PT2233569E - Polipéptidos mutantes de cyaa e derivados de polipéptidos adequados para a entrega de moléculas imunogénicas numa célula - Google Patents

Description

ΡΕ2233569 1

DESCRIÇÃO

"POLIPÉPTIDOS MUTANTES DE CyaA E DERIVADOS DE POLIPÉPTIDOS ADEQUADOS PARA A ENTREGA DE MOLÉCULAS IMUNOGÉNICAS NUMA CÉLULA" A invenção diz respeito a polipéptidos convenientes para uso na entrega de uma ou mais moléculas para a célula.

Em particular, a invenção relaciona-se com polipéptidos adequados para uso na entrega de uma ou mais moléculas que são capazes de provocar uma resposta imunitária num hospedeiro, dirigindo-se especificamente a células que expressam o receptor CDllb/CDl8 (também aqui referido como "células que expressam CDll b"). A invenção é mais particularmente dirigida a polipéptidos derivados de uma proteína adenilato ciclase (CyaA), sendo a última usada ou na forma de uma toxina ou de uma proteína desintoxicada ou toxóide, que são polipéptidos mutantes.

Os referidos polipéptidos mutantes são capazes de reter a actividade de ligação da CyaA nativa ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo e preferivelmente também retendo a actividade de translocção de CyaA 2 ΡΕ2233569 nativo, através do seu domínio N-terminal para as referidas células e além disso têm uma actividade de formação de poros que é reduzida ou suprimida comparada com a da toxina CyaA nativa. A invenção relaciona-se, em particular, com o uso dos referidos polipéptidos como vectores proteináceos. De acordo com isto, os polipéptidos mutantes são adicionalmente combinados com moléculas não-CyaA, dando assim origem a derivados polipeptídicos em que as referidas moléculas têm interesse preventivo como vacina e/ou terapêutico, quando administradas a um hospedeiro.

Os polipéptidos de acordo com a invenção são convenientes para uso como vectores proteináceos para a entrega de uma molécula, em particular de uma molécula polipeptídica contendo uma sequência de aminoácidos que compreende um ou mais epitopo(s), especialmente antigénios para uma célula, em particular células que expressam CDllb.

Assim, a invenção também se relaciona com um derivado polipeptídico (um derivado do polipéptido mutante da invenção) que compreende ou consiste num polipéptido mutante de acordo com a invenção, recombinado com uma ou mais moléculas, em particular com uma ou mais moléculas adequadas para desencadear uma resposta imunitária, constituindo assim um polipéptido recombinante ou uma proteína de fusão. A invenção também se relaciona com derivados de polipéptidos obtidos por enxerto químico da(s) referida(s) molécula(s)nos polipéptidos mutantes. 3 ΡΕ2233569

De acordo com uma forma de realização, os derivados polipeptídicos de acordo com a invenção são convenientes para uso no tratamento profiláctico e especialmente na vacinação e na terapia incluindo na imunoterapia, em particular para desencadear uma resposta imunitária num indivíduo. A CyaA nativa usada no contexto da presente invenção para o design de polipéptidos da invenção é a adenilato ciclase produzida em Bordetella Pertussis e que apresenta as seguintes características e propriedades, reveladas para o efeito de caracterizar a referida proteína, no contexto da invenção. A toxina-hemolisina adelylato ciclase RTX bi-funcional (também designada aqui como a toxina adenilato ciclaseCyaA, ACT, ou AC-Hly) , é um factor de virulência de Bordetella pertussis que é o agente causativo da tosse convulsa (1) . 0 seu polipéptido de 1706 resíduos é uma fusão de um domínio enzimático N-terminal de adenilato ciclase (AC) ou parte (~400 resíduos) a uma hemolisina RTX formadora de poros (Repetição em citolisina ToXina) de ~ 1306 resíduos constituindo a parte C-terminal do domínio (2) . O último contem os sítios de activação de proCyaA a CyaA por palmitoilação pós-traducional covalente de grupos ε-amino de Lys860 e Lys983 assim como as numerosas repetições RTX que formam ~40 sítios de ligação de cálcio, cujo carregamento é requerido para a actividade citotóxica de 4 ΡΕ2233569

CyaA (3,4). A proteína CyaA é realmente sintetizada como uma protoxina inactiva, que é convertida a uma toxina activa por palmitoilação pós traducional de dois resíduos de lisina internos (lisinas 860 e 983) . Esta modificação pós-traducional requere a expressão com o qene cyaA, de um gene acessório i.e. cyaC que está localizado perto de cyaA no cromossoma de B.perussis. A toxina dirige-se especificamente primariamente a fagócitos mielóides hospedeiros que expressam o receptor da integrina αΜβ2, também conhecido como CDllb/CDl8, CR3 ou Mac-1 (5). A referida toxina liga-se especialmente ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo através de um sítio de ligação do receptor presente na sua parte C-terminal. Estas células são, consequentemente, células alvo para a toxina nativa e também para os polipéptidos da invenção. CyaA insere-se na membrana citoplasmática de células e transloca o domínio enzimático AC para o citosol das referidas células alvo (6,7). Dentro das células, o AC é activado por calmodulina e cataliza a conversão não controlada de ATP a cAMP, uma molécula segundo mensageiro chave, provocando perturbação das funções bactericidas dos fagócitos (1). A doses elevadas (>100 ng/ml), a dissipação de ATP em cAMP, catalisada por CyaA torna-se citotóxica e promove apoptose ou mesmo morte necrótica rápida e lise de monócitos CDllb+ (8,9).

Recentemente os inventores mostraram que CyaA se liga a oligossacáridos ligados por N do seu receptor 5 ΡΕ2233569 CDllb/CDl8 (10). Isto sugere que interacções de baixa especificidade com glicanos de proteínas de superfície celular ubiquitárias ou glicolípidos podem contribuir para a capacidade reduzida de cerca de duas vezes, mas facilmente detectável de CyaA de penetrar também em células que não contêm CDllb/CDl8. De facto, devido à actividade catalítica especifica extremamente elevada do domínio AC, observou-se que CyaA eleva substancialmente os níveis de cAMP também em eritrócitos, linfócitos, linfoma, neuro-blastoma, CHO ou células de epitélio traqueal de mamíferos e aves (1, 11) . Já foi proposto em trabalhos anteriores providenciar uma toxina desintoxicada também chamada toxóide, em que a actividade de adenilato ciclase é diminuída, especialmente essencialmente suprimida. Um toxóide CyaA/AC” deste tipo pode ser usado para conseguir a preparação dos polipéptidos da invenção.

Para além de elevar o cAMP, a toxina exibe também uma actividade hemolítica moderada em eritrócitos de mamífero ou ave. Isto é devido à capacidade de formar pequenos poros selectivos para catiões de um diâmetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, que permeabilizam a membrana celular e finalmente provocam lise celular osmótica-colóide (12). Recentemente, os inventores e outros mostraram que a actividade de formação de poros de CyaA sinergiza com a sua actividade enzimática AC de invasão celular e contribui para a potência citolítica total de CyaA em células CDllb+ 6 ΡΕ2233569 (13, 14) . Devido a uma capacidade de formação de poros (hemolitica) intacta, na ausência de osmoprotectores tais como soro, o toxóide CyaA/AC- enzimaticamente inactivo (15) ainda exibe uma actividade hemolitica total em eritrócitos e uma actividade citolitica residual, reduzida cerca de dez vezes em monócitos em monócitos que expressam CDllb (8), o que determina um limite para o seu uso em terapia.

Observou-se anteriormente que as actividades hemolitica (formadora de poros) e de translocação de membrana AC (invasiva de células) de CyaA eram dissociáveis por baixa concentração de cálcio, baixa temperatura (16) e pela extensão e natureza de acilação de CyaA (4, 12, 17). Além disso, as duas actividades diferem substancialmente em sensibilidade a substituições de alterações de carga ou substituições neutras de glutamatos nas posições 509, 516, 570 e 581 no domínio hidrofóbico (8, 13, 18) . Foi assim proposto que as actividades de invasão celular e de formação de poros de CyaA são mutuamente independentes e operando em paralelo na membrana de células alvo. O modelo ilustrado na figura 5 A sugere que duas conformes distintas de CyaA se inserem em membranas celulares alvo em paralelo, sendo uma o precursor de translocação, que contribui para a entrega do domínio AC através da membrana celular com influxo concomitante de iões de cálcio para as células, e sendo a outra um precursor de poros formando finalmente poros oligométricos (13, 18, 19) 7 ΡΕ2233569

Os inventores testaram agora este modelo e refinaram-no, mostrando que a actividade de formação de poros não está envolvida na translocação do domínio AC através da célula alvo.

Na presente invenção, os inventores desenharam inicialmente péptidos CyaA mutantes, baseados na adenilato ciclase de Bordetella perussis, na forma de toxina ou na forma de toxóide, tendo uma combinação de substituições nos domínios formadores de poros (E570Q) e de acilação (K860R) e mostraram que esta combinação específica de substituições aboliam selectivamente a actividade permeabilizadora de células CyaA, eliminando assim a actividade citolítica individual de toxóides CyaA/AC em células CDllb+. Ao mesmo tempo, o constructo E570Q+K860R retinha a capacidade total de translocar o domínio AC para o citosol de células para elevar o cAMP celular e o seu toxóide era completamente capaz de distribuir epitopos contendo moléculas inseridas no referido constructo para a via citosólica de células dendríticas para a apresentação restrita a MHC classe I e indução de respostas de células T citotóxicas in vivo. 0 mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R concebido pelos inventores e no qual é inserido um péptido antigénico é inserido como descrito nos exemplos, é o primeiro constructo ilustrativo da capacidade do mutante CyaA de fornecer uma capacidade reduzida importante de permea-bilizar células que permanecem completamente capazes de translocar os domínios AC através da membrana celular. ΡΕ2233569

Os inventores conceberam agora constructos particulares, ilustrados especialmente como um toxóide CyaA/E570Q+K860R/AC e mostraram que apesar da sua actividade de permeabilização celular bastante reduzida (citolitica), permanece completamente activa na libertação em APCs CDllb+ . Os inventores mostraram ainda que a actividade citolitica total do toxóide CyaA/E570Q+K860RAC-é muito baixa. É assim desprovido de toxicidade residual num hospedeiro humano ou animal e é por isso bastante conveniente para uso em terapia. A invenção fornece assim novos péptidos que são toxóides e têm um perfil de segurança aumentado e podem ser usados como vectores proteináceos para a entrega de moléculas de interesse, em particular de sequências peptidicas imunogénicas em células de um doente em necessidade de um tratamento e mais particularmente a células que expressam CDllb.

Com base nas experiências realizadas pelos inventores, foi assim possível definir e providenciar um polipéptido, cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste numa das seguintes sequências: a) uma sequência de aminoácidos que é um fragmento que tem uma trecho de aminoácidos que compreende resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 de SEQ ID NO:l, no qual: 9 ΡΕ2233569 i) o resíduo de ácido glutâmico, correspondente à posição 570 na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definida em SEQ ID NO: 1, é substituído por um resíduo de glutamina; e ii) o resíduo de lisina, correspondente à posição 860 na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definida em SEQ ID NO: 1, é substituído por um resíduo de arginina,

tendo o referido fragmento a capacidade da proteína CyaA de Bordetella pertussis de se ligar ao receptor CDllb/CD18 de células que expressam o mesmo, a capacidade de translocar 0 seu domínio de enzima adenilato ciclase N-terminal para as referidas células e tendo uma actividade formadora de poros que está reduzida ou suprimida em comparação com a da toxina CyaA nativa; ou b)uma sequência de aminoácidos que difere de um fragmento que apresenta um trecho de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 da SEQ ID NO: 1, por: (i) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondente à posição 570 na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definida na SEQ ID NO: 1, por um resíduo de glutamina; (ii) a substituição do resíduo de lisina, 10 ΡΕ2233569 correspondente à posição 860, na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definida na SEQ ID NO: l,por um resíduo de arginina (iii) de 1 a 50 substituições adicionais; consistindo o polipéptido na referida sequência, tendo a capacidade da proteína CyaA de Bordetella pertussis de se ligar ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo, a capacidade de translocar o seu domínio de enzima adenilato ciclase N-terminal para as referidas células e tendo uma actividade formadora de poros que está reduzida ou suprimida em comparação com a da toxina CyaA nativa.

Para o efeito da invenção, o domínio N-terminal do fragmento descrito é a sequência de aminoácidos do fragmento que inclui os resíduos de aminoácido contíguos à parte N-terminal da proteína CyaA nativa, por exemplo a parte N-terminal do fragmento é tudo ou parte dos resíduos contíguos que formam a sequência de 400 resíduos de aminoácidos do domínio N-terminal da proteína CyaA da Bordetella pertussis.

Aqui, "E570Q" abrange substituição do resíduo de lisina na posição 860 da CyaA nativa de Bordetella pertussis por um resíduo de arginina.

Bordetella

Aqui "K860R" abrange substituição do resíduo de lisina na posição 860 da CyaA nativa de pertussis por um resíduo de arginina. 11 ΡΕ2233569 A CyaA nativa de Bordetella pertussis também foi descrita como uma sequência de aminoácidos e uma sequência de nucleótidos por Glaser, P. et al, 1988, Molecular Microbiology 2(1), 19-30. Esta sequência é referida como SEQ ID N°l, como ilustrado na figura 6. Consequentemente, quando resíduos de aminoácidos ou sequências ou nucleótidos ou sequências nucleotídicas da proteína CyaA de B. pertussis são citados na presente invenção, as suas posições são dadas com respeito às sequências publicadas na referida publicação de Glaser et al. 1988.

Numa forma de realização da presente invenção a sequência de aminoácidos da adenilato ciclase da Bordetella pertussis é a sequência publicada como SEQ ID N°l.

Quando aqui for feita referência a SEQ ID N°1 ou a SEQ ID N°2, é especialmente apontado que, a não ser que não seja tecnicamente relevante, as características publicadas aplicar-se-iam de modo semelhante a uma sequência modificada por inserção de resíduos na SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 de modo a desintoxicar a proteína CyaA. Neste caso, a numeração dos resíduos de aminoácidos deveriam ser adaptados (especialmente no que diz respeito às posições 570 e 860 da sequência nativa).

Vantajosamente a proteína CyaA ou fragmento desta é uma proteína ou fragmento desta, que é o resultado da co-expressão numa célula, especialmente numa célula 12 ΡΕ2233569 recombinante, de ambos os genes cyaA e cyaC. Foi realmente mostrado que para obter propriedades invasivas para células alvo, CyaA tem que sofrer modificações pós-traducionais que são possibilitadas pela expressão de ambos os genes cyaA e cyaC (WO 93/21324).

Como aqui descrito a proteína CyaA é uma proteína bacteriana. Como aqui descrito, a proteína CyaA é derivada da espécie Bordetella. A espécie Bordetella da invenção é a Bordetella pertussis. Outras estirpes de Bordetella são Bordetella parapertussis, Bordetella hinzll ou Bordetella bronchiseptlca. As sequências da proteína de B. pertussis foi publicada especialmente sob o número de acesso NC 002928.3 (como uma sequência de 1740 aminoácidos) e em Parkhill J. et al (Nat. Genet. DOI, 10 (2003)), para B hinzii em Donato G.M.et al (J. Bacteriol. 2005 Nov, 187(22):7579-88) e para B. bronchiseptica em Betsou F. et al (Gene 1995, August 30; 162(1):165-6). A expressão "mutante polipeptídico da proteína adenilato ciclase" exclui a adenilato ciclase nativa como expressa por Bordetella. Como referido acima, é caracteri-zado por uma diferença primária em relação à proteína nativa, residindo na substituição combinada de dois resíduos de aminoácidos específicos. Pode ser adicionalmente modificada com respeito à referida proteína nativa e pode especialmente ser um fragmento da proteína mutada 13 ΡΕ2233569 deste modo, como por exemplo uma variante truncada da referida proteína mutada, em que resíduos em qualquer ou ambos os terminais estão delectados. Em particular, resíduos na extremidade C-terminal podem ser delectados desde que não afecte o reconhecimento e sítio de ligação para o receptor CDllb/CDl8. Alternativamente ou em adição, podem ser delectados resíduos na extremidade N-terminal desde que não afecte a capacidade de translocação do péptido mutante obtido. Também pode ser um fragmento obtido após delecções internas de um ou mais resíduos da proteína CyaA nativa mutada.

Onde a invenção se relaciona com um mutante polipeptídico que é um fragmento como aqui referido, o referido fragmento, que compreende necessariamente os resíduos mutados E570Q e K860R (quando é feita referência à sequência de aminoácidos da proteína CyaA de Bordetella pertussis)também retém a capacidade da CyaA mutada de se ligar a células e de translocar o seu domínio N-terminal para o citosol de células que exprimem CDllb/CDl8. A invenção fornece deste modo polipéptidos mutantes convenientes para o uso na concepção de meios para a libertação de uma ou mais moléculas para dentro de uma célula, especialmente uma célula alvo que expressa o receptor CDllb/CDl8.

Em particular a invenção fornece péptidos mutantes de uma proteína CyaA, em que a referida proteína é 14 ΡΕ2233569 ou derivada da toxina CyaA ou é preferivelmente derivada de um toxóide desta, especialmente um toxóide CyaA/AC~. Os polipéptidos mutantes são capazes de se ligar a uma célula, especialmente uma célula alvo que expressa o receptor CDllb/CDl8, são capazes de translocar o seu domínio N-terminal ou a molécula inserida no referido domínio ou enxertada nele e a sua actividade de formação de poros é totalmente ou parcialmente suprimida comparada com a da toxina CyaA ou toxóide. A capacidade do polipéptido mutante de se dirigir especificamente para as células CDllb/CDl8 pode ser ensaiado especialmente de acordo com os métodos publicados em EP 03291486.3 e El-Azami-El-Idrissi M. et al, J.Biol.Chem., 278(40)38514-21 ou em WO02/22169. Além disso a capacidade do polipéptido mutante para translocar o epitopo(s) ou polipéptido(s) contendo o referido epitopo(s) para o citosol da célula alvo pode ser ensaiada aplicando o método descrito em WO 02/22169.

Supressão total ou parcial da actividade de formação de poros da toxina CyaA ou toxóide ou capacidade de permeabilização de células é para ser entendida como a supressão total ou parcial da capacidade de formar poros, em particular poros selectivos para catiões de um diâmetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, o que permeabiliza uma membrana celular e finalmente provoca a lise celular colóide-osmótica. A actividade de formação de poros pode ser medida usando uma experiência de "whole cell patch-clamp" como descrito nos exemplos. 15 ΡΕ2233569 A actividade formadora de poros da toxina CyaA contribui para a sua actividade total citolitica ou hemolítica em células. De facto, no contexto da presente invenção a actividade total citolitica ou hemolítica de CyaA (ou a sua "actividade citotóxica total") é para ser entendida como o resultado de pelo menos as actividades de adenilato ciclase e formadoras de poros da toxina CyaA. Esta supressão total ou parcial da actividade de formação de poros da toxina CyaA permite pelo menos uma supressão parcial da sua actividade citolitica.

Numa forma de realização preferida, a actividade citolitica total do polipéptido de acordo com a invenção, em particular em células que expressam o receptor CDllb/CD18, é totalmente ou parcialmente reduzida em comparação com a toxina CyaA de Bordetella pertussis. A actividade citolitica do polipéptido inventivo pode ser determinada medindo a quantidade de hemoglobina (para eritrócitos) ou de lactato desidrogenase (para monócitos) libertada pelas células quando incubadas com o polipéptido testado como descrito em exemplos.

Numa forma de realização preferida, a actividade citolitica total do polipéptido e acordo com a invenção em células que expressam o receptor CDllb/CDl8 é pelo menos 75% mais baixa, ainda preferivelmente pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% mais baixa do que a da toxina CyaA de Bordetella pertussis, ou de uma proteína CyaA de Bordetella pertussis 16 ΡΕ2233569 cuja actividade de adenilato ciclase é parcialmente ou totalmente suprimida (ou "toxóide CyaA"). Numa forma de realização particularmente preferida, a actividade citolí-tica total do polipéptido de acordo com a invenção em células que expressam o receptor CDllb/CDl8 é pelo menos 75% mais baixa, ainda preferivelmente pelo menos 80% ou 85% mais baixa do que a de toxóide CyaA de Bordetella pertussis cuja sequência de aminoácidos se mostra na figura 2 (SEQ ID N°2) .

Numa forma de realização preferida, a invenção relaciona-se com um polipéptido que é um mutante de uma adenilato ciclase e cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos (i) que é mutada com respeito à sequência de aminoácidos publicada em SEQ ID N°l, compreendendo as referidas mutações pelo menos as substituições E570Q e K860R ou (ii) que é um fragmento da proteína CyaA tendo a referida sequência de aminoácidos publicada como SEQ ID N°l, na medida em que o referido fragmento tem uma sequência de aminoácidos incluindo substituições E570Q e K860R e em que o polipéptido é capaz de se ligar ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo e de translocar o seu domínio N-terminal para o interior da referida célula.

Numa forma de realização particular da presente invenção, o fragmento incluindo uma substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 57 0 da SEQ ID N°1 por um resíduo de glutamina (referido como "E570Q"), e a 17 ΡΕ2233569 substituição do resíduo de lisina na posição 860 da SEQ ID N° 1 por um resíduo de arginina (referido como "K860R") abrangem pelo menos a sequência de aminoácidos da proteína CyaA começando com o primeiro resíduo N-terminal ou de um dos resíduos de aminoácidos compreendidos entre as posições 1 e 400, preferivelmente entre as posições 1 e 380 e estendendo-se aos resíduos que formam o sítio de reconhecimento e ligação para o receptor celular CDllb/CDl8 e o referido fragmento contem resíduos correspondendo aos resíduos E570Q e K860R mutados ou consistem na referida sequência de aminoácidos. Numa forma de realização preferida, o fragmento que inclui as substituições E570Q e K860R não compreende a sequência de aminoácidos estendendo-se do aminoácido na posição 1 da SEQ ID N°1 ao aminoácido na posição 372 da SEQ ID N°l.

Numa forma de realização preferida o fragmento assim preparado apresenta essencialmente perda da actividade de adenilato ciclase (actividade AC).

Numa forma de realização peferida, o péptido mutante da invenção é produzido por co-expressão numa célula recombinante de um gene mutado que codifica a sequência de aminoácidos de CyaA com as mutações E570Q e R860R e do gene cyaC, seguida de recuperação do fragmento expresso seleccionado de CyaA mutante.

Preferivelmente, o péptido mutante da invenção tem um resíduo de lisina na posição 983 da sequência de 18 ΡΕ2233569 aminoácidos CyaA como apresentada na SEQ ID N°1 e que está acilada, em particular que está palmitoilada ou palmito-leilada.

Alternativamente, o péptido mutante da invenção tem um resíduo de lisina que corresponde ao resíduo de lisina na posição 983 da sequência de aminoácidos de CyaA como apresentado na SEQ ID N°l, que não está acilada.

Alternativamente, o péptido mutante da invenção tem um resíduo de lisina que corresponde ao resíduo de lisina na posição 983 da sequência de aminoácidos, como apresentado na SEQ ID N°1 que não está acilada.

Numa forma de realização específica, o péptido mutante da invenção tem uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de CyaA publicada em SEQ ID N° 1 por mutação de resíduos resultando em E570Q e K860R e tem uma sequência de aminoácidos que partilha 50%, preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID N°1.

Noutra forma de realização preferida, o péptido mutante da invenção tem uma sequência de aminoácidos que difere de um fragmento que tem uma extensão de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 de SEQ ID N°1 por mutação de resíduos que resultam em E570Q e K860R e por uma mutações adicionais que resultam 19 ΡΕ2233569 em 1 a 50 substituições de resíduos de aminoácidos incluindo as substituições E570Q e K860R.

Numa forma de realização específica, o péptido mutante da invenção não apresenta substituições, delecções e/ou inserções de resíduos de aminoácidos, comparado com a sequência de aminoácidos de CyaA de Bordetella pertussis para além das substituições E570Q e K860R. Numa forma de realização específica o polipéptido mutante tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°2 como ilustrado na figura 7. Noutra forma de realização específica, as únicas substituições, delecções e/ou inserções adicionais de aminoácidos comparada com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°2, consiste em substituições, delecções e/ou inserções que suprimem total ou parcialmente a actividade de adenilato ciclase da proteína CyaA, tal como em particular a inserção de um dipéptido, por exemplo um dipéptido "LQ" ou "GS" entre os aminoácidos correspondentes às posições 188 e 189.

Numa forma de realização particular, o polipéptido mutante da invenção difere da sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°l, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições, delecções e/ou inserções de resíduos de aminoácidos para além das substituições E570Q e K860R.

Numa forma de realização particular, para além das substituições E570Q e K860R, o resíduo de leucina na 20 ΡΕ2233569 posição 247 da proteína nativa CyaA de Bordetella pertussis é substituída por um resíduo de glutamina (L247Q) ou por outro resíduo de aminoácido em particular um resíduo de aminoácido conservativo.

Um polipéptido mutante da invenção que é um fragmento, como aqui publicado, da sequência de aminoácidos revelada em SEQ ID N°l, deve ser entendida como uma sequência que compreende um ou mais fragmentos tendo uma extensão de aminoácidos que compreendem os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 e até cerca de 1705 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos SEQ ID N°1, em particular fragmentos que compreendem uma extensão de pelo menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 resíduos de aminoácidos de SEQ ID N°l, abrangendo resíduos E570Q a K860R. Um polipéptido mutante da invenção também pode ser definido como um fragmento da sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID N°2, que compreende um ou mais fragmentos tendo uma extensão de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 e até cerca de 1705 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos SEQ ID N°2, em particular fragmentos que compreendem uma extensão de pelo menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 resíduos de aminoácidos da SEQ ID N°2, abrangendo resíduos de 570 e 860. Os referidos fragmentos retêm preferivelmente a capacidade de se ligarem ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo e a capacidade de translocar o seu domínio N-terminal para o interior das referidas células. 21 ΡΕ2233569

Preferivelmente o polipéptido mutante da invenção que é um fragmento que tem uma extensão de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos 570 como E570Q a 860 como K860R ou 1 a 860, ou 2 a 860 da SEQ ID N°l, desde que as mutações E570Q e K860R sejam observadas com respeito à SEQ ID N°1 original.

Numa forma de realização preferida, o fragmento compreende ainda resíduos de aminoácidos 1166 a 1281 ou resíduos de aminoácidos 1208 a 1243 da sequência de aminoácidos de CyaA, como apresentado na SEQ ID N°1 da proteína CyaA para interacção com células alvo CDllb/CDl8.

Assim, um fragmento particular abrange toda ou parte da parte C-terminal da proteína nativa, parte essa que é responsável pela ligação do polipéptido da invenção à membrana celular alvo e/ou ao receptor CDllb/CDl8 e pela subsequente libertação do domínio N-terminal do polipéptido para o citosol da célula. Um polipéptido particular da invenção é o fragmento CyaA da proteína que contém os resíduos de aminoácidos 373 a 1706 da proteína CyaA especialmente da SEQ ID N°l, desde que os resíduos 570 e 860 estejam mutados como E570Q e K860R.

Noutra forma de realização preferida, o polipéptido mutante é um fragmento que têm uma extensão de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou 2 a 860 da SEQ ID N°l, no qual: 22 ΡΕ2233569 a) uma primeira sequência de aminoácidos, que corresponde a uma extensão de pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos de SEQ ID N°l, compreende os resíduos de aminoácidos 570, na forma de E570Q e ainda inclui 1, 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições em comparação com SEQ ID N°1 e b) uma segunda sequência de aminoácidos, que corresponde a uma extensão de pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID N°l, compreende os resíduos de aminoácidos 860, na forma de K860R e ainda inclui 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições comparado com a SEQ ID N°1 e preferivelmente compreende c) uma terceira sequência de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos 1166 a 1281 ou os resíduos de aminoácidos 1208 a 1243 da sequência de aminoácidos da CyaA, como apresentada na SEQ ID N°1 da proteína CyaA para interacção com células alvo CDllb/CDl8. O pedido de patente revela um fragmento, que é tal que corresponde à proteína CyaA com mutações E570Q e K860R, em que os resíduos de aminoácidos 225 a 234 foram delectados, providenciando um fragmento que contem os resíduos 1 a 224 e 235 a 1706 da proteína mutada.

Numa forma de realização particularmente preferida, um fragmento de polipéptido de acordo com a invenção liga-se a uma célula que expressa o receptor CDllb/CDl8 como resultado de ligação específica ao referido receptor. 23 ΡΕ2233569

Numa forma de realização preferida, a actividade da adenilato ciclase do polipéptido numa célula é parcialmente ou totalmente suprimido em comparação com a da toxina CyaA de Bordetella pertussis. Como acima referido, a expressão "proteína CyaA" relaciona-se ou com a forma de toxina ou preferivelmente com a forma toxóide da proteína. Consequentemente cada forma de realização da invenção que se relaciona com o polipéptido que é um mutante da proteína CyaA aplica-se a cada forma de toxina ou toxóide da proteína.

Supressão total ou parcial da actividade de adenilato ciclase de CyaA ou actividade enzimática, é para ser entendida como a supressão total ou parcial da capacidade de converter ATP em cAMP num ambiente celular em comparação com a da toxina CyaA produzida pela co-expressão dos genes cyaA e cyaC numa célula. A capacidade de converter ATP em cAMP pode ser determinada medindo o nível de cAMP intracelular como descrito nos exemplos.

Esta supressão total ou parcial pode ser obtida como resultado de inactivação genética, por exemplo por introdução de uma curta sequência de aminoácidos, compreendendo por exemplo de um a dez aminoácidos, em particular um dipéptido num sítio da sequência de aminoácidos de CyaA, que é parte do sítio catalítico, i.e. num sítio localizado entre os 400 aminoácidos (domínio AC) da SEQ ID N°1 ou por substituição de uma parte da sequência de aminoácidos da CyaA, como apresentada na SEQ ID N°l, que é essencial para 24 ΡΕ2233569 a actividade catalítica. Numa forma de realização preferida, a supressão total ou parcial da actividade enzimática de CyaA é obtida por inserção de um dipéptido, por exemplo um dipéptido "LQ" ou "GS", entre os aminoácidos correspondentes às posições 188 e 189 da sequência CyaA como apresentado na SEQ ID N°l. Isto pode ser conseguido inserindo um nucleótido tal como "CTG CAG" ou "CGATCC", no sítio EcoRV, na posição 564 da fase codificante do gene cyaA. Ver Ladant et al, 1992. Alternativamente, a supressão total ou parcial da actividade enzimática também pode ser obtida por mutagénese direccionada, por exemplo, substituindo o resíduo de lisina na posição 58 ou 65 da proteína CyaA nativa de Bordetella pertussis (Glase et al., 1989) por um resíduo de Gin. A invenção também é dirigida a uma derivado de polipéptido que compreende ou consiste no polipéptido mutante, de acordo com a invenção, que é adicionalmente combinado com uma ou mais moléculas de interesse. Numa forma de realização preferida, uma molécula de interesse é uma molécula biologicamente activa tanto sozinha como combinada com o polipéptido da invenção. As referidas moléculas podem especialmente ter valor profiláctico ou terapêutico, i.e, podem ter uma actividade profiláctica ou terapêutica ou pode aumentar uma actividade profiláctica ou terapêutica.

Em implementações específicas, as moléculas de interesse são seleccionadas no grupo que compreende: 25 ΡΕ2233569 péptidos, glicopéptidos, lipopéptidos, polissacáridos, oli-gossacáridos, ácidos nucleicos, lípidos e substâncias químicas.

Em implementações especificas, a uma ou mais moléculas de interesse são moléculas polipeptídicas ou contêm moléculas polipeptídicas. A sua sequência de aminoácidos pode conter 2 a 1000, preferivelmente 5-800, 5 a 500, 5 a 200, 5 a 100, 8 a 50, 5 a 25, 5 a 20 ou 8 a 16, ou 300-600, 400-500 resíduos de aminoácidos.

Numa forma de realização preferida, a uma ou mais moléculas de interesse são sequências de aminoácidos heterólogos convenientes para desencadear uma resposta imunitária (também referidos como "antigénios heterólogos") , em particular sequências de aminoácidos que compreendem ou consistem num epitopo, incluindo antigénios. Como usado aqui o termo "herólogo" refere-se a um antigénio que não o péptido mutante que é usado no próprio vector. Como usado aqui o termo "epitopo" refere-se a uma molécula heteróloga e especialmente um péptido heterólogo que pode desencadear uma resposta imunitária, quando apresentada ao sistema imunitário de um hospedeiro. Em particular, um epitopo deste tipo pode compreender ou consiste de uma extensão de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 resíduos de aminoácidos. Pode alternativamente consistir num antigénio de tamanho total ou consistir em fragmento(s) de antigénio(s). 26 ΡΕ2233569

Numa forma de realização específica, um derivado de polipéptido de acordo com a invenção pode ser codificado por um plasmídeo que corresponde ao plasmídeo OVA-QR-AC depositado com o número de acesso CNCM 1-4137 (figura 12) no qual a sequência de DNA que codifica a sequência antigénica "OVA" é substituída por uma sequência de DNA que codifica uma sequência antigénica que compreende um ou mais epitopos. A molécula polipeptídica adequada para desencadear uma resposta imunitária é especialmente uma que desencadeia uma resposta imunitária por células T, incluindo por exemplo uma resposta CTL. A molécula polipeptídica adequada para desencadear uma resposta imunitária também pode ser uma que desencadeia uma resposta imunitária por células B.

Em implementações específicas, o antigénio heterólogo é seleccionado do grupo que consiste num antigénio de um patogénico bacteriano, um antigénio de célula tumoral, um antigénio virai, um antigénio retro-viral, um antigénio de um fungo ou um antigénio de célula parasita.

Uma molécula de interesse pode ser especialmente um antigénio seleccionado do grupo que consiste em: um antigénio de Clamídia, um antigénio de micoplasma, um antigénio de vírus de hepatite, um antigénio de poliovírus, 27 ΡΕ2233569 um antigénio de virus de HIV, um antigénio de virus de influenza, um antigénio de virus da coriomeningite, antigénio tumoral ou uma parte de qualquer destes antigénios que compreende pelo menos um epitopo.

Numa forma de realização preferida do derivado polipeptidico da invenção, a sequência de aminoácidos de cada uma das referidas molécula (s) adequada para desencadear uma resposta imunitária compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos de um antigénio de Clamidia, um antigénio de micoplasma, um antigénio de virus de hepatite, um antigénio de poliovírus, um antigénio de virus de HIV, um antigénio de virus de influenza, uma sequência de virus da coriomeningite, um antigénio tumoral, ou compreende ou consiste numa parte de uma sequência de aminoácidos de qualquer destes antigénios que compreende pelo menos um epitopo.

Numa forma de realização particularmente preferida, a molécula de interesse é um antigénio associado a tumores (tumour associated antigen-TAA). Antigénios associados a tumores foram caracterizados para numerosos tumores, como por exemplo: melanoma, especialmente melanoma metastático; carcinoma do pulmão; carcinoma da cabeça e do pescoço; carcinoma do cérvix; carcinoma do esófago; carcinoma da bexiga, especialmente carcinoma infiltrante da bexiga; carcinoma da próstata; carcinoma da mama; carcinoma colorectal; carcinoma colorectal; carcinoma de células renais; sarcoma; leucemia; mieloma. Para estes vários tipos 28 ΡΕ2233569 histológicos de cancros, mostrou-se que os péptidos antigénicos são especificamente expressos em amostras tumorais e são reconhecidos por células T, especialmente células T CD8+ ou células T CD4+.

Uma revisão de péptidos encontrados como antigénios associados a tumores nestes tipos de tumores é feita por Van der Bruggen P. et al (Immunological Revews, 2002, vol 188:51-64). Especialmente, a divulgação dos péptidos contidos na tabela 3 da referida revisão é referida aqui como fornecendo exemplos destes antigénios associados a tumores e a referida tabela 3 é incorporada por referência na presente aplicação.

Os antigénios seguintes são citados como exemplos de antigénios associados a tumores reconhecidos por células T, de acordo com a publicação de Kawakami Y. et al (Câncer Sei, October 2004, vol.95, no 10, p784-791) que também providencia métodos para triagem destes antigénios ou adicionais: antigénios partilhados por vários cancros, incluindo MAGE (especialmente em Melanoma), NY-ESO-1, Her2/neu, WTl, Survivin, hTERT, CEA, AFP, SART3, GnT-V, antigénios específicos para alguns cancros particulares tais como β-catenina, CD4, MART-2, MUM3, gplOO, MART-1, tirosinase para melanoma; bcr-abl, TEL-AMLl para leucemia; PSA, PAP, PSM, PSMA para cancro da próstata; proteinase 3 para leucemia mielógena; MUC-1 para cancros da mama, do ovário ou do pâncreas; EBV-EBNA, HTV-1 tax para linfoma, ATL ou cancro do cérvix; HLA-A2 mutada para cancro de 29 ΡΕ2233569 células renais; HAl para leucemia/linfoma. Também foram descritos antigénios associados a tumores em animais tais como ciclina Dl e ciclina D2 em tumores que afectam gatos ou cães.

Antigénios associados a tumores reconhecidos por células T também foram divulgados em Novellino L. et al (Immunol Imunother 2004, 54:187-207).

Mais geralmente, TAA de interesse na presente invenção são os correspondentes a antigénios mutados ou a antigénios que estão sobre-expressos em células tumorais, a antigénios partilhados, antigénios de diferenciação específicos de tecidos ou a antigénios virais.

Numa forma de realização particular da invenção, o antigénio associado a tumores é um antigénio de virus de papiloma (HPV) ou tirosinase.

De acordo com outra forma de realização particular da invenção, as sequências de aminoácidos das moléculas polipeptídicas que compreendem ou consistem num epitopo foram modificadas em relação à sua sequência nativa de aminoácidos, por exemplo para diminuir o número de resíduos de aminoácidos carregados negativamente na sequência. Uma modificação deste tipo pode ser obtida removendo alguns destes resíduos de aminoácidos carregados negativamente ou também adicionando alguns resíduos de aminoácidos carregados positivamente, especialmente como 30 ΡΕ2233569 resíduos flanco dos epitopos. Assim polipéptidos que compreendem menos resíduos carregados negativamente podem favorecer a translocação do domínio catalítico do derivado polipeptídico da invenção para o citosol de células alvo.

As sequências de aminoácidos das moléculas polipeptídicas que compreendem ou consistem num epitopo ou um antigénio também podem ser concebidas de tal modo que são desdobradas quando são inseridas no derivado polipeptídico da invenção, o que aumenta a eficiência de internalização da(s) molécula(s) de interesse de acordo coma invenção para células alvo. Este desdobramento em polipéptidos que sofrem dobramento como consequência do seu conteúdo em aminoácidos, pode ser obtido por exemplo, removendo ou substituindo resíduos de cisteína para evitar a formação de pontes dissulfureto que podem estar envolvidas no dobramento de polipéptidos. Nalguns casos é possível evitar o dobramento de polipéptidos preparando-os na presença de agentes redutores para evitar o redobramento in vivo.

Numa forma de realização particular, a sequência de aminoácidos, especialmente o antigénio, pode compreender ou consistir em epitopos crípticos.

Os inventores determinaram, de facto, que constructos de derivado de polipéptido, que compreendem (i) um polipéptido da invenção que é um mutante de uma proteína CyaA (mutante do polipéptido) de acordo com as definições 31 ΡΕ2233569 reveladas aqui e (ii) uma molécula polipeptídica tendo uma sequência de aminoácido que apresenta um ou vários fragmentos antigénicos de um ou vários antigénios, permitem que epitopos crípticos dos referidos antigénios se tornem imunogénicos como resultado da sua apresentação nos constructos. Especialmente os referidos constructos envolvem polipéptidos mutantes como definido na presente invenção, compreendem molécula(s) polipeptídica(s) derivadas de antigénios de interesse, especialmente para aplicações profilácticas ou terapêuticas, incluindo efeitos de vacinação imunoterapêutica, são processados em células alvo em que a(s) molécula(s) polipeptídica(s) são deixadas internalizar como resultado da translocação do domínio N-terminal do polipéptido mutante. Este processamento permite a apresentação de epitopos através das moléculas MHC classe I das células alvo e os referidos epitopos podem compreender epitopos críticos do antigénio que se deixa tornarem-se imunogénicos e, em particular, ocasionar uma resposta de células T num hospedeiro, especialmente uma resposta CTL.

Assim, invenção também se relaciona com um derivado polipeptídico, em particular uma proteína recombinante que compreende uma ou várias moléculas polipeptídicas tendo uma sequência de aminoácidos que contem um ou vários epitopos de um ou vários antigénios, ou contendo os referido(s) antigénio(s), a(s) referida(s) sequência(s) de aminoácido(s) da(s) referida(s) molécula(s) polipeptídica(s) inseridas no mesmo sítio ou em sítios 32 ΡΕ2233569 diferentes, especialmente em sítios permissivos diferentes de um polipéptido mutante de acordo com a invenção, retendo a referida proteína recombinante a propriedade da toxina CyaA de se dirigir especificamente a células apresentadoras de antigénio (antigen presenting cells-APC), em que pelo menos um dos referidos epitopos é um epitopo de células T críptico subdominante e em que o referido derivado polipeptídico, especialmente a referida proteína recombinante, é capaz de desencadear uma resposta específica de antigénio contra a referida molécula(s) polipeptídica (s) .

Numa forma de realização específica do derivado do polipéptido de acordo com a invenção, a ou as sequência(s) de aminoácido(s) são inserido (s) num ou mais sítio(s), especialmente sítio(s) permissivos.

Para a presente invenção, um "sítio permissivo" é um sítio da sequência da proteína CyaA em que pode ser inserido um polipéptido sem afectar substancialmente as propriedades funcionais desejadas da proteína CyaA especialmente sem afectar substancialmente a capacidade de dirigir especificamente para células, particularmente de dirigir especificamente para células apresentadoras de antigénio (APC) por CyaA, incluindo sem afectar substancialmente a ligação específica ao receptor CDllb/CDl8 e, com vantagem, sem afectar substancialmente os domínios da proteína envolvida no processo de translocação do domínio N-terminal de CyaA para uma célula alvo. 33 ΡΕ2233569 Métodos para seleccionar sítios permissivos estão apresentados por exemplo em W093/21324, em Ladant et al., 1992 e Osicka et al., 2000 (Infection and Immunity, 2000, 68(1):247-256). Em particular, uma metodologia que usa uma selecção dupla (resistência a um antibiótico e teste colorimétrico de recipientes por complementação a) permite identificar rapidamente inserções oligonucleotídicas (que presevam a grelha de leitura) na porção do gene que codifica o domínio catalítico N-terminal da toxina. As consequências funcionais destas mutações na actividade catalítica da toxina podem ser facilmente analisadas tanto do ponto de vista genético (complementação funcional de uma estirpe E.coli cya) como bioquímico (caracterização da estabilidade das adenilciclases modificadas, da sua actividade enzimática, da sua interacção com caM, etc) . Esta metodologia tem permitido a triagem de um grande número de mutações para identificar os sítios que são potencialmente vantajosos para a inserção de determinantes antigénicos. Sítios permissivos da adenilato ciclase de Bordetella pertussis que permitem a translocação do domínio catalítico de CyaA e assim translocação de sequências de aminoácidos inseridas nesses sítios permissivos incluem, mas não estão limitados a, resíduos 137-138 (Val-Ala, resíduos 224-225 (Arg-Ala) , resíduos 228-229 (Glu-Ala), resíduos 235-236 (Arg-Glu) e resíduos 317-318 (Ser-Ala) (Sebo et al., 1995). Os seguintes sítios permissivos adicionais também estão incluídos em implementações da 34 ΡΕ2233569 invenção: resíduos 107-108 (Gly-His), resíduos 132-133 (Met-Ala), resíduos 232-233 (Gly-Leu) e 335-336 (Gly-Gln) e 336-337. No entanto podem ser usados outros sítios permissivos na presente invenção, que podem ser identificados por exemplo por uso da metodologia indicada acima, especialmente sítios entre os resíduos 400 e 1700 da proteína CyaA.

Para outras espécies de Bordetella pertussis os sítios permissivos correspondentes podem ser definidos por comparação de sequências e determinação dos resíduos correspondentes.

Como aqui descrito, o polipéptido de uma ou mais sequências de aminoácidos também pode, ou alternativamente se inserido numa e/ou a outra extremidades (parte final) do polipéptido da invenção, preferivelmente no extremidade N-terminal do polipéptido CyaA mutante desprovido de todo ou parte do domínio catalítico N-terminal da proteína CyaA de Bordetella pertussis e, mais particularmente, desprovido dos resíduos 1-373.

De acordo com uma forma de realização específica, a ou as sequências adequadas para desencadear uma resposta imunitária, é enxertada num resíduo de aminoácido do referido polipéptido.

De acordo com a invenção, a "combinação" (ou inserção) de uma sequência de aminoácidos com o polipéptido 35 ΡΕ2233569 mutante de CyaA para providenciar um chamado derivado polipeptídico, também referido como "proteína recombinante" ou "proteína híbrida" abrange inserção genética especialmente por tecnologia de DNA disponível. Alternativamente "combinação" também abrange inserção não genética, incluindo inserção química, por exemplo acoplamento covalente levado a cabo especialmente numa extremidade da sequência de aminoácidos, ou acoplamento não covalente. A inserção não genética pode ser especialmente interessante quando a sequência de aminoácidos a ser inserida é sintética ou semi-sintética. Métodos para acoplar um medicamento a um polipéptido são bem conhecidos na área e compreendem, por exemplo ligações dissulfureto usando N-piridil sulfidrilo activado com sulfonilo.

Em particular é possível enxertar moléculas nos polipéptidos da invenção por ligação química ou por inserção genética para direccionamento específico in vivo para células alvo CyaA, tais como APC, por exemplo CDllb/CDl8 e particularmente para o citosol das referidas células. De facto, ao acoplar uma molécula, correspondente a um dado epitopo de células T, CD8+ ao domínio catalítico da CyaA desintoxicada, quer por meio de ligação dissulfureto, quer por inserção genética, descobriu-se que a molécula transformada pode desencadear resposta CTL específica in vivo, mostrando assim que o referido epitopo de células T CD8+ é translocado para dentro do citosol de células que expressam CDllb. 36 ΡΕ2233569

Numa forma de realização preferida da invenção, o polipéptido CyaA mutante é usado na produção de uma vector proteináceo ou na preparação de uma composição especifi-camente designada para desencadear resposta de células T citotóxicas CD8+ (resposta CTL), quando a referida resposta segue segue o direccionamento especifico do polipéptido CyaA mutante modificado (especialmente recombinado ou conjugado) com uma molécula de interesse para células que expressam CDllb, seguida de translocação da molécula de interesse para o citosol das referidas células que expressam CDllb e, em particular para células dendriticas mielóides. Neste contexto, a molécula de interesse é ou compreende preferivelmente um epitopo ou um antigénio.

Noutra forma de realização preferida da invenção, o polipéptido CyaA mutante é usado para a manufactura do vector proteináceo ou na preparação de uma composição especificamente concebida para desencadear resposta de células CD4+, quando a referida resposta segue o direccionamento especifico da adenilciclase modificada (especialmente recombinada ou conjugada) com uma molécula de interesse para células que expressam CDllb, em particular células dendriticas mielóides. Neste contexto, a molécula de interesse para células que expressam CDllb, em particular células dendriticas mielóides. Neste contexto, a molécula de interesse é ou compreende preferivelmente um epitopo ou um antigénio.

Os polipéptidos mutantes também podem ser usados 37 ΡΕ2233569 na produção de um vector proteináceo para direccionamento específico de um composto profiláctico ou terapêutico e em particular o referido medicamento pode ser quimicamente ou geneticamente acoplado ao polipéptido mutante. Métodos para acoplar um composto a um polipéptido são bem conhecidos na área e compreendem, por exemplo ligação dissulfureto usando N-piridil sulfidrilo activado com sulfonilo. Numa forma de realização, uma molécula de interesse é um composto anti-inflamatório que é, quando acoplado ao polipéptido mutante, especialmente dirigido à superfície das células envolvidas na resposta inflamatória, tais como células dendríticas ou neutrófilos.

Mais especificamente, a apresentação de antigé-nios para activação selectiva de células citotóxicas CD8+ é principalmente realizado por células dendríticas mielóides.

Por conseguinte, numa forma de realização específica, o polipéptido CyaA mutante usado para a produção do vector proteináceo é uma adenilato ciclase geneticamente modificada, contendo uma ou mais molécula(s), quimicamente acoplado por meio de uma ligação dissulfureto para resíduo(s) de cisteína geneticamente inserido(s), localizados no domínio catalítico do polipéptido CyaA mutante. De facto, moléculas múltiplas podem ser quimicamente acopladas ao polipéptido CyaA mutante por meio de uma ligação dissulfureto a diferentes resíduos de cisteína localizados em diferentes sítios permissivos no domínio catalítico. 38 ΡΕ2233569

Os polipéptidos mutantes ou derivados de poli-péptidos de acordo com a invenção são convenientes para uso em terapia ou profilaxia.

Por terapia ou efeito terapêutico entende-se, qualquer efeito que é benéfico para a condição de um doente, seja curativo ou suficiente para limitar os sintomas ou as consequências de uma condição patológica, incluindo limitar a progressão de uma condição patológica. Terapia ou efeito terapêutico também abrange a prevenção do aparecimento da condição patológica.

Os polipéptidos mutantes ou derivados polipe-ptídicos de acordo com a invenção são em particular adequados para desencadear uma resposta imunitária mediada por células, tal como uma resposta imunitária por células T ou uma resposta imunitária por células B num hospedeiro em necessidade delas. Inclui CTL e Th, especialmente resposta Thl, incluído resposta de células T CD4+ e/ou resposta de células T CD8+. A capacidade de um polipéptido derivado da proteína CyaA para desencadear uma resposta imunitária mediada por células pode ser suficiente para evitar o crescimento de tumores in vivo ou mesmo permitir a regressão de tumor num animal. Também pode ser melhorada por activação de componente inata da resposta imunitária através de activação de TLR e por activação diminuída do 39 ΡΕ2233569 componente regulador da resposta imunitária através do uso de agentes quimioterapêuticos. A invenção providencia meios que deveriam permitir obter estes resultados em condições de segurança aumentadas como resultado das mutações combinadas E570Q e K860R, que foram seleccionadas. 0 pedido de patente revela métodos terapêuticos que compreendem a administração a um animal ou doente humano do polipéptido mutante ou derivado de polipéptido de acordo com a invenção a um doente para desencadear uma resposta imunitária por células T ou resposta imunitária por células B num hospedeiro que dela necessita.

Os polipéptidos mutantes ou derivados de polipéptidos de acordo com a invenção, podem ser usados, em particular para a prevenção ou o tratamento de uma doença seleccionada de neoplasia, cancros e doenças infecciosas seleccionadas de doenças induzidas por virus, retrovirus, bactérias ou fungos. Em particular, os derivados de polipéptidos podem ser usados para o tratamento de infecções por HIV num doente. É especialmente providenciado que, numa forma de realização particular da invenção, o polipéptido mutante CyaA ou derivado de polipéptido é conveniente para o tratamento de tumores infiltrantes ou vascularizados versus tumores superficiais ou para o tratamento de tumores metastáticos versus tumores primários, de acordo com os critérios clinicos reconhecidos para a classificação de tumores. 40 ΡΕ2233569

Tumores sólidos são especialmente um alvo para o tratamento através do uso do derivado polipeptídico da invenção.

Entre os tumores que podem ser candidatos para o tratamento com o derivado de polipéptido da invenção, os seguintes, para os quais foram caracterizados antigénios associados a tumores, são descritos como exemplos: melanoma, especialmente melanoma metastático; carcinoma do pulmão; carcinoma da cabeça e do pescoço; carcinoma do cérvix; carcinoma do esófago; carcinoma da bexiga, especialmente carcinoma infiltrante da bexiga; carcinoma da próstata; carcinoma da mama; carcinoma colorectal; carcinoma de células renais; sarcoma; leucemia; mieloma. Para estes vários tipos histológicos de cancros, mostrou-se que os péptidos antigénicos são especifi-camente expressos em amostras tumorais e são reconhecidos por células T, especialmente células T CD8+ ou células T CD4+. A invenção ainda se relaciona com o uso de um derivado polipeptídico de acordo com a invenção, para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento de uma doença seleccionada de neoplasia, cancros e doenças infecciosas seleccionadas de doenças induzidas por virus ou retrovirus. 41 ΡΕ2233569

Numa forma de realização preferida, o polipéptido ou derivado de polipéptido de acordo com a invenção pode ser administrado ao doente em combinação com um adjuvante e/ou em combinação com outra molécula terapeuticamente activa ou agente.

No contexto da presente invenção, a referida "outra molécula terapeuticamente activa ou agente" é aquela que pode ser benéfica para a condição de um doente ao qual é administrada. É especialmente um principio activo adequado para uso na produção de um medicamento. Pode ser um composto adequado para ambos, aumentar potenciar ou modular o efeito de um principio terapeuticamente activo. 0 polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido deste, pode ser administrado com uma molécula terapeuticamente activa ou agente, em particular uma conveniente para desencadear uma resposta imunitária num doente.

Em particular, o polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido deste pode ser administrado com um agente terapeuticamente activo, conveniente para modular uma resposta celular num doente, em particular diminuído ou bloqueando a capacidade imunosupressiva de células T reguladoras.

De acordo com uma forma de realização da invenção, um efeito deste tipo numa resposta celular 42 ΡΕ2233569 regulatória pode ser obtida com um agente modulante, uma célula T reguladora e/ou modulando outra resposta supressiva celular, tal como resposta de células mielóides supressivas, dirigindo-se o referido agente especificamente às referidas células reguladoras, especialmente células T, reduzindo ou inactivando estas células (tal como com o anticorpo especifico para CD25 ou ciclofosfamida) alterando o tráfego das referidas células, especialmente células T reguladoras (tal como anticorpo especifico para CCL22) ou alterando a diferenciação e sinalização das referidas células (tal como bloqueando o sinal F0XP3 (forkhead box P3) ) .

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o agente que modula uma resposta celular reguladora, dirige-se especificamente a moléculas supressivas, especialmente as moléculas presentes em APCs (tais como B7-H1, B7-H4, IDO (indoleamina 2,3-dioxigenase) ou arginase) ou em células T (tal como CTLA4-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) ou PDl (programmed cell death l))ou moléculas imunosupressivas solúveis (tais como TGF beta-transforming growth factor), IL-10, VEGF (vascular endotelial growth factor), C0X2 (ciclooxigenase 2)).

Como exemplo de agentes que têm um efeito sobre a resposta celular reguladora, são propostos agentes citotóxicos, que conseguem matar células T reguladoras ou outras células imunosupressivas, ou que podem bloquear a sua actividade e/ou desenvolvimento e/ou acumulação. 43 ΡΕ2233569

Numa forma de realização particular da invenção, o agente que modula a resposta celular reguladora, especialmente uma resposta de células T reguladoras, é um agente quimioterapêutico. Especialmente é seleccionado entre os agentes quimioterapêuticos conhecidos como agentes anticancerigenos e usados em quimioterapia. Estes agentes incluem os que ajudam a reduzir o peso tumoral, os que actuam aumentando a sensibilidade de células tumorais ao tratamento ou as que permitem matar ou inactivar as células imunitárias reguladoras. Os agentes quimioterapêuticos usados no âmbito da invenção aumentam assim a imunidade anti-tumoral.

Numa forma de realização particular da invenção, o agente quimioterapêutico é um agente alquilante. Especialmente é Ciclofosfamida (CTX)(Sigma, Steinheim, Alemanha). Ciclofosfamida é capaz de reduzir ou inactivar células T reguladoras.

Numa outra forma de realização particular da invenção, o agente quimioterapêutico é um agente interca-lante.

Numa forma de realização particular, o agente quimioterapêutico é Doxorubicina (DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). 0 agente quimioterapêutico é administrado com vantagem a baixas doses. 44 ΡΕ2233569 0 polipéptido CyaA mutante ou o derivado polipeptídico deste também pode ser administrado com um componente adjuvante, adequado para activar a resposta imunitária inata estimulada por um tumor num doente.

Numa forma de realização particular da invenção, o componente adjuvante é seleccionado no grupo de componentes que consistem em ácidos nucleicos, peptidoqlicanos, hidratos de carbono, péptidos, citoquinas, hormonas e pequenas moléculas, em que o referido componente adjuvante é capaz de sinalizar através de receptores de reconhecimento de padrão (pattern-recognition receptors-PRRs).

Sabe-se que PRRs medeiam a resposta imunitária inata a patogénicos e a tumores, por reconhecimento de chamadas assinaturas conservadas de patogénicos (pathogen-associated molecule patterns, PAMs). PRRs estão presentes numa variedade de células imunitárias incluindo células dendriticas, natural killer cells, células B e também nalgumas células não imunitárias tais como células epiteliais ou células endoteliais. PRRs e o seu envolvimento na resposta imunitária nata, estão descritos em Pashine A. et al (Nature medicine supplement volume 11, No 4, April 2005) .

Em particular um componente adjuvante para a activação da resposta imunitária nata pode dirigir-se especificamente para PRRs e assim activar a sinalização 45 ΡΕ2233569 através de PRRs, em que os referidos PRRs, em que os referidos PRRs abrangem receptores tipo Toll ou dominio de oligomerização e ligação a nucleótido (nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)) ou lectina tipo C.

Numa forma de realização particular da invenção, o componente adjuvante é um agonista de um receptor Toll-like (TLR). 0 agonista do receptor Toll-like é especialmente formulado para activar eficientemente o sistema imunitário inato de um doente. 0 referido agonista de TLR é capaz de se ligar a TLR, i.e., é um ligando de TLR e é ainda capaz de aumentar a resposta imunitária desencadeada sob o controlo do referido TLR.

Para ilustração, agonistas TLR são seleccionados do grupo de agonistas TLR-9, TLR-8, TLR-3 e TLR-7. No entanto agonistas de outros receptores TLR podem ser usados para levar a cabo a invenção, tais como agonistas dos receptores TLR2, TLR4, TLR5. 0 agonista de TLR usado na invenção pode ser um agonista natural ou sintético. Pode ser uma combinação de diferentes agonistas do mesmo receptor toll-like ou de receptores diferentes.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, o agonista de TLR é uma sequência nucleotidica imuno-estimuladora, especialmente uma sequência nucleotidica estabilizada, por exemplo estabilizada como resultado 46 ΡΕ2233569 de uma modificação da estrutura tal como uma modificação fosforotioato. A sequência nucleotidica também pode ser protegida contra a degradação por formulação específica. Especialmente formulação de lipossomas destes, por exemplo suspensão de lipossomas, pode ser vantajosa para a administração eficiente da sequencia nucleotidica imuno-estimuladora.

Numa forma de realização particular da invenção, a sequência de ácido nucleico imuno-estimuladora é um RN A de cadeia simples.

Numa forma de realização particular da invenção, a sequência nucleotidica imunoestimuladora compreende um motivo CpG e especialmente é um oligonucleótido CpG (CpG ODNs) . Como exemplo de oligonucleótidos CpG adequados, a invenção fornece ligandos de TLR-9 tais como CpG ODN tipo A, i.e., CpG 2216 tendo sequência de nucleótidos 5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3' ou CpG ODN tipo B, i.e., CpG 182 6 tendo sequência nucleotidica 5'-TCCATGACGTT CCTGACGTT-3'. 0 oligonucleótido CpG pode ser usado após ser complexado com DOTAP (Roche Manheim, Alemanha), para o proteger contra a degradação e facilitar a sua absorção.

De acordo com outra forma de realização particular da invenção, o agonista TLR é uma molécula pequena. Moléculas pequenas adequadas como agonistas de TLR são, por exemplo, derivados amina de imidazoquinolina, tais como um 47 ΡΕ2233569 chamado R848 (resiquimod), i.e., 4-amino-2-etoximetil-a,a, dimetil-l-H-imidazo[4,5c]quinolina-l-etanol disponível de Invivogen, como ligando de TLR-7, ou um chamado R837 (imiqimod) disponível de Aldara como agonista de TLR-7.

Outras moléculas adequadas como agonistas de TLR são poliuridina (pU) como ligando TLR-3, ou ácido policitidílico como ligando de TLR-7.

Estas moléculas podem ser formuladas para facilitar a sua absorção e/ou para as proteger de degradação. Estas moléculas também podem ser preparadas como uma formulação de lipossomas, especialmente como uma suspensão de lipossomas, para administração a um doente.

De acordo com outra forma de realização particular da invenção, o componente adjuvante pode ser um componente adjuvante baseado em células. Um exemplo deste é células dendríticas que se sabe serem capazes de estimular a resposta linfocítica, sendo estas células dendríticas possivelmente processadas ex vivo antes da sua administração, para aumentar a sua actividade de estimulação da resposta de células dendríticas podem assim ser estimuladas com adjuvantes interagindo com os PRRs incluindo ligandos TLR ou agonistas (Pashine A. et al Nature Medicine supplement Volume 11, N°4, April 2005 pS63-S68).

Alternativamente, o polipéptido ou derivado de polipéptido de acordo com a invenção pode ser administrado ao doente sem um adjuvante. 48 ΡΕ2233569

De facto, os inventores mostraram anteriormente que CTL específicos para o antigénio vectorizado podem ser estimulados in vivo após uma única injecçâo intravenosa da toxina recombinante, especialmente sem necessidade de fornecer um adjuvante heterólogo. Estes resultados e em particular o direccionamento específico do epitopo para células dendríticas mielóides permitem ultrapassar o requerimento para um adjuvante e ajuda de células T CD4+.

Assim, a invenção também se relaciona com o uso de um polipéptido mutante CyaA recombinado com uma molécula e especialmente um péptido de interesse para a preparação de uma composição formulada por administração intravenosa e permitindo uma resposta imunológica de células T CD8+ in vivo, sendo a referida composição livre de um adjuvante heterólogo. A invenção também diz respeito a esta composição como tal. 0 pedido de patente revela métodos terapêuticos que compreendem a administração do polipéptido mutante ou derivado de polipéptido de acordo com a invenção a um animal ou doente humano que sofre de uma doença seleccionada de neoplasia, cancros e doenças infecciosas seleccionadas de doenças induzidas por vírus, retrovírus, bactérias ou fungos. 0 polipéptido mutante ou derivado de polipéptido pode em particular ser administrado com uma molécula terapeuticamente activa e/ou adjuvante. 49 ΡΕ2233569 0 polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido, a molécula terapeuticamente activa e/ou um adjuvante podem ser administrados em conjunto como parte de uma composição farmacêutica que compreende ainda um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico ou excipiente (s) .

Alternativamente, os vários tipos de moléculas descritas aqui para levar a cabo a invenção, podem ser administrados separadamente ou simultaneamente no tempo (especialmente para o polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido e o adjuvante) ou separadamente no tempo (especialmente o polipéptido CyaA mutante). A administração de uma molécula terapeuticamente activa pode ser levada a cabo alternativamente antes ou depois da administração do polipéptido CyaA mutante ou do derivado de polipéptido e/ou adjuvante. Também pode ser sequencial no tempo.

Um regime particular que pode ser adoptado é um protocolo de administração repetida, especialmente num protocolo que envolve dois ciclos ou mais de administração de pelo menos um dos compostos seleccionados do polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido, o agente terapeuticamente activo e/o adjuvante. A invenção também é dirigida a uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido CyaA mutante ou 50 ΡΕ2233569 um derivado de polipéptido de acordo com a invenção, um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico ou excipiente(s) e opcionalmente um adjuvante e/ou outra molécula terapeuticamente activa O pedido de patente revela um kit de partes que compreendem o polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido, uma molécula terapeuticamente activa e/ou um adjuvante.

Os compostos do kit de partes ou a composição da invenção podem ser dados especialmente a um doente através de administração intravenosa, administração intratumoral ou administração subcutânea. O kit de partes ou a composição tem a capacidade de se dirigir especificamente (i)a resposta imunitária adaptativa, através do polipéptido CyaA mutante ou o derivado de polipéptido revelado na presente aplicação, (ii) regular negativamente a resposta imunitária reguladora através do agente terapeuticamente activo e, se o adjuvante está presente, dirigir-se especificamente para (iii) o componente inato da resposta imunitária, activando a referida resposta inata através do adjuvante. O pedido revela um método de tratamento de um doente em necessidade, seja um doente humano ou animal, que compreende o passo de administrar os componentes do kit de partes ou a composição aqui divulgada. 51 ΡΕ2233569 A invenção em particular também se relaciona com uma nova composição imunogénica formulada para administração, especialmente administração intravenosa, num hospedeiro animal ou humano, caracterizado por compreender um derivado de polipéptido CyaA recombinante, que compreende um antigénio inserido no domínio catalítico. A invenção ainda se relaciona com uma composição farmacêutica para administração a um humano ou um animal formulado para se dirigir uma molécula de interesse especificamente para células que expressam CDllb caracte-rizada por a referida molécula de interesse ser acoplada a um polipéptido CyaA mutante como descrito aqui.

Noutra forma de realização específica, a composição farmacêutica ou imunogénica compreende uma construção de ácido nucleico que codifica o derivado de polipéptido CyaA recombinante, que compreende um polipéptido mutante CyaA como definido aqui, acoplado a uma molécula de interesse.

Além disso, a invenção também se relaciona com o uso da composição imunogénica, como definida acima, para a preparação de uma vacina ou uma composição imunoterapêu-tica, para administração a um hospedeiro animal ou humano.

Como aqui usado, o termo "composição imunotera-pêutica" relaciona-se com uma composição que conduz a uma 52 ΡΕ2233569 resposta imunológica e que está associada a tratamentos terapêuticos, tais como tratamento contra neoplasia, cancros, infecções virais, infecções fúngicas, infecções parasitárias ou infecções bacterianas. 0 pedido divulga um método para imunizar um hospedeiro animal ou humano, em que o referido método compreende os passos de: a) providenciar uma composição imunogénica como definida acima; b) administrar a referida composição imunogénica, preferivelmente por via intravenosa, ao referido hospedeiro para promover uma resposta imunitária.

Em particular, as composições imunogénicas da invenção são capazes de induzir ou estimular, in vivo ou in vitro uma resposta celular imunitária envolvendo especi-ficamente células dendriticas. As composições imunogénicas da invenção podem em particular ser usadas para vacinação preventiva ou terapêutica de um doente.

Como consequência, numa forma de realização específica, a composição imunogénica ou farmacêutica é desprovida com vantagem de adjuvantes estimuladores geralmente usados na área, tais como hidróxido de alumínio. A invenção ainda se relaciona com um método para 53 ΡΕ2233569 a preparação de um vector proteináceo adequado para entrega de uma molécula de interesse para o interior de uma célula, que compreende ligar a molécula de interesse a um péptido mutante CyaA como aqui definido. 0 pedido divulga moléculas de ácido nucleico, em particular moléculas de DNA ou RNA, que codificam um polipéptido ou derivado de polipéptido como definido acima. 0 pedido divulga células eucariotas ou proca-riotas que compreendem as moléculas de ácido nucleico como definido acima. 0 pedido divulga células eucariotas, preferivelmente células de mamífero, que compreendem um polipéptido CyaA mutante ou derivado de polipéptido como definido acima. Como aqui descrito, as células são células humanas. 0 pedido revela células eucariotas, preferivelmente células de mamífero, transformadas com o vector proteináceo como definido acima.

Figuras

Fig.l. Sustituições nos domínios de formação de poros e de acilação sinergizam para diminuir a actividade hemolítica específica de CyaA.(A)Foram incubados 5xl08/ml eritrócitos de ovelha em tampão TNC com 5 yg/ml de proteínas CyaA enzimaticamente activas a 37°C. Após 54 ΡΕ2233569 30 min, alíquotas de suspensões celulares foram lavadas repetidamente para remover CyaA não ligado e usadas para determinar a quantidade de actividade AC associada a células e invasiva. A actividade hemolítica foi medida após 5 horas de incubação como a quantidade de hemoglobina libertada por determinação fotométrica (A541) . A actividade de CyaA intaca foi tomada como 100%. (B)A actividade de ligação a células reduzida com a substituição de K860R foi compensada por aumentar a sua concentração de 5 yg/ml para 25yg/ml. As actividade de CyaA/2330VA (CyaA/OVA) na presença foram tomadas como valor 100%. Os resultados representam valores médios de pelo menos três experiências independentes realizadas em duplicado. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (**, p<0,001) das actividades de CyaA (Fig. 1 A) ou CyaA/OVA (Fig. 1B)

Fig.2.CyaA/OVA/E570Q+K860R liga-se e transloca-se para monócitos CDllb+. (A)J774A.1 células (106/ml) foram incubadas em DMEM durante 30 min a 4°C com 2,5 pg/ml de CyaA, lavadas repetidamente e a quantidade de actividade AC associada a células foi determinada em lisados de células. Para bloquear o receptor CDllb/CDl8, as células foram incubadas durante 30 min com o anticorpo especifico para CDllb Ml/70 (Exbio, República Checa) a uma concentração final de 10 pg/ml antes da adição de CyaA (**, p<0,001) . (B)A capacidade de translocação do domínio AC de constructos foi avaliada como a capacidade de peetrar em células e converter o ATP citosólico em 55 ΡΕ2233569 cAMP. J774A.1 células foram incubadas com constructos CyaA durante 30 minutos a 37°C e foram determinadas as quantidades de cAMP acumulado em lisados celulares (41). 0 receptor CDllb/CDl8 foi bloqueado com Ml/70 como acima. São mostrados resultados representativos de três determinações independentes realizadas em duplicado.

Fig.3.Toxoide E570Q+K860R não permeabiliza células J774A.1. Medidas de Whole-cell patch-clamp foram realizadas em células J774A.1 individuais à temperatura ambiente exposta a lyg/ml de (a)CyaA/2330VA/AC“ ou (B)proteínas CyaA/233OVA/E570Q+K860R/AC“ tal como descrito em Matérias e Métodos. As curvas apresentadas são representativas de seis determinações em 3 experiências independentes.

Fig.4. Toxoide com substituições E570Q+K860R entrega o epitopo de células T OVA para apresentação por moléculas de MHC classe I e indução de CTLs CD8+ (A)BMDC (3x 105 células/poço) usadas como APCs foram incubadas na presença das concentrações indicadas (0 a 60 nM) de toxóides contendo o epitopo OVA ou com mock CyaA/AC-. Após co-cultura durante 24 horas com células B3Z T (lxlO5 células/poço), foi determinada a secreção de IL-2 pelas células B3Z estimuladas pelo método de proliferação CTLL. Os resultados estão expressos como Acpm de [3H]timidina incorporada (cpm na presença de toxóide-cpm na ausência de toxoide)! SD e são representativas de cinco experiências independentes. (B) 56 ΡΕ2233569

Análise da indução de respostas CTL específicos para OVA (SIINFEKL) por ensaio in vivo killing. No dia 0 os ratinhos receberam 50pg i.v. de toxóides mock AC- ou toxóides OVA/AC- e ao dia 7 foram injectados i.v. com uma mistura (1:1) de células de baço CFSEhigh carregados com péptido OVA (SIINFEKL) e CFSElow não carregados. 0 número de células CFSE positivas mantidas no baço após 20h foi determinada por análise de FACS, como documentado para um ensaio representativo killing in vivo no conjunto de gráficos do painel superior, em que a percentagem de células nos gates estão indicadas. 0 painel inferior mostra resultados reunidos de ensaios killing in vivo para três experiências independentes. Significância estatística foi determinada pelo teste t de Student (p=0,75 para OVA/AC- vs OVA/E570Q+K860R/AC-).

Fig.5. Modelo de acção de CyaA na membrana. (A) 0 modelo prevê um equilíbrio entre dois confórmeros de CyaA em solução, cada uma deles inserindo na membrana celular em diferente conformação. Um ocasionaria um precursor de translocação CyaA monomérico, entrega do domínio AC para o citosol e concomitante influxo de iões de cálcio para as células. 0 confórmero inseriria como precursor de poro oligomerizando num poro de CyaA.(B) 0 efeito sinérigico das substituições E570Q e K860R bloquearia selectivamente a capacidade de precursores de poro CyaA de oligomerizar a um poro, enquanto a capacidade de precursores de translocação de transportar o domínio AC através da membrana não seria afectada. 57 ΡΕ2233569

Fig.6. Sequência de aminoácidos da toxina CyaA de Bordetella pertussis (SEQ ID Nal).

Fig.7. Sequência de aminoácidos do mutante

CyaA/E570Q+K860R de Bordetella pertussis (SEQ ID Na2).

Fig.S. Sequência de aminoácidos do mutante

CyaA/E570Q+K860R/AC" de Bordetella pertussis (SEQ ID Na3) .

Fig.9. Sequência de aminoácidos do mutante

CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC- de Bordetella pertussis (SEQ ID Na4).

Fig.10.Plasmídeo que codifica o mutante

CyaA/E57 0Q+K8 60R/AC- (QR-AC") .

Fig.11.Sequência de DNA de QR-AC-. plasmídeo que codifica o mutante CyaA/E570Q+K860R/AC-(SEQ ID Na5) .

Fig.12.Plasmídeo que codifica o mutante

CyaA/233OVA/E670Q+K860R/AC" (OVA-QR-AC") .

Fig.13.Sequência de DNA de plasmídeo OVA-QR-AC- que codifica o mutante CyaA/233OVA/E670Q+K860R/AC-(SEQ ID Na6) 58 ΡΕ2233569

Exemplos

Toxina de adenilato ciclase transloca-se através da membrana da célula alvo sem formar um poro

Materiais e Métodos

Construção, Produção e Purificação de proteínas

CyaA. As modificações produzindo os constructos CyaA/ AC”, CyaA/2330VA , CyaA/E570Q e CyaA/K860R, foram previamente descritas (13, 20, 21) e foram introduzidas em CyaA/2330VA /AC” individualmente ou em combinação. As proteínas derivadas de CyaA foram produzidas em E.coli XL-1 Blue e purificadas quase à homogeneidade como descrito previamente (29) . Durante a cromatografia hidrofóbica, a resina com a toxina ligada foi lavada repetidamente com isopropanol 60% (30) para reduzir o contéudo de endotoxina de amostras de CyaA abaixo de lOOlU/mg de proteína, como determinado pelo ensaio LAL QCL-1000 (Cambrex)

Uma Escherichia coli XLl-Blue Strain (Stratagene) contendo o plasmídeo QR-AC” (figura 10)que codifica o mutante CyaA/E570Q+K860R/AC” foi depositado em Março 18, 2009 no CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France) sob o número de acesso CNCM 1-4136 (figura 10). A sequência de DNA do plasmídeo QR-AC” (SEQ ID N°5) está divulgada na figura 11.

Uma Escherichia coli XLl-Blue Strain (Stratagene) 59 ΡΕ2233569 contendo o plasmídeo OVA-QR-AC” (figura 12) que codifica o mutante CyaA/233OVA/E670Q+K860R/AC foi depositado em Março 18, 2009 no CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France) sob o número de acesso CNCM I-4137. A sequência de DNA do plasmídeo OVA-QR-AC” (SEQ ID N°6) está divulgada na figura 13.

Ligação Celular e Actividades Hemolíticas em Eritrócitos de Ovelha. 5x1O8 eritrócitos de ovelha lavados em Tris pH 7,7 50 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM (tampão TNC)foram incubados a 37°C com 5yg/ml de proteínas CyaA e as actividades de ligação celular, invasão celular AC e actividades hemolíticas de CyaA foram determinadas como descrito em detalhe anteriormente (13). A significância das diferenças nos valores de actividade foi analisada usando análise de variância one-way (ANOVA) com pós-teste Bonferroni (SigmaStat v.3.11, Systat, San Jose, CA).

Ligação de Macrófagos, Elevação de cAMP e Capacidade de Lise Celular de CyaA. Macrofagos J774A.1 (106) foram incubados em D-MEM com 2,5yg/ml de variantes CyaA durante 30 min a 4°C, antes da remoção da toxina não ligada por três lavagens em D-MEM. As células foram lisadas com Triton X-100 0,1% para determinação da actividade AC ligada às células. Para ensaios de cAMP intracelulares, 105 células foram incubadas com CyaA durante 30 minutos em D-MEM com 100 μΜ IBMX (3-isobutil-l-metilxantina) , a reacção foi parada por adição de 0,2% Tweenn-20 e HC1 100 mM e as amostras foram fervidas durante 15 min a 100°C, 60 ΡΕ2233569 neutralizadas pela adição de imidazol 150 mM não-tamponado e o cAMP foi medido tal como descrito (29). Para bloquear o receptor CDllb/CDl8, as células foram preincubadas durante 30 min em gelo com o bloqueador específico de CDllb, MAb Ml/70 (Exbio, Czech Republic) a uma concentração final de 10 yg/m) antes da adição de CyaA. A lise de J774A.1 induzida por toxinas foi determinada usando o ensaio

CytoTox96Kit (Promega) como a quantidade de lactat desidro-genase libertada de 105 células em 3 horas de incubação com 10yg/ml da proteína apropriada a 37°C em D-MEM como descrito (8). A significância das diferenças nos valores de actividade foi analisada como acima.

Medidas Patch Clamp. Medidas de "Whole-cell Patch-clamp" foram realizadas em células J774A.1 banhadas em HBSSo (NaCl 140 mM, KC1 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 3 mM, Hepes-Na 10 mM, glucose 50 mM; pH 7,4). Micropipetas de vidro com um diâmetro exterior de cerca de 3 μΜ foram enchidas com uma solução de gluconato de potássio 125 mM, KC1 15 mM, CaCl2 0,5 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 5 mM, HEPES-KOH 10 mM pH7,2. As resistências resultantes dos microeléctrodos eram 3 a 5 ΜΩ. As células foram grampeadas a -4 0mV, os dados foram filtrados a 1 kHz e digitalizados a 2 kHz usando um amplificador Axopatch 200 A, Digidata 1320 A e pacote de software PClamp-9 (Axon Instruments, Foster City, CA) .

Ratinhos e linhas celulares. Fêmeas C57BL/6 obtidas dos laboratórios Charles River foram mantidas em 61 ΡΕ2233569 condições livres de patogénicos e manipulados de acordo com orientações institucionais. Células CTLL-2 foram obtidas de ATCC. B3Z, um hibridoma de células T especifico CD8+ especifico para o epitopo OVA (SIIFEKL) restrito a Kb, foi fornecido por N.Shastri (Universidade da Califórnia, Berkeley) e mantido na presença de G418 1 mg/ml e higromicina B, 400 yg/ml em meio RPMI completo (Invitrogen Life Technologies) com FCS 10% inactivado pelo calor, penicilina lOOU/ml, estreptomicina 100 yg/ml e 2-ME 5xl0“5 M.

Estudos de apresentação de antigénios. Células dendriticas de medula óssea (BMDC(boné marrow dendritic cells), 3x 105 por poço, usados como APCs foram incubados na presença de várias concentrações (0 a 60 nM) de CyaA/OVA/AC” recombinante contendo o epitopo OVA (SIIFEKL) ou mock CyaA/AC- e co-cultivadas durante 24 horas com células T B3Z (1 x 105 por poço), reconhecendo selectivamente os complexos MHC classe I OVA SIIFEKL/H-2Kb. Após 18 h de cultura, os sobrenadantes foram congelados durante pelo menos 2 h a -80°C. A quantidade de IL-2 produzida pelas células B3Z estimuladas foi então determinada pelo método de proliferação de CTLL.

Resumidamente, 104 células da linha CTLL dependente de IL-2 por poço, foram cultivadas com 100μ1 de sobrenadante em 200μ1 de volume final. Vinte e quatro horas mais tarde, foi adicionada [ 3H]-timidina (50 yCi/poço) e as células foram colhidas 6h depois com um colhedor de células automatizado. A [3H]-timidina incorporada foi detectada por contagem de cintilação. Cada ponto foi feito em duplicado e a experiência foi repetida cinco vezes. Os resultados estão 62 ΡΕ2233569 expressos em Acpm de [3H]-timidina incorporada (cpm na presença de toxóide-cpm na ausência de toxóide).

Ensaio "Killing" in vivo. Para estimulação de CTL, ratinhos foram imunizados por injecção i.v. com 50 yg de CyaA/OVA/AC-, contendo o epitopo OVA (SIIFEKL) ou CyaA/AC- mock. Sete dias após imunização, células de baço singénicas, foram pulsadas com o péptido OVA (SIIFEKL)(10yg/ml)(30 min, 37°C), lavadas extensivamente e marcadas com uma elevada concentração (1,25μΜ) de éster de succinimidilo de carboxifluorsceina (CFSE; Molecular Probes, Eugene, OR) . A população de controlo não pulsada foi marcada com uma baixa concentração (0,125 μΜ) de CFSE. Células marcadas CFSEhigh e CFSElow foram misturadas numa razão 1:1 (5xl06 células de cada população) e injectadas i.v. em ratinhos. Células de baço foram colhidas 20 horas mais tarde, lavadas e ressuspendidas em tampão FACS (PBS suplementado com 1% BSA e 0,1% NaNa) . O número de células CFSE positivas que ficaram no baço após 20 h foi determinado por FACS. A percentagem de lise especifica foi calculada como se segue: percentagem de lise específi-ca=100-[100 x (%ratinhos imunizados CFSEhigh / % ratinhos imunizados CFSElow) / (%ratinhos naive CFSEhigh/% ratinhos naive CFSElow) ] .

Análise estatística: A significância das diferenças dos valores foi analisada usando uma análise de variância one-way (ANOVA) com pós-teste Bonferroni (SigmaStat v.3.11, Systat, San Jose, CA). 63 ΡΕ2233569

Resultados A eliminação combinada de glutamato 570 carregado negativamente e de lisina 860 acilada remove a capacidade de permeabilização celular de CyaA. 0 modelo de trabalho da acção de CyaA prevê que CyaA pode ser modificada para perder a sua actividade de formação de poros (hemolitica) , preservando a capacidade de entrega do domínio AC para o citosol de células alvo. Para testar esta hipótese, os inventores procuraram produzir constructos CyaA que exibem actividades hemolíticas e citolíticas tão baixas quanto possível, baseado em observações anteriores de que a capacidade de toxóides CyaA/AC~ de lisar células pode ser modulada positiva ou negativamente por substituições no domínio formador de poros (8, 12-14, 18). Para permitir avaliar a penetração de células alvo também para os toxóides CyaA/AC-, os inventores derivaram estes mutantes de uma toxina CyaA/230OVA que foi previamente marcada por inserção do péptido SIINFEKL de ovalbumina (OVA). Esta variante foi escolhida já que a inserção do repórter epitopo de células T CD8+ restrito a Kb no resíduo 233 não afecta a actividade de AC e permite quantificar a translocação do enzima OVA/AC para o interior das células, como elevação do cAMP citosólico. Mais importante, a presença do epitopo OVA permite avaliar também a capacidade dos toxóides CyaA/2330VA/AC- enzimaticamente inactivos de transportar o seu domínio OVA/AC- para o citosol de células apresentadoras de antigénio (APC) CDllb+, processamento por proteasoma e apresentação à superfície celular do epitopo 64 ΡΕ2233569 OVA em glicoproteínas MHC Classe I que pode ser determinada como estimulação de células T CD8+ especificas para OVA, tanto in vitro como in vivo (20).

Para gerar toxóides CyaA/AC possivelmente desprovidos de actividade citolitica, os inventores combinaram as substituições E570Q e K860R, que se observou previamente reduzirem a actividade hemolitica especifica de CyaA em eritrócitos de ovelha, com a substituição E570Q que se mostrou também reduzir a actividade citolitica de CyaA/AC- em monócitos J774A.1 CDllb+ (8, 13). Estas substituições foram introduzidas em CyaA/2330VA/AC-individualmente e em combinação e as actividades hemolitica e citolitica especificas dos toxóides resultantes foram comparadas usando eritrócitos de ovelha, como modelo alvo CDllb-, e J774A.1 como modelo alvo CDllb+ em paralelo (Tabela I). De acordo com resultados obtidos previamente com toxóides desprovidos do epitopo OVA (4, 8, 13, 21), nas condições usadas os toxóides OVA/AC contendo as substituições E570Q e K860R individualmente exibiam respectivamente uma actividade hemolitica relativa duas vezes reduzida (55 ± 8) e nula (1 ± 1) em eritrócitos e a actividade citolitica relativa do toxóide E570Q para células J774A.1 expressando CDb” também foi reduzida (37 ± 10), comparada com OVA/AC”. Por outro lado, como esperado dos resultados obtidos com um constructo K860R enzimaticamente activo, apesar da baixa actividade hemolitica em eritrócitos CDllb-, o toxóide K860R exibiu somente uma actividade citolitica relativa ligeiramente 65 ΡΕ2233569 reduzida em células J774A.1 CDllb+ (72 ± 22%), confirmando que o defeito estrutural causado pela substituição K860R foi recuperado por interacção com o receptor CDllb/CDl8 (4). No entanto, quando combinado com E570Q, a substituição K860R exibia uma efeito sinergistico claro na redução da actividade citolitica relativa do constructo E570Q+K860R sobre células J774A.1 para 14 ± 7%.

Tabela I: Actividades citolíticas de OVA/AC- e derivados em eritrócitos de ovelha e macrófagos J774A.1

Proteína Lise de eritrócitos (% de AC~)a Lise de células J774A.1 (% de AC~)a AC- 100 ± 5 100 ± 10 OVA/AC- 93 ± 4 93 ± 12 OVA/E57 0Q/AC~ 55 ± 8** 37 ± 10** OVA/K8 60R/ACT 1 ± 1** 72 ± 22** OVA-L247Q-ACT 97 ± 3 41 ± 9 OVA/E570Q+K8 60R/ACT 1 ± 1** 14 ± 7** OVA/E570Q-L247Q-ACT 50 ± 12 40 ± 11 OVA/K8 60R-L247Q-ACT 1 ± 1 45 ± 11 OVA/E570Q-K8 60R-L247Q-ACT 0 + 1 16 ± 10

Legenda da Tabela aLise de eritrócitos de ovelha foi determinada após 4,5 horas, como a quantidade de hemoglobina libertada após incubação de 5x 108 RBC a 37°C na presença de Ca2+ 2 mM e 5 yg/ml da dada proteína (31) . A actividade hemolítica de CyaA/AC- foi tomada como 100% actividade. Os resultados representam a média de valores obtidos em 66 ΡΕ2233569 quatro experiências independentes realizadas em duplicado ± S.D. (desvio padrão), com duas preparações de proteínas diferentes. bLise de células J774A.1 foi determinada como a quantidade de lactato desidrogenase libertada de 105 células após 3 horas de incubação com 10 yg/ml da proteína apropriada a 37°C em D-MEM Lise celular de J774A.1 por CyaA/AC- foi tomada como 100%. Os resultados representam a média dos valores obtidos em quatro experiências separadas realizadas em duplicados ± S.D. com duas preparações de proteínas diferentes (*, p<0,0 01) .

Para permitir a quantificação da capacidade do constructo E570Q+K860R de transportar o domínio AC para o citosol de células, as substituições E570Q e K869R foram transferidas para constructos enzimaticamente activos derivados de CyaA/2330VA (CyaA/OVA). Estes foram produzidos e purificados do mesmo modo do que os toxóides AC- (não mostrados) e caracterizados para ligação a células, capacidade hemolítica e de translocação de AC- em eritrócitos de ovelha. Como se mostra na Fig. 1 A e se espera dos resultados com toxinas desprovidos de epitopo OVA (4, 13, 21) , a substituição E570Q não teve impacto na ligação de eritrócitos ou na capacidade de CyaA/OVA de transportar o domínio AC para o citosol de eritrócitos e reduziu selectivamente só a sua actividade hemolítica relativa. Como ainda esperado (4), a substituição K860R reduziu significativamente a capacidade de CyaA/OVA de se ligar e 67 ΡΕ2233569 penetrar nos eritrócitos, causando uma marcada redução nas actividades hemolítica relativa e invasiva celular AC dos mutantes E570Q e E570Q+K860R em eritrócitos.

Tem que se mencionar que a actividade hemolítica de CyaA é uma função cooperativa da quantidade de CyaA associado a células (número Hill>3), sugerindo que a oligomerização é um pré-requisito para a formação de poros (22) . Por isso, para avaliar o impacto de substituições E570Q+K860R na actividade hemolítica, a perda da capacidade de ligação a eritrócitos de constructos K860R teve que ser compensada aumentando a sua concentração no ensaio para 25 yg/ml (5yg/ml para a toxina intacta), para atingir a ligação de quantidades iguais de todas as proteínas a eritrócitos, como se mostra na Fig.lB. Nestas condições, a combinação das substituições E570Q e K860R exibiram uma clara sinergia em reduzir adicionalmente por um factor dois as já deficientes actividades hemolíticas de constructos contendo as substituições E570Q (~50%) e K860R (~30%) individualmente. Isto sugere que a combinação de duas substituições afectou a capacidade permeabilizadora específica de CyaA. A actividade formadora de poros de CyaA é dispensável para a translocação pela membrana do domínio AC. Em contraste com o impacto da substituição K860R na actividade da toxina em eritrócitos, foi anteriormente observado que as substituições E570Q e K869R não têm efeito na capacidade de CyaA para se ligar e penetrar em monócitos J774A.1 que 68 ΡΕ2233569 expressam o receptor CDllb/CDl8 (4,8). Além disso, como documentado na Fig.2, quando as duas substituições eram combinadas na mesma molécula de toxina, o constructo CyaA/OVA/E570Q+K860R exibia uma igual capacidade para se ligar a células J774A.1 (Fig.2A) e de transportar o domínio AC para o seu citosol para elevar as concentrações citosólicas de cAMP (Fig. 2B9, tal como a CyaA intacta. Ao mesmo tempo, no entanto, o toxóide com dupla mutação exibia uma capacidade citolítica relativa reduzida de cerca de sete vezes (14 ± 7%) nestas células (comparar Tabela I) . Isto sugere que a combinação de substituições E570Q e K860R perturbaram selectivamente somente a capacidade do toxóide de permeabilizar J774A.1 células e não a sua capacidade de translocar o domínio AC através da membrana celular.

Para testar isto, os inventores analisaram a capacidade de permeabilização de células do constructo E570Q+K860R em experiências "Whole cell patch-clamp". Aqui de novo tinham que ser usados os toxóides AC-, para evitar "ruffling" massivo de células J774A.1 provocado por cAMP gerado por toxina (23). Como se mostra na Fig. 3 A por um registo representativo de correntes iónicas através da membrana de células J774A.1 individuais "patch-clamped expostas a 1 yg/ml de CyaA/OVA/AC-, após uma atraso inicial de cerca de 3 minutos as células J774A.1 foram progressivamente e massivamente permeabilizadas por CyaA/OVA/AC-, e as correntes através da membrana celular atingiram -3,000 pA em 10 minutos. Em contraste, como se mostra na Fig 3B, exposição a CyaA/OVA/E570Q+K860R/AC- 69 ΡΕ2233569 causaram reprodutivelmente somente uma permeabilização inicial transiente e mínima das células, com correntes através da membrana que não excediam -200 pA e voltando a perto de zero em 10 min após a adição do toxóide. Os registos mostrados são representativos de pelo menos seis determinações de 3 experiências independentes e demonstram que a combinação de substituições E570Qe K860R tinham um impacto major na capacidade do toxóide de permeabilizara membrana de células J774A.1 células. Dado que a versão activa enzimaticamente do mesmo constructo foi completamente capaz de translocar o domínio AC para J774A.1 células (comparar Fig.2B), estes resultados sugerem fortemente que a actividade de permeabilização celular (formação de poros) de CyaA não era requerida para a translocação do domínio AC através da membrana celular. A actividade de permeabilização da membrana de CyaA é dispensável para o transporte de antigénios passageiro para a via MHC classe I citosólica. Já que a via para cAMP citosólica não podia ser usada para avaliar a capacidade de penetração celular dos toxóides AC, foi usado o ensaio substituto para avaliar a sua capacidade de transportar o epitopo OVA repórter para o sítio de processamento citosólico da via de apresentação do antigénio da MHC classe I (7, 24) . Para este fim, os inventores determinaram a capacidade de células dendríticas derivadas de medula óssea de ratinho C57BL/6 (BMDCs-bone marrow derived dendritic cells) , carregadas com os 70 ΡΕ2233569 toxóides, para estimular a libertação de IL-2 por células B3Z que reconhecem selectivamente o complexo de moléculas MHC classe I Kb com o péptido SIINFEKL (OVA) em APCs. Como se mostra na Fig. 4 A, as células de hibridoma foram estimuladas efectivamente após incubação com BMDCs e qualquer dos toxóides que transportam o epitopo OVA, mas não o toxóide mock. Além disso, os toxóides OVA/E57OQ/AC” e OVA/E570Q+K860R/AC” induziram a estimulação de linfócitos B3Z por APCs in vitro com eficiência tão elevada como o toxóide OVA/AC- intacto. Estes resultados confirmam que o mutante duplo E570Q+K860R foi completamente capaz de translocar o seu domínio AC para BMDC no citosol para processamento e apresentação do epitopo OVA por moléculas MHC classe I Kb, sendo ao mesmo tempo essencialmente incapazes de permeabilizar as células J774A.1. Estes resultados sugerem que a actividade de permeabilização celular de CyaA não foi nem requerida para a translocação do domínio AC através da membrana celular, nem desempenhou qualquer função na capacidade de CyaA para transportat epitopos passageiros para o citosol de APC.

Para corroborar a capacidade de entrega de antigénios in vitro dos toxóides não citolíticos, os inventores avaliaram a sua capacidade in vivo de estimular linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTL) específicos para OVA. 50 yg dos vários toxóides OVA foram injectados por via intravenosa em ratinhos C57BL/6 e uma semana mais tarde as respostas CTL específicas para OVA foram avaliados em 71 ΡΕ2233569 ratinhos imunizados por um ensaio killing in vivo. Ratinhos C57BL/6 receberam injecção i.v. de uma mistura (1:1) de células de baço carregadas com péptido OVA(SIIFEKL)CFSEhigh e não carregados CFSElow, seguidos um dia mais tarde por análise de FACS de células marcadas com CFSE. Como se mostra na Fig. 4B, a imunização de ratinhos com toxóide mock (fictício) não induziram qualquer actividade CTL específica para SIINFEKL in vivo. Por outro lado, imunização com o toxóide E570Q+K860R induziu a mesma resposta CTL killing in vivo específica para OVA do que o toxóide não mutado, usado como controlo positivo, não sendo a ligeira diferença nos valores de resposta média aos toxóides intactos e com dupla mutação estatisticamente significativa (p=0,065). Estes resultados mostram que a actividade de permeabilização celular de CyaA era dispensável para a capacidade in vivo dos toxóides CyaA/2330VA/AC- de entregar um antigénio passageiro AC-inserido no citosol de APCs.

Discussão

Os inventores demonstram aqui que a translocação do domínio AC de CyaA através da membrana de células mielóides alvo, exprimindo o receptor CDllb/CDl8 não depende da capacidade da toxina formar poros e permeabilizar a membrana celular.

Como sumarizado no modelo proposto na Fig.5, os 72 ΡΕ2233569 inventores reportaram anteriormente que o balanço entre as duas actividades de CyaA pode ser desviado por mutações ou acilação alternativa de CyaA. Aumento da actividade de formação de poros (hemolitica) à custa da capacidade de entregar AC para o interior das células foi realmente observado após substituição por lisina dos glutamatos 509, 516 e 581 (13, 18) ou após bloqueio da translocação de AC pelo anticorpo monoclonal (MAb) 3Dl (25) . Por outro lado, um desvio na direcção oposta foi observado para a r-Ec-CyaA recombinante, acilado em E.coli por residuos palmitoleil (C16:l), em comparação com o Bp-CyaA (C16:0) palmitolado, nativo, produzido por B. pertussis. Descobriu-se que r-Ec-CyaA exibe actividade hemolitica cerca de quatro vezes reduzida e actividade de formação de poros cerca de dez vezes mais baixa em bicamadas lipídicas planares do que Bp-CyaA (12), sendo ambas as formas de CyaA igualmente activas na penetração da membrana celular e translocando o domínio AC para o interior de eritrócitos (17, 26) . Além disso, observou-se recentemente que o constructo CyaA/E570Q exibe uma completa capacidade de entregar o domínio AC tanto em eritrócitos como macrófagos J774A.1, exibindo ao mesmo tempo actividade hemolitica reduzida e mais baixa capa- cidade de formação de poros em bicamadas lipídicas planares do que CyaA intacta, exibindo o toxóide CyaA/E570Q/AC- uma actividade citolítica duas vezes reduzida em células J774A.1 (8, 13).

Apesar do mencionado acima e dos muitos CyaAs que os inventores caracterizaram, a questão permaneceu se a 73 ΡΕ2233569 formação de um poro de membrana por CyaA é requerido para translocaçã o do domínio AC através da membrana de células que expressam CDllb. 0 mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R é o primeiro constructo com uma capacidade consideravelmente reduzida de permeabilizar células que se mantêm completamente capazes de translocar o domínio AC através da membrana celular. Isto mostra que no caminho para o citosol da célula, a domínio AC translocante pode passar o poro selectivo para catiões formado por CyaA.

No entanto o modo e via da translocação do domínio AC através da membrana celular, no entanto, está ainda por definir em maior detalhe. Dado os efeitos diferentes das substituições dos glutamatos 509, 516, 570 e 581 nas actividades de formação de poros e transporte de CyaA (8, 13, 18), em que o equilíbrio entre as duas actividades pode ser quase inteiramente desviada numa das direcções por substituições específicas, as hélices anfifáticas contendo estes resíduos de glutamato parecem estar envolvidas em ambas as actividades de CyaA de um modo alternativo. Isto é suportado pelo efeito da substituição combinada de E509K+E516K, que produz uma CyaA híper-hemolítica, incapaz de entregar o domínio AC para o interior das células (8, 18) enquanto a combinação aqui descrita produz o oposto, uma CyaA essencialmente não-citolítica que é totalmente competente para translocar o domínio AC para o interior de células J774A.1 (CDllb+) . Estas observações corroboram adicionalmente o modelo 74 ΡΕ2233569 proposto de que as duas actividades de membrana de CyaA dependeriam de diferentes confórmeros que se inseririam na membrana, um produzindo translocação do domínio AC por monómeros de toxina e o outro levando à formação de poros CyaA oligoméricos (13, 18) .

Fica por definir se os segmentos fora do domínio de formação de poros estão envolvidos na translocação do domínio AC através da membrana. Dado o requerimento para a sua intergridade estrutural (27), o domínio de repetição RTX grande (resíduos 1006 a 1706)é provável que tome parte na translocação de AC para as células. Teria tamanho suficiente (700 resíduos) para formar uma interface de translocação hidrofílica na membrana celular que pode permitir a passagem de um domínio AC não dobrado através da membrana sem a formação concomitante de um verdadeiro poro de permeabilização da célula. Alternativamente, CyaA pode promover a formação de estruturas lipídicas não-lamelares (fase hexagonal invertida) (28), que podem potencialmente tomar parte numa interface proteína-lípido bem selada, através da qual o domínio AC poderia deslizar para o citosol da célula.

Por fim, uma descoberta prática aqui reportada é que o toxóide CyaA/E570Q+K860R/AC-, com a actividade de permeabilização celular muito reduzida, permanece totalmente activo da entrega de antigénios para o interior de APCs CDllb+. Isto é importante com vista ao seu uso poten- 75 ΡΕ2233569 ciai como ferramenta de segurança aumentada para entregar antigénios específicos de tumor em segunda geração de vacinas derivadas de CyaA/AC- para a imunoterapia de cancro.

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<210> 1 <211> 1706 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <4 0 0> 1

Met Gin Gin Ser His Gin Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu 1 5 10 15

Ser Gly lie Pro Ala Ala Vai Leu Asp Gly lie Lys Ala Vai Ala Lys 20 25 30

Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Vai Asn Pro His Ser Thr 35 40 45

Ser Leu Ile Ala Glu Gly Vai Ala Thr Lys Gly Leu Gly vai His Ala 50 55 60

Lys Ser Ser Asp Trp Gly Leu Gin Ala Gly Tyr Ile Pro Vai Asn Pro 65 70 75 80

Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Vai Ile Ala Arg Ala 85 90 95

Asp Asn Asp Vai Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Vai Asp 100 105 110

Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gin Ala Gly Leu 115 120 125

Vai Thr Gly Met Ala Asp Gly Vai Vai Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr 130 135 140 81 ΡΕ2233569

Glu Gin Phe Glu Phe Arg Vai Lys Glu Thr Ser Asp Gly Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Vai Gin Tyr Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Vai Lys Vai 165 170 175 Ile Gly Asn Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Ile Asp Met Phe 180 185 190 Ala Ile Met Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser 195 200 onc Vai Thr Ser Gly Asp Ser vai Thr Asp Tyr Leu Ala Arg Thr Arg Arg 210 215 220 Ala Ala Ser Glu Ala . Thr Gly Gly Leu Asp Arg Glu Arg Ile Asp Leu 225 230 235 240 Leu Trp Lys Ile Ala Arg Ala Gly Ala Arg Ser Ala Vai Gly Thr Glu 245 250 255 Ala Arg Arg Gin Phe Arg Tyr Asp Gly Asp Met Asn Ile Gly Vai Ile 260' 265 270 Thr Asp Phe Glu Leu Glu Vai Arg Asn Ala Leu Asn Arg Arg Ala His 275 280 285 Ala Vai Gly Ala Gin Asp Vai Vai Gin His Gly Thr Glu Gin Asn Asn 290 295 300 Pro Phe Pro Glu Ala Asp Glu Lys Ile Phe Vai Vai Ser Ala Thr Gly 305 310 315 320 Glu Ser Gin Met Leu Thr Arg Gly Gin Leu Lys Glu Tyr Ile Gly Gin 325 330 335 Gin Arg Gly Glu Gly Tyr Vai Phe Tyr Glu Asn Arg Ala Tyr Gly Vai 340 345 350 Ala Gly Lys Ser Leu Phe Asp Asp Gly Leu Gly Ala Ala Pro Gly Vai 355 360 365 82 ΡΕ2233569

Pro Ser Gly Arg Ser Lys Phe Ser 370 375

Pro Asp Vai Leu Glu Thr Vai Pro 380

Ala Ser Pro Gly Leu Arg Arg Pro 385 390

Ser Leu Gly Ala Vai Glu Arg Gin 395 400

Asp Ser Gly Tyr Asp Ser Leu Asp 405

Gly Vai Gly Ser Arg Ser Phe Ser 410 415

Leu Gly Glu Vai Ser Asp Met Ala 420

Ala Vai Glu Ala Ala Glu Leu Glu 425 430

Met Thr Arg Gin Vai Leu His Ala 435 440

Gly Ala Arg Gin Asp Asp Ala Glu 445

Pro Gly Vai Ser Gly Ala Ser Ala 450 455

His Trp Gly Gin Arg Ala Leu Gin 460

Gly Ala Gin Ala Vai Ala Ala Ala 465 470

Gin Arg Leu Vai His Ala Ile Ala 475 480

Leu Met Thr Gin Phe Gly Arg Ala 485

Gly Ser Thr Asn Thr Pro Gin Glu 490 495

Ala Ala Ser Leu Ser Ala Ala Vai 500

Phe Gly Leu Gly Glu Ala Ser Ser 505 510

Ala Vai Ala Glu Thr Vai Ser Gly 515 520

Phe Phe Arg Gly Ser Ser Arg Trp. 525

Ala Gly Gly Phe Gly Vai Ala Gly 530 535

Gly Ala Met Ala Leu Gly Gly Gly 540

He Ala Ala Ala Vai Gly Ala Gly 545 550

Met Ser Leu Thr Asp Asp Ala Pro 555 560

Ala Gly Gin Lys Ala Ala Ala Gly 565

Ala Glu Ile Ala Leu Gin Leu Thr '570 575

Gly Gly Thr Vai Glu Leu Ala Ser 580

Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala 585 590 ΡΕ2233569 83

Ala Arg Gly Vai Thr Ser Gly Leu 595 600

Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala 610 615

Gly Leu Vai Gin Gin Ser His Tyr 625 630

Gin Glu Ser Ser Ala Tyr Gly Tyr 645

Leu Tyr Arg Asp Lys Thr Ala Ala 660

Ala Vai Leu Ser Thr Vai Gly Ala 675 680

Ser Vai Vai Gly Ala Pro Vai Ala 690 695

Ala Leu Asn Gly Ile Leu Arg Gly 705 710

Leu Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Lys 725

Ala.Tyr Phe Glu Lys Asn Leu Gin 740

Ser Asp Gly Leu Arg Lys Met Leu 755 760

Ala Ser Ser Vai Ile Gly Vai Gin 770 775

Leu Glu Leu Ala Ala Ile Thr Gly 785 790

Asp Vai Phe Vai Asp Arg Phe Vai 805

Vai Ala Gly Ala Ser Ala Gly 605 Leu Ser Pro Met Glu Ile Tyr 620 Asp Gin Leu Asp Lys Leu Ala 635 640 Gly Asp Ala Leu Leu Ala Gin 650 655 Gly Ala vai Ala Gly Vai Ser 670 Vai Ser ile Ala Ala Ala Ala 685 Vai Thr Ser Leu Leu Thr Gly 700 Gin Gin Pro Ile Ile Glu Lys 715 720 Asp Glu Leu Gly Gly Pro Gin 730 735 Arg His Glu Gin Leu Ala Asn 750 Asp Leu Gin Ala Gly Trp Asn 765 Thr Glu Ile Ser Lys Ser Ala 780 Ala Asp Asn Leu Lys Ser Vai 795 800 Gly Glu Arg Vai Ala Gly Gin 810 815

Pro Vai Vai Leu Asp Vai Ala Ala Gly Gly Ile Asp Ile Ala Ser Arg ΡΕ2233569 84 820 825 830

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Thr Phe Vai Glu Ile Vai Gly Lys Gin Asp Arg Trp Arg Ile Arg Asp 865 870 875 880

Gly Ala Ala Asp Thr Thr Ile Asp Leu Ala Lys Vai Vai Ser Gin Leu 885 890 895

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Ser Met 1265 Lys Asp Vai Leu Ile 1270 Gly Asp Ala Gin Ala 1275 Asn Thr Leu Met Gly 1280 Gin Gly Gly Asp Asp 1285 Thr Vai Arg Gly Gly 1290 Asp Gly Asp Asp Leu 1295 Leu Phe Gly Gly Asp 1300 Gly Asn Asp Met Leu 1305 Tyr Gly Asp Ala Gly 1310 Asn Asp Thr Leu Tyr 1315 Gly Gly Leu Gly Asp 1320 Asp Thr Leu Glu Gly 1325 Gly Ala Gly Asn Asp 1330 Trp Phe Gly Gin Thr 1335 Gin Ala Arg Glu His 1340 Asp Vai Leu Arg Gly 1345 Gly Asp Gly Vai Asp 1350 Thr Vai Asp Tyr Ser 1355 Gin Thr Gly Ala His 1360 Ala Gly Ile Ala Ala 1365 Gly Arg Ile Gly Leu 1370 Gly lie Leu Ala Asp 1375 Leu Gly Ala Gly Arg 1380 Vai Asp Lys Leu Gly 1385 Glu Ala Gly Ser Ser 1390 Ala Tyr Asp Thr Vai 1395 Ser Gly Ile Glu Asn 1400 Vai Vai Gly Thr Glu 1405 Leu Ala Asp Arg Ile 1410 Thr Gly Asp Ala Gin 1415 Ala Asn Vai Leu Arg 1420 Gly Ala Gly Gly Ala 1425 Asp Vai Leu Ala Gly 1430 Gly Glu Gly Asp Asp 1435 Vai Leu Leu Gly Gly 1440 Asp Gly Asp Asp Gin 1445 Leu Ser Gly Asp Ala 1450 Gly Arg Asp Arg Leu 1455 Tyr Gly Glu Ala Gly 1460 Asp Asp Trp Phe Phe 1465 Gin Asp Ala Ala Asn 1470 Ala Gly Asn ΡΕ2233569 87

Leu Leu Asp Gly Gly Asp Gly Arg Asp Thr Vai Asp Phe 1475 1480 1485

Ser Gly

Pro Gly Arg Gly Leu Asp Ala Gly Ala Lys Gly Vai Phe 1490 1495 1500

Leu Ser

Leu Gly Lys Gly Phe Ala Ser Leu Met Asp Glu Pro Glu 1505 1510 1515

Thr Ser

Asn Vai Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ala Vai Gly Ser Ala 1520 1525 1530

Arg Asp

Asp Vai Leu Ile Gly Asp Ala Gly Ala Asn Vai Leu Asn 1535 1540 1545

Gly Leu

Ala Gly Asn Asp Vai Leu Ser Gly Gly Ala Gly Asp Asp 1550 1555 1560

Vai Leu

Leu Gly Asp Glu Gly Ser Asp Leu Leu Ser Gly Asp Ala 1565 1570 1575

Gly Asn

Asp Asp Leu Phe Gly Gly Gin Gly Asp Asp Thr Tyr Leu 1580 1585 1590

Phe Gly

Vai Gly Tyr Gly His Asp Thr Ile Tyr Glu Ser Gly Gly 1595 1600 1605

Gly His

Asp Thr Ile Arg Ile Asn Ala Gly Alá Asp Gin Leu Trp 1610 1615 1620

Phe Ala

Arg Gin Gly Asn Asp Leu Glu Ile Arg Ile Leu Gly Thr 1625 1630 1635

Asp Asp

Ala Leu Thr Vai His Asp Trp Tyr Arg Asp Ala Asp His 1640 1645 1650

Arg Vai

Glu Ile Ile His Ala Ala Asn Gin Ala Vai Asp Gin Ala 1655 1660 1665

Gly Ile

Glu Lys Leu Vai Glu Ala Met Ala Gin Tyr Pro Asp Pro 1670 1675 1680

Gly Ala

Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Arg Vai Pro Asp Thr

Leu Met ΡΕ2233569 1685 1690 1695

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Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gin Ala Gly Leu 115 120 125

Vai Thr Gly Met Ala Asp Gly Vai Vai Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr 130 135 140

Gly Arg Tyr Ala 160

Glu Gin Phe Glu Phe Arg Vai Lys Glu Thr Ser Asp 145 150 155 ΡΕ2233569 89

Val Gin Tyr

Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Val 165 170

Lys Val 175

Ile Gly Asn

Ala Ile Met 195

Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Ile Asp Met Phe 180 185 190

Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser 200 205

Val Thr Ser Gly Asp Ser Val Thr Asp Tyr Leu Ala Arg Thr Arg Arg 210 215 220

Ala Ala Ser Glu Ala Thr Gly Gly Leu Asp Arg Glu Arg Ile Asp Leu 225 230 235 240

Leu Trp Lys Ile Ala Arg Ala Gly Ala Arg Ser Ala Val Gly Thr Glu 245 250 255

Ala Arg Arg Gin Phe Arg Tyr Asp Gly Asp Met Asn Ile Gly Val Ile 260 265 270

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Pro Phe Pro Glu Ala Asp Glu Lys Ile Phe Val Val Ser Ala Thr Gly 305 310 315 320

Glu Ser Gin Met Leu Thr Arg Gly Gin Leu Lys Glu Tyr Ile Gly Gin 325 330 335

Gin Arg Gly Glu Gly Tyr Val Phe Tyr Glu Asn Arg Ala Tyr Gly Val 340 345 350

Ala Gly Lys Ser Leu Phe Asp Asp Gly Leu Gly Ala Ala Pro Gly Val 355 360 365

Pro Ser Gly Arg Ser Lys Phe Ser Pro Asp Val Leu Glu Thr Val Pro 370 375 380

Ala Ser Pro Gly Leu Arg Arg Pro Ser Leu Gly Ala Val Glu Arg Gin 90 ΡΕ2233569 385 390 395 400

Asp Ser Gly Tyr Asp Ser Leu Asp 405

Gly Vai Gly Ser Arg Ser Phe Ser 410 415

Leu Gly Glu Vai Ser Asp Met Ala 420

Ala Vai Glu Ala Ala Glu Leu Glu 425 430

Met Thr Arg Gin Vai Leu His Ala 435 440

Gly Ala Arg Gin Asp Asp Ala Glu 445

Pro Gly Vai Ser Gly Ala Ser Ala 450 455

His Trp Gly Gin Arg Ala Leu Gin 460

Gly Ala Gin Ala Vai Ala Ala Ala 465 470

Gin Arg Leu Vai His Ala Ile Ala 475 480

Leu Met Thr Gin Phe Gly Arg Ala 485

Gly Ser Thr Asn Thr Pro Gin Glu 490 495

Ala Ala Ser Leu Ser Ala Ala Vai 500

Phe Gly Leu Gly Glu Ala Ser Ser 505 510

Ala Vai Ala Glu Thr Vai Ser Gly 515 520

Phe Phe Arg Gly Ser Ser Arg Trp 525 .

Ala Gly Gly Phe Gly Vai Ala Gly 530 535

Gly Ala Met Ala Leu Gly Gly Gly 540

He Ala Ala Ala Vai Gly Ala Gly 545 550

Met Ser Leu Thr Asp Asp Ala Pro 555 560

Ala Gly Gin Lys Ala Ala Ala Gly 565

Ala Gin Ile Ala Leu Gin Leu Thr 570 575

Gly Gly Thr Vai Glu Leu Ala Ser 580

Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala 585 590

Ala Arg Gly Vai Thr Ser Gly Leu 595 600

Gin Vai Ala Gly Ala Ser Ala Gly 605

Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala 610 615

Ala Leu Ser Pro Met Glu Ile Tyr 620 91 ΡΕ2233569

Gly Leu Vai Gin Gin Ser His Tyr 625 630

Ala Asp Gin Leu Asp Lys Leu Ala 635 640

Gin Glu Ser Ser Ala Tyr Gly Tyr 64 5

Glu Gly Asp Ala Leu Leu Ala Gin 650 655

Leu Tyr Arg Asp Lys Thr Ala Ala 660

Glu Gly Ala Vai Ala Gly Vai Ser 665 670

Ala Vai Leu Ser Thr Vai Gly Ala 675 680

Ala Vai Ser Ile Ala Ala Ala Ala 685

Ser Vai Vai Gly Ala Pro Vai Ala 690 695

Vai Vai Thr Ser Leu Leu Thr Gly 700

Ala Leu Asn Gly Ile Leu Arg Gly 705 710

Vai Gin Gin Pro Ile Ile Glu Lys 715 720

Leu Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Lys 725

Ile Asp Glu Leu Gly Gly Pro Gin 730 735

Ala Tyr Phe Glu Lys Asn Leu Gin 740

Ala Arg His Glu Gin Leu Ala Asn 745 750

Ser Asp Gly Leu Arg Lys Met Leu 755 760

Ala Asp Leu Gin Ala Gly Trp Asn 765

Ala Ser Ser Vai Ile Gly Vai Gin 770 775

Thr Thr Glu Ile Ser Lys Ser Ala 780

Leu Glu Leu Ala Ala Ile Thr Gly 785 790

Asn Ala Asp Asn Leu Lys Ser Vai 795 800

Asp Vai Phe Vai Asp Arg Phe Vai 805

Gin Gly Glu Arg Vai Ala Gly Gin 810 815

Pro Vai Vai Leu Asp Vai Ala Ala 820

Gly Gly Ile Asp Ile Ala Ser Arg 825 830

Lys Gly Glu Arg Pro Ala Leu Thr 835 840

Phe Ile Thr Pro Leu Ala Ala Pro 845 92 ΡΕ2233569

Gly Glu Glu Gin Arg Arg Arg Thr Lys Thr Gly Arg Ser Glu Phe Thr 850 855 860

Thr Phe Vai Glu Ile Vai Gly Lys Gin Asp Arg Trp Arg Ile Arg Asp 865 870 875 880

Gly Ala Ala Asp Thr Thr Ile Asp Leu Ala Lys Vai vai Ser Gin Leu 885 890 895

Vai Asp Ala Asn Gly Vai Leu Lys His Ser Ile Lys Leu Asp Vai Ile 900 905 910

Gly Gly Asp Gly Asp Asp Vai Vai Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ile His 915 920 925

Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Thr Asn Thr Vai Ser Tyr Ala Ala Leu Gly 930 935 940

Arg Gin Asp Ser Ile Thr Vai Ser Ala Asp Gly Glu Arg Phe Asn Vai 945 950 955 960

Arg Lys Gin Leu Asn Asn Ala Asn Vai Tyr Arg Glu Gly Vai Ala Thr 965 970 975

Gin Thr Thr Ala Tyr Gly Lys Arg Thr Glu Asn Vai Gin Tyr Arg His 980 985 990

Vai Glu Leu Ala Arg Vai Gly Gin Vai Vai Glu Vai Asp Thr Leu Glu 995 1000 1005

His Vai 1010 Gin His Ile Ile Gly 1015 Gly Ala Gly Asn Asp 1020 Ser Ile Thr Gly Asn 1025 Ala His Asp Asn Phe 1030 Leu Ala Gly Gly Ser 1035 Gly Asp Asp Arg Leu 1040 Asp Gly Gly Ala Gly 1045 Asn Asp Thr Leu Vai 1050 Gly Gly Glu Gly Gin 1055 Asn Thr Vai Ile Gly 1060 Gly Ala Gly Asp Asp 1065 Vai Phe Leu 93 ΡΕ2233569

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Leu Glu Arg Met Gly Asp Thr Gly Ile His Ala Asp Leu Gin Lys 1100 1105 1110

Gly Thr Vai Glu Lys Trp Pro Ala Leu Asn Leu Phe Ser Vai Asp 1115 1120 1125

His Vai Lys Asn Ile Glu Asn Leu His Gly Ser Arg Leu Asn Asp 1130 1135 1140

Arg Ile Ala Gly Asp Asp Gin Asp Asn Glu Leu Trp Gly His Asp 1145 1150 1155

Gly Asn Asp Thr Ile Arg Gly Arg Gly Gly Asp Asp Ile Leu Arg 1160 1165 1170

Gly Gly Leu Gly Leu Asp Thr Leu Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Asp 1175 1180 1185

Ile Phe Leu Gin Asp Asp Glu Thr Vai Ser Asp Asp Ile Asp Gly 1190 1195 1200

Gly Ala Gly Leu Asp Thr Vai Asp Tyr Ser Ala Met Ile His Pro 1205 1210 ' 1215

Gly Arg Ile Vai Ala Pro His Glu Tyr Gly Phe Gly Ile Glu Ala 1220 1225 1230

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Ser Met Lys Asp Vai Leu Ile Gly Asp Ala Gin Ala Asn Thr Leu 1265 1270 1275

Met Gly Gin Gly Gly Asp Asp Thr Vai Arg Gly Gly Asp Gly Asp 94 ΡΕ2233569 1280 1285 1290

Asp Leu Leu Phe Gly Gly Asp Gly Asn Asp Met Leu Tyr Gly Asp 1295 1300 1305

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Glu Gly Gly Ala Gly Asn Asp Trp Phe Gly Gin Thr Gin Ala Arg 1325 1330 1335

Glu His Asp Vai Leu Arg Gly Gly Asp Gly Vai Asp Thr Vai Asp 1340 1345 1350

Tyr Ser Gin Thr Gly Ala His Ala Gly Ile Ala Ala Gly Arg Ile 1355 1360 1365

Gly Leu Gly Ile Leu Ala Asp Leu Gly Ala Gly Arg Vai Asp Lys 1370 1375 1380

Leu Gly Glu Ala Gly Ser Ser Ala Tyr Asp Thr Vai Ser Gly Ile 1385 1390 1395

Glu Asn Vai Vai Gly Thr Glu Leu Ala Asp Arg Ile Thr Gly Asp 1400 1405 1410

Ala Gin Ala Asn Vai Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Asp Vai Leu 1415 1420 1425

Ala Gly Gly Glu Gly Asp Asp Vai Leu Leu Gly Gly Asp Gly Asp 1430 1435 1440

Asp Gin Leu Ser Gly Asp Ala Gly Arg Asp Arg Leu Tyr Gly Glu 1445 1450 1455

Ala Gly Asp Asp Trp Phe Phe Gin Asp Ala Ala Asn Ala Gly Asn 1460 1465 1470

Leu Leu Asp Gly Gly Asp Gly Arg Asp Thr Vai Asp Phe Ser Gly 1475 1480 1485

Pro Gly Arg Gly Leu Asp Ala Gly Ala Lys Gly Vai Phe Leu Ser 1490 1495 1500 ΡΕ2233569 95

Leu Gly Lys Gly Phe Ala Ser Leu Met Asp Glu Pro 1505 1510 1515

Glu Thr Ser

Asn Vai Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ala Vai Gly Ser 1520 1525 1530

Ala Arg Asp

Asp Vai Leu Ile Gly Asp Ala Gly Ala Asn Vai Leu 1535 1540 1545

Asn Gly Leu

Ala Gly Asn Asp Vai Leu Ser Gly Gly Ala Gly Asp 1550 1555 1560

Asp Vai Leu-

Leu Gly Asp Glu Gly Ser Asp Leu Leu Ser Gly Asp 1565 1570 1575

Ala Gly Asn

Asp Asp Leu Phe Gly Gly Gin Gly Asp Asp Thr Tyr 1580 1585 1590

Leu Phe Gly

Vai Gly Tyr Gly His Asp Thr Ile Tyr Glu Ser Gly 1595 1600 1605

Gly Gly His

Asp Thr Ile Arg Ile Asn Ala Gly Ala Asp Gin Leu 1610 1615 1620

Trp Phe Ala

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Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Vai Asn Pro His Ser Thr 35 40 45

Ser Leu Ile Ala Glu Gly Vai Ala Thr Lys Gly Leu Gly Vai His Ala 50 55 60

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Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Vai Ile Ala Arg Ala 85 90 95

Asp Asn Asp Vai Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Vai Asp 100 .105 110

Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gin Ala Gly Leu 115 120 125

Vai Thr Gly Met Ala Asp Gly Vai Vai Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr 130 135 140

Glu Gin Phe Glu Phe Arg Vai Lys Glu Thr Ser Asp Gly Arg Tyr Ala 145 150 155 160

Vai Gin Tyr Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Vai Lys Vai 165 170 175

Ile Gly Asn Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Gly Ser Ile Asp 180 185 190 97 ΡΕ2233569

Met Phe Ala Ile Met Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg 195 200 205

Ser Ser Vai Thr Ser Gly Asp Ser Vai Thr Asp Tyr Leu Ala Arg Thr 210 215 220

Arg Arg Ala Ala Sér Glu Ala Thr Gly Gly Leu Asp Arg Glu Arg Ile 225 230 235 240

Asp Leu Leu Trp Lys Ile Ala Arg Ala Gly Ala Arg Ser Ala Vai Gly 245 250 255

Thr Glu Ala Arg Arg Gin Phe Arg Tyr Asp Gly Asp Met Asn Ile Gly 260 265 270

Vai Ile Thr Asp Phe Glu Leu Glu Vai Arg Asn Ala Leu Asn Arg Arg 275 280 285

Ala His Ala Vai Gly Ala Gin Asp Vai Vai Gin His Gly Thr Glu Gin 290 295 300

Asn Asn Pro Phe Pro Glu Ala Asp Glu Lys Ile Phe Vai Vai Ser Ala 305 310 315 320

Thr Gly Glu Ser Gin Met Leu Thr Arg Gly Gin Leu Lys Glu Tyr Ile 325 330 335

Gly Gin Gin Arg Gly Glu Gly Tyr Vai Phe Tyr Glu Asn Arg Ala Tyr 340 345 350

Gly Vai Ala Gly Lys Ser Leu Phe Asp Asp Gly Leu Gly Ala Ala Pro 355 360 365

Gly Vai Pro Ser Gly Arg Ser Lys Phe Ser Pro Asp Vai Leu Glu Thr 370 375 380

Vai Pro Ala Ser Pro Gly Leu Arg Arg Pro Ser Leu' Gly Ala Vai Glu 385 390 395 400

Arg Gin Asp Ser Gly Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Vai Gly Ser Arg Ser 405 410 415 98 ΡΕ2233569

Phe Ser Leu Gly Glu Vai Ser Asp Met Ala Ala Vai Glu Ala Ala Glu 420 425 430

Leu Glu Met Thr Arg Gin Vai Leu His Ala Gly Ala Arg Gin Asp Asp 435 440 445

Ala Glu Pro Gly Vai Ser Gly Ala Ser Ala His Trp Gly Gin Arg Ala 450 455 460

Leu Gin Gly Ala Gin Ala Vai Ala Ala Ala Gin Arg Leu Vai His Ala 465 470 475 480

He Ala Leu Met Thr Gin Phe Gly Arg Ala Gly Ser Thr Asn Thr Pro 485 490 495

Gin Glu Ala Ala Ser Leu Ser Ala Ala Vai Phe Gly Leu Gly Glu Ala 500 505 510

Ser Ser Ala Vai Ala Glu Thr Vai Ser Gly Phe Phe Arg Gly Ser Ser 515 520 525

Arg Trp Ala Gly Gly Phe Gly Vai Ala Gly Gly Ala Met Ala Leu Gly 530 535 540

Gly Gly Ile Ala Ala Ala Vai Gly Ala Gly Met Ser Leu Thr Asp Asp 545 550 555 560

Ala Pro Ala Gly Gin Lys Ala Ala Ala Gly Ala Gin Ile Ala Leu Gin 565 570 575

Leu Thr Gly Gly Thr Vai Glu Leu Ala Ser Ser Ile Ala Leu Ala Leu 580 585 590

Ala Ala Ala Arg Gly Vai Thr Ser Gly Leu Gin Vai Ala Gly Ala Ser 595 600 605

Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Leu Ser Pro Met Glu 610 615 620

Ile Tyr Gly Leu Vai Gin Gin Ser His Tyr Ala Asp Gin Leu Asp Lys 625 630 635 640 99 ΡΕ2233569

Leu Ala Gin Glu Ser Ser Ala Tyr 645

Gly Tyr Glu Gly Asp Ala Leu Leu 650 655

Ala Gin Leu Tyr Arg Asp Lys Thr 660

Ala Ala Glu Gly Ala Vai Ala Gly 665 670

Vai Ser Ala Vai Leu Ser Thr Vai 675 680

Gly Ala Ala Vai Ser Ile Ala Ala 685

Ala Ala Ser Vai Vai Gly Ala Pro 690 695

Vai Ala Vai Vál Thr Ser Leu Leu 700

Thr Gly Ala Leu Asn Gly Ile Leu 705 710

Arg Gly Vai Gin Gin Pro Ile Ile 715 720

Glu Lys Leu Ala Asn Asp Tyr Ala 725

Arg Lys Ile Asp Glu Leu Gly Gly 730 735

Pro Gin Ala Tyr Phe Glu Lys Asn 740

Leu Gin Ala Arg His Glu Gin Leu 745 750

Ala Asn Ser Asp Gly Leu Arg Lys 755 760

Met Leu Alá Asp Leu Gin Ala Gly 765

Trp Asn Ala Ser Ser Vai Ile Gly 770 775

Vai Gin Thr Thr Glu Ile Ser Lys 780

Ser Ala Leu Glu Leu Ala Ala Ile 785 790

Thr Gly Asn Ala Asp Asn Leu Lys 795 800

Ser Vai Asp Vai Phe Vai Asp Arg 805

Phe Vai Gin Gly Glu Arg Vai Ala 810 815

Gly Gin Pro Vai Vai Leu Asp Vai 820

Ala Ala Gly Gly Ile Asp Ile Ala 825 830

Ser Arg Lys Gly Glu Arg Pro Ala 835 840

Leu Thr Phe Ile Thr Pro Leu Ala 845

Ala Pro Gly Glu Glu Gin Arg Arg 850 855

Arg Thr Lys Thr Gly Arg Ser Glu 860

Phe Thr Thr Phe Vai Glu Ile Vai

Gly Lys Gin Asp Arg Trp Arg Ile 100 ΡΕ2233569 865 870 875 880

Arg Asp Gly Ala Ala Asp Thr Thr Ile Asp Leu Ala Lys Vai Vai Ser 885 890 895

Gin Leu Vai Asp Ala Asn Gly Vai Leu Lys His Ser Ile Lys Leu Asp 900 905 910

Vai Ile Gly Gly Asp Gly Asp Asp Vai Vai Leu Ala Asn Ala Ser Arg 915 920 925

Ile His Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Thr Asn Thr Vai Ser Tyr Ala Ala 930 935 940

Leu Gly Arg Gin Asp Ser Ile Thr Vai Ser Ala Asp Gly Glu Arg Phe 945 950 955 960

Asn Vai Arg Lys Gin Leu Asn Asn Ala Asn Vai Tyr Arg Glu Gly Vai 965 970 975

Ala Thr Gin Thr Thr Ala Tyr Gly Lys Arg Thr Glu Asn Vai Gin Tyr 980 985 990

Arg His Vai Glu Leu Ala Arg Vai Gly Gin Vai Vai Glu Vai Asp Thr 995 1000 1005

Leu Glu 1010 His Vai Gin His Ile 1015 Ile Gly Gly Ala Gly 1020 Asn Asp Ser Ile Thr 1025 Gly Asn Ala His Asp 1030 Asn Phe Leu Ala Gly 1035 Gly Ser Gly Asp Asp 1040 Arg Leu Asp Gly Gly 1045 Ala Gly Asn Asp Thr 1050 Leu Vai Gly Gly Glu 1055 Gly Gin Asn Thr Vai 1060 Ile Gly Gly Ala Gly 1065 Asp Asp Vai Phe Leu 1070 Gin Asp Leu Gly Vai 1075 Trp Ser Asn Gin Leu 1080 Asp Gly Gly Ala Gly 1085 Vai Asp Thr Vai Lys 1090 Tyr Asn Vai His Gin 1095 Pro Ser Glu 101 ΡΕ2233569

Glu Arg 1100 Leu Glu Arg Met Gly 1105 Asp Thr Gly Ile His 1110 Ala Asp Leu Gin Lys 1115 Gly Thr Vai Glu Lys 1120 Trp Pro Ala Leu Asn 1125 Leu Phe Ser Vai Asp 1130 His Vai Lys Asn Ile 1135 Glu Asn Leu His Gly 1140 Ser Arg Leu Asn Asp 1145 Arg Ile Ala Gly Asp 1150 Asp Gin Asp Asn Glu 1155 Leu Trp Gly His Asp 1160 Gly Asn Asp Thr ile 1165 Arg Gly Arg Gly Gly 1170 Asp Asp Ile Leu Arg 1175 Gly Gly Leu Gly Leu 1180 Asp Thr Leu Tyr Gly 1185 Glu Asp Gly Asn Asp 1190 Ile Phe Leu Gin Asp 1195 Asp Glu Thr Vai Ser 1200 Asp Asp Ile Asp Gly 1205 Gly Ala Gly Leu Asp 1210 Thr Vai Asp Tyr Ser 1215 Ala Met Ile His Pro 1220 Gly Arg Ile Vai Ala 1225 Pro His Glu Tyr Gly 1230 Phe Gly Ile Glu Ala 1235 Asp Leu Ser Arg Glu 1240 Trp Vai Arg Lys Ala 1245 Ser Ala Leu Gly V 3.]_ 1250 Asp Tyr Tyr Asp Asn 1255 Vai Arg Asn Vai Glu 1260 Asn Vai Ile Gly Thr 1265 Ser Met Lys Asp Vai 1270 Leu Ile Gly Asp Ala 1275 Gin Ala Asn Thr Leu 1280 Met Gly Gin Gly Gly 1285 Asp Asp Thr Vai Arg 1290 Gly Gly Asp Gly Asp 1295 Asp Leu Leu Phe Gly 1300 Gly Asp Gly Asn Asp 1305 Met Leu Tyr 102 ΡΕ2233569

Gly Asp 1310 Ala Gly Asn Asp Thr 1315 Leu Tyr Gly Gly Leu 1320 Gly Asp Asp Thr Leu 1325 Glu Gly Gly Ala Gly 1330 Asn Asp Trp Phe Gly 1335 Gin Thr Gin Ala Arg 1340 Glu His Asp Vai Leu 1345 Arg Gly Gly Asp Gly 1350 Vai Asp Thr Vai Asp 1355 Tyr Ser Gin Thr Gly 1360 Ala His Ala Gly Ile 1365 Ala Ala Gly Arg Ile 1370 Gly Leu Gly Ile Leu 1375 Ala Asp Leu Gly Ala 1380 Gly Arg Vai Asp Lys 1385 Leu Gly Glu Ala Gly 1390 Ser Ser Ala Tyr Asp 1395 Thr Vai Ser Gly Ile 1400 Glu Asn Vai Vai Gly 1405 Thr Glu Leu Ala Asp 1410 Arg Ile Thr Gly Asp 1415 Ala Gin Ala Asn Vai 1420 Leu Arg Gly Ala Gly 1425 Gly Ala Asp Vai Leu 1430 Ala Gly Gly Glu Gly 1435 Asp Asp Vai Leu Leu 1440 Gly Gly Asp Gly Asp 1445 Asp Gin Leu Ser Gly 1450 Asp Ala Gly Arg Asp 1455 Arg Leu Tyr Gly Glu 1460 Ala Gly Asp Asp Trp 1465 Phe Phe Gin Asp Ala 1470 Ala Asn Ala Gly Asn 1475 Leu Leu Asp Gly Gly 1480 Asp Gly Arg Asp Thr 1485 Vai Asp Phe Ser Gly 1490 Pro Gly Arg Gly Leu 1495 Asp Ala Gly Ala Lys 1500 Gly Vai Phe Leu Ser 1505 Leu Gly Lys Gly Phe 1510 Ala Ser Leu Met Asp 1515 Glu Pro Glu 103 ΡΕ2233569

Thr Ser Asn Vai Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ala Vai Gly Ser Ala 1520 1525 1530

Arg Asp Asp Vai Leu Ile Gly Asp Ala Gly Ala Asn Vai Leu Asn 1535 1540 1545

Gly Leu Ala Gly Asn Asp Vai Leu Ser Gly Gly Ala Gly Asp Asp 1550 1555 1560

Vai Leu Leu Gly Asp Glu Gly Ser Asp Leu Leu Ser Gly Asp Ala 1565 1570 1575

Gly Asn Asp Asp Leu Phe Gly Gly Gin Gly Asp Asp Thr Tyr Leu 1580 1585 1590

Phe Gly Vai Gly Tyr Gly His Asp Thr Ile Tyr Glu Ser Gly Gly 1595 1600 1605

Gly His Asp Thr Ile Arg Ile Asn Ala Gly Ala Asp Gin Leu Trp 1610 1615 1620

Phe Ala Arg Gin Gly Asn Asp Leu Glu Ile Arg Ile Leu Gly Thr 1625 1630 1635

Asp Asp Ala Leu Thr Vai His Asp Trp Tyr Arg Asp Ala Asp His 1640 1645 1650

Arg Vai Glu Ile Ile His Ala Ala Asn Gin Ala Vai Asp Gin Ala 1655 1660 1665

Gly Ile Glu Lys Leu Vai Glu Ala Met Ala Gin Tyr Pro Asp Pro 1670 1675 1680

Gly Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Arg Vai Pro Asp Thr 1685 1690 1695

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Met Gin Gin Ser His Gin Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu 1 5 10 15 Ser Gly Ile Pro Ala Ala Vai Leu Asp Gly Ile Lys Ala Vai Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Vai Asn Pro His Ser Thr 35 40 45 Ser Leu Ile Ala ,- u Gly Vai 7\ 1 Q jTu_a Thr T * · uy o Gly T Λ1 * iiCU yiy Vai His 7\ 1 —» n±a 50 55 60 Lys Ser Ser Asp Trp Gly Leu Gin Ala Gly Tyr Ile Pro Vai Asn Pro 65 70 75 80 Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Vai Ile Ala Arg Ala 85 90 95 Asp Asn Asp Vai Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Vai Asp 100 105 110 Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gin Ala Gly Leu 115 120 125 Vai Thr Gly Met Ala Asp Gly Vai Vai Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr 130 135 140 Glu Gin Phe Glu Phe Arg Vai Lys Glu Thr Ser Asp Gly Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Vai Gin Tyr Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Vai Lys Vai 165 170 175 Ile Gly Asn Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Gly Ser Ile Asp 180 185 190 Met Phe Ala Ile Met Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg 195 200 205 105 ΡΕ2233569

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Gly Ala Gin Asp Vai Vai Gin His Gly Thr Glu Gin Asn Asn Pro Phe 305 310 315 , 320

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Gly Arg Ser Lys Phe Ser Pro Asp Vai Leu Glu Thr Vai Pro Ala Ser 385 390 395 400

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Gly Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Vai Gly Ser Arg Ser Phe Ser Leu Gly 420 425 430

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Arg Gin Vai Leu His Ala Gly Ala 450 455

Vai Ser Gly Ala Ser Ala His Trp 465 470

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Ser Leu Ser Ala Ala Vai Phe Gly 515 520

Ala Glu Thr Vai Ser Gly Phe Phe 530 535

Gly Phe Gly Vai Ala Gly Gly Ala 545 550

Ala Ala Vai Gly Ala Gly Met Ser 565

Gin Lys Ala Ala Ala Gly Ala Gin 580

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Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Leu 625 630

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Arg Asp Lys Thr Ala Ala Glu Gly 675 680

Ala vai Ala Gly Vai Ser Ala Vai 685

Leu Ser Thr Vai Gly Ala Ala Vai 690 695

Ser Ile Ala Ala Ala Ala Ser Vai 700

Vai Gly Ala Pro Vai Ala Vai Vai 705 710

Thr Ser Leu Leu Thr Gly Ala Leu 715 720

Asn Gly Ile Leu Arg Gly Vai Gin 725

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Asn Asp Tyr Ala Arg Lys Ile Asp 740

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Phe Glu Lys Asn Leu Gin Ala Arg 755 760

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Gly Leu Arg Lys Met Leu Ala Asp 770 775

Leu Gin Ala Gly Trp Asn Ala Ser 780

Ser Vai Ile Gly Vai Gin Thr Thr 785 790

Glu Ile Ser Lys Ser Ala Leu Glu 795 800

Leu Ala Ala Ile Thr Gly Asn Ala 805

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Phe Vai Asp Arg Phe Vai Gin Gly 820

Glu Arg Vai Ala Gly Gin Pro Vai 825 830

Vai Leu Asp Vai Ala Ala Gly Gly 835 840

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Glu Gin Arg Arg Arg Thr Lys Thr 865 870

Gly Arg Ser Glu Phe Thr Thr Phe 875 880

Vai Glu Ile Vai Gly Lys Gin Asp 885

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Ala Asp Thr Thr lie Asp Leu Ala Lys Vai Vai Ser Gin Leu Vai Asp 900 905 910

Ala Asn Gly Vai Leu Lys His Ser Ile Lys Leu Asp Vai Ile Gly Gly 915 920 925

Asp Gly Asp Asp Vai Vai Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ile His Tyr Asp 930 935 940

Gly Gly Ala Gly Thr Asn Thr Vai Ser Tyr Ala Ala Leu Gly Arg Gin 945 950 955 960

Asp Ser Ile Thr Vai Ser Ala Asp Gly Glu Arg Phe Asn Vai Arg Lys 965 970 975

Gin Leu Asn Asn Ala Asn Vai Tyr Arg Glu Gly Vai Ala Thr Gin Thr 980 985 990

Thr Ala Tyr Gly Lys Arg Thr Glu Asn Vai Gin Tyr Arg His Vai Glu 995 1000 1005

Leu Ala Arg Vai Gly Gin Vai Vai Glu Vai Asp Thr Leu Glu His 1010 1015 1020

Vai Gin His Ile Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asp Ser Ile Thr Gly 1025 1030 1035

Asn Ala His Asp Asn Phe Leu Ala Gly Gly Ser Gly Asp Asp Arg 1040 1045 1050

Leu Asp Gly Gly Ala Gly Asn Asp Thr Leu Vai Gly Gly Glu Gly 1055 1060 1065

Gin Asn Thr Vai Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asp Vai Phe Leu Gin 1070 1075 1080

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Glu Arg Met Gly Asp Thr Gly Ile His Ala Asp Leu Gin Lys Gly 1115 1120 1125

Thr Vai Glu Lys Trp Pro Ala Leu Asn Leu Phe Ser Vai Asp His 1130 1135 1140

Vai Lys Asn Ile Glu Asn Leu His Gly Ser Arg Leu Asn Asp Arg 1145 1150 1155

Ile Ala Gly Asp Asp Gin Asp Asn Glu Leu Trp Gly His Asp Gly 1160 1165 1170

Asn Asp Thr ile Arg Gly Arg Gly Gly Asp Asp Ile Leu Arg Gly 1175 1180 1185

Gly Leu Gly Leu Asp Thr Leu Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Asp Ile 1190 1195 1200

Phe Leu Gin Asp Asp Glu Thr Vai Ser Asp Asp Ile Asp Gly Gly 1205 1210 1215

Ala Gly Leu Asp Thr Vai Asp Tyr Ser Ala Met Ile His Pro Gly 1220 1225 1230

Arg Ile Vai Ala Pro His Glu Tyr Gly Phe Gly ile Glu Ala Asp 1235 1240 1245

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Tyr Tyr Asp Asn Vai Arg Asn Vai Glu Asn Vai Ile Gly Thr Ser 1265 1270 1275

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Gly Gin Gly Gly Asp Asp Thr Vai Arg Gly Gly Asp Gly Asp Asp 1295 1300 1305

Leu Leu Phe Gly Gly Asp Gly Asn Asp Met Leu Tyr Gly Asp Ala 1310 1315 1320

Gly Asn Asp Thr Leu Tyr Gly Gly Leu Gly Asp Asp Thr Leu Glu 110 ΡΕ2233569 1325 1330 1335

Gly Gly Ala Gly Asn Asp Trp Phe Gly Gin Thr Gin Ala Arg Glu 1340 1345 1350

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Ser Gin Thr Gly Ala His Ala Gly Ile Ala Ala Gly Arg lie Gly 1370 1375 1380

Leu Gly Ile Leu Ala Asp Leu Gly Ala Gly Arg Vai Asp Lys Leu 1385 1390 1395

Gly Glu Ala Gly Ser Ser Ala Tyr Asp Thr Vai Ser Gly Ile Glu 1400 1405 1410

Asn Vai Vai Gly Thr Glu Leu Ala Asp Arg Ile Thr Gly Asp Ala 1415 1420 1425

Gin Ala Asn Vai Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Asp Vai Leu Ala 1430 1435 1440

Gly Gly Glu Gly Asp Asp Vai Leu Leu Gly Gly Asp Gly Asp Asp 1445 1450 1455

Gin Leu Ser Gly Asp Ala Gly Arg Asp Arg Leu Tyr Gly Glu Ala 1460 1465 1470

Gly Asp 1475

Asp Trp Phe Phe Gin 1480

Asp Ala Ala Asn

Ala Gly Asn Leu 1485

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Gly Arg Gly Leu Asp Ala Gly Ala Lys Gly Vai Phe Leu Ser Leu 1505 1510 1515

Gly Lys Gly Phe Ala Ser Leu Met Asp Glu Pro Glu Thr Ser Asn 1520 1525 1530

Vai Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ala Vai Gly Ser Ala Arg Asp Asp 1535 1540 1545 111 ΡΕ2233569

Vai Leu Ile Gly Asp Ala Gly 1550 1555

Ala Asn Vai Leu Asn Gly Leu Ala 1560

Gly Asn Asp Vai Leu Ser Gly 1565 1570

Gly Ala Gly Asp Asp Vai Leu Leu 1575

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Leu Ser Gly Asp Ala Gly Asn Asp 1590

Asp Leu Phe Gly Gly Gin Gly 1595 1600

Asp Asp Thr Tyr Leu Phe Gly Vai 1605

Gly Tyr Gly His Asp Thr Ile 1610 1615

Tyr Glu Ser Gly Gly Gly His Asp 1620

Thr Ile Arg Ile Asn Ala Gly 1625 1630

Ala Asp Gin Leu Trp Phe Ala Arg 1635

Gin Gly Asn Asp Leu Glu Ile 1640 1645

Arg Ile Leu Gly Thr Asp Asp Ala 1650

Leu Thr Vai His Asp Trp Tyr 1655 1660

Arg Asp Ala Asp His Arg Vai Glu 1665

Ile Ile His Ala Ala Asn Gin 1670 1675

Ala Vai Asp Gin Ala Gly Ile Glu 1680

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Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala 1700 1705

Arg Vai Pro Asp Thr Leu Met Gin 1710

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gcgcgctgga cgcggccgcc actcgcgcgc 780 agctggaccg ctaccatgcc gaactgatcg caggactgcg cgcgagcaac ggcggatacg 840 cgccgcgagg ccggggcacc gcctaaggat cctctagagc ttgcatgccc tggcacgaca 900 ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc 960 attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga 1020 gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatgc agcaatcgca tcaggctggt 1080 tacgcaaacg ccgccgaccg ggagtctggc atccccgcag ccgtactcga tggcatcaag 1140 gccgtggcga aggaaaaaaa cgccacattg atgttccgcc tggtcaaccc ccattccacc 1200 agcctgattg ccgaaggggt ggccaccaaa ggattgggcg tgcacgccaa gtcgtccgat 1260 tgggggttgc aggcgggcta cattcccgtc aacccgaatc tttccaaact gttcggccgt 1320 gcgcccgagg tgatcgcgcg ggccgacaac gacgtcaaca gcagcctggc gcatggccat 1380 accgcggtcg acctgacgct gtcgaaagag cggcttgact atctgcggca agcgggcctg 1440 gtcaccggca tggccgatgg cgtggtcgcg agcaaccacg caggctacga gcagttcgag 1500 tttcgcgtga aggaaacctc ggacgggcgc tatgccgtgc agtatcgccg caagggcggc 1560 gacgatttcg aggcggtcaa ggtgatcggc aatgccgccg 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cgcacgaggg agcttccagg 8580 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 8640 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 8700 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 8760 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 8820 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaag 8855

Lisboa, 24 de setembro de 2014

Claims (20)

1. ΡΕ2233569 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste numa das seguintes sequências: (a)uma sequência de aminoácidos que é um fragmento que tem um trecho de aminoácidos que compreendem resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 da SEQ ID NO:l, no qual: (i) o resíduo de ácido glutâmico, correspondente à posição 570 na sequencia da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definido na SEQ ID NO:l, é substituído por um resíduo de glutamina; e (ii) o resíduo de lisina, correspondente à posição 860 na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussis como definido na SEQ ID NO:l, é substituído por um resíduo de arginina, tendo o referido fragmento a capacidade da proteína CyaA de Bordetella pertussis de se ligar ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo, a capacidade de translocar o seu domínio de enzima adenilato ciclase N-terminal para as referidas células e tendo uma actividade de formação de poros que é reduzida ou suprimida comparada com a da toxina CyaA nativa; ou (b) uma sequência de aminoácidos que difere de um 2 ΡΕ2233569 fragmento que tem um trecho de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 860 ou de 2 a 860 da SEQ ID NO:l, por: (i) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondente à posição 570 na sequencia da CyaA nativa de Bordetella pertussis, como definido na SEQ ID NO:l, por um resíduo de glutamina; e (ii) a substituição do resíduo de lisina, correspondente à posição 860 na sequência da CyaA nativa de Bordetella pertussisf como definido na SEQ ID NO:l, por um resíduo de arginina; e (iii) de 1 a 50 substituições adicionais; consistindo o polipéptido na referida sequência, tendo a capacidade da proteína CyaA de Bordetella pertussis de se ligar ao receptor CDllb/CDl8 de células que expressam o mesmo, a capacidade de translocar o seu domínio de enzima adenilato ciclase N-terminal para as referidas células e tendo uma actividade de formação de poros que é reduzida ou suprimida, comparada com a da toxina CyaA nativa.
2. 2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fragmento é pelo menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ou 1600 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO:l, em tamanho.
3. 3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 3 ΡΕ2233569 ou 2, que é um mutante de um toxóide de adenilato ciclase, cuja actividade de adenilato ciclase em células é parcialmente ou totalmente suprimido comparado com a da toxina CyaA de Bordetella pertussis.
4. 4. Polipéptido de acordo com a reivindicação 3, em que a referida supressão total ou parcial da actividade de adenilato ciclase é atingida por inserção de um dipéptido entre os resíduos de aminoácidos que correspondem às posições 188 e 189 da SEQ ID No:l.
5. 5. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, cuja sequência de aminoácidos é SEQ ID N0:2.
6. 6. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, que é a sequência de aminoácidos revelada como SEQ ID NO:2, na qual foi inserido um dipéptido entre as posições 188 e 189, preferivelmente que é a sequência de aminoácidos revelada como SEQ ID NO:3.
7. 7. Derivado de polipéptido compreendendo ou consistindo do polipéptido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 combinados adicionalmente com uma ou mais moléculas de interesse.
8. 8. Derivado de polipéptido de acordo com a reivindicação 7, em que cada uma ou mais das referidas moléculas de interesse consistem numa sequência de aminoácidos adequada para desencadear uma resposta imunitária. 4 ΡΕ2233569
9. 9. Polipéptido derivado de acordo com a reivindicação 8, em que a sequência de aminoácidos de cada uma das referida(s) molécula (s) adequadas para desencadear uma resposta imunitária consiste de 5 a 800 especialmente 300 a 600, ou 400 a 500 resíduos de aminoácidos.
10. 10. Derivado de polipéptido de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a sequência de aminoácidos de cada uma da(s) referida(s) molécula(s),adequada(s) s para desencadear uma resposta imunitária, compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos de um antigénio de poliovírus, um antigénio de vírus de HIV, um antigénio de vírus de HIV, uma antigénio de vírus de influenza, uma sequência de vírus de coriomeningite, um antigénio tumoral, ou compreende ou consiste numa parte de uma sequência de aminoácidos de qualquer destes antigénios, que compreende pelo menos um epitopo.
11. 11. Derivado de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, que é um polipéptido recombinante em que a sequência de aminoácidos de cada uma da(s) referida(s) molécula(s), adequada para desencadear uma resposta imunitária, é inserida num sítio permissivo do referido polipéptido, desde que seja preservada a capacidade do referido péptido de translocar o seu domínio enzimático de adenilato ciclase N-terminal para células que expressam CDllb/CDl8. 5 ΡΕ2233569
12. 12. Derivado de polipéptido de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que cada uma das referidas sequências de aminoácidos adequadas para desencadear uma resposta imunológica é enxertada, especialmente enxertada quimicamente, num resíduo de aminoácido do referido polipéptido.
13. 13. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou derivado de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, para uso em terapia.
14. 14. Polipéptido ou derivado de polipéptido de acordo com a reivindicação 13, para uso em terapia com o intuito de desencadear uma resposta imunitária de células T e/ou para desencadear uma resposta imunitária de células B num hospedeiro em necessidade desta.
15. 15. Derivado de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, para uso na prevenção ou no tratamento de uma doença seleccionada de: neoplasia, cancros e doenças infecciosas, seleccionadas de: doenças induzidas por vírus, retrovírus, bactérias, parasitas ou fungos.
16. 16. Polipéptido ou derivado de polipéptido para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que o referido polipéptido é para ser administrado em combinação com um adjuvante e/ou em combinação com outra molécula terapeuticamente activa. 6 ΡΕ2233569
17. 17. Polipéptido ou derivado de polipéptido para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que o referido polipéptido não é para ser administrado em combinação com um adjuvante.
18. 18. Composição farmacêutica que compreende um polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou um derivado de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12 e um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico e, opcionalmente, um adjuvante e/ou uma molécula terapeuticamente activa.
19. 19. Uso de um derivado de polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento de uma doença seleccionada de: neoplasia, cancros e doenças infecciosas seleccionadas de: doenças induzidas por vírus, retrovirus, bactérias, parasitas ou fungos.
20. 20. Método para a preparação de um vector pro-teináceo adequado para a entrega de uma molécula numa célula que expressa CDllb/CDl8, que compreende ligar a referida molécula a um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6. Lisboa, 24 de setembro de 2014