ES2505324T3 - Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas a una célula - Google Patents

Abstract

Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una de las siguientes secuencias: (a) una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos 5 que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en que: (i) el resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de glutamina; y (ii) el resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de arginina, teniendo dicho fragmento la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa; o, b) una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, por: (i) la sustitución del resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de glutamina; (ii) la sustitución del resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de arginina; y (iii) de 1 a 50 sustituciones adicionales; consistiendo el polipéptido en dicha secuencia que tiene la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad a translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

Description

Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas a una célula

La invención se refiere a polipéptidos adecuados para su uso en el suministro de una o más moléculas a una célula.

En particular, la invención se refiere a polipéptidos adecuados para su uso en el suministro de una o más moléculas que son capaces de provocar una respuesta inmune en un hospedador, abordando células que expresan el receptor CD11b/CD18 (también mencionadas en este documento como "células que expresan CD11b").

La invención se refiere más particularmente a polipéptidos derivados de una proteína adenilato ciclasa (CyaA), usándose ésta última en forma de una toxina o de una proteína destoxificada o toxoide, que son polipéptidos mutantes. Dichos polipéptidos mutantes son capaces de retener la actividad de unión de CyaA nativa al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo y preferiblemente también de retener la actividad de translocación de CyaA nativa a través de su dominio N-terminal en dichas células y además tienen una actividad de formación de poro que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

La invención se refiere en particular al uso de dichos polipéptidos como vectores proteicos. Por consiguiente los polipéptidos mutantes se combinan adicionalmente con moléculas no CyaA, dando lugar de este modo a derivados polipeptídicos, donde dichas moléculas tienen un interés preventivo de vacuna y/o terapéutico cuando se administra a un hospedador.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención son adecuados para su uso como vectores proteicos para el suministro de una molécula, en particular de una molécula polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más epítopos, especialmente antígenos, a una célula, especialmente en células que expresan CD11b.

La invención por tanto también se refiere a un derivado polipeptídico (un derivado del polipéptido mutante de la invención) que comprende o consiste en un polipéptido mutante de acuerdo con la invención recombinado con una o más moléculas, en particular con una o más moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune, constituyendo de este modo un polipéptido recombinante o un polipéptido de fusión. La invención también se refiere a derivados polipeptídicos obtenidos injertando químicamente dicha molécula o moléculas en los polipéptidos mutantes.

De acuerdo con una realización, los derivados polipeptídicos de acuerdo con la invención son adecuados para su uso en tratamiento profiláctico y especialmente en vacunación y en terapia incluyendo en inmunoterapia, en particular para provocar una respuesta inmune en un sujeto.

La CyaA nativa usada en el contexto de la presente invención para el diseño de los polipéptidos de la invención es la adenilato ciclasa producida en Bordetella pertussis y que tiene las siguientes características y propiedades descritas con el propósito de caracterizar dicha proteína en el contexto de la invención.

La toxina adenilato ciclasa-hemolisina RTX bi-funcional (también denominada en este documento como toxina adenilato ciclasa (CyaA, ACT, o AC-Hly) es un factor de virulencia clave de Bordetella pertussis que es el agente causante de la tos ferina (1). Su polipéptido de 1706 restos de longitud es una fusión de un dominio o parte enzimática adenilato ciclasa (AC) N-terminal (∼400 restos) a una hemolisina RTX de formación de poros (Repetición en ToXina citolisina) de ∼1306 restos que constituye la parte o dominio C-terminal (2). El último alberga los sitios de activación de proCyaA en CyaA por palmitoilación post-traduccional covalente de grupos grupos ε-amino de Lys860 y Lys983, así como las numerosas repeticiones RTX que forman ∼40 sitios de unión de calcio, cuya carga es necesaria para la actividad citotóxica de CyaA (3, 4). La proteína CyaA de hecho se sintetiza como una protoxina inactiva que se convierte en una toxina activa por palmitoilación post-traduccional de dos restos internos de lisina (lisinas 860 y 983). Esta modificación post-traduccional requiere la expresión con el gen mCyaA, de un gen accesorio, es decir, cyaC que está localizado cerca de CyaA en el cromosoma de B. pertussis.

La toxina principalmente aborda fagocitos mieloides hospedadores que expresan el receptor de integrina αMβ2, conocido también como CD11b/CD18, CR3 o Mac-1 (5). Dicha toxina se une especialmente al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo a través de una sitio de unión a receptor presente en su parte Cterminal. Estas células por consiguiente son células diana para la toxina nativa y también para los polipéptidos de la invención. CyaA se inserta en la membrana citoplasmática de células y transloca el dominio enzimático AC al citosol de dichas células diana (6, 7). Dentro de las células, la AC se activa por calmodulina y cataliza la conversión no controlada de ATP celular en AMPc, una molécula de segundo mensajero clave que proporciona alteración de las funciones bactericida de los fagocitos (1). A dosis elevadas (>100 ng/ml), la disipación catalizado por CyaA de ATP en AMPc se convierte en citotóxica y promueve la apoptosis o incluso una muerte necrótica rápida y lisis de monocitos CD11b+ (8, 9).

Recientemente, los inventores demostraron que CyaA se une a oligosacáridos N-ligados de su receptor CD11b/CD18 (10). Esto sugiere que las interacciones de baja especificidad con glucanos de proteínas o glucolípidos de superficie celular ubicuas pueden suponer una capacidad aproximadamente dos órdenes de magnitud reducida pero fácilmente detectable de CyaA para penetrar también en células que carecen de CD11b/CD18. De hecho, debido a la actividad catalítica específica extremadamente elevada del dominio AC, se descubrió que CyaA eleva sustancialmente el AMPc también en eritrocitos, linfocitos, linfoma, neuroblastoma, CHO, o células epiteliales de la tráquea de mamíferos y aves (1, 11).

Ya se ha propuesto en la técnica previa proporcionar toxina destoxificada también llamada toxoide, donde la actividad adenilato ciclasa está disminuida, especialmente suprimida esencialmente. Dicho toxoide CyaA/AC -puede usarse para conseguir la preparación de los polipéptidos de la invención.

Además de elevar el AMPc, la toxina muestra también una actividad hemolítica moderada en eritrocitos de mamíferos y aves. Esto se debe a la capacidad de formar poros selectivos de cationes pequeños de un diámetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, que permeabilizan la membrana celular y finalmente provocan la lisis celular coloideosmótica (12). Recientemente, los inventores y otros han demostrado que la actividad de formación de poros de CyaA sinergiza con su actividad enzimática AC invasiva de células y contribuye a la potencia citolítica global de CyaA sobre células CD11b+ (13, 14). Debido a una capacidad intacta de formación de poros (hemolítica), en ausencia de osmoprotectores tales como suero, el toxoide CyaA/AC -enzimáticamente inactivo (15) aún muestra una actividad hemolítica completa sobre eritrocitos y una actividad citolítica residual, aproximadamente diez veces reducida sobre monocitos que expresan CD11b (8), lo que establece un límite a su uso en terapia.

En seguida se descubrió que las actividades hemolítica (formación de poros) y AC de translocación de membrana (invasiva de células) de CyaA son disociables por concentración baja de calcio, temperatura baja (16) y por el grado y naturaleza de acilación de CyaA (4, 12, 17). Además, la dos actividades difieren sustancialmente en sensibilidad a sustituciones de reversión de carga o neutras de glutamatos en las posiciones 509, 516, 570 y 581 dentro del dominio hidrófobo (8, 13, 18). Las actividades invasiva de células y de formación de poros de CyaA por tanto se propusieron como mutuamente independientes y de funcionamiento en paralelo en membrana de células diana. El modelo ilustrado en la figura 5A, sugiere que dos confórmeros CyaA distintos se insertan en la membrana de células diana en paralelo, siendo uno el precursor de translocación, que supone el suministro del dominio AC a través de la membrana celular con flujo entrante concomitante de iones calcio en las células, siendo el otro un precursor de poros que finalmente forma poros oligoméricos (13, 18, 19).

Los inventores ahora han ensayado esto modelo y los han refinado, demostrando que la actividad de formación de poros no está implicada en la translocación del dominio AC a través de la célula diana.

En la presente invención, los inventores inicialmente diseñaron polipéptidos mutantes CyaA, basándose en la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, en el formato de toxina o de toxoide, que tiene una combinación de sustituciones dentro de los dominios de formación de poros (E570Q) y que alberga acilación (K860R) y demostraron que esta combinación específica de sustituciones anulaba selectivamente la actividad de permeabilización de células de CyaA, eliminando de este modo la actividad citolítica residual de toxoides CyaA/AC-sobre células CD11b+. Al mismo tiempo, la construcción E570Q+K860R retenía una capacidad completa de translocar el dominio AC al citosol de las células para elevar el AMPc celular y su toxoide era completamente capaz de suministrar epítopos que contenían moléculas insertadas dentro de dicha construcción a la vía citosólica de células dendríticas para la presentación restringida a MHC clase I y la inducción de respuestas de células T citotóxicas específicas in vivo.

El mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R diseñado por los inventores, y en que hay un péptido antigénico OVA insertado como se describe en los ejemplos, es la primera construcción ilustrativa de la capacidad del mutante CyaA de proporcionar una capacidad reducida de forma importante para permeabilizar las células que permanece completamente capaz de translocar el dominio AC través de la membrana celular.

Los inventores ahora han diseñado construcciones particulares, ilustradas especialmente como un toxoide CyaA/E570Q+K860R/AC -y han demostrado que a pesar de su actividad permeabilizante de células (citolítico) muy reducida, sigue siendo completamente activo en el suministro de antígeno a APC CD11b+. Los inventores han demostrado adicionalmente que la actividad citolítica global del toxoide CyaA/E570Q+K860R/AC -ilustrativo es muy baja. Por tanto está desprovisto de toxicidad residual en un hospedador animal o humano y por lo tanto es muy adecuado para su uso en terapia.

La invención por tanto proporciona nuevos polipéptidos, que son toxoides y tienen un perfil potenciado de seguridad y pueden usarse como vectores proteicos para el suministro de moléculas de interés, en particular de secuencias peptídicas inmunogénicas, a células de un paciente en necesidad de un tratamiento, y más particularmente a células que expresan CD11b.

En base a los experimentos realizados por los inventores ha sido posible definir y proporcionar un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

a) una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en el que:

(i)

el resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de glutamina; y

(ii)

el resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de arginina,

teniendo dicho fragmento la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida

o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa; o, b) una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, por:

(i)

la sustitución del resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de glutamina;

(ii)

la sustitución del resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de arginina; y

(iii) de 1 a 50 sustituciones adicionales;

consistiendo el polipéptido en dicha secuencia que tiene la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad a translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

Para el propósito de la invención, el dominio N-terminal del fragmento descrito es la secuencia de aminoácidos del fragmento que incluye los restos aminoacídicos contiguos de la parte N-terminal de la proteína CyaA nativa, por ejemplo la parte N-terminal del fragmento es todo o parte de los restos contiguos que forman la secuencia de 400 restos aminoacídicos del dominio N-terminal de la proteína CyaA de Bordetella pertussis.

En este documento, "E570Q" abarca la sustitución del resto de ácido glutámico en la posición 570 de CyaA nativa de Bordetella pertussis por un resto de glutamina.

En este documento, "K860R" abarca la sustitución del resto de lisina en la posición 860 de CyaA nativa de Bordetella pertussis por un resto de arginina.

La CyaA nativa de Bordetella pertussis también se ha descrito como una secuencia de aminoácidos y una secuencia de nucleótidos por Glaser, P. et al., 1988, Molecular Microbiology 2(1), 19 -30. Esta secuencia se menciona como SEC ID Nº 1 ilustrada en la figura 6. Por consiguiente, cuando se citan restos aminoacídicos o secuencias o nucleótidos o secuencias de nucleótidos de la proteína CyaA de B. pertussis, en la presente invención, se dan sus posiciones con respecto a las secuencias descritas en dicha publicación de Glaser et al. 1988.

En una realización de la presente invención la secuencia de aminoácidos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis es la secuencia descrita como SEC ID Nº 1.

Cuando se hace referencia a la SEC ID Nº 1 o a la SEC ID Nº 2 en este documento, se señala especialmente que, salvo que sea técnicamente no relevante, se aplicarían las características descritas de manera similar a una secuencia modificada por inserción de restos en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2 para destoxificar la proteína CyaA. En dicho caso, la numeración de los restos aminoacídicos debe adaptarse (especialmente en la medida en que estés implicadas las posiciones 570 y 860 de la secuencia nativa).

De forma ventajosa, la proteína CyaA o un fragmento de la misma es una proteína o un fragmento de la misma, que es el resultado de la co-expresión en una célula, especialmente en una célula recombinante, de los genes tanto cyaA como cyaC. De hecho se ha demostrado que para que tenga propiedades invasivas para células diana, CyaA deben experimentar modificaciones post-traduccionales que se ven posibilitadas por la expresión de los genes tanto cyaA como cyaC (documento WO 93/21324).

Como se describe en este documento, la proteína CyaA es una proteína bacteriana. Como se describe en este documento, la proteína de CyaA se obtiene de una especie Bordetella.

La especie Bordetella de la invención es Bordetella pertussis. Otras cepas de Bordetella son aquellas de Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii o Bordetella bronchiseptica. Las secuencias de la proteína CyaA de B. parapertussis se han descrito especialmente con el número de acceso NC 002928.3 (como una secuencia de 1740 aminoácidos) y en Parkhill J. et al. (Nat. Genet. DOI, 10 (2003)), para B. hinzii en Donato G.M. et al. (J. Bacteriol. 2005 Nov, 187(22):7579 -88) y para B. bronchiseptica en Betsou F. et al. (Gene 1995, 30 de agosto; 162(1): 165 -6).

La expresión "mutante polipeptídico de la proteína adenilato ciclasa" excluye la adenilato ciclasa nativa expresada por Bordetella. Como se ha indicado anteriormente, se caracteriza por una diferencia primaria con la proteína nativa, que recae en la sustitución combinada de dos restos aminoacídicos específicos. Puede modificarse adicionalmente con respecto a dicha proteína nativa y puede ser especialmente un fragmento de la proteína así mutada, tal como por ejemplo una variante truncada de dicha proteína mutada, donde están delecionados restos en uno de los dos o ambos extremos terminales. En particular pueden delecionarse restos en el extremo C-terminal en la medida en que no afecten al sitio de reconocimiento y unión para el receptor celular CD11b/CD18. Alternativa o adicionalmente pueden delecionarse restos en el extremo N-terminal en la medida en que no afecte a la capacidad de translocación del polipéptido mutante obtenido. También puede ser un fragmento obtenido también después de deleciones internas de uno o más restos de la proteína CyaA mutada nativa.

Cuando la invención se refiere a un mutante polipeptídico que es un fragmento indicado en este documento, dicho fragmento que necesariamente comprende los restos mutados E570Q y K860R (cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos de la proteína CyaA de Bordetella pertussis) también retiene la capacidad de CyaA de longitud completa mutada de unirse a las células y translocar su dominio N-terminal al citosol de células que expresan CD11b/CD18.

La invención por tanto proporciona polipéptidos mutantes adecuados para su uso en el diseño de medios para el suministro de una o más moléculas a una célula, especialmente una célula diana que expresa el receptor CD11b/CD18.

En particular, la invención proporciona polipéptidos mutantes de una proteína CyaA, donde dicha proteína se obtiene de la toxina CyaA o se obtiene preferiblemente de un toxoide de la misma, especialmente un toxoide CyaA/AC -. Los polipéptidos mutantes son capaces de unirse a una célula, especialmente una célula diana que expresa el receptor CD11b/CD18, son capaces de translocar su dominio N-terminal o la molécula insertada en dicho dominio o injertada en el mismo al interior de la célula y su actividad de formación de poros está total o parcialmente suprimida en comparación con la de la toxina o toxoide CyaA.

La capacidad del polipéptido mutante de abordar células CD11b/CD18 se pueden ensayar especialmente de acuerdo con los métodos descritos en el documento EP 03291486.3 y El-Azami-El-Idrissi M. et al., J. Biol. Chem., 278(40)38514 -21 o en el documento WO 02/22169. Además, la capacidad del polipéptido mutante de translocar el epítopo o epítopos o polipéptido o polipéptidos que contienen dicho epítopo o epítopos al citosol de la célula diana se puede ensayar aplicando el método descrito en el documento WO 02/22169.

La supresión total o parcial de la actividad de formación de poros de la toxina o toxoide CyaA, o la capacidad de permeabilización celular, se entiende como la supresión total o parcial de la capacidad de formar poros, en particular poros selectivos de cationes de un diámetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, que permeabilizan una membrana celular y finalmente provocan la lisis celular coloide-osmótica. La actividad de formación de poros se puede medir usando el experimento de pinzamiento zonal de una única célula completa como se describe en los ejemplos.

La actividad de formación de poros de la toxina CyaA contribuye a su actividad citolítica o hemolítica global sobre las células. De hecho en el contexto de la presente invención, la actividad citolítica o hemolítica global de CyaA (o su "actividad citotóxica global") debe entenderse como resultante de al menos las actividades adenilato ciclasa y de formación de poros de la toxina CyaA. Por tanto la supresión total o parcial de la actividad de formación de poros de la toxina CyaA permite al menos una supresión parcial de su actividad citolítica.

En una realización preferida, la actividad citolítica global del polipéptido de acuerdo con la invención, en particular sobre células que expresan el receptor CD11b/CD18, está total o parcialmente reducida en comparación con la de la toxina CyaA de Bordetella pertussis. La actividad citolítica del polipéptido de la invención se puede determinar midiendo la cantidad de hemoglobulina (para eritrocito) o de lactato deshidrogenasa (para monocitos) liberada por las células cuando se incuban con el polipéptido ensayado como se describe en los ejemplos.

En una realización preferida, la actividad citolítica global del polipéptido de acuerdo con la invención sobre células que expresan el receptor CD11b/CD18 es al menos un 75% inferior, más preferiblemente al menos un 80%, 85%, 90% o 95% inferior, que la de la toxina CyaA de Bordetella pertussis, o que la de una proteína CyaA de Bordetella pertussis cuya actividad adenilato ciclasa está parcial o totalmente suprimida (o "toxoide CyaA"). En una realización particularmente preferida, la actividad citolítica global del polipéptido de acuerdo con la invención sobre células que expresan el receptor CD11b/CD18 es al menos un 75% inferior, más preferiblemente al menos un 80% o 85% inferior, que el del toxoide CyaA de Bordetella pertussis cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la figura 2 (SEC ID Nº 2).

En una realización preferida, la invención se refiere a un polipéptido que es un mutante de una adenilato ciclasa y cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos (i) que está mutada con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 1, comprendiendo dichas mutaciones al menos las sustituciones E570Q y K860R o (ii) que es un fragmento de la proteína CyaA que tiene dicha secuencia de aminoácidos descrita como SEC ID Nº 1, en la medida en que dicho fragmento tiene una secuencia de aminoácidos

que incluye la sustituciones E570Q y K860R y donde el polipéptido es capaz de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo y de translocar su dominio N-terminal al interior de dicha célula.

En una realización particular de la presente invención, el fragmento que incluye una sustitución del resto de ácido glutámico en la posición 570 de la SEC ID Nº 1 por un resto de glutamina (mencionada como "E570Q"), y la sustitución del resto de lisina en la posición 860 de la SEC ID Nº 1 por un resto de arginina (mencionada como "K860R") abarca al menos la secuencia de aminoácidos de la proteína CyaA que empieza con el primer resto Nterminal o desde uno de los restos aminoacídicos comprendidos entre las posiciones 1 y 400, preferiblemente entre las posiciones 1 y 380 y que se extiende hasta las restos que forman el sitio de reconocimiento y de unión para el receptor celular CD11b/CD18 y dicho fragmento contiene restos correspondiente a los restos E570Q y K860R mutados o consiste en dicha secuencia de aminoácidos. En una realización preferida, el fragmento que incluye las sustituciones E570Q y K860R no comprende la secuencia de aminoácidos que discurre desde el aminoácido en la posición 1 de la SEC ID Nº 1 hasta el aminoácido en la posición 372 de la SEC ID Nº 1.

En una realización preferida, el fragmento que se prepara de este modo tiene esencialmente pérdida actividad enzimática adenil ciclasa (actividad AC)

En una realización preferida, el polipéptido mutante de la invención se produce por co-expresión en una célula recombinante de un gen mutante que codifica la secuencia de aminoácidos de CyaA mutada en E570Q y R860R y del gen cyaC, seguido por la recuperación del fragmento expresado seleccionado de CyaA mutante.

Preferiblemente, el polipéptido mutante de la invención tiene un resto de lisina que corresponde al resto de lisina en la posición 983 de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 y que se acila, en particular que se palmitoila o palmitoleila.

Como alternativa, el polipéptido mutante de la invención tiene un resto de lisina que corresponde al resto de lisina en la posición 983 de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 que no está acilado.

En una realización específica, el polipéptido mutante de la invención tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de CyaA descrita en la SEC ID Nº 1 por mutación de restos resultante en E570Q y K860R y tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1.

En otra realización específica, el polipéptido mutante de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1 por mutación de restos resultante en E570Q y K860R y por mutaciones adicionales resultantes en 1 a 50 sustituciones de restos aminoacídicos incluyendo las sustituciones E570Q y K860R.

En una realización específica, el polipéptido mutante de la invención no porta ninguna sustitución, supresión, y/o inserción de restos aminoacídicos en comparación con la secuencia de aminoácidos de CyaA de Bordetella pertussis diferente a las sustituciones E570Q y K860R. En una realización específica, el polipéptido mutante tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ilustrada en la figura 7. En otra realización específica, las únicas sustituciones, supresiones, y/o inserciones de aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 consisten en sustituciones, supresiones, y/o inserciones de aminoácidos que suprimen total o parcialmente la actividad enzimática adenil ciclasa de la proteína CyaA, tal como en particular la inserción de un dipéptido, por ejemplo un dipéptido "LQ" o "GS" entre los aminoácidos correspondiente a las posiciones 188 y 189.

En una realización particular, el polipéptido mutante de la invención difiere de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones, supresiones, y/o inserciones de restos aminoacídicos además de las sustituciones E570Q y K860R.

En una realización particular, además de las sustituciones E570Q y K860R, el resto de leucina en la posición 247 de la proteína CyaA nativa de Bordetella pertussis está sustituido por un resto de glutamina (L247Q) o por otro resto aminoacídico en particular un resto de aminoácido conservativo.

Un polipéptido mutante de la invención que es un fragmento descrito en este documento de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 1 se entiende como una secuencia que comprende uno o más fragmentos que tienen un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 y hasta aproximadamente 1705 restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 1, en particular fragmentos que comprenden un tramo de al menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1, que abarcan los restos E570Q y K860R. Un polipéptido mutante de la invención también puede definirse como un fragmento de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 2 que comprende uno o más fragmentos que tienen un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 y hasta aproximadamente 1705 restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2, en particular fragmentos que comprenden un tramo de al menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 restos aminoacídicos de la

SEC ID Nº 2, que abarcan los restos 570 y 860. Dichos fragmentos preferiblemente retienen la capacidad de unión al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo y la capacidad a translocar su dominio N-terminal al interior de dichas células. Preferiblemente, el polipéptido mutante de la invención que es dicho fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 570 como E570Q a 860 como K860R o 1 a 860, o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1 en la medida en que se observan las mutaciones E570Q y K860R con respecto a la SEC ID Nº 1 original.

En una realización preferida, el fragmento comprende adicionalmente los restos aminoacídicos 1166 a 1281 o los restos aminoacídicos 1208 a 1243 de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 de la proteína CyaA para su interacción con células diana CD11b/CD18.

Un fragmento particular por tanto comprende todo o parte de la parte C-terminal de la proteína nativa, siendo dicha parte responsable de la unión del polipéptido de la invención a la membrana y/o receptor CD11b/CD18 de la célula diana, y del posterior suministro del dominio N-terminal del polipéptido al citosol celular. Un polipéptido particular de la invención es el fragmento de la proteína CyaA que contiene los restos aminoacídicos 373 a 1706 de la proteína CyaA especialmente de la SEC ID Nº 1, en la medida en que los restos 570 y 860 están mutados como E570Q y K860R.

En otra realización preferida, el polipéptido mutante es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en que:

a) una primera secuencia de aminoácidos que corresponde a un tramo de al menos 100 restos aminoacídicos contiguos de la SEC ID Nº 1 comprende el resto aminoacídico 570 como E570Q, y además incluye 0, 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones en comparación con la SEC ID Nº 1 y b) una segunda secuencia de aminoácidos que corresponde a un tramo de al menos 100 restos aminoacídicos contiguos de la SEC ID Nº 1 comprende el resto aminoacídico 860 como K860R, y además incluye 0, 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones en comparación con la SEC ID Nº 1 y preferiblemente comprende c) una tercera secuencia de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1166 a 1281 o los restos aminoacídicos 1208 a 1243 de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 de la proteína CyaA para su interacción con células diana CD11b/CD18.

La solicitud describe un fragmento que es uno que corresponde a la proteína CyaA mutada E570Q y K860R donde los restos aminoacídicos 225 a 234 se han delecionado, proporcionando de este modo un fragmento que contiene los restos 1 a 224 y 235 a 1706 de la proteína mutada.

En una realización particularmente preferida, el fragmento polipeptídico de acuerdo con la invención se une a una célula que expresa el receptor CD11b/CD18 como un resultado de la unión específica a dicho receptor.

En una realización preferida, la actividad adenilato ciclasa del polipéptido en una célula está parcial o totalmente suprimida en comparación con la de la toxina CyaA de Bordetella pertussis. Como se ha indicado anteriormente, la expresión "proteína CyaA" se refiere la forma de toxina o preferiblemente a la forma de toxoide de la proteína. Por consiguiente, cada realización de la invención que se refiere al polipéptido que es un mutante de la proteína CyaA se aplica a cada una de las formas de toxina o toxoide de la proteína.

La supresión total o parcial de la actividad enzimática adenilato ciclasa CyaA debe entenderse como la supresión total o parcial de la capacidad a convertir ATP en AMPc en un entorno celular en comparación con la de una toxina CyaA producida por co-expresión de los genes cyaA y cyaC en una célula. La capacidad a convertir ATP en AMPc puede determinarse midiendo el nivel de AMPc intracelular como se describe en los ejemplos.

Dicha supresión total o parcial puede obtenerse como resultado de inactivación genética, por ejemplo por introducción de una corta secuencia de aminoácidos, que comprende por ejemplo de uno a diez aminoácidos, en particular un dipéptido en un sitio de la secuencia de aminoácidos de CyaA que es parte del sitio catalítico, es decir en un sitio localizado dentro de los primeros 400 aminoácidos (dominio AC) de la SEC ID Nº 1 o por sustitución de una parte de la secuencia de aminoácidos de CyaA expuesta en la SEC ID Nº 1 que es esencial para la actividad enzimática. En una realización preferida, la supresión total o parcial de la actividad enzimática CyaA se obtiene por inserción de un dipéptido, por ejemplo un dipéptido "LQ" o "GS", entre los aminoácidos correspondientes a las posiciones 188 y 189 de la secuencia de CyaA expuesta 2222222222222222 en la SEC ID Nº 1. Esto puede conseguirse insertando un oligonucleótido, tal como "CTG CAG" o "CGATCC", en el sitio EcoRV en la posición 564 de la fase codificante del gen cyaA. Véase Ladant et al., 1992. Como alternativa, la supresión total o parcial de la actividad enzimática puede obtenerse también por mutagénesis dirigida, por ejemplo, remplazando el resto de lisina en la posición 58 o 65 de la proteína CyaA nativa de Bordetella pertussis (Glaser et al., 1989) por un resto de Gln.

La invención también se refiere a un derivado polipeptídico que comprende o que consiste en el polipéptido mutante de acuerdo con la invención que está adicionalmente combinado con una o más moléculas de interés. En una realización preferida, una molécula de interés es una molécula biológicamente activa ya sea en solitario o combinada con el polipéptido de la invención. Dichas moléculas pueden ser especialmente de valor profiláctico o

valor terapéutico es decir, pueden tienen una actividad profiláctico o terapéutica, o pueden potenciar una actividad profiláctica o terapéutica.

En realizaciones específicas, las moléculas de interés se seleccionan del grupo que comprende: péptidos, glucopéptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos y agentes químicos.

En una realización específica, la una o más moléculas de interés son moléculas polipeptídicas o contienen moléculas polipeptídicas. Su secuencia de aminoácidos puede comprender de 2 a 1000, preferiblemente 5 -800, 5 a 500, 5 a 200, 5 a 100, 8 a 50, 5 a 25, 5 a 20 u 8 a 16, o 300 -600, 400 -500, restos aminoacídicos.

En una realización preferida, la una o más moléculas de interés son secuencias de aminoácidos heterólogas adecuadas para provocar una respuesta inmune (también mencionadas como "antígenos heterólogos"), en particular secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten en un epítopo, incluyendo antígenos. Como se usa en este documento, el término "heterólogo" se refiere a un antígeno diferente al polipéptido mutante que se usa en el propio vector. Como se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a una molécula heteróloga y especialmente un péptido heterólogo que puede provocar una respuesta inmune, cuando se presenta al sistema inmune de un hospedador. En particular, dicho epítopo puede comprender o consistir en un tramo de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 restos aminoacídicos. Puede consistir alternativamente en un antígeno de longitud completa o consistir en fragmento o fragmentos antigénicos.

En una realización específica, un derivado polipeptídico de acuerdo con la invención puede estar codificado por un plásmido que corresponde con el plásmido OVA-QR-AC depositado con el número de acceso CNCM I-4137 (figura 12) en que la secuencia de ADN que codifica la secuencia antigénica "OVA" está remplazada por una secuencia de ADN que codifica una secuencia antigénica que comprende uno o más epítopos.

La molécula polipeptídica adecuada para provocar una respuesta inmune es especialmente una que provoca una respuesta inmune de células T, incluyendo como ejemplo una respuesta CTL. La molécula polipeptídica adecuada para provocar una respuesta inmune también puede ser una que provoca una respuesta inmune de células B.

En realizaciones específicas, el antígeno heterólogo se selecciona entre el grupo que consiste en un antígeno de un patógeno bacteriano, un antígeno de célula tumoral, un antígeno viral, un antígeno retroviral, un antígeno fúngico o un antígeno de célula parasitaria.

Una molécula de interés puede ser especialmente un antígeno seleccionado entre el grupo que consiste en: un antígeno de Chlamidia, un antígeno de micoplasma, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la influenza, un antígeno de virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o una parte de cualquiera de estos antígenos que comprenda al menos un epítopo.

En una realización preferida del derivado polipeptídico de la invención, la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de un antígeno de Chlamidia, un antígeno de micoplasma, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la influenza, un secuencia de virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o comprende o consiste en una parte de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos antígenos que comprende al menos un epítopo.

En una realización particularmente preferida, la molécula de interés es un antígeno asociado a tumor (TAA). Los antígenos asociados a tumor se han caracterizado para varios tumores tales como por ejemplo: melanoma, especialmente melanoma metastásico; carcinoma de pulmón; carcinoma de cabeza y cuello; carcinoma cervical, carcinoma esofágico; carcinoma de vejiga, especialmente carcinoma de vejiga infiltrante; carcinoma de próstata; carcinoma de mama; carcinoma colorrectal; carcinoma de células renales; sarcoma; leucemia; mieloma. Para estos diversos tipos histológicos de cáncer, se ha demostrado que los péptidos antigénicos se expresan específicamente en muestras de tumor y se reconocen por células T, especialmente por células T CD8+ o células T CD4+.

Se hizo una revisión de péptidos hallados como antígenos asociados a tumor en estos tipos de tumores por Van der Bruggen P. et al. (Immunological Reviews, 2002, vol 188:51 -64). Especialmente, la descripción de los péptidos contenidos en la tabla 3 de dicha revisión se remite en este documento para proporcionar ejemplos de dichos antígenos asociados a tumor y dicha tabla 3 se incorpora por referencia en la presente solicitud.

Se citan los siguientes antígenos como ejemplos de antígenos asociados a tumor reconocidos por células T, de acuerdo con la publicación de Kawakami Y. et al. (Cancer Sci, octubre 2004, vol. 95, nº 10, pág. 784 -791) que también proporciona métodos para seleccionar estos antígenos o además uno: antígenos compartidos por diversos cánceres, incluyendo MAGE (especialmente en melanoma), NY-ESO-1, Her2/neu, WT1, Survivina, hTERT, CEA, AFP, SART3, GnT-V, antígenos específicos para algunos cánceres particulares tales como βbeta-catenina, CDK4, MART-2, MUM3, gp100, MART-1, tirosinasa para melanoma; bcr-abl, TEL-AML1 para leucemia; PSA, PAP, PSM, PSMA para cáncer de próstata; Proteinasa 3 para leucemia mielógena; MUC-1 para cáncer de mama, de ovario o páncreas ; EBV-EBNA, HTLV-1 tax para linfoma, ATL o cáncer cervical; HLA-A2 mutado para cáncer de células

renales; HA1 para leucemia/linfoma. También se han descrito antígenos asociados a tumor en animales tales como Ciclina D1 y Ciclina D2 en tumores que afectan a gatos o perros.

Los antígenos asociados a tumor reconocidos por células T también se han descrito en Newlino L. et al. (Immunol Immunother 2004, 54:187 -207).

Más en general, los TAA de interés en la presente invención son aquellos correspondiente a antígenos mutados, o a antígenos que se sobre-expresan en células tumorales, a antígenos compartidos, antígenos de diferenciación específicos de tejido o a antígenos virales.

En una realización particular de la invención, el antígeno asociado a tumor es un antígeno de papilomavirus (HPV) o es tirosinasa.

De acuerdo con otra realización particular de la invención, las secuencias de aminoácidos de las moléculas polipeptídicas que comprenden o consisten en un epítopo se han modificado con respecto a su secuencia de aminoácidos nativa, por ejemplo para disminuir la cantidad de restos aminoacídicos cargados negativamente dentro de la secuencia. Dicha modificación puede obtenerse eliminando algunos de estos restos aminoacídicos cargados negativamente o también añadiendo algunos restos aminoacídicos cargados positivamente, especialmente como restos flanqueantes de los epítopos. Los polipéptidos que por tanto comprenden menos restos cargados negativamente podrían favorecer la translocación del dominio catalítico del derivado polipeptídico de la invención al citosol de células diana.

Las secuencias de aminoácidos de las moléculas polipeptídicas que comprenden o consisten de un epítopo o un antígeno también pueden diseñarse de tal forma que estén desplegadas cuando se insertan en el derivado polipeptídico de la invención, lo que mejora la eficacia de la internalización de la molécula o moléculas de interés de acuerdo con la invención en las células diana. Dicho despliegue en polipéptidos que experimentan plegamiento como consecuencia de su contenido de aminoácidos, puede obtenerse por ejemplo, eliminando o sustituyendo restos de cisteína para evitar la formación de enlaces disulfuro que pueden estar implicados en el plegamiento de los polipéptidos. En algunos casos, es posible evitar el plegamiento de los polipéptidos preparándolos en presencia de agentes reductores que permiten evitar el replegamiento in vivo.

En una realización particular, las secuencias de aminoácidos, especialmente el antígeno, pueden comprender o consistir en epítopos crípticos.

Los inventores de hecho han determinado que construcciones de derivados polipeptídicos, que comprenden (i) un polipéptido de la invención que es un mutante de una proteína CyaA (polipéptido mutante) de acuerdo con las definiciones descritas en este documento y (ii) una molécula polipeptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que alberga uno o varios fragmentos antigénicos de uno o varios antígenos, posibilita que epítopos crípticos de dichos antígenos leguen a ser inmunogénicos como resultado de su presentación en las construcciones. Especialmente, dichas construcciones que implican polipéptidos mutantes definidos en la presente invención que comprenden molécula o moléculas polipeptídicas derivadas de antígenos de interés para aplicaciones especialmente profilácticas o terapéuticas, incluyendo propósitos de vacunación inmunoterápeutica, se procesan en células diana donde se permite que la molécula o moléculas polipeptídicas se internalicen como resultado de la translocación del dominio N-terminal del polipéptido mutante. Dicho procesamiento posibilita la presentación de epítopos a través de las moléculas MHC de clase I de las células diana, y dichos epítopos pueden comprender epítopos crípticos del antígeno que se permite que lleguen a ser inmunogénicos y en particular que establezcan una respuesta de células T en un hospedador, especialmente una respuesta CTL.

La invención por tanto también se refiere a un derivado polipeptídico, en particular a una proteína recombinante que comprende uno o varias moléculas polipeptídicas que tienen una secuencia de aminoácidos que alberga uno o varios epítopos de uno o varios antígenos, o que alberga dicho o dichos antígenos, insertándose dicha secuencia o secuencias de aminoácidos de dicha molécula o moléculas polipeptídicas en el mismo sitio o en diferentes sitios, especialmente en diferentes sitios permisivos de un polipéptido mutante de acuerdo con la invención, reteniendo dicha proteína recombinante la propiedad de la toxina CyaA de abordar células presentadoras de antígeno (APC), donde al menos uno de dichos epítopos es un epítopo críptico subdominante de células T y donde dicho derivado polipeptídico, especialmente dicha proteína recombinante, es capaz de provocar una respuesta de específica de antígeno contra dicha molécula o moléculas polipeptídicas.

En una realización específica del derivado polipeptídico de acuerdo con la invención, la una o más secuencias de aminoácidos se insertan en uno o más sitios, especialmente sitios permisivos.

Para la presente invención, un "sitio permisivo" es un sitio de la secuencia de la proteína CyaA donde puede insertarse un polipéptido sin afectar sustancialmente a la propiedades funcionales deseadas de la proteína CyaA especialmente sin afectar sustancialmente al direccionamiento celular, especialmente el direccionamiento a células presentadoras de antígeno (APC) por CyaA, incluyendo sin afectar sustancialmente a la unión específica al receptor

CD11b/CD18 y ventajosamente sin afectar sustancialmente a los dominios de la proteína implicados en el proceso de translocación del dominio N-terminal de CyaA al interior de una célula diana.

Se presentan métodos para seleccionar sitios permisivos por ejemplo en el documento WO93/21324, en Ladant et al., 1992, y en Osicka et al., 2000 (Infection and Immunity, 2000, 68(1):247 -256). En particular, una metodología usando una doble selección (resistencia a antibiótico y ensayo colorimétrico en placas por α-complementación) posibilita identificar fácilmente inserciones de oligonucleótidos (que conservan la fase de lectura) en la parte del gen que codifica el dominio catalítico N-terminal de la toxina. La consecuencias funcionales de estas mutaciones sobre la actividad catalítica de la toxina se pueden analizar fácilmente, tanto genéticamente (complementación funcional de una cepa E. coli cya -cepa) como bioquímicamente (caracterización de la estabilidad de las adenilciclasas modificadas, de su actividad enzimática, de su interacción con caM, etc.). Esta metodología ha posibilitado seleccionar una gran cantidad de mutaciones para identificar los sitios que son potencialmente ventajosos para la inserción de determinantes antigénicos.

Lo sitios permisivos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis que permiten la translocación del dominio catalítico CyaA y por lo tanto la translocación de secuencias de aminoácidos insertadas en dicho sitios permisivos incluyen, aunque sin limitación, los restos 137 -138 (Val-Ala), los restos 224 -225 (Arg-Ala), los restos 228 -229 (Glu-Ala), los restos 235 -236 (Arg-Glu), y los restos 317 -318 (Ser-Ala) (Sebo et al., 1995). También se incluyen los siguientes sitios permisivos adicionales en realizaciones de la invención: los restos 107 -108 (Gly-His), los restos 132 -133 (Met-Ala), los restos 232 -233 (Gly-Leu), y los 335 -336 (Gly-Gln) y 336 -337. Sin embargo, pueden usarse otros sitios permisivos en la presente invención, que se pueden identificar por ejemplo usando la metodología indicada anteriormente, especialmente sitios entre los restos 400 y 1700 de la proteína CyaA.

Para otras especies Bordetella los sitios permisivos correspondientes se pueden definir por comparación de secuencias y determinación de los restos correspondientes.

Como se describe en este documento, el uno o más polipéptidos de secuencia de aminoácidos puede también o alternativamente insertarse en uno y/o el otro extremos (finales) del polipéptido de la invención, preferiblemente en el extremo N-terminal del polipéptido CyaA mutante que carece de todo o parte del dominio catalítico N-terminal de la proteína CyaA de Bordetella pertussis, y más particularmente que carece de los restos 1 -373.

De acuerdo con una realización específica, la una o más secuencias de aminoácidos adecuadas para provocar una respuesta inmune, se injertan en un resto aminoacídico de dicho polipéptido.

De acuerdo con la invención, la "combinación" (o inserción) de una secuencia de aminoácidos con el polipéptido mutante CyaA para proporcionar un llamado derivado polipeptídico, también mencionada como "proteína recombinante" o una "proteína híbrida", abarca la inserción genética especialmente por tecnología de ADN disponible. Como alternativa, "combinación" también abarca inserción no genética, incluyendo por ejemplo inserción química por ejemplo acoplamiento covalente realizado especialmente en un extremo de la secuencia de aminoácidos, o acoplamiento no covalente. La inserción no genética puede ser especialmente de interés cuando la secuencia de aminoácidos a insertar es sintética o semi-sintética. Los métodos para acoplar un fármaco a un polipéptido son bien conocidos en la técnica y comprenden por ejemplo enlace disulfuro usando sulfhidrilo activado por N-piridil sulfonilo.

En particular, es posible injertar moléculas a los polipéptidos de la invención por enlace químico o por inserción genética para direccionamiento in vivo a células diana de CyaA, tales como APC, por ejemplo células CD11b/CD18 positivas y especialmente al citosol de dichas células. De hecho, cuando se acopla una molécula correspondiente a un epítopo de célula T CD8+ dado al dominio catalítico de CyaA destoxificada, mediante un enlace disulfuro o por inserción genética, se ha descubierto que la molécula modificada por ingeniería puede provocar una respuesta CTL específica in vivo, mostrando de este modo que dicho epítopo de células T CD8+ se transloca al citosol de células que expresan CD11b.

En una realización preferida de la invención, el polipéptido CyaA mutante se usa en la fabricación de un vector proteico o en la preparación de una composición específicamente diseñada para cebar una respuesta de células T citotóxicas CD8+ (respuesta CTL) cuando dicha respuesta sigue al abordamiento del polipéptido CyaA mutante modificado (especialmente recombinado o conjugado) con una molécula de interés a células que expresan CD11b, seguido por la translocación de la molécula de interés al citosol de dichas células que expresan CD11b, y en particular a células dendríticas mieloides. En este contexto, la molécula de interés es o comprende preferiblemente un epítopo o un antígeno.

En otra realización preferida de la invención, el polipéptido CyaA mutante se usa en la fabricación del vector proteico

o en la preparación de una composición específicamente diseñada para cebar una respuesta de células CD4+ cuando dicha respuesta sigue al abordamiento focalización de la adenilciclasa modificada (especialmente recombinada o conjugada) con una molécula de interés a células que expresan CD11b, en particular células dendríticas mieloides. En este contexto, la molécula de interés es o comprende preferiblemente un epítopo o un antígeno.

Los polipéptidos mutantes pueden usarse también en la fabricación de un vector proteico para el direccionamiento de un compuesto profiláctico o terapéutico a células que expresan CD11b. En este contexto, en una realización específica de la invención, la molécula llamada de interés tiene un valor profiláctico o terapéutico y en particular es un fármaco. Dicho compuesto profiláctico o terapéutico y en particular dicho fármaco puede estar genética o químicamente acoplado al polipéptido mutante. El método para acoplar un compuesto a un polipéptido es bien conocido en la técnica y comprende por ejemplo enlace disulfuro usando sulfhidrilo activado por N-piridil sulfonilo. En una realización, una molécula de interés es un compuesto antiinflamatorio que se dirige, cuando está acoplado al polipéptido mutante, específicamente a la superficie de las células implicadas de la respuesta inflamatoria, tales como células dendríticas o neutrófilos.

Más específicamente, la presentación de antígeno para el cebado de células citotóxicas CD8+ selectivas se realiza principalmente realizada por células dendríticas mieloides.

Por consiguiente, en una realización específica, el polipéptido CyaA mutante usado para la fabricación del vector proteico es una adenilciclasa modificada genéticamente que contiene una o más moléculas químicamente acopladas mediante un enlace disulfuro a uno o más restos insertados de cisteína localizados dentro del dominio catalítico del polipéptido CyaA mutante. De hecho, se pueden acoplar químicamente múltiples moléculas al polipéptido CyaA mutante mediante un enlace de disulfuro a diferentes restos de cisteína localizados en diferentes sitios permisivos dentro del dominio catalítico.

Los polipéptidos mutantes o derivados polipeptídicos de acuerdo con la invención son adecuados para su uso en terapia o profilaxis.

Por terapia o efecto terapéutico se entiende cualquier efecto que sea beneficioso para la afección de un paciente, que sea curativo o suficiente para limitar los síntomas o las consecuencias de una afección patológica, incluyendo limitación de la progresión de una afección patológica. Por terapia o efecto terapéutico también se abarca la prevención del comienzo de una afección patológica.

Los polipéptidos mutantes o derivados polipeptídicos de acuerdo con la invención son en particular adecuados para provocar una respuesta inmune mediada por células tal como una respuesta inmune de células T o una respuesta inmune de células B en un hospedador que lo necesite. Incluye respuesta CTL y Th, especialmente Th1, incluyendo respuesta de células T CD4+ y /o respuesta de células T CD8+.

La capacidad de un polipéptido derivado de proteína CyaA de provocar una respuesta inmune mediada por células puede ser suficiente para prevenir el crecimiento tumoral in vivo o incluso para posibilita la regresión tumoral en un animal. También puede potenciarse por activación del componente innato de la respuesta inmune a través de la activación TLR y por activación negativa del componente regulador de la respuesta inmune a través del uso de agentes quimioterapéuticos. La invención proporciona medios que posibilitarán que se obtengan dichos resultados en condiciones mejoradas de de seguridad como resultado de la mutaciones combinadas E570Q y K86oR, que se han seleccionado.

La solicitud describe métodos terapéuticos que comprenden la administración a un paciente animal o humano del polipéptido mutante o derivado polipeptídico de acuerdo con la invención a un paciente para provocar una respuesta inmune de células T o una respuesta inmune de células B en un hospedador que lo necesite.

Los polipéptidos mutantes o derivados polipeptídicos de acuerdo con la invención pueden usarse en particular para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas o fúngicas. En particular, los derivados polipeptídicos pueden usarse para el tratamiento de infecciones por VIH en un paciente.

Se proporciona especialmente que en una realización particular de la invención, el polipéptido mutante o derivado polipeptídico de CyaA es adecuado para el tratamiento de tumores infiltrantes o vascularizados frente a tumores superficiales o para el tratamiento de tumores metastásicos frente a tumores primarios, de acuerdo con los criterios clínicos conocidos para la clasificación de tumores.

Los tumores sólidos son especialmente una diana para el tratamiento a través del uso del derivado polipeptídico de la invención.

Entre los tumores que pueden ser candidatos para el tratamiento con el derivado polipeptídico de la invención, se describen los siguientes, para los cuales se han caracterizado antígenos asociados a tumor, como ejemplos:

melanoma, especialmente melanoma metastásico; carcinoma de pulmón; carcinoma de cabeza y cuello; carcinoma cervical, carcinoma esofágico; carcinoma de vejiga, especialmente carcinoma de vejiga infiltrante; carcinoma de próstata; carcinoma de mama; carcinoma colorrectal; carcinoma de células renales; sarcoma; leucemia; mieloma. Para estos diversos tipos histológicos de cánceres, se ha demostrado que los péptidos

antigénicos se expresan específicamente en muestras de tumor y se reconocen por células T, especialmente por células T CD8+ o células T CD4+.

La invención además se refiere al uso de un derivado polipeptídico de acuerdo con la invención, para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales o retrovirales.

En una realización preferida, el polipéptido o derivado polipeptídico de acuerdo con la invención se puede administrar al paciente en combinación con un adyuvante y/o en combinación con otra molécula o agente terapéuticamente activo.

En el contexto de la presente invención dicha "otra molécula o agente terapéuticamente activo" es uno que puede ser beneficioso para la afección de un paciente al cual se administrada. Es especialmente un principio activa adecuado para su uso en la fabricación de un fármaco. Puede ser un compuesto adecuado para potenciar, aumentar

o modular el efecto de un principio terapéuticamente activo.

El polipéptido CyaA mutante o el polipéptido derivado del mismo se puede administrar con una molécula o agente terapéuticamente activo, en particular una adecuada para provocar una respuesta inmune en un paciente.

En particular, el polipéptido CyaA mutante o el polipéptido derivado del mismo se puede administrar con un agente terapéuticamente activo adecuado para modular una respuesta celular en un paciente, en particular por reducir o bloquear la capacidad inmunosupresora de células T reguladoras.

De acuerdo con una realización particular de la invención, dicho efecto sobre una respuesta celular reguladora se puede obtener con un agente que modula una célula T reguladora y/o que modula otra respuesta supresora celular, tal como la respuesta celular supresora mieloide, dirigiendo dicho agente a dichas células reguladoras, especialmente células T, agotando o inactivando estas células (tal como con anticuerpo CD25-específico, o ciclofosfamida), alterando el tráfico de dichas células, especialmente células T reguladoras (tal como anticuerpo CCL22-específico) o alterando diferenciación y señalización de dichas células (tal como por bloqueo de señal FOXP3 (forkhead box P3)).

De acuerdo con una realización particular de la invención, el agente modulador de una respuesta celular reguladora aborda moléculas supresoras, especialmente dichas moléculas presentes en APC (tales como B7-H1, B7-H4, IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) o arginasa) o en células T (tales como CTLA4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) o PD1 (muerte celular programada 1)), o aborda moléculas inmunosupresoras soluble (tales como TGF beta (factor de crecimiento transformante), IL-10, VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), COX2 (ciclooxigenasa 2)).

Como ejemplos de agentes que tienen un efecto sobre una respuesta celular reguladora, se proponen agentes citotóxicos, que pueden eliminar células T reguladoras u otras células inmunosupresoras, o que pueden bloquear su actividad y/o desarrollo y/o acumulación.

En una realización particular de la invención, el agente que modula la respuesta celular reguladora, especialmente una respuesta de células T reguladoras, es un agente quimioterapéutico. Especialmente se selecciona entre agentes quimioterapéuticos conocidas como agentes antineoplásicos y usados en quimioterapia. Dichos agentes incluyen aquellos que ayudan a reducir la carga del tumor, aquellos que actúan aumentando la sensibilidad de las células tumorales al tratamiento o aquellos que posibilitan la eliminación o inactivación de células reguladoras inmunes. Los agentes quimioterapéuticos usados dentro del marco de la invención de este modo potencian la inmunidad antitumoral.

En una realización particular de la invención, el agente quimioterapéutico es un agente alquilante. Especialmente, es ciclofosfamida (CTX) (Sigma, Steinheim, Alemania). La ciclofosfamida es capaz de agotar o inactivar células T reguladoras.

En otra realización particular de la invención, el agente quimioterapéutico es un agente intercalante.

En una realización particular, el agente quimioterapéutico es doxorrubicina (DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, EEUU).

El agente quimioterapéutico se administra ventajosamente por dosis bajas.

El polipéptido CyaA mutante o el polipéptido derivado del mismo se puede administrar también con un componente adyuvante, adecuado para activar la respuesta inmune innata cebada por un tumor en un paciente.

En una realización particular de la invención, el componente adyuvante se selecciona en el grupo de componentes que consisten en ácidos nucleicos, peptidoglucanos, carbohidratos, péptidos, citoquinas, hormonas y moléculas

pequeñas, donde dicho componente adyuvante es capaz de señalizar a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR).

Los PRR son conocidos por mediar la respuesta inmune innata a patógenos, y a tumores, por reconocimiento de las

5 llamadas marcas conservadas evolutivamente de patógenos (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP). Los PRR están presentes en una diversidad de células inmunes incluyendo células dendríticas, células citolíticas naturales, células B, y también en algunas células no inmunes tales como células epiteliales o células endoteliales. Los PRR y su implicación en la respuesta inmune innata se describen en Pashine A. et al. (Nature medicine supplement volumen 11, Nº 4, abril 2005).

10 En particular un componente adyuvante para la activación de la respuesta inmune innata puede abordar PRR y por lo tanto activar la señalización a través de PRR, donde dichos PRR abarcan receptores tipo Toll o dominio de oligomerización de unión a nucleótido (NOD) o lectina tipo C.

15 En una realización particular de la invención, el componente de adyuvante es un agonista de receptor tipo Toll (TLR). El agonista de receptor tipo Toll se formula especialmente para activar de forma eficaz el sistema inmune innato de un paciente. Dicho agonista TLR es capaz de unirse al TLR, es decir, es un ligando del TLR y además es capaz de potenciar la respuesta inmune provocada bajo el control de dicho TLR.

20 Por motivos de ilustración, los agonistas TLR se seleccionan entre el grupo de agonistas TLR-9, TLR-8, TLR-3 y TLR-7. Sin embargo pueden usarse agonistas de otros receptores TLR para realizar la invención, tales como agonistas de los receptores TLR2, TLR4, TLR5.

El agonista TLR usado en la invención puede ser un agonista natural o sintético. Puede ser una combinación de 25 diferentes agonistas del mismo o de diferentes receptores tipo toll.

De acuerdo con una realización particular de la invención, el agonista TLR es una secuencia de nucleótidos inmunoestimuladora, especialmente una secuencia de nucleótidos estabilizada, por ejemplo estabilizada como resultado de modificación estructural tal como modificación fosforotioato. La secuencia de nucleótidos puede

30 protegerse también contra degradación por formulación específica. Especialmente formulación de liposoma de la misma, por ejemplo, suspensión de liposoma, puede ser ventajosa para la administración eficaz de la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladora.

En una realización particular de la invención, la secuencia de ácido nucleico inmunoestimuladora es un ARN 35 monocatenario.

En una realización particular de la invención, la secuencia de nucleótidos inmunoestimuladora comprende un motivo CpG y especialmente es un oligonucleótido CpG (CpG ODN). Como ejemplo de oligonucleótidos CpG adecuados la invención proporciona ligandos TLR-9 tales como CpG ODN tipo A, es decir, CpG 2216 que tiene la secuencia de

40 nucleótidos 5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3' o CpG ODN tipo B, es decir, CpG 1826 que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'.

El oligonucleótido CpG puede usarse después de complejarse con DOTAP (Roche Manheim, Alemania), para protegerlo contra la degradación y para facilitar su captación.

45 De acuerdo con otra realización particular de la invención, el agonista TLR es una molécula pequeña. Las moléculas pequeñas adecuadas como agonistas TLR son, por ejemplo, derivados amina de imidazoquinolina, tales como el llamado R848 (resiquimod), es decir, 4-amino-2-etoximetil-a,a, dimetil-1-H-imidazo[4,5c]quinolina -1-etanol disponible en Invivogen, como ligando TLR-7, o el llamado R837 (imiqimod) disponible en Aldara como agonista

50 TLR-7.

Otras moléculas adecuadas como agonistas TLR son poliuridina (pU) como ligando TLR-3, o ácido policitidílico (PICO) como ligando TLR-7.

55 Estas moléculas pueden formularse para facilitar su captación y/o para protegerlos de la degradación. Estas moléculas se pueden preparar también como una formulación de liposoma, especialmente como una suspensión de liposoma, para administración a un paciente.

De acuerdo con otra realización particular de la invención, el componente adyuvante puede ser un componente

60 adyuvante basado en células. Un ejemplo del mismo es células dendríticas que se sabe que son capaces de cebar una respuesta de linfocitos, estando dichas células dendríticas posiblemente condicionadas ex vivo antes de su administración, para aumentar su actividad de estimulación de la respuesta de células T. Las células dendríticas por tanto pueden estimularse con adyuvantes que interaccionan con los PRR, incluyendo ligandos o agonistas TLR (Pashine A. et al. Nature Medicine Supplement volumen 11, Nº 4, abril 2005 pág. S63-S68).

Como alternativa, el polipéptido o derivado polipeptídico de acuerdo con la invención se puede administrar al paciente sin un adyuvante. De hecho los inventores han demostrado previamente que puede cebarse la CTL específica para el antígeno vectorizado in vivo después de una inyección intravenosa única de la toxina recombinante, especialmente sin

5 necesidad de proporcionar un adyuvante heterólogo. Estos resultados y en particular el direccionamiento específico del epítopo a células dendríticas mieloides posibilita eludir la necesidad de adyuvante y célula T CD4+ auxiliar.

Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de un polipéptido CyaA mutante recombinado con una molécula y especialmente un péptido de interés para la preparación de una composición formulada para administración 10 intravenosa y que posibilite una respuesta inmune de células T CD8+ in vivo, estando dicha composición libre de un adyuvante heterólogo. La invención también se refiere esta composición como tal.

La solicitud describe métodos terapéuticos que comprenden la administración del polipéptido mutante o derivado polipeptídico de acuerdo con la invención a un paciente animal o humano que padece una enfermedad seleccionada 15 entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionados entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas o fúngicas.

El polipéptido mutante o derivado polipeptídico se puede administrar en particular con una molécula terapéuticamente activa y/o un adyuvante.

20 El polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico, la molécula terapéuticamente activa y/o un adyuvante pueden administrarse juntos como parte de una composición farmacéutica que comprende además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

25 Como alternativa, los diversos tipos de moléculas descritas en este documento para realizar la invención usada, pueden administrarse por separado o simultáneamente en el tiempo (especialmente para el polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico y el adyuvante) o por separado en el tiempo (especialmente para el polipéptido CyaA mutante).

30 La administración de la molécula terapéuticamente activa se puede realizar alternativamente antes y después de la administración del polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico y/o el adyuvante. También puede ser secuencial en el tiempo.

Un régimen particular que puede adoptarse es un protocolo de administración repetida, especialmente en un 35 protocolo que comprende dos rondas o más de administración de al menos uno de los compuestos seleccionados entre el polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico, el agente terapéuticamente activo y/o el adyuvante.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido CyaA mutante o un derivado polipeptídico de acuerdo con la invención, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y 40 opcionalmente un adyuvante y/u otra molécula terapéuticamente activa.

La solicitud describe un kit de partes que comprenden el polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico, una molécula terapéuticamente activa y/o un adyuvante.

45 Los compuestos del kit de partes o la composición de la invención pueden darse al paciente especialmente a través de administración intravenosa, administración intratumoral o administración subcutánea.

El kit de partes o la composición tiene la capacidad de abordar (i) la respuesta inmune adaptativa, a través del polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico descrito en la presente solicitud, (ii) regular negativamente la 50 respuesta inmune reguladora a través del agente terapéuticamente activo, y si el adyuvante está presente, abordar

(iii) el componente innato de la respuesta inmune, activando dicha respuesta innata a través del adyuvante.

La solicitud describe un método de tratamiento de un paciente en necesidad del mismo, un paciente humano o animal, que comprende la etapa de administrar los componentes del kit de partes o de la composición descrita en 55 este documento.

La invención en particular también se refiere a una nueva composición inmunogénica formulada para su administración, especialmente administración intravenosa, a un hospedador animal o humano, caracterizada por que comprende un derivado polipeptídico CyaA recombinante que comprende un antígeno insertado en el dominio

60 catalítico.

La invención además se refiere a una composición farmacéutica para su administración a un ser humano o animal formulada para dirigir una molécula de interés específicamente a células que expresan CD11b caracterizada por que dicha molécula de interés está acoplada a un polipéptido CyaA mutante descrito en este documento.

En otra realización específica, la composición farmacéutica o inmunogénica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el derivado polipeptídico CyaA recombinante que comprende un polipéptido mutante CyaA como se define en este documento acoplado a una molécula de interés. Además, la invención también se refiere al uso de la composición inmunogénica definida anteriormente para la preparación de una vacuna o una composición inmunoterápeutica, para su administración a un hospedador animal o humano.

Como se usa en este documento, la expresión "composición inmunoterápeutica" se refiere a una composición que conduce a una respuesta inmunológica y que está asociada a tratamientos terapéuticos, tales como tratamiento contra neoplasia, cánceres, infecciones virales, infecciones fúngicas, infecciones por parásitos o infecciones bacterianas.

La solicitud describe un método para inmunizar a un hospedador animal o humano, donde dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una composición inmunogénica como se ha definido anteriormente;

b) administrar dicha composición inmunogénica, preferiblemente mediante vía intravenosa, a dicho hospedador para promover una respuesta inmune.

En particular, las composiciones inmunogénicas de la invención son capaces de inducir o estimular, in vivo o in vitro una respuesta celular inmune que implique específicamente células dendríticas. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse para vacunación preventiva o terapéutica de un paciente.

Como consecuencia, en una realización específica, la composición inmunogénica o farmacéutica está ventajosamente desprovista de adyuvantes cebadores usados habitualmente en la técnica, tales como hidróxido de aluminio.

La invención además se refiere a un método para la preparación de un vector proteico adecuado para el suministro de una molécula de interés a una célula que comprende la unión la molécula de interés a un polipéptido mutante CyaA definido en este documento.

La solicitud describe moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ADN o ARN, que codifican un polipéptido o derivado polipeptídico definido anteriormente.

La solicitud describe células eucariotas o procariotas que comprenden las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente.

La solicitud describe células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, que comprenden un polipéptido CyaA mutante o derivado polipeptídico definido anteriormente. Como se describe en este documento, las células son células humanas.

La solicitud describe células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, transformadas con el vector proteico definido anteriormente.

Figuras

Fig. 1. Sustituciones en los dominios de formación de poros y de acilación sinergizan en la disminución de la actividad hemolítica específica de CyaA. (A) Se incubaron eritrocitos de oveja (5x108/ml) en tampón TNC con 5 µg/ml de proteínas CyaA enzimáticamente activas a 37ºC. Después de 30 min, se lavaron alícuotas de suspensiones celulares repetidamente para retirar la CyaA no unida y se usaron para determinar la cantidad de actividad AC asociada a células e invasiva de células. La actividad hemolítica se midió después de 5 horas de incubación como la cantidad de hemoglobina liberada por determinación fotométrica (A541). La actividad de CyaA intacta se tomó como el 100%. (B) La reducida actividad de unión celular de las proteínas con la sustitución K860R se compensó aumentando su concentración de 5 µg/ml a 25 µg/ml. Las actividades de CyaA/233OVA (CyaA/OVA) en presencia se tomaron como el valor del 100%. Los resultados representan valores promedio de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (**, p< 0,001) de actividades de CyaA (Fig. 1A) o CyaA/OVA (Fig. 1B).

Fig. 2. CyaAlOVA/E570Q+K860R se une y se transloca al interior de monocitos CD11b+. (A) Se incubaron células J774A.1 (106/ml) en D-MEM durante 30 min a 4ºC con 2,5 µg/ml de CyaA, se lavaron repetidamente, y se determinó la cantidad de actividad AC asociada a las células en lisados celulares. Para bloquear el receptor CD11b/CD18, las células se incubaron durante 30 min con el anticuerpo M1/70 específico de CD11b (Exbio, República Checa) a una concentración final de 10 µg/ml antes de la adición de CyaA (**, p< 0,001). (B) La capacidad de translocación del dominio AC de las construcciones se evaluó como la capacidad de penetrar en las células y convertir ATP citosólico en AMPc. Las células J774A.1 se incubaron con construcciones de CyaA

durante 30 minutos a 37ºC y se determinaron las cantidades de AMPc acumuladas en lisados celulares (41). El receptor CD11b/CD18 se bloqueó con M1/70 como anteriormente. Se muestran los resultados representativos de tres determinaciones independientes realizadas por duplicado. Fig. 3. El toxoide E570Q+K860R no permeabiliza células J774A.1. Se realizaron mediciones de pinzamiento

5 zonal de célula completa sobre células J774A.1 individuales a temperatura ambiente expuestas a 1 µg/ml de proteínas (A) CyaA/233OVA/AC -o (B) CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC -como se describe en materiales y métodos. Las curvas mostradas son representativas de seis determinaciones en 3 experimentos independientes.

Fig. 4. El toxoide con sustituciones E570Q+K860R suministra el epítopo de células T OVA para su presentación

10 por moléculas MHC de clase I e inducción de CTL CD8+. (A) Se incubaron BMDC (3 x 105 células/pocillo) usadas como APC en presencia de concentraciones indicadas (0 a 60 nM) de los toxoides que albergan el epítopo OVA

o con CyaA/AC -simulado. Tras el co-cultivo durante 24 horas con células T B3Z (1 x 105 células/pocillo), se determinó la secreción de IL-2 por las células B3Z estimuladas por el método de proliferación de CTLL. Los resultados se expresan como Δcpm de [3H]timidina incorporada (cpm en presencia de toxoide -cpm en ausencia 15 de toxoide) ± SD y son representativos de cinco experimentos independientes. (B) Análisis de la inducción de respuestas CTL específicas de OVA (SIINFEKL) por ensayo de eliminación in vivo. En el día 0, los ratones recibieron 50 µg i.v. de toxoides simulador AC -u OVA/AC -y en el día 7, se les inyectó i.v. una mezcla (1:1) de esplenocitos CFSEhigh cargados con péptido OVA (SIINFEKL) y CFSElow no cargados. Se determinó la cantidad de células CFSE-positivas restantes en el bazo después de 20 h por análisis FACS, documentado para un

20 ensayo de eliminación in vivo representativo en el ensamblaje de panel superior de diagramas, donde se indican los porcentajes de células en las entradas. El panel inferior muestra resultados combinados de ensayos de eliminación in vivo para tres experimentos independientes. Se determinó la significancia estadística por el ensayo t de Student (p= 0,75 para OVA/AC -frente a OVA/E570Q+K860R/AC -).

25 Fig. 5. Modelo de acción de CyaA sobre la membrana. (A) El modelo predice un equilibrio entre dos confórmeros de CyaA en solución, insertándose cada uno de ellos en la membrana celular en diferente conformación. Uno produciría un precursor de translocación de CyaA monomérica, suministro del dominio AC al citosol y flujo entrante concomitante de iones calcio a las células. El confórmero se insertaría como precursor de poro que oligomeriza en un poro de CyaA. (B) El efecto sinérgico de las sustituciones E570Q y K860R bloquearía

30 selectivamente la capacidad de los precursores de poro CyaA de oligomerizar en un poro, mientras que la capacidad de los precursores de translocación de suministrar el dominio AC a través la membrana permanecería sin afectar.

Fig. 6. Secuencia de aminoácidos de la toxina CyaA de Bordetella pertussis (SEC ID Nº 1).

35 Fig. 7. Secuencia de aminoácidos del mutante CyaA/E570Q+K860R de Bordetella pertussis (SEC ID Nº 2).

Fig. 8. Secuencia de aminoácidos del mutante CyaA/E570Q+K860R/AC -de Bordetella pertussis (SEC ID Nº 3).

40 Fig. 9. Secuencia de aminoácidos del mutante CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC -de Bordetella pertussis (SEC ID Nº 4).

Fig. 10. Plásmido que codifica el mutante CyaA/E570Q+K86OR/AC -(QR-AC -).

45 Fig. 11. Secuencia de ADN del plásmido QR-AC -que codifica el mutante CyaA/E570Q+K860R/AC -(SEC ID Nº 5).

Fig. 12. Plásmido que codifica el mutante CyaA/2330VA/E670Q+K86OR/AC -(OVA-QR-AC -).

50 Fig. 13. Secuencia de ADN del plásmido OVA-QR-AC -que codifica el mutante CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC (SEC ID Nº 6).

Ejemplos

55 La toxina adenilatociclasa se transloca a través de la membrana de la célula diana sin formación de un poro

Materiales y métodos

Construcción, producción y purificación de proteínas CyaA. Las modificaciones que producen las construcciones

60 CyaA/AC -, CyaA/233OVA, CyaA/E570Q y CyaA/K860R se han descrito previamente (13, 20, 21) y se introdujeron en CyaA/233OVA/AC -individualmente o en combinación. Las proteínas derivadas de CyaA se produjeron en E. coli XL1 Blue y se purificaron cerca de homogeneidad como se ha descrito previamente (29). Durante la cromatografía hidrófoba, la resina con toxina unida se lavó repetidamente con isopropanol al 60% (30) para reducir el contenido de endotoxinas de las muestras de CyaA por debajo de 100 UI/mg de proteína, determinado por ensayo LAL QCL-1

65 000 (Cambrex).

Se depositó una cepa de Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene) que contenía el plásmido QR-AC -(figura 10) que codifica el mutante CyaA/E570Q+K860R/AC -el 18 de marzo de 2009 a la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Francia) con el número de acceso CNCM I-4136 (figura 10). La secuencia de ADN del plásmido QR-AC -(SEC ID Nº 5) se describe en la figura 11.

Se depositó una cepa de Escherichia coli cepa XL1-Blue (Stratagene) que contenía el plásmido OVA-QR-AC -(figura 12) que codifica el mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R/AC -el 18 de marzo de 2009 a la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Francia) con el número de acceso CNCM I-4137. La secuencia de ADN del plásmido OVA-QR-AC -(SEC ID Nº 6) se describe en la figura 13.

Unión a las células y actividades hemolíticas sobre eritrocitos de oveja. Se incubaron 5x108 eritrocitos de oveja lavados en Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y CaCl2 2 mM (tampón TNC) a 37ºC con 5 µg/ml de proteínas CyaA y se determinó la unión a las célula, la AC invasiva de células y las actividades hemolíticas de CyaA como se ha descrito en detalle previamente (13). Se analizó la significancia de diferencias en valores de actividad usando un análisis de la varianza de un factor (ANOVA) con el post-ensayo de Bonferroni (SigmaStat v. 3.11, Systat, San Jose, CA).

Unión a macrófagos, elevación de AMPc y capacidades de lisis celular de CyaA. Se incubaron macrófagos J774A.1

(106) en D-MEM con 2,5 µg/ml de variantes de CyaA durante 30 min a 4ºC, antes de eliminación de toxina sin unir por tres lavados en D-MEM. Las células se lisaron con Triton X-100 al 0,1% para la determinación de la actividad AC unida a las células. Para ensayos de AMPc intracelular, se incubaron 105 células con CyaA durante 30 minutos en D-MEM con IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) 100 µM, la reacción se detuvo por adición de Tween-20 al 0,2% en HCl 100 mM, las muestras se hirvieron durante 15 min a 100ºC, se neutralizaron por adición de imidazol no tamponado 150 mM y se midió el AMPc como se ha descrito (29). Para bloquear el receptor CD11b/CD18, las células se preincubaron durante 30 min en hielo con el MAb M1/70 de bloqueo CD11b-específico (Exbio, República Checa) a una concentración final de 10 µg/m) antes de la adición de CyaA. La lisis inducida por toxina de las células J774A.1 se determinó usando el kit de ensayo CytoTox 96 (Promega) como la cantidad de lactato deshidrogenasa liberada de 105 células en 3 horas de incubación con 10 µg/ml de la proteína apropiada a 37ºC en D-MEM como se ha descrito (8). La significancia de las diferencias en los valores de actividad se analizó como anteriormente.

Mediciones de pinzamiento zonal. Las mediciones de pinzamiento zonal de célula completa se realizaron sobre células J774A.1 en baño en HBS (NaCl 140 mM, KCI 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 3 mM, Hepes-Na 10 mM, glucosa 50 mM; pH 7,4). Se cargaron micropipetas de vidrio pulidas al fuego con diámetro exterior de aproximadamente 3 µm con una solución de gluconato de potasio 125 mM, KCI 15 mM, CaCl2 0,5 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 5 mM, HEPES-KOH 10 mM pH 7,2. Las resistencias resultantes de los microelectrodos fueron 3 a 5 M. Las células se pinzaron a -40 mV, los datos se filtraron a 1 kHz y se digitalizaron a 2 kHz usando el amplificador Axopatch 200A, el digitalizador Digidata 1320A y el paquete de software PClamp-9 (Axon Instruments, Foster City, CA).

Ratones y líneas celulares. Se mantuvieron C57BL/6 hembra obtenidos de Charles River Laboratorys en condiciones específicas libres de de patógenos y se manipularon de acuerdo con las directrices institucionales. Las células CTLL-2 se obtuvieron de la ATCC. El hibridoma B3Z específico de células T CD8+ para el epítopo OVA Kb restringido (SIINFEKL), se proporcionó por N. Shastri (Universidad de California, Berkeley) y se mantuvo en presencia de 1 mg/ml de G418 y 400 µg/ml de higromicina B en medio RPMI 1640 completo (Invitrogen Life Technologies) con FCS inactivado por calor al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, y 2-ME 5x

10 -5 M.

Estudios de presentación de antígeno. Se incubaron células dendríticos de médula ósea (BMDC, 3 x 105 por pocillo) usadas como APC en presencia de diversas concentraciones (0 a 60 nM) del CyaA/OVA/AC -recombinante que porta el epítopo OVA (SIINFEKL) o el CyaA/AC -simulado y se cocultivaron durante 24 horas con células T B3Z (1 x 105 por pocillo), se reconociendo selectivamente los complejos OVA SIINFEKL/H-2Kb MHC clase I. Después de 18 h de cultivo, se congelaron los sobrenadantes durante al menos 2 h a -80ºC. La cantidad de IL-2 producida por las células B3Z estimuladas se determinó después por el método de proliferación CTLL. En resumen, se cultivaron 104 células de la línea CTLL IL-2-dependiente por pocillo con 100 µl de sobrenadante en 200 µl de volumen final. Veinticuatro horas después, se añadió [3H]-timidina (50 µCi/pocillo) y se recogieron las células 6 h después con un recolector automatizado de células. La [3H]-timidina incorporada se detectó por recuento de centelleo. Cada punto se hizo por duplicado y el experimento se repitió cincos veces. Los resultados se expresan en Δcpm de [3H]-timidina incorporada (cpm en presencia de toxoide -cpm en ausencia de toxoide).

Ensayo de eliminación in vivo. Para el cebador CTL, se inmunizaron ratones por inyección i.v. con 50 µg de CyaA/OVA/AC -recombinante que porta el epítopo OVA (SIINFEKL) o CyaA/AC -simulado. Siete días después de la inmunización, se pulsaron esplenocitos vírgenes singénicos con péptido OVA (SIINFEKL) (10 µg/ml) (30 min, 37ºC), le lavaron extensivamente y se marcaron con una elevada concentración (1,25 µM) de succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE; Molecular Probes, Eugene, OR). La población de control no pulsada se marcó con una concentración baja (0,125 µM) de CFSE. Las células marcadas CFSEhigh-y CFSElow se mezclaron en una proporción

1:1 (5x 106 células de cada población) y se inyectaron i.v. en ratones. Las células esplénicas se recogieron 20 h

después, se lavado y se resuspendieron en tampón FACS (PBS suplementado con BSA al 1% y NaN3 al 0,1%). El número de células CFSE-positivas restante en el bazo después de 20 h se determinó por FACS. El porcentaje de lisis específica se calculó del siguiente modo: porcentaje de lisis específica = 100 -[100 x (% de ratones inmunizados CFSEhigh/% de ratones inmunizados CFSElow)/(% ratones vírgenes CFSEhigh/% de ratones vírgenes CFSElow)].

Análisis estadístico: La significancia de diferencias en los valores se analizó usando un análisis de la varianza de un factor (ANOVA) con post-ensayo de Bonferroni (SigmaStat v. 3.11, Systat, San Jose, CA).

Resultados

Eliminación combinada de glutamato 570 cargado negativamente y lisina 860 acilada extirpa la capacidad de permeabilización celular de CyaA. El modelo de trabajo de acción de CyaA predice que CyaA se puede modificar para perder su actividad de formación de poros (hemolítico) conservando al mismo tiempo la capacidad de suministrar el dominio AC al de células diana. Para ensayar esta hipótesis, los inventores buscaron producir construcciones de CyaA que mostraran como actividades hemolíticas y citolíticas los más bajas posibles, sobre la observación anterior de que la capacidad de los toxoides CyaA/AC -de lisar células puede modularse tanto positiva como negativamente por sustituciones dentro del dominio de formación de poros (8, 12 -14, 18). Para posibilitar la evaluación de la penetración en células diana también para los toxoides CyaA/AC -, los inventores obtuvieron dichos mutantes de una toxina CyaA/233OVA que se había marcado previamente por inserción del péptido SIINFEKL de ovalbúmina (OVA). Esta variante de CyaA se eligió ya que la inserción del epítopo indicado de células T CD8+ Kbrestringido en el resto 233 no afecta a la actividad AC y permite cuantificar la translocación de la enzima OVA/AC en células como elevación del AMPc citosólico. De forma más importante, la presencia del epítopo OVA permite evaluar también la capacidad de toxoides CyaA/233OVA/AC -a enzimáticamente inactivos de suministrar su dominio OVA/AC -al citosol de células presentadoras de antígeno (APC) CD11b+, ya que esto posibilita el procesamiento por el proteasoma y la presentación en superficie celular del epítopo OVA en glucoproteínas MHC clase I que puede determinarse como estimulación de células T CD8+ OVA-específicas, tanto in vitro como in vivo (20).

Para generar toxoides de CyaA/AC -que posiblemente carecen de actividad citolítica, los inventores combinaron las sustituciones E570Q y K860R que previamente han demostrado reducir la actividad hemolítica específica de CyaA sobre eritrocitos de oveja, con la sustitución E570Q que se ha descubierto que reduce también la actividad citolítica de CyaA/AC -en monocitos J774A.1 CD11b+ (8, 13). Estas sustituciones se realizaron por ingeniería en CyaA/233OVA/AC -individualmente y en combinación y las actividades específicas hemolítica y citolíticas de los toxoides resultantes se compararon usando eritrocitos de oveja como diana CD11b -modelo y J774A.1 como diana CD11b+ modelo en paralelo (tabla I). De acuerdo con los resultados obtenidos previamente con toxoides que carecen del epítopo OVA (4, 8, 13, 21), en la condiciones usadas los toxoides OVA/AC -que portan individualmente las sustituciones E570Q y K860R mostraron respectivamente una actividad hemolítica relativa dos veces reducida (55 ± 8) y nula (1 ± 1) en eritrocitos y la actividad citolítica relativa del toxoide E570Q hacia células J774A.1 que expresan CD11b también estaba reducida (37 ± 10), en comparación con OVA/AC -. A su vez, como se esperaba de los resultados obtenidos con una construcción K860R enzimáticamente activa, a pesar de la baja actividad hemolítica sobre eritrocitos CD11b -, el toxoide K860R mostró una actividad citolítica relativa sólo ligeramente reducida sobre células J774A.1 CD11b+ (72 ± 22%), confirmando que el defecto estructural causado por la sustitución K860R se rescataba por interacción con el receptor CD11b/CD18 (4). Sin embargo, cuando se combina con E570Q, la sustitución K860R mostró un claro efecto sinérgico en reducir la actividad citolítica relativa de la construcción E570Q+K860R hacia células J774A.1 hasta 14 ± 7%

Tabla I: actividades citolíticas de OVA/AC -y derivados sobre eritrocitos de oveja y macrófagos J774A.1. Proteína Lisis de eritrocitos (% de AC -)a Lisis de células J774A.1 (% de AC -)b

AC

100 ± 5 100 ± 10

OVA/AC

93 ± 4 93 ± 12

OVA/E570Q/AC

55 ± 8** 37 ± 10**

OVA/K860R/AC

1 ± 1** 72 ± 22**

OVA-L247Q-AC

97 ± 3 41 ± 9

OVA/E570Q+K860R/AC

1 ± 1** 14 ± 7**

OVA-E570Q-L247Q-AC

50 ± 12 40 ± 11

OVA-K860R-L247Q-AC

1 ± 1 45 ± 11

OVA-E570Q-K860R-L247Q-AC

0 ± 1 16 ± 10

Leyendas de la tabla

-

aLa lisis de eritrocitos de oveja se determinó después de 4,5 horas como la cantidad de hemoglobina liberada tras incubación de 5x108 RBC a 37ºC en presencia de Ca2+ 2 mM con 5 µg/ml de la proteína dada (31). La actividad hemolítica de CyaA/AC -se tomó como el 100% de actividad. Los resultados representan el promedio

de valores obtenidos en cuatro experimentos independientes realizados en duplicados ± S.D con dos diferentes

preparaciones de proteína. -bLa lisis de células J774A.1 se determinó como la cantidad de lactato deshidrogenasa liberada de 105 células tras

3 horas de incubación celular con 10 µg/ml de la proteína apropiada a 37ºC en D-MEM. La lisis de células

J774A.1 por CyaA/AC -se tomó como el 100%. Los resultados representan el promedio de valores obtenidos en

cuatro experimentos diferentes realizados en duplicados ± S.D con dos diferentes preparaciones de proteína (*,

p < 0,05; **, p < 0,001).

Para posibilitar la cuantificación de la capacidad de la construcción E570Q+K860R de suministrar el dominio AC al citosol de células, las sustituciones E570Q y K860R se transfirieron a construcciones enzimáticamente activas derivado de CyaA/233OVA (CyaA/OVA). Éstas se produjeron y purificaron en la misma forma que los toxoides AC(no mostrados) y se caracterizaron para la unión celular, las capacidades hemolítica y de translocación de AC en eritrocitos de oveja. Como se muestra en la Fig. 1A y esperado a partir de los resultados con toxinas que carecen del epítopo OVA (4, 13, 21), la sustitución E570Q no tuvo impacto sobre la unión a eritrocitos o la capacidad de CyaA/OVA de suministrar el dominio AC al citosol de eritrocitos y de reducir selectivamente sólo su actividad hemolítica relativa. Como se esperaba adicionalmente (4), la sustitución K860R redujo significativamente la capacidad de CyaA/OVA de unirse y penetrar en eritrocitos, causando una aguda reducción de las actividades AC relativas hemolítica e invasiva de células de los mutantes E570Q y E570Q+K860R sobre eritrocitos.

Debe observarse, que la actividad hemolítica de CyaA es una función muy cooperativa de la cantidad de CyaA asociado a células (número de Hill >3), lo que sugiere que la oligomerización de CyaA es un pre-requisito para la formación de poros (22). Por lo tanto, para evaluar el impacto de combinar sustituciones E570Q+K860R sobre la actividad hemolítica, la pérdida de capacidad de unión a eritrocito de las construcciones K860R tuvo que compensarse aumentando su concentración en el ensayo hasta 25 µg/ml (5 µg/ml para toxina intacta), para conseguir la unión de cantidades iguales de todas proteínas a los eritrocitos, como se muestra en la Fig. 1B. En estas condiciones la combinación de las sustituciones E570Q y K860R demostraron una clara sinergia en reducción adicional en un factor de dos las ya alteradas actividades hemolíticas de las construcciones que portan las sustituciones E570Q (∼50%) y K860R (∼30%) individualmente. Esto sugiere que la combinación de la das sustituciones afectaba a la capacidad de permeabilización celular específica de CyaA.

La actividad de formación de poros de CyaA es dispensable para la translocación en membrana del dominio AC. En contraste con el impacto de la sustitución K860R sobre la actividad de toxina sobre eritrocitos, se descubrió previamente que las sustituciones tanto E570Q como K860R no tienen efecto sobre la capacidad de CyaA de unirse y penetrar en monocitos J774A.1 que expresan el receptor CD11b/CD18 (4, 8). Además, como se documenta en la Fig. 2, cuando la das sustituciones se combinaban en la misma molécula de toxina, la construcción CyaA/OVA/E570Q+K860R mostraba una capacidad igual para unirse a células J774A.1 (Fig. 2A) y para suministrar el dominio AC a su citosol para elevar las concentraciones citosólicas de AMPc (Fig. 2B), a la de CyaA intacta. Al mismo tiempo, sin embargo, el toxoide doblemente mutado E570Q+K860R mostró una capacidad citolítica relativa aproximadamente siete veces reducida (14 ± 7%) sobre estas células (cf. Tabla I). Esto sugirió que la combinación de las sustituciones E570Q y K860R alteraba selectivamente sólo la capacidad del toxoide de permeabilizar células J774A.1 y no su capacidad de translocar el dominio AC a través de la membrana celular.

Para ensayar esto, los inventores analizaron la capacidad de permeabilización celular de la construcción E570Q+K860R en experimentos de pinzamiento zonal de célula completa. Aquí otra vez tuvieron que usarse los toxoides AC -, para a evitar la alteración masiva de células J774A.1 provocada por el AMPc generado por la toxina (23). Como se muestra en la Fig. 3A mediante un registro representativo de las corrientes de iones a través de la membrana de células J774A.1 individuales con pinzamiento zonal expuestas a 1 µg/ml de CyaA/OVA/AC -, tras una demora inicial de aproximadamente 3 minutos, las células J774A.1 se permeabilizaron de forma progresa y masiva por CyaA/OVA/AC -y las corrientes a través de la membrana celular alcanzaron -3 000 pA en 10 minutos. En contraste, como se muestra en la Fig. 3B, la exposición al CyaA/OVA/E570Q+K860R/AC -causó de forma reproducible una permeabilización inicial solamente transitoria y mínima de las células, con corrientes a través de la membrana celular que no excedieron los -200 pA y volviendo cerca de cero en 10 minutos después de la adición de toxoide. Los registros mostrados fueron representativos de al menos seis determinaciones de 3 experimentos independientes y demuestran que la combinación de las sustituciones E570Q y K860R tuvo un mayor impacto sobre la capacidad del toxoide de permeabilizar la membrana de células J774A.1. Dado que la versión enzimáticamente activa de la misma construcción fue completamente capaz de translocar el dominio AC al interior de células J774A.1 (cf. Fig. 2B), estos resultados sugieren fuertemente que la actividad de permeabilización celular (formación de poros) de CyaA no era necesaria para la translocación del dominio AC a través de la membrana celular.

La actividad de permeabilización de membrana de CyaA es dispensable para suministrar de antígenos pasajeros a la vía MHC clase I citosólica. Como el ensayo para el AMPc citosólico no pudo usarse para evaluar la capacidad de penetración celular de los toxoides AC -, se usó el ensayo afín para su capacidad de suministrar el epítopo OVA indicador al sitio de procesamiento citosólico de la vía de presentación de antígenos MHC clase I (7, 24). Hacia este fin, los inventores determinaron la capacidad de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón C57BL/6 (BMDC), cargado con los toxoides, de estimular la liberación de IL-2 por células T B3Z que reconocen selectivamente el complejo de moléculas Kb MHC clase I con el péptido SIINFEKL (OVA) sobre APC. Como se

muestra en la Fig. 4A, las células de hibridoma B3Z se estimularon eficazmente tras co-incubación con BMDC y cualquiera de los toxoides que portan el epítopo OVA, pero no con el toxoide simulado. Además, los toxoides OVA/E570Q/AC -y OVA/E570Q+K860R/AC -indujeron estimulación de los linfocitos B3Z por APC in vitro con una eficacia tan elevada como el OVA/AC -intacto. Estos resultados confirman que el doble mutante E570Q+K860R era completamente capaz de translocar su dominio AC al citosol de BMDC para el procesamiento y presentación del epítopo OVA por moléculas Kb MHC clase I, mientras que es esencialmente incapaz de permeabilizar las células J774A.1. Estos resultados sugieren que la actividad de permeabilización celular (formación de poros) de CyaA no era necesaria para la translocación del dominio AC a través de la membrana celular, no para desempeñar ninguna tarea en la capacidad de CyaA de suministrar epítopos pasajeros al citosol de APC.

Para corroborar la capacidad observada in vitro de suministro de antígeno de los toxoides no citolíticos, los inventores evaluaron su capacidad in vivo de cebar linfocitos T CD8+ citotóxico (CTL) OVA-específicos. Se inyectaron 50 µg de los diversos toxoides OVA-por vía intravenosa en ratones C57BL/6 y una semana después se evaluaron las respuestas CTL OVA-específicas en ratones inmunizados por un ensayo de eliminación in vivo. Los ratones C57BL/6 recibieron inyección i.v. de una mezcla (1:1) de esplenocitos CFSEhigh cargados con péptido OVA (SIINFEKL) y CFSElow no cargados, seguido una día más tarde por análisis FACS de células marcadas con CFSE. Como se muestra en la Fig. 4B, la inmunización de ratones con el toxoide simulado no indujo ninguna actividad CTL SIINFEKL-específica in vivo. A su vez, la inmunización con el toxoide E570Q+K860R indujo la misma respuesta de eliminación por CTL OVA-específica in vivo que el toxoide no mutado usado como control positivo, no siendo la ligera diferencia en los valores de respuesta media en los toxoides intacto y doblemente mutado estadísticamente significativa (p=0,065). Estos resultados muestran que la actividad de permeabilización celular de CyaA era dispensable para la capacidad in vivo de los toxoides CyaA/233OVA/AC -de suministrar un antígeno pasajero insertado en AC al citosol de APC.

Discusión

Los inventores aquí demuestran que la translocación del dominio AC de CyaA a través de la membrana de células diana mieloides que expresan el receptor CD11b/CD18 no depende de la capacidad de la toxina de formar poros y permeabilizar la membrana celular.

Como se resumen en el modelo propuesto en la Fig. 5, los inventores han informado previamente de que el equilibrio entre la dos actividades de CyaA puede desplazarse por mutaciones o acilación alternativa de CyaA. La potenciación de la actividad de formación de poros (hemolítica) a expensar de la capacidad de suministrar AC al interior de las células se observó, de hecho, tras sustituciones con lisina de los glutamatos 509, 516 y 581 (13, 18), o tras el bloqueo de la translocación de AC por el anticuerpo monoclonal (MAb) 3D1 (25). A su vez, se observó un desplazamiento en la dirección opuesta para la r-Ec-CyaA recombinante, acilada en E. coli por restos de palmitoleilo (C16:1), en comparación con la Bp-CyaA palmitilada (C16:0) nativa producida por B. pertussis. Se descubrió que la r-Ec-CyaA mostraba actividad hemolítica aproximadamente cuatro veces reducida y actividad de formación de poros aproximadamente diez veces inferior en bicapas lipídicas planas que Bp-CyaA (12), mientras ambas formas de CyaA eran igual de activas en penetración de la membrana celular y translocación del dominio AC al interior del eritrocito (17, 26). Además, recientemente se descubrió que la construcción CyaA/E570Q muestra una capacidad completa de suministrar el dominio AC al interior tanto de eritrocitos como de macrófagos J774A.1, mostrando al mismo tiempo actividad hemolítica reducida y capacidad de formación de poros específica inferior en bicapas lipídicas planas que CyaA intacta, mostrando el toxoide CyaA/E570Q/AC -una actividad citolítica dos veces reducida sobre células J774A.1 (8, 13).

A pesar de los mencionado anteriormente y las muchas CyaA mutantes que los inventores caracterizaron, la pregunta sigue siendo si la formación de un poro de membrana por CyaA es necesaria para la translocación del dominio AC a través de la membrana de células que expresan CD11b. El mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R aquí descrito es la primera construcción con una capacidad reducida de forma importante de permeabilizar células que sigue siendo completamente capaz de translocar el dominio AC a través de la membrana celular. Esto demuestra que en su camino al citosol celular el dominio AC que se está translocando puede eludir el poro selectivo de cationes formado por CyaA.

El modo y trayecto de la translocación del dominio AC a través de la membrana celular, sin embargo, sigue teniendo que definirse en más detalle. Dados los diferentes efectos de las sustituciones de los glutamatos 509, 516, 570 y 581 sobre el formación de poros y las actividades de suministro de AC de CyaA (8, 13, 18), donde el equilibrio entre la dos actividades puede desplazarse casi completamente en cualquier dirección por sustituciones específicas, las hélices anfipáticas que albergan estos restos de glutamato parecen estar implicadas en ambas actividades de CyaA de una manera alternativa. Esto está apoyado por el efecto de la sustitución E509K+E516K combinada, que produce una CyaA hiper-hemolítica incapaz de suministrar el dominio AC al interior de las células (8, 18), mientras que la combinación E570Q+K860R aquí descrita produce lo opuesto, una CyaA esencialmente no citolítica que es completamente competente para translocar el dominio AC al interior de células J774A.1 (CD11b+). Estas observaciones corroboran adicionalmente el modelo propuesto de que las dos actividades de membrana de CyaA dependerían de diferentes confórmeros que se insertan en la membrana, produciendo uno la translocación del dominio AC por monómeros de toxina y conduciendo el otro a la formación de poros de CyaA oligoméricos (13, 18).

Sigue por definir cuales fuera de los segmentos de CyaA fuera del dominio de formación de poros están implicados en la translocación del dominio AC a través de la membrana. Dada la necesidad para su integridad estructural (27), el dominio de repetición RTX grande (restos 1006 a 1706) probablemente toma parte en la translocación de AC al interior de las células. Tendría un tamaño suficiente (700 restos) para formar una interfaz de translocación hidrófila dentro de la membrana celular que podría dejar un paso de un dominio AC no plegado a través de la membrana sin la formación concomitante de un poro de permeabilización celular real. Como alternativa, CyaA podría promover la formación de estructuras lipídicas no lamelares invertidas (fase hexagonal invertida) (28), que podrían tomar parte potencialmente en una interfaz proteína-lípido bien sellada a través de la cual el dominio AC podría deslizar al citosol celular.

Por último, un descubrimiento práctico informado en este documento es que el toxoide CyaA/E570Q+K860R/AC -con la actividad de permeabilización celular (citolítico) muy reducida, sigue completamente activo en el suministro de antígeno a APC CD11b+. Esto es de importancia a la luz de su uso potencial como herramienta con perfil de seguridad potenciada para el suministro de antígenos de específicos de tumor en vacunas de segunda generación derivadas de CyaA/AC -para inmunoterapia de cáncer.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> INSTITUT PASTEUR

<120> Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas a una célula

<130> B08142

<140> aún no conocido

<141>

<160> 6

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 1706

<212> PRT

<213> Bordetella pertussis

<400> 1

<210> 2

<211> 1706 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CyaA/E570Q 10

<400> 2

<210> 3

<211> 1708

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CyaA/E570Q

<400> 3

<210> 4

<211> 1720 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CyaA/2330VA/E570Q 10

<400> 4

<210> 5

<211> 8825 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> QR AC10

<400> 5

<210> 6

<211> 8855 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> OVA QR AC10

<400> 6

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

   (a) una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, en que:

   (i)

   el resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de glutamina; y

   (ii)

   el resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia del CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, está sustituido por un resto de arginina,

   teniendo dicho fragmento la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida

   o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa; o, b) una secuencia de aminoácidos que difiere de un fragmento que tiene un tramo de aminoácidos que comprende los restos aminoacídicos 1 a 860 o 2 a 860 de la SEC ID Nº 1, por:

   (i)

   la sustitución del resto de ácido glutámico, correspondiente a la posición 570 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de glutamina;

   (ii)

   la sustitución del resto de lisina, correspondiente a la posición 860 en la secuencia de CyaA nativo de Bordetella pertussis definida en la SEC ID Nº 1, por un resto de arginina; y

   (iii) de 1 a 50 sustituciones adicionales;

   consistiendo el polipéptido en dicha secuencia que tiene la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis de unirse al receptor CD11b/CD18 de células que expresan el mismo, la capacidad a translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal al interior de dichas células y teniendo una actividad de formación de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa.

2. 2.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fragmento es de al menos 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 o 1600 restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1, de tamaño.

3. 3.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un mutante de un toxoide de adenilato ciclasa cuya actividad adenilato ciclasa en células está parcial o totalmente suprimida en comparación con la de la toxina CyaA de Bordetella pertussis.

4. 4.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha supresión parcial o total de actividad adenilato ciclasa se consigue por inserción de un dipéptido entre los restos aminoacídicos correspondiente a las posiciones 188 y 189 dela SEC ID Nº 1.

5. 5.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos es la SEC ID Nº 2.

6. 6.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es la secuencia de aminoácidos descrita como la SEC ID Nº 2 en que se ha insertado un dipéptido entre las posiciones 188 y 189, preferiblemente que es la secuencia de aminoácidos descrita como la SEC ID Nº 3.

7. 7.

   Derivado polipeptídico que comprende o que consiste en el polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 adicionalmente combinado con una o más moléculas de interés.

8. 8.

   Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 7, en el que cada una de dichas una o más moléculas de interés consiste en una secuencia de aminoácidos adecuada para provocar una respuesta inmune.

9. 9.

   Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune consiste en 5 a 800 especialmente 300 a 600, o 400 a 500 restos aminoacídicos.

10. 10.

    Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la influenza, una secuencia del virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o comprende o consiste en una parte de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos antígenos que comprende al menos uno epítopo.

11. 11.

    Derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que es un polipéptido recombinante en el que la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmune se inserta en un sitio permisivo de dicho polipéptido, siempre que se conserve la capacidad

    de dicho polipéptido de translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N-terminal en las células que expresan CD11b/CD18.

12. 12.

    Derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que cada una de dichas secuencias de aminoácidos adecuadas para provocar una respuesta inmune está injertada, especialmente injertada químicamente, en un resto de aminoácido de dicho polipéptido.

13. 13.

    Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para su uso en terapia.

14. 14.

    Polipéptido o derivado polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en terapia para provocar una respuesta inmune de células T y/o para provocar una respuesta inmune de células B en un hospedador que lo necesite.

15. 15.

    Derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas, por parásitos o fúngicas.

16. 16.

    Polipéptido o derivado polipeptídico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho polipéptido tiene que administrarse en combinación con un adyuvante y/o en combinación con otra molécula terapéuticamente activa.

17. 17.

    Polipéptido o derivado polipeptídico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho polipéptido no tiene que administrarse en combinación con un adyuvante.

18. 18.

    Composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante y/o una molécula terapéuticamente activa.

19. 19.

    Uso de un derivado polipeptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad seleccionado entre neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas entre enfermedades inducidas virales, retrovirales, bacterianas, por parásitos o fúngicas.

20. 20.

    Método para la preparación de un vector proteico adecuado para el suministro de una molécula a una célula que expresa CD11b/CD18 que comprende unir dicha molécula a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

    Figura 1

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5

    Figura 6

    Figura 7

    Figura 8

    Figura 9

    Figura 10

    Figura 11

    Figura 12

    Figura 13