CN102219813B

CN102219813B - 一种从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法

Info

Publication number: CN102219813B
Application number: CN 201110209731
Authority: CN
Inventors: 李晓; 魏悦; 郭唯; 范毅; 董建军; 赵天增; 张海燕; 李倩; 于立芹; 陈玲
Original assignee: Henan Kegao Vegetable Natural Product Development Engineering Technology Co ltd
Current assignee: Henan Kegao Vegetable Natural Product Development Engineering Technology Co ltd
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-07-26
Also published as: CN102219813A

Abstract

本发明涉及从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，该方法以连翘叶为原料，先通过热水提取、浓缩、分离获得连翘苷粗提物和连翘酯苷粗提液；然后连翘苷粗提物经乙酸乙酯提取、乙醇重结晶得到纯度高达99%的连翘苷产品；而连翘酯苷粗提液经水饱和的正丁醇溶液萃取、浓缩、干燥后得到纯度大于40%的连翘酯苷粗品，经进一步纯化纯度可大于90%。本发明方法工艺简单，原料利用率高，所得产品纯度高，适合工业化生产。

Description

一种从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种从连翘叶中提取分离连翘苷和连翘酯苷的方法。

背景技术

连翘为木犀科连翘属落叶灌木，是中药中最常见的药材之一，具有清热解毒、消肿散结之功效。现代药理研究表明，连翘具有抗菌、抗病毒、解热抗炎、抗氧化、保肝等多种药理作用。我国连翘资源丰富，南北部均有分布，以河南、山西、陕西产量最大。连翘的化学成分主要有三大类：木脂素类（如连翘苷、连翘酯苷等）、三萜酸类（如齐墩果酸、熊果酸等）和挥发油类。据研究，连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，并且叶子中的有效成分如连翘苷、连翘酯苷的含量均比果实中的含量高。果实中连翘苷的含量在0.7%左右，连翘酯苷含量在2%左右，而叶中连翘苷和连翘酯苷的含量均在4%左右。传统中医药以连翘果实入药，大量的连翘叶被废弃不用，造成资源的严重浪费。

连翘苷溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，溶于热水但难溶于水，是连翘的主要成分之一，也是国家药典所规定的连翘质量控制指标成分，具有抗菌、降血脂及减肥功能。连翘酯苷为咖啡酸衍生物，分子结构中具有酯键和糖苷键，在弱酸条件下稳定，遇碱、强酸和高温条件均易分解，是连翘抗病毒的主要有效成分，除此之外其对金黄色葡萄球菌等十一种致病菌有极强的抑制作用，兼具抑制磷酸二酯酶、抑制真菌及抗氧化作用，两者在医药和食品领域作为天然药物、天然防腐剂及天然抗氧化剂均具有广泛的应用前景。

目前提取连翘酯苷和连翘苷均是采用从连翘果实或叶中提炼的，如中国专利01122779.6、200610148179.0、200810054428.9采用水提或乙醇提取、大孔树脂分离得到20%－40%的连翘酯苷。中国专利201010535334.0采用CO₂超临界萃取、多级逆流萃取、大孔吸附树脂纯化得连翘酯苷。中国专利201010235729.9公开了一种从连翘叶中提取连翘苷的方法，其通过碱水提取、树脂吸附、氧化铝柱纯化和重结晶等制备连翘苷，方法中使用碱水提取，在获得连翘苷的同时破坏了其中的连翘酯苷。

现有方法存在的不足：（1）现有方法中的水提取多是采用将连翘叶与水混合浸泡后再加热提取，而这种传统的采用浸泡加热的提取方法会导致连翘叶中某些有效成分如连翘苷等的水解破坏；（2）连翘叶的现有提取方法仅针对连翘酯苷或连翘苷，不能同时得到连翘苷和连翘酯苷两种有效成分，而且操作复杂、成本较高。目前尚未见到有从连翘叶中同时提取分离连翘苷和连翘酯苷的相关报道。针对所存在的问题，我们提出了一种工艺方法简单、原料利用率高的从连翘叶中同时提取分离连翘苷和连翘酯苷的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种从连翘叶中提取分离连翘苷和连翘酯苷的方法，该方法能有效提高连翘叶中有效成分的利用率，操作工艺简单，所得产品纯度高，适合工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，该方法包括如下步骤：

①提取：在40－90℃的水中直接加入连翘叶进行提取，每次提取时间0.5－2h，提取2－4次，连翘叶和水的重量比为1：6－20（此处的提取除可用前述的常规热提取外，还可以使用超声提取）；

②分离：合并所得提取液，固液分离弃去残渣，滤液减压浓缩后室温静置，分离沉淀和水层，沉淀为连翘苷粗提物（其中连翘苷含量为50%以上），水层为连翘酯苷粗提液（其中连翘酯苷含量为10%以上）。

较好的，步骤①中水温以60－85℃为宜。现有的常规操作是把原料加入水中或浸泡一段时间，然后慢慢升温加热提取，这样使得连翘叶的有效成分在浸泡过程中易于水解，提取率偏低。本发明采用将连翘叶直接加入热水中提取，这样能够有效降低原料连翘叶中的某些水解酶等因素对有效成分的破坏，从而大大提高了提取液中有效成分的含量。为取得好的提取效果，可以将连翘叶按比例加入热水中进行提取，提取结束后过滤分离；所得滤渣再次加水提取，提取结束后过滤分离；如此重复，合并每次所得提取液进行下一工序。

较好的，步骤②中减压浓缩的程度取决于能使连翘苷和连翘酯苷获得最大程度的分离，浓缩前后滤液的体积比以7—15：1为宜，此时大量的连翘酯苷保留在浓缩液中，而大部分连翘苷从浓缩液中沉淀出来，分离连翘苷粗提物，其中连翘苷含量可达50%左右，更利于下一步的精制纯化。步骤②中的室温静置时间以10－48h为佳，此静置过程利于连翘苷和连翘酯苷能被充分分离开来。步骤②中的分离可以采用常压过滤分离、减压过滤分离或离心分离等。

进一步的，所得连翘苷粗提物按如下方法：将连翘苷粗提物烘干，然后把烘干的连翘苷粗提物与乙酸乙酯按重量比1：2－8混合后回流提取2－4次，合并提取液，减压浓缩至干，再经乙醇重结晶1－4次即得白色针状连翘苷晶体，HPLC检测纯度高达99%。其中，所述回流提取时间为20－60min（回流温度一般在40－80℃），使用的乙醇优选无水乙醇或体积浓度90%－99%的乙醇。

所得连翘酯苷粗提液按如下方法精制：将连翘酯苷粗提液用水饱和的正丁醇溶液萃取，弃去水层，合并有机层，有机层经减压浓缩干燥后得纯度大于40%的连翘酯苷粗品。其中在下述条件操作时效果较好：萃取时水饱和的正丁醇溶液添加量为连翘酯苷粗提液体积的0.4－1.2倍；萃取次数为1－3次，合并每次萃取所得有机层，该有机层先减压浓缩至相对密度为1.3－1.5，然后干燥得连翘酯苷粗品。

所得连翘酯苷粗品可以用正相硅胶层析、反相硅胶层析或重结晶方法进一步纯化，得到连翘酯苷成品，纯度可达90%以上。

与现有技术比较，本发明方法具有如下优点：

（1）将连翘叶直接放入热水中进行提取，避免有效成分的破坏：

连翘叶中的连翘苷易水解，传统中药提取采用的先浸泡、后加热提取方法易于促进连翘苷的水解，为此本发明方法废弃浸泡、加热等工序，将连翘叶直接加入到热水中进行提取，有效地降低了原料中水解酶等因素对连翘苷等有效成分的破坏，大大提高了提取液中有效成分的含量。

（2）工艺简单、生产成本低：

①本发明利用连翘苷、连翘酯苷在热水中溶解度的差异，采用简单的浓缩、静置、沉淀的方法即可实现连翘苷和连翘酯苷较大程度的分离，同时得到纯度较高的连翘苷粗提物和连翘酯苷粗提液，其中连翘苷粗提物中连翘苷的纯度可达50%；

②连翘苷粗提物在后续的精制过程中无需使用大孔树脂、氧化铝、硅胶等柱层析方法，仅需使用少量乙酸乙酯提取及乙醇重结晶即可得到纯度高达99%的连翘苷产品，工艺简单可行，产品品质好，生产周期大大缩短；

③连翘酯苷粗提液采用水饱和正丁醇萃取的方法进行精制，得到纯度40%以上的连翘酯苷粗品，不用大孔树脂等柱层析方法即可达到柱层析的效果，方法更简单；而正丁醇还可回收利用，有机溶剂的用量大大减少，生产周期大大缩短。此外，本发明方法显著降低连翘苷和连翘酯苷的生产成本，适合工业化生产。

（3）充分利用天然植物资源：传统中医药以连翘果实入药，而连翘叶中的有效成分连翘苷、连翘酯苷的含量均比果实中的含量高。大量的连翘叶被废弃不用，造成资源的严重浪费。现有技术中仅单一提取连翘苷或连翘酯苷一种，制备方法缺乏应用的综合利用。本发明方法从连翘叶一次同时提取分离精制连翘苷和连翘酯苷两种产品，最大限度利用了资源，对植物资源保护具有重要意义。

附图说明

图1为连翘苷标准品的高效液相图谱；

图2为采用本发明方法制得的连翘苷晶体的高效液相图谱；

图3为采用本发明方法制得的连翘苷晶体的核磁共振图谱；

图4为连翘酯苷标准品的高效液相图谱；

图5为采用本发明方法制得的连翘酯苷产品的高效液相图谱；

图6为采用本发明方法制得的连翘酯苷产品的核磁共振图谱。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

①提取：把5kg连翘叶加入到80℃的水（水量50kg）中超声提取1h，超声功率20KHz，提取2次；

②分离：合并两次所得提取液，过滤分离弃去残渣，滤液减压浓缩（浓缩前后滤液的体积比为8：1）后室温静置15h，然后常压过滤分离沉淀和水层，沉淀为连翘苷粗提物，水层为连翘酯苷粗提液；

③精制连翘苷：将连翘苷粗提物烘干，然后把烘干的200g连翘苷粗提物与乙酸乙酯按重量比1：6混合后55℃回流提取2次，每次40min，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩至干，再经体积浓度95%的乙醇重结晶2次即得白色针状连翘苷晶体24g，用高效液相HPLC检测纯度为99%；

④精制连翘酯苷：将连翘酯苷粗提液用水饱和的正丁醇溶液室温萃取2次，水饱和的正丁醇溶液添加量为连翘酯苷粗液体积的0.8倍，弃去水层，合并每次萃取所得正丁醇有机层，该有机层先减压浓缩至相对密度为1.3，经干燥得纯度41%的连翘酯苷粗品350g。所得连翘酯苷粗品用正相硅胶层析进一步纯化，得到纯度为92%的淡黄色连翘酯苷成品89g。

实施例2

①提取：把10kg连翘叶加入到55℃的水（水量160kg）中进行提取，每次提取1.5h，提取3次；

②分离：合并三次所得提取液，常压过滤分离弃去残渣，滤液减压浓缩（浓缩前后滤液的体积比为12：1）后室温静置48h，然后3000r/min高速离心机离心分离沉淀和水层，沉淀为连翘苷粗提物，水层为连翘酯苷粗提液；

③精制连翘苷：将连翘苷粗提物烘干，然后把烘干的380g连翘苷粗提物与乙酸乙酯按重量比1：4混合后60℃回流提取2次，每次30min，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩至干，再用无水乙醇重结晶一次得白色针状连翘苷晶体50g，用高效液相HPLC检测纯度为99%；

④精制连翘酯苷：将连翘酯苷粗提液用水饱和的正丁醇溶液室温萃取2次，水饱和的正丁醇溶液添加量为连翘酯苷粗液体积的0.5倍，弃去水层，合并每次萃取所得正丁醇有机层，该有机层先减压浓缩至相对密度为1.5，经干燥得纯度43%的连翘酯苷粗品。所得连翘酯苷粗品用反相硅胶层析进一步纯化，得到纯度94%的淡黄色连翘酯苷成品190g。

连翘苷的鉴定：采用本发明方法提取分离得到的连翘苷为白色针状晶体，分子式：C₂₇H₃₄O₁₁，分子量534，分别通过高效液相色谱和核磁共振谱进行鉴定。

（1）高效液相色谱（HPLC）：取少量连翘苷标准品（购自中国生物制品检定所，编号0821-9602）和实施例1所得连翘苷晶体分别用甲醇溶解，进行HPLC分析并比较。HPLC测定条件：仪器型号：Waters 600型高效液相色谱仪，Waters2489型紫外检测器，N2000色谱数据工作站，色谱柱：Sunfire TMC18 (5.0um,4.6mm×150mm)，流动相：乙腈:水（25:75），流速：1ml/min，检测波长：277nm，温度：室温。连翘苷标准品的保留时间为9.032min，谱图结果见图1；制得的连翘苷晶体保留时间为9.015min，谱图结果见图2，两者基本一致。实施例2制得的连翘苷产品的高效液相色谱结果与实施例1相同。

（2）核磁共振谱：将实施例制得的连翘苷成品作碳（¹³C）核磁共振分析，谱图结果见图3。用Bruker DPX-400MHz核磁共振仪测定，TMS为内标。¹³C-NMR的工作频率为100.577 MHz，DMSO为溶剂。使用5mm NMR探头，NMR实验在室温下进行。¹³C-NMR的谱宽为25 000 Hz，数据点为32 000，弛豫延迟为2s。测定结果为：δ:135.4(C-1),110.5(C-2),149.1(C-3),146.1(C-4),115.3(C-5),118.3(C-6),86.9(C-7),49.5(C-8),69.8(C-9),131.4(C-1′),109.5 (C-2′),148.6(C-3′),147.8(C-4′),111.6(C-5′),117.7(C-6′),48.8(C-7′),48.8(C-8′),69.2(C-9 ′),100.2(C-1″),73.4(C-2″),77.1(C-3″),70.5(C-4″),77.2(C-5″),60.9(C-6″),55.8,55.6,54.3 (OMe)，以上数据与文献（Ming DS, Yu DQ, Yu SS.A new compound from Forsythia suspensa.JANPR,1999,(3):221-226.）报道的连翘苷数据一致，可确定本品为连翘苷。

连翘酯苷的鉴定：采用本发明方法提取分离得到的连翘酯苷为淡黄色粉末，分子式：C₂₉H₃₆O₁₅，分子量624，通过高效液相色谱和核磁共振谱进行鉴定。

（1）高效液相色谱（HPLC）：取少量连翘酯苷标准品（购自上海诗丹德生物技术有限公司）和实施例1所得连翘酯苷成品分别用甲醇溶解，进行HPLC分析并比较。HPLC测定条件：仪器型号：Waters 600型高效液相色谱仪，Waters2489型紫外检测器，N2000色谱数据工作站，色谱柱：SunfireTMC18 (5.0um,4.6mm×150mm)，流动相：乙腈:水:醋酸（15:85:0.2），流速：2ml/min，检测波长：332nm，温度：室温。连翘酯苷标准品的保留时间为15.523min，谱图结果见图4；制得的连翘酯苷产品主峰保留时间为15.898min，谱图结果见图5，两者基本一致。实施例2制得的连翘酯苷产品的高效液相色谱结果与实施例1相同。

（2）核磁共振谱：将实施例制得的连翘酯苷成品作碳（¹³C）核磁共振分析，谱图结果见图6。用Bruker DPX-400MHz核磁共振仪测定，TMS为内标。¹³C-NMR的工作频率为100.577 MHz，CD₃OD为溶剂。使用5mm NMR探头，NMR实验在室温下进行。¹³C-NMR的谱宽为25 000 Hz，数据点为32 000，弛豫延迟为2s。测定结果为：δ:131.4(C-1),116.4(C-2),146.1(C-3),144.7(C-4),117.1(C-5),121.3(C-6),36.7(C-7),72.4(C-8),127.7(C-1′),115.2(C-2′), 146.9(C-3′),149.8(C-4′),116.5(C-5′),123.1(C-6′),114.8(C-8′),168.3(C-9′),104.5(C-1″),75.2(C-2″),75.9(C-3″),74.8(C-4″),74.0(C-5″),67.6(C-6″),102.36(C-1″′),72.4(C-2″′),72.3(C-3″′),72.0(C-4″′),69.9(C-5″′),18.0(C-6″′)。以上数据与文献（Kitagawa S,Tsukamoto H,Hisada S et al. Studies on the Chinese drug “Forsythia Fructus”Ⅶ:a new caffeyol glycoside from Forsythia viridissima.Chem Pharm Bull,1984,12(3):1209-1213.）报道的连翘酯苷数据一致，可确定本品为连翘酯苷。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①提取：在60－85℃的水中直接加入连翘叶进行提取，每次提取时间0.5－2h，提取2－4次，连翘叶和水的重量比为1：6－20；

②分离：合并所得提取液，固液分离弃去残渣，滤液减压浓缩后室温静置，分离沉淀和水层，沉淀为连翘苷粗提物，水层为连翘酯苷粗提液；

所得连翘苷粗提物按如下方法精制：将连翘苷粗提物烘干，然后把烘干的连翘苷粗提物与乙酸乙酯按重量比1：2－8混合后回流提取2－4次，合并提取液，减压浓缩至干，再经乙醇重结晶1－4次即得白色针状连翘苷晶体；

所得连翘酯苷粗提液按如下方法精制：将连翘酯苷粗提液用水饱和的正丁醇溶液萃取，弃去水层，有机层经减压浓缩、干燥后得连翘酯苷粗品。

2.根据权利1所述从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，步骤②中减压浓缩前后滤液的体积比为7－15：1，室温静置时间为10－48h。

3.根据权利1所述从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，步骤②中分离采用常压过滤分离、减压过滤分离或离心分离。

4.根据权利1所述从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，所述回流提取时间为20－60min，所用乙醇为无水乙醇或体积浓度90%－99%乙醇。

5.根据权利1所述从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，在萃取时水饱和的正丁醇溶液添加量为连翘酯苷粗提液体积的0.4－1.2倍；萃取次数为1－3次，合并每次萃取所得有机层，该有机层先减压浓缩至相对密度为1.3－1.5，然后干燥得连翘酯苷粗品。

6.根据权利1或5所述从连翘叶中提取连翘苷和连翘酯苷的方法，其特征在于，将得到的连翘酯苷粗品用正相硅胶层析、反相硅胶层析或重结晶方法纯化得连翘酯苷成品。