CN103012359B - (2′s)-南五味子木质素j及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种(2′S)-南五味子木质素J及其制备方法。该化合物的结构式如式I所示，其制备方法包括下述步骤：1)将粉碎后的药材黑老虎Kadsura Coccinea用有机溶剂进行提取，收集提取液并浓缩，得到浸膏1；2)向浸膏1中加入热水并超声，过滤，收集滤渣；将滤渣用三氯甲烷溶解，过滤，收集三氯甲烷液并浓缩，得到浸膏2；3)将浸膏2用石油醚进行洗涤至石油醚洗涤液接近无色，并挥干浸膏2中的石油醚；4)将步骤3)处理后的浸膏2进行硅胶柱层析，分段收集洗脱液，合并含式I所示化合物的洗脱液，挥干溶剂，重结晶得到目标化合物。体外药效实验证明，(2′S)-南五味子木质素J对肝癌细胞具有较好的抑制作用。

Description

(2′S)-南五味子木质素J及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种(2′S)-南五味子木质素J及其制备方法。

背景技术

黑老虎为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根，别名过山龙、大钻、臭饭团、钻地风等，主要分布于我国江西、湖南、福建、广西、四川、云南等地。味辛、微苦、性温。具有行气活血，祛风止痛的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、痛经、脘腹疼痛等。现代医学研究表明黑老虎具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化等作用。黑老虎的主要生理活性成分为木脂素和三萜酸。其中木脂素结构类型较多，立体化学复杂，而且具有抗肝炎、抗艾滋病毒和抗肿瘤等活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种联苯环辛烯类木脂素化合物及其制备方法。

本发明所提供的化合物的结构式如式I所示：

(式I)

其中文名为(2′S)-南五味子木质素J；英文名为(2′S)-Kadsuralignan J；系统名为(7R，8R，8′R，S_ax)-3′，7-dihydroxy-3，4′，5′-trimethoxy-4，5-methylenedioxy-2，2′-cyclolignan。

式I所示化合物是从中药黑老虎中提取分离得到的，具体方法包括下述步骤：

1)将粉碎的黑老虎根木部用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏，记为浸膏1；

或将粉碎的黑老虎根皮部加水蒸馏，弃去挥发油，水提液过滤，分别收集滤液和滤渣；将所述滤液浓缩得到浸膏；将所述滤渣用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏；合并所述浸膏得到浸膏1；

或将粉碎的黑老虎根皮部加水蒸馏，弃去挥发油，水提液过滤，分别收集滤液和滤渣；将所述滤液浓缩得到浸膏；将所述滤渣和粉碎的黑老虎根木部混合用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏；合并所述浸膏得到浸膏1；

2)向所述浸膏1中加入90℃以上的热水并超声分散，过滤，收集滤渣；将滤渣用三氯甲烷溶解，过滤，收集三氯甲烷液并浓缩，得到浸膏2；

3)将浸膏2用石油醚进行洗涤至石油醚洗涤液接近无色，并挥干浸膏2中的石油醚；

4)将步骤3)处理后的浸膏2进行硅胶柱层析，收集含式I所示化合物的洗脱液，挥干溶剂，得到式I所示化合物。

其中，步骤1)中所述有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇，所述有机溶剂的水溶液中有机溶剂的体积含量为50-95％；所述黑老虎根木部与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g∶(4-20)ml；所述滤渣与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g∶(4-20)ml；所述滤渣和粉碎的黑老虎根木部的混合物与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g∶(4-20)ml；所述提取为回流提取，所述回流提取至少进行2次，每次提取的时间为1-5小时。

对粉碎的黑老虎根皮部加水蒸馏时，粉碎的黑老虎皮部与水的配比可为1kg∶(3000-20000)ml。

步骤2)中所述浸膏1与热水的配比为1g∶(1-4)ml。所述滤渣与三氯甲烷的配比为1g∶(1-10)ml。

步骤4)中所述硅胶柱层析的洗脱条件为：以石油醚和乙醚体积比为(2∶1)-(4∶1)的混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱；

步骤4)中进行硅胶柱层析时，分段收集洗脱液，将洗脱液用薄层色谱法或高效液相色谱法检测，合并含式I所示化合物的洗脱液。

其中，所述薄层色谱法检测的条件如下：用收集的洗脱液点样，采用硅胶GF₂₅₄薄层板，以石油醚(沸程30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸体积比为15∶5∶1的混合液的上层溶液为展开剂，合并Rf值0.60～0.70的洗脱液。

所述高效液相色谱法检测的色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为甲醇-水体积比为80∶20的混合溶剂或乙腈-水体积比为70∶30的混合溶剂；检测波长为214nm，合并保留时间t为16～17min的洗脱液。

为了得到纯度较高的式I化合物，所述方法还包括对步骤4)得到的式I所示化合物进行纯化的步骤，具体方法如下：将式I所示化合物进行硅胶柱层析，分段收集洗脱液，将洗脱液用高效液相色谱法检测，合并式I所示化合物的纯度大于90％的洗脱液，挥干溶剂，得到纯化后的式I所示化合物；

在纯化步骤中硅胶柱层析的洗脱条件为：以石油醚和乙醚体积比为(5∶1)～(20∶1)的混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱。

此外，为了进一步提高目的产物的纯度，还可对纯化的产物进行重结晶。所采用的溶剂为乙醚或石油醚和乙醚体积比为(50∶50)-(0∶100)的混合溶剂。

采用本发明方法提取分离的化合物，经结构鉴定其确为目标化合物(2′S)-南五味子木质素。纯度可达98％以上，且提取率可达到50％以上。

本发明的再一个目的是提供上述(2′S)-南五味子木质素J的应用。

本发明所提供的(2′S)-南五味子木质素J的应用包括两方面：1)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；2)制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。

所述产品可为药品和/或保健品。

在应用1)中，所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞可为肝癌细胞。所述肝癌细胞具体包括人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2等。

在应用2)中，所述肿瘤为癌；所述癌为肝癌。

本发明还保护一种真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，它的有效成分为(2′S)-南五味子木质素J。

此外，以(2′S)-南五味子木质素J为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。

所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

用(2′S)-南五味子木质素J制备的预防和/或治疗肿瘤的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

体外药效实验证明，本发明提供的化合物(2′S)-南五味子木质素J对肝癌细胞具有较好的抑制作用。

附图说明

图1.MTT法检测化合物(2′S)-南五味子木质素J作用48h时对SMMC-7721细胞的生长抑制作用。

图2.MTT法检测化合物(2′S)-南五味子木质素J作用48h时对HepG2细胞的生长抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的药材黑老虎符合《广东省中药材标准》(第一册)2004版第188页黑老虎项下的有关规定。投料前，通过鉴定，药材实物与名称相符，质量符合标准。药材黑老虎是指黑老虎的干燥根，其包括黑老虎根木部和根皮部。

实施例1、提取分离(2′S)-南五味子木质素J

一、制备方法：

取粉碎的黑老虎木部(过二号筛)2.0Kg，加体积浓度为95％乙醇12000ml回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏1(1178g)。向所得浸膏1中加2000ml热水(90℃以上)，超声分散10分钟(超声功率300W，频率50kHz)，过滤，得沉淀。用三氯甲烷4000ml将沉淀溶解，超声分散10分钟(超声功率300W，频率50kHz)，粗滤，去掉较大块的滤渣，滤液离心10分钟，去掉溶液上层漂浮物，再过滤，得三氯甲烷液，回收三氯甲烷，得浸膏2(65.8g)。将浸膏2用适量石油醚(沸程60～90℃)反复多次洗涤至石油醚液近无色，挥掉石油醚，加适量三氯甲烷将浸膏2溶解，加入25g硅胶(粒度：200目～300目)拌样，装样品柱，通过制备色谱硅胶柱(内径为3cm，柱高为45cm，硅胶粒度为200目～300目)进行硅胶柱层析，溶剂洗脱条件为：洗脱剂为石油醚(沸程60～90℃)∶乙醚＝2∶1(v/v)，按体积收集洗脱液，每100ml为1个洗脱组份，共收集30个洗脱组份。每个组份通过TLC检测，合并Rf值约0.65的洗脱组份，回收溶剂，得浸膏3，再加适量三氯甲烷将浸膏3(11.2g)溶解，加入20g硅胶拌样，装样品柱，通过制备色谱硅胶柱(内径为3cm，柱高为45cm，硅胶粒度为300目～400目)进行硅胶柱层析，溶剂洗脱条件为：洗脱剂为石油醚(沸程60～90℃)∶乙醚＝7∶1(v/v)，按体积收集洗脱液，每100ml为1个洗脱组份，共收集20个洗脱组份，每个组份通过HPLC检测，合并保留时间t为(16～17min)处峰面积相对较大(纯度大于90％)的洗脱组份，回收溶剂，得浸膏4。用乙醚或石油醚(沸程60～90℃)-乙醚(1∶1，v/v)的混合溶剂对浸膏4反复重结晶，得到纯度在98％以上的式I化合物即(2′S)-南五味子木质素J。结晶余液还可以继续进行硅胶柱层析，洗脱条件同上。按照上述提取分离方法得到(2′S)-南五味子木质素J的纯品约为3.06g，其提取率达到53％。

上述TLC检测方法如下：

直接用收集液点样，点于硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(沸程30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1，v/v/v)放置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。在Rf值约0.65处可以看到很明显的荧光斑点。将符合上述条件的洗脱组分合并。

上述HPLC检测方法如下：

色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为甲醇-水(80∶20，v/v)或者乙腈-水(70∶30，v/v)；检测波长为214nm。

供试液制备：分别从每组份中吸取1ml，置蒸发皿中，挥干溶剂，用甲醇2ml溶解，滤过，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

测定结果判定：供试品色谱中，保留时间t为(16～17min)处有相对应的色谱峰，合并峰面积相对较大(纯度大于90％)的洗脱组份。

二、化合物结构鉴定：

1、紫外光谱(UV)

仪器：Perkin-Elmer Lambda 25紫外光谱仪；

数据：UV(MeOH)λ_maxnm(logε)：214(4.68)，254(sh)，283(3.57)；

2、红外光谱(IR)

仪器：WQF-410 FT-IR

测定方法：KBr压片；

数据：IR(KBr)v_max3523(OH)，1741(C＝O)，1617，1573，1504(Ar.)，1469，1421，1365，1263，1236，1180，1151，1095，1054，1028cm1。

3、核磁共振谱(NMR)

仪器：Bruker DRX-400型超导核磁共振仪；

溶剂：氘代三氯甲烷(CDCl₃)；

数据：如表1所示；

无畸变极化转移增强核磁共振碳谱(DEPT)：

表1：(2′S)-南五味子木质素J的¹H NMR(400MHz，CDCl₃)和¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据

4、质谱(MS)

仪器：MDS SCIEX API 2000 LC/GC/MS；

测定方法：直接进样；ESI源，正离子模式；

数据：ESIMS m/z(％)：995[2M+Na]⁺，509[M+Na]⁺，469[M-OH]⁺，385[M-C₂H₅(CH₃)CHCO₂]⁺。

5、熔点

仪器：Yanagimoto显微熔点测定仪(Yanagimoto，Kyoto，Japan)

熔点：110-112℃

6、比旋光值

仪器：Perkin-Elmer 341 polarimeter

比旋光值：[α]_D ²⁰+49.8(c 2.0，MeOH)，+54.4(c 1.0，MeOH)。

7、(2′S)-南五味子木质素J的水解

(2′S)-南五味子木质素J样品(90mg)溶于质量浓度4％NaOH甲醇水(1∶1，v/v)溶液(10mL)，加热回流12小时，减压浓缩除去甲醇，加入5mL水，用乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，再溶于甲醇，将甲醇溶液通过强酸性阳离子交换树脂柱，将流出液浓缩至干，得到水解产物1a(27mg)。将乙酸乙酯萃取后的水相用质量浓度1％HCl调pH值至6，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯萃取液以无水硫酸钠干燥后在30℃下减压浓缩，再溶于甲醇，将甲醇溶液通过强酸性阳离子交换树脂柱，将流出液在30℃下减压浓缩至干，得到水解产物1b(9mg)。

水解产物1a结构鉴定：白色粉末，[α]_D ²⁰-11.7(c 5.0，CHCl₃)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.41(1H，s，H-4)，6.38(1H，s，H-11)，5.97、5.95(各1H，d，J＝1.5Hz，H₂-19)，4.63(1H，br s，H-9)，3.90(3H，s，2-OCH₃)，3.88(3H，s，3-OCH₃)，3.87(3H，s，14-OCH₃)，2.63(2H，m，H₂-6)，2.06(1H，m，H-7)，1.91(1H，m，H-8)，1.16(3H，d，J＝7.3Hz，H₃-18)，0.93(3H，d，J＝7.5Hz，H₃-17)。数据与日本南五味子素甲(Ookawa et al.，1981)一致。

水解产物1b结构鉴定：无色油状物，[α]_D ²⁰+15.5(c 0.4，MeOH)；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ：2.32(1H，m，H-2)，1.62(1H，m，H-3a)，1.44(1H，m，H-3b)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz，H₃-5)，0.92(3H，t，J＝7.0Hz，H₃-4)。数据与(S)-2-甲基丁酸((S)-2-Methylbutanoic acid)一致。

三、综合结构解析

正离子ESIMS给出了m/z 995[2M+Na]⁺和509[M+Na]⁺准分子离子峰以及m/z469[M-OH]⁺和385[M-C₂H₅(CH₃)CHCO₂]⁺碎片离子峰，显示其分子量为486。核磁共振碳谱(¹³C NMR)显示该化合物含27个碳原子。根据其分子量和所含碳原子数可推定该化合物的分子式为C₂₇H₃₄O₈。该化合物的¹H NMR和¹³C NMR谱(表1)除给出了与日本南五味子素甲(Ookawa N.，Ikeya Y.，Taguchi H.，Yosioka I，1981.The consitituentsof Kadsura japonica Dunal.I.The structures of three new lignans，acetyl-，angeloyl-andcaproyl-binankadsurin A.Chem.Pharm.Bull.，29(1)：123-127.)相似的质子和碳信号外，还存在下列基团信号：一个伯碳甲基[δ_H0.81(3H，t，J＝7.2Hz)；δ_C11.4]、一个仲碳甲基[δ_H0.93(3H，d，J＝7.2Hz)；δ_C16.7]、一个亚甲基[δ_H1.58和1.42(各1H，m)；δ_C26.7]、一个次甲基[δ_H2.41(1H，m)；δ_C41.3]、一个酯羰基(δ_C176.3)。这些信号说明在该化合物分子中存在一个2-甲基丁酰氧基。另外，与日本南五味子素甲的¹H和¹³C NMR谱比较，该化合物的¹H NMR谱中未出现日本南五味子素甲的1-OH质子信号，其¹³CNMR谱中的C-1向高场位移而C-2和C-16向低场位移，提示2-甲基丁酰氧基连在C-1位。基于上述分析，推定该化合物即为南五味子木质素J(Kadsuralignan J)(Li et al.，2007)。该化合物的光谱数据与南五味子木质素J的文献(Li et al.，2007)报道数据完全一致。但文献(Li et al.，2007)未报道南五味子木质素J的C-2′位构型，为了确定C-2′位构型，对该化合物进行了碱水解，获得了二个水解产物1a和1b。产物1a的¹HNMR数据与日本南五味子素甲一致；产物1b的¹H NMR数据、比旋光度值与(S)-2-甲基丁酸吻合，据此确定C-2′位为S构型。因此，确定该化合物为(2′S)-南五味子木质素J。

实施例2、提取分离(2′S)-南五味子木质素J

取粉碎的黑老虎根皮部(过二号筛)2.0Kg，加水12000ml，蒸馏，得挥发油(弃之)，水提液过滤，滤液蒸干得浸膏a，滤渣加12000ml乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，回收乙醇后得浸膏b，将浸膏a、b合并得浸膏1，并向其中加2000ml热水(90℃以上)，超声10分钟(超声功率300W，频率50kHz)，过滤，得沉淀。其余同实施例1。

按照上述提取分离方法得到(2′S)-南五味子木质素J的纯品约为1.48g。

化合物结构鉴定结果同实施例1。

实施例3、提取分离(2′S)南五味子木质素J

取粉碎的黑老虎根木部(过三号筛)2.0Kg，加体积浓度为85％丙酮12000ml回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，回收溶剂后得浸膏，其余同实施例1。

按照上述提取分离方法得到(2′S)-南五味子木质素J的纯品约为2.54g。

化合物结构鉴定结果同实施例1。

实施例4、提取分离(2′S)-南五味子木质素J

取粉碎的黑老虎根木部(过二号筛)2.0Kg，加体积浓度为50％乙醇溶液40000ml回流提取2次，每次5小时，过滤，合并滤液，回收溶剂后得浸膏1，向浸膏1中加4000ml热水(90℃以上)，超声10分钟(超声功率300W，频率50kHz)，过滤，得沉淀。其余同实施例1。

按照上述提取分离方法得到南五味子木质素J的纯品约为2.36g。

化合物结构鉴定结果同实施例1。

实施例5、化合物(2′S)-南五味子木质素J抗肝癌细胞活性研究

1.材料与仪器

1.1细胞株：人肝癌细胞(SMMC-7721，HepG2)。

1.2仪器和设备：Thermo医用型净化工作台，离心机(上海医疗器械厂)，CO₂恒温细胞培养箱(Thermo公司)，倒置相差微镜(日本尼康公司)，全自动酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.3主要试剂

化合物(2′S)-南五味子木质素J(分子量486.55)用DMSO溶解，配成100mM储存液，置于-20℃保存，临用时用无血清培养基稀释。

DMSO购自sigma公司，RPMI-1640培养基，胎牛血清，100×氨苄青霉素和链霉素(10000U/mL和10000μg/mL)均购于美国Gibco公司。

DMEM培养基购自德国PAA公司

2.实验方法

2.1细胞培养：人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2均为贴壁生长细胞，以适量浓度接种于培养皿中，加入含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640或DMEM完全培养液，置于37℃恒温、5％CO₂的培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2细胞毒性实验(MTT法)：培养细胞经胰酶消化后，接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，培养24小时后，弃掉培养液，分别加入含不同浓度化合物的无血清培养基，以不加化合物的培养基为对照组。化合物(2′S)-南五味子木质素J对HepG2作用细胞浓度分别为0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和80μM，对SMMC-7721作用浓度为0μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM，每组设3个复孔。继续培养48小时后，每孔加MTT溶液(5g/L)20μl，孵育4h，吸弃孔内上清液，每孔加100μl DMSO，充分震荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪(波长490nm)测定各孔的吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞生长抑制率，对数法计算IC50值。抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％

3.实验结果

不同浓度的化合物(2′S)-南五味子木质素J分别给药48小时后，对SMMC-7721细胞生长呈明显抑制作用，化合物(2′S)-南五味子木质素J浓度为20μM时，即对细胞产生明显抑制作用，随着浓度的增大，抑制效果越明显；当药物浓度达到60μM时，48小时抑制率为65.90％。化合物(2′S)-南五味子木质素J作用48小时IC50值为36.19μM。(结果如图1所示)

不同浓度的化合物(2′S)-南五味子木质素J分别给药48小时后，对HepG2细胞生长呈抑制作用，抑制作用随着药物浓度的增大而增大，药物浓度为40μM时，抑制率为34.93％，化合物(2′S)-南五味子木质素J作用48小时的IC50值大于40μM，按斜率推算IC50值约为70μM。(结果如图2所示)

以上结果表明，化合物(2′S)-南五味子木质素J对HepG2细胞、SMMC-7721细胞生长有明显的抑制作用，且抑制率呈明显的量效关系，其中化合物(2′S)-南五味子木质素J对HepG2细胞作用更强，给药48小时IC50值为36.19μM，提示该化合物体外有一定的抗肝癌细胞活性。

Claims (3)

1.制备式Ⅰ所示化合物的方法，包括下述步骤：

1)将粉碎的黑老虎根木部用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏，记为浸膏1；

或将粉碎的黑老虎根皮部加水蒸馏，弃去挥发油，水提液过滤，分别收集滤液和滤渣；将所述滤液浓缩得到浸膏；将所述滤渣用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏；合并所述浸膏得到浸膏1；

或将粉碎的黑老虎根皮部加水蒸馏，弃去挥发油，水提液过滤，分别收集滤液和滤渣；将所述滤液浓缩得到浸膏；将所述滤渣和粉碎的黑老虎根木部混合用有机溶剂或有机溶剂的水溶液进行提取，收集提取液并浓缩得到浸膏；合并所述浸膏得到浸膏1；

步骤1)中所述有机溶剂为乙醇或丙酮，所述有机溶剂的水溶液中有机溶剂的体积含量为50-95％；

所述黑老虎根木部与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g:(4-20)ml；所述滤渣与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g:(4-20)ml；所述滤渣和粉碎的黑老虎根木部的混合物与有机溶剂或有机溶剂的水溶液的配比为1g:(4-20)ml；所述提取为回流提取，所述回流提取至少进行2次，每次提取的时间为1-5小时；

步骤1)所述蒸馏中，粉碎的黑老虎根皮部与水的配比为1kg：(3000-20000)ml；

2)向所述浸膏1中加入90℃以上的热水并超声分散，过滤，收集滤渣；将滤渣用三氯甲烷溶解，过滤，收集三氯甲烷液并浓缩，得到浸膏2；

步骤2)中所述滤渣与三氯甲烷的配比为1g:(1-10)ml；步骤2)中所述浸膏1与热水的配比为1g:(1-4)ml；

3)将浸膏2用石油醚进行洗涤至石油醚洗涤液接近无色，并挥干浸膏2中的石油醚；

4)将步骤3)处理后的浸膏2进行硅胶柱层析，收集含式Ⅰ所示化合物的洗脱液，挥干溶剂，得到式Ⅰ所示化合物；

步骤4)中所述硅胶柱层析的洗脱条件为：以石油醚和乙醚体积比为(2:1)-(4:1)的混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱；

所述方法还包括对步骤4)得到的式Ⅰ所示化合物进行纯化的步骤，具体方法如下：将式Ⅰ所示化合物进行硅胶柱层析，分段收集洗脱液，将洗脱液用高效液相色谱法检测，合并式Ⅰ所示化合物的纯度大于90％的洗脱液，挥干溶剂，得到纯化后的式Ⅰ所示化合物；所述硅胶柱层析的洗脱条件分为：以石油醚和乙醚体积比为(5:1)-(20:1)的混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱；

所述方法还包括将所述纯化后的式Ⅰ所示化合物进行重结晶的步骤；所述重结晶使用的溶剂为乙醚或石油醚和乙醚体积比为(50：50)-(0：100)的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中进行硅胶柱层析时，分段收集洗脱液，将洗脱液用薄层色谱法或高效液相色谱法检测，合并含式Ⅰ所示化合物的洗脱液；

所述薄层色谱法检测的条件如下：用收集的洗脱液点样，采用硅胶GF254薄层板，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸体积比为15：5：1的混合液的上层溶液为展开剂，合并Rf值0.60～0.70的洗脱液；

所述高效液相色谱法检测的色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为甲醇-水体积比为80：20的混合溶剂或乙腈-水体积比为70：30的混合溶剂；检测波长为214nm。

3.式Ⅰ所示的化合物在下述1)或2)中的应用：

1)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；2)制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用，所述产品为药品和/或保健品；

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞，且所述癌细胞为肝癌细胞；

所述肿瘤为癌，且所述癌为肝癌。