moleculas a las celulas que expresan cd11b.
AU2007203473B2 (en) * 2000-09-15 2011-04-14 Centre National De La Recherche Scientifique Vectors for Molecule Delivery to CD11b Expressing Cells
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
DE10211063A1 (de) * 2002-03-13 2003-10-09 Axaron Bioscience Ag Neue Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen in vivo
EP1609107A4 (en) * 2003-03-28 2006-08-30 Idm Pharma Inc METHOD FOR IDENTIFYING OPTIMAL PEPTIDE PITOPARIANTS
WO2004098526A2 (en) 2003-05-05 2004-11-18 Johns Hopkins University Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein
EP1489092A1 (en) 2003-06-18 2004-12-22 Institut Pasteur Modified Bordetella adenylate cyclase comprising or lacking CD11b/CD18 interaction domain and uses thereof
WO2005035557A2 (en) * 2003-10-14 2005-04-21 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin Adenylate cyclase in the treatment and/or prophylaxis of immune-medicated disease
US20070026022A1 (en) * 2004-11-19 2007-02-01 Gilles Dadaglio Recombinant adenylate cyclase toxin of Bordetella induces T cell responses against tumoral antigens
EP1716415A1 (en) * 2003-11-21 2006-11-02 Institut Pasteur Recombinant adenylate cyclase of bordetella sp. for diagnostic and immunomonitoring uses, method of diagnosing or immunomonitoring using said recombinant adenylate cyclase, and kit for diagnosing or immunomonitoring comprising said recombinant adenylate cyclase
WO2005053738A1 (en) * 2003-11-21 2005-06-16 Institut Pasteur Recombinant adenylate cyclase toxin of bordetella induces t cell responses against tumoral antigens
DK1576967T3 (da) * 2004-03-18 2008-01-21 Pasteur Institut Rekombinant protein, der bærer epitoper fra det humane papillomvirus indsat i et adenylatcyclaseprotein eller et fragment deraf samt dets terapeutiske anvendelse
AU2005250170A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genimmune N.V. Peptides for inducing a CTL and/or HTL response to hepatitis C virus
US20060286613A1 (en) * 2004-11-19 2006-12-21 Claude Leclerc Recombinant adenylate cyclase of Bordetella sp. for diagnostic and immunomonitoring uses, method of diagnosing or immunomonitoring using said recombinant adenylate cyclase, and kit for diagnosing or immunomonitoring comprising said recombinant adenylate cyclase
WO2007079448A2 (en) * 2006-01-03 2007-07-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Three component carbohydrate vaccine
WO2008137115A1 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
ES2331271B1 (es) * 2007-06-29 2010-10-14 Universidad Del Pais Vasco Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas.
US20120039984A1 (en) 2008-07-03 2012-02-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycopeptide and uses thereof
CA2736799A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Burnham Institute For Medical Research Conserved hemagglutinin epitope, antibodies to the epitope, and methods of use
EP2233569B1 (en) 2009-03-23 2014-06-25 Institut Pasteur Mutant CyaA polypeptides and polypeptide derivatives suitable for the delivery of immunogenic molecules into a cell
JP5770711B2 (ja) 2009-03-23 2015-08-26 アンスティテュ パストゥール 細胞中への免疫原性分子のデリバリーに適したＣｙａＡポリペプチド突然変異体及びポリペプチド誘導体
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
EP2478915A1 (en) 2011-01-24 2012-07-25 Genticel CyaA-carried polypeptide(s) and use to induce both therapeutic and prophylactic immune responses
DK2691530T3 (en) 2011-06-10 2018-05-22 Univ Oregon Health & Science CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
WO2018091613A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection
EP3323426A1 (en) 2016-11-17 2018-05-23 Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5182211A (en) * 1987-08-07 1993-01-26 Institut Pasteur Plasmid vectors encoding a protein of a picornavirus
US5312902A (en) * 1988-06-09 1994-05-17 Institut Pasteur Dimer of the precursor of HIV-2 envelope glycoprotein
FR2638169B1 (fr) * 1988-10-25 1991-01-11 Pasteur Institut Derives d'adenyl cyclase et leurs utilisations biologiques
EP0406857B1 (en) * 1989-07-07 1995-05-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteins and production thereof
NO175188C (no) * 1990-06-27 1994-09-14 Sjur Olsnes Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol

Also Published As

Publication number Publication date
EP1715047A3 (en) 2008-08-27
DK0637335T3 (da) 2007-11-26
DE69334155T2 (de) 2008-02-14
EP0637335A1 (en) 1995-02-08
WO1993021324A1 (en) 1993-10-28
EP0637335B1 (en) 2007-07-25
PT637335E (pt) 2007-10-31
ATE368113T1 (de) 2007-08-15
DE69334155D1 (de) 2007-09-06
CA2133999A1 (en) 1993-10-28
US5679784A (en) 1997-10-21
EP1715047A2 (en) 2006-10-25
US5503829A (en) 1996-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2290950T3 (es) Mutantes recombinantes para inducir respuestas inmunitarias especificas.
US5935580A (en) Recombinant mutants for inducing specific immune responses
EP0689551B1 (en) Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
JP3428646B2 (ja) ジフテリア毒素ワクチン
JP3491896B2 (ja) 免疫調節ペプチド
JP3755773B2 (ja) 変異型ｒドメインを有するジフテリア毒素ワクチン
Romero et al. Immunization with synthetic peptides containing a defined malaria epitope induces a highly diverse cytotoxic T lymphocyte response. Evidence that two peptide residues are buried in the MHC molecule.
JPH08502244A (ja) 免疫調節ペプチド
US6660276B1 (en) Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor
AU615940B2 (en) Novel hiv proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of aids
JP4699612B2 (ja) Ｔヘルパー細胞エピトープ
KR960005181B1 (ko) 재조합 htlv-ⅲ 단백질 및 이의 용도
US6024958A (en) Polypeptide fragments capable of competition with Streptococcus mutans antigen I/II
Thomas et al. Nature of T lymphocyte recognition of macrophage-associated antigens. V. Contribution of individual peptide residues of human fibrinopeptide B to T lymphocyte responses.
US6861507B1 (en) Screening of neisserial vaccine candidates and vaccines against pathogenic neisseria
WO1998007441A1 (en) Allogeneic histocompatibility complexes as mediators of cell destruction
Rees et al. The effect of lipoylation on CD4 T-cell recognition of the 19,000 MW Mycobacterium tuberculosis antigen.
Schwartz et al. Genetic control of the T-lymphocyte proliferative response to cytochrome c
JP2000000099A (ja) ヘモフィルスインフルエンザｂ型菌の外皮膜タンパク質Ｐ２の部分断片を用いた接合体
Fayolle et al. Bordetella pertussis adenylate cyclase delivers chemically coupled CD8+ T-cell epitopes to dendritic cells and elicits CTL in vivo
JP3731004B2 (ja) ワクチン
CA2271699A1 (en) Chimeric ltb vaccines
JP2003289887A (ja) 免疫調節ペプチド
THOMAS et al. NATURE OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION OF MACROPHAGE-ASSOCIATED ANTIGENS
JPH03101697A (ja) Ｔ細胞性免疫性を刺激することが可能な合成ペプチド