CN108992434A - 咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在制备预防结直肠癌药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供咖啡酸3,4‑二羟基苯乙酯(CADPE)在制备预防结直肠癌药物中的应用。本发明所述的药物是以CADPE为活性成分与药学上可接受的载体制成。本发明所述的CADPE可有效预防由1,2‑二甲肼(DMH)和葡聚糖硫酸钠诱导的ICR小鼠结直肠癌的早期发生，没有明显毒性，其作用机制与抑制炎症细胞侵入和浸润、抑制单核细胞内的NF‑κB表达，抑制β‑catenin在异常隐窝内的表达及入核、下调细胞增殖蛋白PCNA和Cyclin D₁、抗凋亡蛋白survivin和癌基因c‑Myc的表达、以及抑制肿瘤血管增生有关。为临床防治结直肠癌提供新的治疗手段。

Description

咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在制备预防结直肠癌药物的用途

技术领域

本发明属医药领域,涉及咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(Caffeic acid 3,4-dihydroxyphenethyl ester,CADPE)的医药用途，具体涉及咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在制备预防结直肠癌药物中的用途。更具体的说，制备以咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯为活性成分或活性成分之一的药物用于结直肠癌的预防。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大癌症，也是癌症死亡的重要病因之一。随着人们生活日渐西方化、环境因素的恶化、肥胖以及老龄化社会等因素的加剧，结直肠癌的发生率及死亡率将进一步扩大，因此结直肠癌的防治越来越为人们所关注。

目前结直肠癌的主要治疗模式仍然是手术治疗为主，结合化疗、放疗的综合治疗方法。但该治疗方法存在自身的弊端，如化疗毒副作用强，大面积切除造成永久性结直肠创口等。近年靶向药物也用于结直肠癌的治疗，主要有两大类，一类是以肿瘤表面生长因子受体为靶点的药物，如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)；另一类是以血管内皮生长因子为靶点的药物，如贝伐单抗(bevacizumab)等。但这些药物在治疗结直肠癌的过程中仍然存在许多问题，如贝伐单抗易引起高血压、血栓、蛋白尿、胃肠道穿孔及伤口愈合障碍等。再有，靶向药物这类药物的获得性耐药进一步限制了其使用，如研究表明，西妥昔单抗用于治疗KRAS基因突变的结直肠癌无效。因此寻找新的安全有效的治疗结直肠癌途径或药物仍然迫不及待。

癌症需要经历病变、发生、发展和恶化的变化过程，近年来研究发现在肿瘤的早期启动阶段进行药物干预可能是今后人类战胜癌症的有效途径。目前已有预防乳腺癌的药物上市，如乳腺癌疫苗赫赛汀可以预防HER2阳性乳腺癌的发生。很多天然化合物因其毒性低和生物活性强而逐渐成为预防癌症的研究对象。如研究表明：来源于食材调味品姜黄的姜黄素、茶叶的儿茶酚和葡萄的白藜芦醇等天然化合物都有预防结直肠癌的活性。但目前还没有批准用于预防结直肠癌的疫苗或药物上市。可见，研发一种可以预防结直肠癌发生的药物具有重要意义。

咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(Caffeic acid 3,4-dihydroxyphenethyl ester,CADPE)是从中药肿节风(Sarcandra glabra)中分离到的一个多酚酯类活性化合物。已经授权的中国专利公开了该化合物的制备方法(ZL200910115002.4)和在治疗肿瘤方面的医药用途(ZL200910114960.X；ZL200910134180.1)。我们的进一步研究发现CADPE可以预防动物模型诱导的肠癌发生，没有明显的毒性。因此，咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(CADPE)在制备预防结直肠癌药物方面具有良好用途。

发明内容

本发明的目的是提供咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(Caffeic acid 3,4-ddihydroxyphenethyl ester,CADPE)在制备预防结直肠癌药物中的应用。

本发明所述的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯具有以下的化学结构：

本发明所述的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(CADPE)的用途，是CADPE在制备预防结直肠癌药物方面的医药用途；所述的药物是以CADPE为活性成分，与药学上可接受的载体组成的药物。

本发明所述的预防结直肠癌是指咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)可以预防结直肠癌的发生，(1)CADPE可以有效预防由1,2-二甲肼(DMH)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的ICR小鼠结直肠癌的早期发生；(2)CADPE预防结直肠癌的作用没有明显毒性；(3)CADPE预防结直肠癌的作用机制与抑制炎症细胞侵入和浸润、抑制单核细胞内的NF-κB表达，抑制β-catenin在异常隐窝内的表达及入核、下调细胞增殖蛋白PCNA和Cyclin D₁、抗凋亡蛋白survivin和癌基因c-Myc的表达、以及抑制肿瘤血管增生有关。

附图说明

图1是CADPE对小鼠结直肠癌发生率及瘤体积的影响。

图2是CADPE对肿瘤个数平均数和肿瘤大小分布的影响。

图3是不同动物组的代表性结直肠癌组织切片及H&E染色图，显示CADPE延缓原发性结直肠癌的发生的作用。

图4是CADPE在早期预防实验中对小鼠脾、肝和肾的影响。

图5是CADPE在后期预防实验中对小鼠脾、肝和肾的影响。

图6是CADPE对肠癌组织损伤的修复作用。

图7是CADPE促进肠损伤的组织向正常方向修复。

图8是CADPE抑制β-catenin在异常隐窝内的表达和入核，调控CD68阳性细胞在肠上皮层内的募集以及β-catenin在CD68阳性细胞内的入核。

图9是CADPE抑制NF-κB在CD68阳性细胞内的表达。

图10是CADPE下调肿瘤和异常增生细胞的细胞增殖蛋白和抗凋亡蛋白的表达。

图11是CADPE下调VEGF的表达。

图12是CADPE降低肿瘤组织内的c-Myc表达。

图13是CADPE抑制炎症细胞的浸润。

具体实施例

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是,本发明不限于这些实施例。

实施例一、咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯(CADPE)对DMH/DSS诱导的原发性结直肠癌的预防作用

本研究采用一次腹腔注射1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH,20mg/kg)，而后连续给予一周的2％葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS，36000-50000),诱导ICR雄性小鼠结直肠癌模型。观测咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯对癌症诱导剂诱导的结直肠癌发生的预防作用。该结直肠癌模型是由1,2-二甲基肼(DMH)启动，葡聚糖硫酸钠(DSS)致炎以促进形成结直肠癌，这与人类炎性结直肠癌形成的过程类似,是国际公认的一种肠癌模型。

为了探明CADPE预防结直肠癌的主要环节，本实验设计了药物在癌症形成的不同阶段进行干预，即：全程干预(从1周到第14周)、早期干预(从1周到第7周)、后期干预(从8周到第14周)。

全程干预：动物在实验室适应环境三天后，根据动物体重分组，分为正常动物组、模型组、丁酸钠组和CADPE组，每组7只动物(n＝7)，而后造模给予造模药物，并同时分别给予模型组、丁酸钠组、CADPE组的动物β-环糊精(21.25mg/kg，灌胃给药)、丁酸钠(0.25％丁酸钠，饮水给药)和CADPE(2.5mg/kg，灌胃给药)，直到第十四周，动物颈部脱臼处死，取出肠，用游标卡尺测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积并计数，测量肠长度，并将肠在冰冷的10％甲醛溶液内固定24-48h后石蜡包埋、切片、H&E染色。并同时取其脾、肝、肾，测量其重量，拍照记录其外观变化。

前期干预：动物在实验室适应环境三天后，根据动物体重分组，分为正常动物组、模型组、阿司匹林组和CADPE组，每组12只动物(n＝12)，而后造模，并同时分别灌胃给予模型组、阿司匹林组、CADPE组的动物β-环糊精(21.25mg/kg,灌胃给药)、阿司匹林(54mg/kg，灌胃给药)、CADPE(2.5mg/kg，灌胃给药)，直到第七周，然后停止给药，正常饲养到第十四周，取材分析。动物颈部脱臼处死，取肠，用游标卡尺测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积并计数，测量肠长度，并将肠在冰冷的10％甲醛溶液内固定24-48h后石蜡包埋、切片、H&E染色。并同时取其脾、肝、肾，测量其重量，拍照记录其外观变化。

后期干预：动物造模并正常饲养到第七周，根据小鼠体重、小鼠体重变化以及观察到的小鼠状态进行分组，分为正常动物组、模型组、阿司匹林组、CADPE组，每组12只动物(n＝13-14)，并开始分别给予β-环糊精(21.25mg/kg,灌胃给药)、阿司匹林(54mg/kg，灌胃给药)、CADPE(2.5mg/kg，灌胃给药)，直到第十四周。动物颈部脱臼处死，取肠，用游标卡尺测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积并计数，测量肠长度，并将肠在冰冷的10％甲醛溶液内固定24-48h后石蜡包埋、切片、H&E染色，并同时取其脾、肝、肾，测量其重量，拍照记录其外观变化。1.原发性肠癌模型的诱导

动物购买后，在实验室内适应环境3天后，一次性腹腔注射1,2-二甲基肼(DMH,2mg/kg,ip),一周后，给予2％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮水一周，然后正常饮食，一直饲养到第十四周。2.肿瘤体积测量及计数：

用游标卡尺测量肉眼可见肿瘤的长宽，计算肿瘤体积，记录肿瘤个数，并计算其发生率及每组小鼠平均肿瘤个数。计算肿瘤长度在<2mm、2-4mm、>4mm的所占的总肿瘤的百分比，并用直尺记录整个结直肠的长度，即从肛门处到盲肠与结肠链接处。

相关公式:

肿瘤体积＝1/2×瘤长×瘤宽^2；肿瘤发生率＝每组长肿瘤的小鼠只数/每组总小鼠只数×100％；瘤长(<2mm、2-4mm、>4mm)的肿瘤数百分比＝瘤长(<2mm、2-4mm、>4mm)的肿瘤个数/总瘤个数×100％。

3.H&E染色

1)脱蜡：二甲苯(10min)、二甲苯(10min)、无水乙醇(5min)、90％乙醇(2min)、70％乙醇(2min)、蒸馏水(2min)；

2)滴加几滴苏木素染液使覆盖组织，浸染2min；

3)置摇床上，洗去苏木素染液，约5min；

4)用1％盐酸酒精分化8s；

5)置摇床上水洗2次，每次5min；

6)滴加几滴伊红染液使覆盖组织，浸染4min；

7)置摇床上，水洗1min；

8)脱水及透明：95％乙醇(30s-1min)、100％乙醇(5min)、100％乙醇(5min)、二甲苯(10min)、二甲苯(10min)；

9)中性树胶封片。

4.数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS软件进行作图和统计分析。数据以mean±SD或mean±SE表示，各组动物肿瘤发生率采用卡方检验(Chi-square test)，其它均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异十分显著，p<0.001表示差异极为显著。

5.实验结果

5.1.CADPE可以预防原发性结直肠癌的发生

从每组动物的肿瘤发生率结合肿瘤大小和每组动物中所有肿瘤个数平均数结合不同尺寸肿瘤的分布情况两个层次进行分析CADPE是否可以预防原发性结直肠癌的发生。

A.从动物的肿瘤发生率结合肿瘤大小分析

如附图1A所示，在全程预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤发生率和肿瘤体积上都小于模型组，且有显著差异，p值分别为0.011和0.014。而阳性对照药丁酸钠组，虽然小鼠在肿瘤发生率和肿瘤体积上都小于模型组，但是仅在肿瘤体积上有显著差异(p＝0.046)，在肿瘤发生率上差异不是很明显(p＝0.058)。可见CADPE对结直肠癌的预防效果优于丁酸钠。

如附图1B所示，在早期预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤发生率与模型组无差异，而在肿瘤体积上与模型组有显著差异，其p值为0.024。而阳性对照药阿司匹林组，小鼠在肿瘤发生率和肿瘤体积上与模型组比较均无显著差异。可见在早期预防的过程中，CADPE对结直肠癌的预防效果优于阿司匹林。阿司匹林对结直肠癌的早期无明显预防效果。

如附图1C所示，在后期预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤发生率和肿瘤体积上均无显著差异。而阳性对照药阿司匹林组，虽然在肿瘤体积上无显著差异，而在肿瘤发生率上差异极为显著，其p值为0.001。可见在后期的预防过程中，阿司匹林对结直肠癌的预防效果优于CADPE。CADPE对结直肠癌的后期无明显预防效果。

以上结果证明，CADPE对结直肠癌的预防作用主要发生在早期，这不同于阿司匹林对结直肠癌的预防作用，主要发生在后期。

B.从每组动物中所有肿瘤个数平均数结合肿瘤大小的分布情况分析

如附图2A所示，在全程预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤数量上小于模型组，且有显著差异，p值为0.027，而阳性对照药丁酸钠组，虽然小鼠在肿瘤数量上小于模型组，但没有统计上的差异。在肿瘤直径大小的百分比分布上，直径<2mm的肿瘤三个组别相差不是很大；CADPE组小鼠中直径2-4mm的肿瘤明显多于模型组和丁酸钠组；而直径>4mm的肿瘤在CADPE组未出现，而在其它两个组别中均占有超过14％的比例。实验结果提示，在全程预防的过程中，CADPE不仅对原发性结直肠癌的发生有预防作用，而且还可抑制肿瘤生长的进程，且效果优于阳性对照药丁酸钠。

如附图2B所示，在早期预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤数量上小于模型组，且有显著差异，p值为0.036，而阳性对照药阿司匹林组与模型组相比无明显差异。在肿瘤直径大小的百分比分布上，直径<2mm的肿瘤CADPE组多于模型组组，所占比例分别为2.7％和18.4％；直径2-4mm的肿瘤CADPE组与模型组比较，差别不大；而CADPE组中直径>4mm的肿瘤明显小于模型组，所占比例分别为60.3％和42.1％。实验结果进一步提示，在早期预防的过程中，CADPE不仅已经对原发性结直肠癌的发生有了预防作用，而且还有抑制肿瘤的进程的作用，而阳性对照阿司匹林对原发性结直肠癌无早期预防作用。

如附图2C所示，在后期预防的实验中，发现CADPE组小鼠在肿瘤数量上与模型组无差异，而阳性对照药阿司匹林组小于模型组，且有显著差异，其p值为0.038。在肿瘤直径大小的百分比分布上，直径<2mm的肿瘤上，CADPE组与模型组差别不大；直径2-4mm的肿瘤，CADPE组少于模型组，所占比例分别为45.2％和34.9％。；直径>4mm的肿瘤，CADPE组多于模型组，所占比例分别为46.6％和56.6％。实验结果提示，在后期预防的过程中，CADPE对原发性结直肠癌的发生没有后期预防作用及延缓肿瘤进展的作用，而阳性对照阿司匹林对原发性结直肠癌发生后期就有好的预防作用。

以上实验结果表明：CADPE可以预防原发性结直肠癌的发生，其作用主要在癌症发生的前期阶段，并且可能有延缓肿瘤进展的作用，而对癌症发生的后期没有作用。而阳性对照阿司匹林对结直肠癌的预防作用主要发生在癌症发生的后期，对癌症发生的前期没有预防作用。可见CADPE与阿司匹林预防结直肠癌发生的作用阶段不同，这也提示二者的作用机制可能也有不同。

5.2.CADPE可以延缓原发性结直肠癌的发生

在上述全程预防的实验中，取每组动物代表性的结直肠癌组织进行切片并进行H&E染色(附图3)。染色片在2倍镜(2×)下观察，发现CADPE组动物的肿瘤尺寸明显小于模型组。肠隐窝内杯状细胞丧失被认为是评价结直肠癌变的一个重要标准。在40倍镜(40×)下观察，发现模型组中异常突起的肠组织内，全部肠隐窝内的杯状细胞已经完全消失，即已经完全癌变。而在CADPE组内，全部肠隐窝内的杯状细胞绝大多数都存在，只出现少部分的肠隐窝内杯状细胞完全消失，即仅有少部分癌变。实验结果表明CADPE不仅可以预防原发性结直肠癌的发生还可以延缓原发性结直肠癌的发生进程。

5.3.CADPE用于预防结直肠癌的发生，未见明显的毒性

如附图4A所示，在上述早期预防的实验中，各个组别小鼠的肝、脾、肾未发现任何病变现象。这提示CADPE和阿司匹林用于预防原发性结直肠癌的安全性。再者，我们进一步分析了各个组别小鼠的肝指数、脾指数和肾指数，其值为肝、脾、肾的重(mg)/体重(g)。如附图4B所示，CADPE组小鼠的脾指数和肾指数与正常小鼠组相比均无差异。而模型组和阿司匹林组小鼠的脾指数与正常小鼠组相比，均有显著差异。说明CADPE用于结直肠癌的预防具有较少的毒性。

如附图5A所示，在上述后期预防的实验中，各个组别小鼠的肝、脾、肾没有发现任何病变现象，而且，CADPE组小鼠的脾指数、肝指数和肾指数与正常小鼠组和模型组比较均无差异(附图5B)，而阳性对照阿司匹林组小鼠的脾指数和肝指数与正常小鼠组比较具有显著的差异(p＜0.05)，这进一步提示CADPE运用于预防结直肠癌的安全性。

实施例二、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)预防原发性结直肠癌的机制

上述研究表明，CADPE可以预防原发性结直肠癌的发生和延缓原发性结直肠癌的进程的作用，且其作用过程，主要发生在早期。这与阿司匹林的作用不同，阿司匹林主要作用阶段在后期，而前期阶段无效。CADPE用于预防原发性结直肠癌的机制还不清楚。这里主要探讨CPDPE预防原发性结直肠癌发生及其其延缓原发性结直肠癌进程的作用机制。

为了探讨CADPE对结直肠预防作用的早期机制，我们分别于造模后的第1天(整个实验的第15天)和第4天(整个实验的第18天)将动物分批脱臼处死，取肠组织，于10％的甲醛溶液内固定48h后，石蜡包埋、切片、最后进行免疫组化分析。此外，还研究了CADPE对已成瘤小鼠的结直肠癌的影响(选取全程给药组已成瘤小鼠的肠组织做机制探究)，以探究CADPE对于延缓原发性结直肠癌的影响。

1.动物模型的构建

动物购买后，在实验室内适应环境3天后，一次性腹腔注射1，2-二甲基肼(DMH，2mg/kg，ip)，一周后，给予2％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮水一周，而后正常饲养，并在给予所用造模药物的第1天(整个实验的第15天)和第4天(整个实验的第18天)分别取材。

2.H&E染色

实验方法与实施例一所述的方法相同。

3.免疫组织化学

免疫组化：

1)脱蜡：二甲苯(15min)、二甲苯(15min)、无水乙醇(5min)、90％乙醇(2min)、70％乙醇(2min)、蒸馏水(2min)；

2)将片子放于载片架上后置于洗漕内，用0.01mmol/L PBS(pH7.4)在摇床上洗涤5次，每次5min；

3)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％H₂O₂(0.01mmol/L PBS配制)，置37℃温箱内10min(避光)；

4)PBST(含0.25％Triton 0.01mmol/L PBS溶液)清洗3次，每次5min；

5)热抗原修复：将贴在玻片上的肠切片放于已预热到96℃的Tris-EDTA抗原修复液中，放于已预热到96℃的水浴锅内，10min后，拿出放于室温下自然冷却；

6)用0.01mmol/L PBS于摇床中洗3次，每次5min；

7)2％BSA封闭非特异性结合位点：每张切片需要量按20μL(肠切片)计算，置于37℃温箱内30min；

8)滴加第一抗体：用枪吸除BSA，直接滴加稀释后一抗体以刚刚覆盖切片为准，4℃冰箱过夜；

9)0.01mmol/L PBS清洗：5次，每次5min；

10)滴加PV 9000试剂盒内试剂二(信号放大试剂)，置37℃温箱内30min；

11)PBS清洗：3次，每次3min；

12)滴加PV9000试剂盒内试剂一(二抗)，置37℃温箱内30min；

13)PBS清洗：5次，每次5min；

14)DAB显色(若为荧光二抗，实验做到第13步，即可用DAPI防淬灭封片剂在暗处封片即可)；

15)0.01mmol/L PBS充分冲洗5次，每次5min；

16)苏木素衬染：滴加苏木素覆盖组织，3-5s，自来水清洗5min；然后1％的盐酸乙醇分化3-5s，自来水清洗3次，每次5min，而后自来水内静止，返蓝，不少于30min；

17)脱水及透明：50％乙醇(2min)、80％乙醇(2min)、95％乙醇(2min)、100％乙醇(5min)、100％乙醇(5min)、乙醇-二甲苯(1：1，5min)、二甲苯(10min)、二甲苯(10min)；

18)封片：用中性树胶封片。

4.免疫组织化学DAB显色定量分析

统计在每个肿瘤内或异常增生的肠隐窝中凋亡抑制基因Survivin、细胞周期蛋白CyclinD₁所占的阳性颗粒的百分比(每个组别随机选取九个肿瘤区域，计算每个肿瘤区域内的平均每个肠隐窝内的Survivin、CyclinD₁阳性颗粒百分比)。而统计癌基因c-Myc、核转录因子NF-κB、和CD68阳性细胞数以平均每个视野(40×倍镜下的视野)内阳性颗粒的个数(每组动物随机选取3个肿瘤)。

5.炎症评分或隐窝损伤评分

炎症评分或隐窝评分：所有损失隐窝占所有隐窝的百分比，若无损伤则即为0级；隐窝损伤百分比在0-25％、25％-50％、50％-75％、75％-100％之间的小鼠分别被记为1级、2级、3级、4级。

6.数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS软件进行作图和统计分析。数据以mean±SD或mean±SE表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。p<0.05表示有显著差异，p<0.01表示有十分显著差异，p<0.001表示有极为显著差异。

7.实验结果

7.1由DMH/DSS诱导的肠损伤组织，在第18天时开始进入修复阶段

如附图6A所示，在第15天的时候，肠切片(40×倍视野，左图)和肠隐窝损伤评分(右图)表明，阿司匹林有抑制肠道炎症的作用，而CADPE无此作用；而在第18天的时候，肠切片(40×倍视野，左图)和肠隐窝损伤评分表明氨酸阿司匹林无抑制肠道炎症作用的趋势，CADPE有抑制肠道炎症的趋势。

如附图6B所示，在第15天的时候，在肠溃烂组织处，明显组、阿司匹林组、CADPE组的增殖细胞核抗原(PCNA,红色荧光)的阳性细胞均少于正常小鼠组，且其分布为止凌乱，不再集中癌开口隐窝底部。在第18天的时候，模型组、阿司匹林组、CADPE组的PCNA明显增加。PCNA是真核生物中的一种DNA聚合酶的持续激活因子，是DNA复制的必要因子，它在DNA复制、损伤后修复、染色质重构和表观遗传学中都起着重要的作用。PCNA可以反应细胞复制的能力。这提示在第18天时，损伤的肠上皮细胞已经进入修复阶段。为此我们进一步检测了细胞间的粘连蛋白Occludin(红色荧光)的表达情况，以进一步确定在第18天时，肠损伤组织已经开始修复。如附图6C所示，在第15天时，模型组小鼠肠溃烂组织处，Occludin蛋白几乎无表达，而阿司匹林组、CADPE组和正常小鼠组都有表达；在第18天时各个组别包括模型组Occludin蛋白均有表达小鼠。这个结果表明，在第18天时，肠损伤组织已经开始修复，同时也提示在肠损伤阶段，CADPE和阿司匹林对肠粘膜都有一定的保护作用。

7.2 CADPE促进肠损伤组织向正常方向修复

如附图7A所示是在第15天时各组动物的代表性肠组织的H&E染色片。结果显示在肠溃烂旁的组织，在模型组和CADPE组均出现了肠隐窝腔变大及杯状细胞消失的特征，而阿司匹林组则出现肠隐窝腔消失及杯状细胞消失的特征。而在第18天时(附图7B)，即肠损伤组织修复阶段时，在肠溃烂旁组织，我们发现模型组和阿司匹林组小鼠肠溃烂组织其旁组织隐窝腔消失或缩小及杯状细胞进一步消失，而CADPE组小鼠肠溃烂组织其旁组织隐窝腔及杯状细胞也开始出现。实验结果表明：CADPE促进肠损伤的组织向正常方向修复。

7.3 CADPE抑制β-catenin在异常隐窝内的表达和入核，同时也调控CD68阳性细胞在肠上皮层内的募集以及β-catenin在CD68阳性细胞内的入核

β-Catenin过表达是被认为是结直肠癌形成的关键，抑制β-Catenin在异常隐窝的表达被认为是预防结直肠癌的一个重要靶标。如附图8A所示，在第15天时，模型组和阿司匹林组小鼠肠溃烂组织旁组织中的异常隐窝中的β-catenin(绿色箭头所指处)高表达，而且有β-catenin入核。而CADPE组和正常小鼠组的小鼠肠溃烂组织旁组织中的异常隐窝中无此情况。再者，模型组小鼠的肠溃烂组织旁组织中的CD68(红色箭头所指处)阳性细胞中，有显著β-catenin入核，而阿司匹林组、CADPE组和正常小鼠组中仅有微弱的β-catenin入核。

如附图8B所示，在第18天时，模型组和阿司匹林组的小鼠肠溃烂组织旁组织中的异常隐窝中，β-catenin(绿色箭头所指处)有显著表达和入核，而CADPE组和正常小鼠组中β-catenin表达和入核不明显，而且CADPE组小鼠的肠溃烂组织旁组织中肠上皮层的CD68(红色箭头所指处)阳性细胞明显多于其它组别，而其β-catenin(绿色箭头所指处)入核与模型组无差异。阿司匹林组CD68阳性细胞数明显少于模型组，但其CD68阳性细胞内的β-catenin入核多于模型组。以上实验结果表明，CADPE可以抑制β-catenin在异常隐窝内的表达及其入核；在肠癌组织损伤期，CADPE抑制β-catenin在CD68阳性细胞内表达，并促进β-catenin入核；在修复期时，CADPE不能促进β-catenin在CD68阳性细胞内的入核，也不影响其的表达，却可以促进CD68阳性细胞在肠上皮层中的招募。

7.4在组织损伤期，CADPE抑制NF-κB在溃烂处的CD68阳性细胞内的表达

NF-κB是炎症细胞激活的一个关键因子，抑制单核细胞内NF-κB的表达可以抑制单核细胞激活，从而减少组织损伤。如附图9所示，在第15天组织损伤时期，在小鼠结直肠溃烂处,模型组和CADPE组中的CD68阳性细胞(红色)均多于正常小鼠组，而阿司匹林组中的CD68阳性细胞少于正常小鼠组。CADPE组的CD68阳性细胞内的NF-κB(绿色)表达明显弱于其他组别。这提示CADPE可以抑制CD68阳性细胞内NF-κB的表达。

7.5 CADPE下调肿瘤和异常增生细胞的细胞增殖蛋白和抗凋亡蛋白的表达

附图10A、10B、10C分别表示异常增生细胞和肿瘤细胞中细胞增殖蛋白(PCNA、Cyclin D₁)和抗凋亡蛋白Survivin的阳性染色片(左图)，右边为其阳性颗粒定量数据。实验结果表明，CADPE可以下调增殖蛋白(PCNA、Cyclin D₁)和抗凋亡蛋白Survivin的表达水平。

7.6 CADPE通过下调VEGF的表达来抑制血管的增生

如附图11A和11B所示，CADPE组的小鼠肠异常增生的组织及肿瘤区域的亚肌层区域的VEGF和CD31阳性染色颗粒(棕色)明显少于模型组。CD31是血管表皮的标志，VEGF促进血管生成的关键因子。实验结果提示，CADPE通过下调VEGF的表达而抑制肿瘤的生长。

7.7 CADPE可以下调肿瘤区域c-Myc的表达

如附图12所示，CADPE组小鼠肠癌组织中c-Myc的表达显著少于模型组，这提示CADPE可以下调原癌基因c-Myc的表达，这可能与CADPE早期抑制β-Catenin和NF-κB在异常隐窝内的表达相关。

7.8 CADPE可以抑制炎症细胞的浸润

附图13A和13B所示为T细胞CD3e和单核细胞CD68阳性细胞，实验结果发现CADPE组的肿瘤组织以及异常增生组织中CD3e和CD68阳性细胞，均明显少于模型组，说明CADPE可以抑制炎症T细胞和的单核细胞在肿瘤及异常增生组织内浸润。

总之，实验研究证明CADPE可以预防由1,2-二甲基肼(DMH)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的原发性结直肠癌的早期发生，很可能是预防肠上皮细胞癌前病变，而且没有发现明显的毒性。初步作用机制研究表明：(1)CADPE可以抑制β-catenin在异常隐窝内的表达及入核以及在单核细胞CD68阳性细胞内的入核；(2)CADPE抑制肠溃烂组织及其旁组织内单核细胞内的NF-κB表达，并促进单核细胞在肠溃烂组织招募；(3)CADPE可以下调细胞增殖蛋白PCNA和Cyclin D₁、抗凋亡蛋白survivin以及癌基因c-Myc的表达；(4)CADPE降低VEGF的表达从而抑制血管增生；(5)CADPE抑制炎症T细胞CD3e和单核细胞CD68的浸润。因此，CADPE在制备预防结直肠癌药物方面具有良好的应用前景。

Claims (2)

1.一种咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在制备预防结直肠癌药物中的应用，所述的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的化学结构如下：

2.根据权利要求1所述的一种咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在制备预防结直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述的药物是以咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯为活性成分，与药学上可接受的载体制成。