CN1879672A - 一种含有植物肿节风有效成分的药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于所述的有效成分是肿节风有效部位总多酚以及有效单体成分咖啡酸3，4－二羟基苯乙酯。有效单体成分咖啡酸3，4－二羟基苯乙酯包括从肿节风和其它植物中提取分离纯化和通过化学合成而得。肿节风有效部位总多酚的制备和其有效单体成分咖啡酸3，4－二羟基苯乙酯的提取分离纯化方法包括不同浓度乙醇回流提取、不同浓度乙醇渗漉提取、水煎煮提取、正丁醇萃取、大孔吸附树脂柱层析、正相和反相硅胶柱层析。本发明可用于抗肿瘤、增效减毒、抗肿瘤放化疗的毒性反应及肿瘤辅助治疗，亦用于原发性血小板减少性紫癜及继发性血小板减少性紫癜，并可用于治疗常见细菌性感染。

Description

一种含有植物肿节风有效成分的药物 及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物药物肿节风，更具体的说是肿节风有效部位和其有效成分单体及其由两者单独或分别与其它植物提取物或化合物混合制成的各种制剂及其制备方法和它们在抗肿瘤、抗肿瘤的增效减毒及抗血小板减少性紫癜、抗菌抗炎方面的应用。

背景技术

肿节风(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)为金粟兰科草珊瑚属植物干燥全草，又名草珊瑚、九节茶、接骨木、驳骨茶、骨消风等。为多年生常绿草本，分布于江西、安徽、浙江、湖南、湖北、四川、广东、广西等省，江西省为主要产地。肿节风有活血祛瘀、止痛、清热解毒等功效。用于治疗常见炎症(包括咽喉炎、气管支气管炎、肺炎、角膜炎、蜂窝组织炎、阑尾炎)、风湿性关节炎。近代用于癌症辅助治疗。对多种恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、直肠癌等均有疗效。现有文献报道肿节风含黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油、三萜，倍半萜类、酚类等多种成分。《中国药典》2000年版和2005年版收载了肿节风片、血康口服液、草珊瑚含片3个制剂。肿节风片(肿节风浸膏制成)用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎，并可用于癌症辅助治疗。血康口服液用于血小板紫癜，可升高血小板。草珊瑚含片用于咽喉炎。《卫生部药品标准》收载了肿节风注射液制剂。肿节风注射液同样用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎，癌症辅助治疗。这4个制剂均属于总提取物的粗制剂，不是有效部位和单体化合物的制剂，而且有效成分不明确。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种肿节风有效部位和其有效成分单体及其由两者单独或分别与其它植物提取物或化合物混合制成的各种制剂的抗肿瘤、抗肿瘤的增效减毒及抗血小板减少性紫癜、抗菌抗炎的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于所述的有效成分是肿节风有效部位总多酚；

所述的有效成分是肿节风有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

制备所述的肿节风有效部位总多酚包括如下步骤：

肿节风总提取物的提取：

乙醇回流提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后，加热回流提取3～4次，每次1～2小时，合并回流液，浓缩后得肿节风总提取物；

或：

乙醇渗漉提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后进行渗漉直到渗漉液无色，合并渗漉液，浓缩后得肿节风总提取物；

或：

水煎煮提取：取肿节风药材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小时，滤过，滤液合并，浓缩后肿节风总提取物；

肿节风有效部位总多酚的制备：

上述方法提取的肿节风总提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物经大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱后再用40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩后得浸膏。将浸膏溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用10％乙醇洗脱，再用25％乙醇洗脱，收集25％乙醇洗脱液；

浓缩和干燥：

肿节风总提取物和肿节风总多酚的浓缩方法可用薄膜浓缩或减压浓缩，干燥方法可用真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，浓缩并干燥后得肿节风总多酚；

制备所述的肿节风有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯包括如下步骤：

将肿节风总多酚溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用25％乙醇洗脱，分段收集25％乙醇洗脱液，用高效液相色谱检测每个组分，将含有单一成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的组分合并，浓缩并干燥后得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯；

或：

试药：3，4-二羟基苯乙酸，咖啡酸，亚硫酰二氯，四氢铝化锂，二环己基碳二亚胺，无水甲醇，无水四氢呋喃，酒石酸，无水硫酸钠；

方法：

3，4-二羟基苯乙醇的合成：

将3，4-二羟基苯乙酸溶于无水甲醇中，在0℃条件下逐滴加入亚硫酰二氯并搅拌15分钟后，于室温下放置16小时并不停搅拌；

反应物经减压浓缩后，其残留物溶于无水四氢呋喃中，分部加入四氢铝化锂后，于室温下放置16小时并不停搅拌；

反应物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液经无水硫酸钠脱水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物；

乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用环己烷和乙酸溶解于无水四氢呋喃中，然后加入二环己基碳二亚胺；

其混合物在室温下搅拌8小时，加乙酯的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用薄层层析(TLC)在紫外灯下检测每一组分，将含有3，4二羟基苯乙醇的洗脱液合并后回收有机溶剂得到3，4-二羟基苯乙醇；

咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的合成：

将咖啡酸和3，4-二羟基苯乙醇入微量蒸馏水继续搅拌15分钟。滤过，滤液在60℃下减压浓缩得棕色稠状溶液；

该棕色稠状溶液经硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用TLC在紫外灯下检测各组分，将含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的各组分合并后回收有机溶剂得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

制备的肿节风总多酚纯度大于50％(50％-90％)，有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯纯度大于80％(80％-100％)，从其他植物或化学合成方法得到咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯纯度大于80％(80％-100％)。

制成的制剂包括片剂：口服片、含片、咀嚼片，丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、颗粒、泡腾剂、针剂：小针剂、大针剂、粉针剂、乳剂、混悬液，口服液、糖浆、乳剂、合剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂。

含有植物肿节风有效成分的药物，应用于：

抗肿瘤；

抗肿瘤增效；

降低由放射、化学治疗肿瘤所引起的毒性反应如白细胞下降及血小板减少；

抗菌抗炎。

由于本发明采取了上述的技术措施，它与现有技术相比具有如下优点：

本发明用多种动物实验证明肿节风抗肿瘤及增效减毒作用的有效部位为多酚类化合物，并发现其主要的有效成分为咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。肿节风有效部位总多酚的上述作用优于目前市售的肿节风注射液、肿节风片和血康口服液粗制剂。本发明用体外培养肿瘤细胞生长抑制作用实验证明肿节风总多酚和其有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对多种肿瘤细胞生长具有明显抑制作用，且单体成分的作用明显优于总多酚。本发明建立的提取分离纯化方法可制备其纯度大于50％(50～90％)的肿节风总多酚和纯度大于90％(90～98％)的单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯以及纯度大于98％的对照品咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。而且纯度大于90％的单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯还可通过化学合成而获得。本发明为将肿节风开发成有效成分明确、纯度更高、疗效更好、毒副作用更少、质量可控的各种制剂提供了科学依据。

附图说明

图1是肿节风有效部位总多酚的高效液相色谱图；

图2是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的结构示意图；

图3是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的H-C远程偶合关系示意图；

图4是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的高效液相色谱图；

图5是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成流程图；

图6是肿节风总多酚和咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细描述。

一、肿节风有效部位总多酚的制备及含量测定

(一)肿节风总提取物的提取：

1、乙醇回流提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后，加热回流提取3～4次，每次1～2小时，合并回流液，浓缩后得肿节风总提取物。

2、乙醇渗漉提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后进行渗漉直到渗漉液无色，合并渗漉液，浓缩后得肿节风总提取物。

3、水煎煮提取：取肿节风药材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小时，滤过，滤液合并，浓缩后肿节风总提取物。

(二)肿节风有效部位总多酚的制备：

上述三种方法提取的肿节风总提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物经大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱后再用40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩后得浸膏。将浸膏溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用10％乙醇洗脱，再用25％乙醇洗脱，收集25％乙醇洗脱液，浓缩并干燥后得肿节风总多酚。

浓缩和干燥方法：本发明肿节风总提取物和肿节风总多酚的浓缩和干燥方法可用薄膜浓缩，减压浓缩和真空干燥，喷雾干燥，冷冻干燥等各种方法。选择何种方法，可视实际条件。

(三)肿节风有效部位总多酚的含量测定：

1、仪器：高效液相色谱仪。

2、试药：咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品，从肿节风中提取分离纯化，纯度大于98％。甲醇(色谱纯)，乙酸(分析纯)。

3、色谱条件：色谱柱：：Hypersil C₁₈高效液相色谱柱(250×4.6mm，5μm)；柱温：25C；检测波长：326nm；流速：1.5mL/min；流动相：见表1。

表1咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯RP-HPLC分析的梯度条件

时间(min)	1	20	35	36	50	51	60	61	70
										甲醇	15	30	40	40	70	90	90	15	15
乙酸∶水(0.5∶100)	85	70	60	60	30	10	10	85	85

4、对照品溶液的制备：精密称取在60℃真空干燥后的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微热溶解，放冷，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

5、供试品溶液的制备：精密称取在60℃真空干燥后的肿节风总多酚样品50.0mg，置50ml容量瓶中，加70％乙醇35ml，置水浴上微热溶解，放冷，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

6、线性关系考察：取浓度为1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品溶液2，4，8，10，20μL依次进样，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，以对照品进样量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，回归得直线方程Y＝1511.380204X-444.46234，r＝0.99967。结果表明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯进样量在2.5～25μg范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系。

7、精密度试验：取浓度为1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品溶液连续进样6次，每次10μL，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，其峰面积的RSD＝0.97％(n＝6)。

8、稳定性试验：取浓度为1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品溶液分别0，1，38，40，45时内进样，每次10μL，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，其峰面积的RSD＝0.64％(n＝5)。

9、样品测定：取浓度为1.0mg/mL的供试品溶液20μL进样，在前述色谱条件下测定各单一化合物的峰面积，各单一化合物的含量均以咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯计算。各单一化合物含量的总和即为肿节风总多酚的含量。本发明制备的肿节风总多酚的含量为52.6％(n＝3，SD＝0.53)。参照图1，肿节风有效部位总多酚的高效液相色谱图中，6号峰为咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

二、单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的分离，结构鉴定和含量测定

(一)咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的分离：将肿节风总多酚溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用25％乙醇洗脱，分段收集25％乙醇洗脱液，用高效液相色谱检测每个组分，将含有单一成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的组分合并，浓缩并干燥后得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

(二)单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的结构鉴定：咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的结构(图2)是根据1维1H、13C谱，2维1H-1H COSY、HMQC、HMBC(图3)的核磁共振谱和高分辨的质谱分析并与文献[Amani MD et al.Phytochemistry，2000；55：927-931]的光谱数据比较而鉴定。该化合物为无定形粉末，溶于甲醇和乙醇中，在甲醇或乙醇与水的混合溶剂中溶解度更大，三氯化铁反应阳性；UV(MeOH)λf_max(nm)212，251(肩峰)，293，326；IR(KBr，cm^-1)3429，1693，1606，1524，1448，1384，1263，1162，1116，1056；其¹H和¹³C-NMR数据见表2。

表2、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的氢和碳谱数据

	1H	13C		1H	13C
						1	-	125.3	1’	-	129.9
2	7.03(1H，s)	114.9	2’	6.67(1H，s)	116.7
						3	-	146.1	3’	-	144.9
4	-	148.9	4’	-	143.5
						5	6.72(1H，d，J＝7.9Hz)	116.0	5’	6.59(1H，d，J＝7.9Hz)	115.4
6	6.89(1H，d，J＝7.9Hz)	120.8	6’	6.48(1H，d，J＝7.9Hz)	119.6
						7	7.34(1H，d，J＝15.8H z)	144.3	7’	2.74(1H，t，J  ＝13.0/11.0Hz)	37.2
8	6.15(1H，d，J＝15.8Hz)	114.6		3.01(1H，d，J＝13.0Hz)

9

-

166.3

8’

4.87(1H，d，J＝11.0Hz)

76.0

参照图2，咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的结构和图3咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的H-C远程偶合关系。

(三)化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量测定：精密称取在60℃真空干燥后的单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微热溶解，放冷，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取浓度为1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯供试品溶液10μL进样，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，并计算咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量。本发明从肿节风中提取分离的单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量为91.0％(n＝3，SD＝0.5)。参照图4，单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的高效液相色谱图。

三、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品的制备及纯度测定

1、仪器：制备型的高效液相色谱仪。

2、试药：甲醇(色谱纯)。

3、色谱条件：色谱柱：Econosil C₁₈高效液相色谱柱(250×20mm，5μm)；检测波长：326nm；流速：3mL/min；流动相：甲醇/水(45∶55)。

4、方法：上述分离得到的单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯配成5mg/mL的70％甲醇溶液，用前述制备型的高效液相色谱条件进行纯化，每次进样500～800μL，收集其保留时间为56分钟的组分，合并后的收集液先在60～70℃减压条件下回收甲醇，其残留液置冰箱冷冻后再用冷冻干燥法干燥得到对照品咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

5、对照品的纯度测定：对照品咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯配成1.0mg/mL的70％甲醇溶液，每次进样10μL，在前述高效液相色谱条件下由归一化法测定其含量。并由核磁共振谱确证。本发明分离纯化的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量大于98％，可作为定量分析的对照品。

四、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成

本发明以3，4-二羟基苯乙酸和咖啡酸两种商品化学品为原料，经三步化学反应得到咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。其方法简单，经济。

1、试药：3，4-二羟基苯乙酸(3，4-didroxyphenylacetic acid)，咖啡酸(caffeic acid)，亚硫酰二氯(thionyl chloride)，四氢铝化锂(LiAlH4)，二环己基碳二亚胺(DCC)，无水甲醇，无水四氢呋喃(TFA)，酒石酸(tartaricaid)，无水硫酸钠。

2、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成流程：

参照图5，咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成流程。

3、方法：(1)3，4-二羟基苯乙醇的合成：将3，4-二羟基苯乙酸溶于无水甲醇中，在0℃条件下逐滴加入亚硫酰二氯并搅拌15分钟后，于室温下放置16小时并不停搅拌。反应物经减压浓缩后，其残留物溶于无水四氢呋喃中，分部加入四氢铝化锂后，于室温下放置16小时并不停搅拌。反应物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液经无水硫酸钠脱水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用环己烷和乙酸溶解于无水四氢呋喃中，然后加入二环己基碳二亚胺。其混合物在室温下搅拌8小时，加乙酯的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用薄层层析(TLC)在紫外灯下检测每一组分，将含有3，4-二羟基苯乙醇的洗脱液合并后回收有机溶剂得到3，4-二羟基苯乙醇。(2)咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的合成：将咖啡酸和3，4-二羟基苯乙醇入微量蒸馏水继续搅拌15分钟。滤过，滤液在60℃下减压浓缩得棕色稠状溶液。该棕色稠状溶液经硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用TLC在紫外灯下检测各组分，将含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的各组分合并后回收有机溶剂得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

4、合成品咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量测定：将上述合成的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯照前述方法配成1.0mg/mL的供试品溶液，以10μL进样，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，并计算咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量。本发明用化学方法合成的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量为93.2％(n＝3，SD＝0.22)。

五、肿节风有效部位总多酚和咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的制备工艺

参照图6，肿节风总多酚和咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的制备工艺流程。

六、肿节风有效部位总多酚和其有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的抗肿瘤、抗肿瘤的增效减毒及抗血小板减少紫癜等应用

(一)整体实验：通过对多种肿瘤试验证明，肿节风有效部位总多酚、有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其配制成的制剂有明显的直接抗肿瘤的作用。且优于目前市售的粗提物制剂肿节风注射液、肿节风片。

1、直接抗肿瘤实验：在直接抗小鼠S₁₈₀试验中，通过口服、腹腔注射、肌肉注射、尾静脉注射这四种方式给药，肿节风有效部位总多酚、有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯均有明显的抗肿瘤作用，抑瘤率在30％和85％之间。S₁₈₀腹水型肿瘤小鼠的生命延长率100～200％。

2、增效实验：在环磷酰胺治疗小鼠S₁₈₀实体瘤增效试验中，通过口服、腹腔注射、肌肉注射、尾静脉注射这四种方式分别给以环磷酰胺及环磷酰胺加肿节风总多酚或单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其由两者配制成的制剂，实验结果表明单用环磷酰胺小剂量的抑瘤率在5％和20％之间，而与肿节风总多酚和单体成分合用后其抑瘤率在35％和80％以上，说明肿节风总多酚、单体成分与环磷酰胺合用时可明显增强化疗药环磷酰胺的抗肿瘤作用。在氟尿嘧啶治疗小鼠S₁₈₀腹水型肿瘤增效试验中，通过口服、肌肉注射、尾静脉注射这三种方式分别给以氟尿嘧啶小剂量、氟尿嘧啶小剂量分别加肿节风总多酚或加单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其由两者配制成的制剂，实验结果表明单用小剂量氟尿嘧啶S₁₈₀腹水型肿瘤小鼠的生命延长率在5％和15％之间，小剂量氟尿嘧啶加肿节风总多酚或加单体成分合用后其S₁₈₀腹水型肿瘤小鼠的生命延长率在20％和80％之间。说明氟尿嘧啶分别与肿节风总多酚和单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯合用时可明显增强其抗肿瘤作用。

3、减毒实验：在对环磷酰胺、阿糖胞苷治疗小鼠S₁₈₀实体瘤减毒试验中，通过口服、腹腔注射、肌肉注射、尾静脉注射这四种方式分别给以环磷酰胺、阿糖胞苷和两者加肿节风总多酚或单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其由两者配制成的制剂，实验结果表明小鼠在给药环磷酰胺、阿糖胞苷后都出现血小板和白细胞显著下降，分别加肿节风总多酚及其单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其由两者配制成的制剂后，白细胞和血小板明显的上升，说明肿节风总多酚和单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯和化疗药合用时有明显的减毒作用。

(二)体外实验

1、对体外培养肿瘤细胞生长抑制作用实验：在对MTT法体外培养的人结肠癌细胞(HCT-8)、人胃癌细胞(BGC-823)、人卵巢癌细胞(A-2780)的生长抑制作用的实验，肿节风总多酚、单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对上述三种肿瘤细胞生长的抑制浓度分别为0.5μg/ml，5.0μg/ml，50.0μg/ml，IC₅₀：在50μg/ml以下，说明肿节风总多酚、单体成分具有明显抗肿瘤作用，而且单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的作用明显优于总多酚。

肿节风总多酚及肿节风总提取物注射液(表3)。

表3肿节风总多酚及咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的直接抗肿瘤的作用(MTT法)

药物	细胞	浓度(μg/ml)	抑制率(％)	IC50(μg/ml)
						结肠癌HCT-8	0.5550	0.1110.3790.578	20.4746
咖啡酸3，4二羟基苯乙酯	胃癌BGC-823	0.5550	0.0890.4160.593	16.4235
						卵巢癌A-2780	0.5550	0.0190.1480.980	8.0683
肿节风总多酚	结肠癌HCT-8	0.5550	0.0230.3040.509	40.0352
					肿节风注射液(总提取物)	结肠癌HCT-8	0.5550	0.0140.2240.468	72.8999

2、体外抑菌实验：在体外抑菌试验中，采用绿脓杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、白色念球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、甲链球菌、卡他球菌、流感杆菌、肺炎双球菌、链球菌及脆弱类杆菌等15种117株菌，经MIC和MSC试验表明肿节风有效部位总多酚、单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯均有不同程度的抗菌作用。

Claims (7)

1、一种含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于所述的有效成分是肿节风有效部位总多酚。

2、根据权利要求1所述的含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于所述的有效成分是肿节风有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

3、根据权利要求1所述的含有植物肿节风有效成分的药物的制备方法，其特征在于制备所述的肿节风有效部位总多酚包括如下步骤：

肿节风总提取物的提取：

乙醇回流提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后，加热回流提取3～4次，每次1～2小时，合并回流液，浓缩后得肿节风总提取物；

或：

乙醇渗漉提取：取肿节风药材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后进行渗漉直到渗漉液无色，合并渗漉液，浓缩后得肿节风总提取物；

或：

水煎煮提取：取肿节风药材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小时，滤过，滤液合并，浓缩后肿节风总提取物；

肿节风有效部位总多酚的制备：

上述方法提取的肿节风总提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物经大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱后再用40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩后得浸膏。将浸膏溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用10％乙醇洗脱，再用25％乙醇洗脱，收集25％乙醇洗脱液；

浓缩和干燥：

肿节风总提取物和肿节风总多酚的浓缩方法可用薄膜浓缩或减压浓缩，干燥方法可用真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，浓缩并干燥后得肿节风总多酚；

制备所述的肿节风有效单体成分咖啡酸3，4～二羟基苯乙酯包括如下步骤：

将肿节风总多酚溶解于少量25％乙醇中，经反相硅胶柱层析，先用水洗脱，后用25％乙醇洗脱，分段收集25％乙醇洗脱液，用高效液相色谱检测每个组分，将含有单一成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的组分合并，浓缩并干燥后得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯；

或：

试药：3，4-二羟基苯乙酸，咖啡酸，亚硫酰二氯，四氢铝化锂，二环己基碳二亚胺，无水甲醇，无水四氢呋喃，酒石酸，无水硫酸钠；

方法：

3，4-二羟基苯乙醇的合成：

将3，4-二羟基苯乙酸溶于无水甲醇中，在0℃条件下逐滴加入亚硫酰二氯并搅拌15分钟后，于室温下放置16小时并不停搅拌；

反应物经减压浓缩后，其残留物溶于无水四氢呋喃中，分部加入四氢铝化锂后，于室温下放置16小时并不停搅拌；

反应物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液经无水硫酸钠脱水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物；

乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用环己烷和乙酸溶解于无水四氢呋喃中，然后加入二环己基碳二亚胺；

其混合物在室温下搅拌8小时，加乙酯的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用薄层层析(TLC)在紫外灯下检测每一组分，将含有3，4-二羟基苯乙醇的洗脱液合并后回收有机溶剂得到3，4-二羟基苯乙醇；

咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的合成：

将咖啡酸和3，4-二羟基苯乙醇入微量蒸馏水继续搅拌15分钟，滤过，滤液在60℃下减压浓缩得棕色稠状溶液；

该棕色稠状溶液经硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用TLC在紫外灯下检测各组分，将含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的各组分合并后回收有机溶剂得单体化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。

4、根据权利要求3所述的含有植物肿节风有效成分的药物的制备方法，其特征在于制备的肿节风总多酚纯度大于50％，有效单体成分咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯纯度大于80％，从其他植物或化学合成方法得到咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯纯度大于80％。

5、根据权利要求1或2所述的含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于制成的制剂包括片剂：口服片、含片、咀嚼片，丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、颗粒、泡腾剂、针剂：小针剂、大针剂、粉针剂、乳剂、混悬液，口服液、糖浆、乳剂、合剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂。

6、根据权利要求1或2所述的含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于应用于：

抗肿瘤；

抗肿瘤增效；

降低由放射、化学治疗肿瘤所引起的毒性反应如白细胞下降及血小板减少；

抗菌抗炎。

7、根据权利要求4所述的含有植物肿节风有效成分的药物，其特征在于应用于：

抗肿瘤；

抗肿瘤增效；

降低由放射、化学治疗肿瘤所引起的毒性反应如白细胞下降及血小板减少；

抗菌抗炎。

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