CN1660184B - 一种含有肿节风提取物的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有肿节风提取物的药物组合物及其制备方法和用途。药物组合物包括肿节风的黄酮类总提取物以及药学上可接受的附加剂。制备方法包括提取肿节风总浸膏、用大孔树脂吸附法分离精制黄酮类总提取物等步骤。用途为治疗原发性及继发性血小板减少性紫癜等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及中草药,具体地说是一种含有中药肿节风提取物的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
肿节风为金粟兰科植物Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai,民间称为草珊瑚、九节茶、接骨木、驳骨茶、骨风消等,为多年生常绿草本或亚灌木。分布于江西、安徽、浙江、湖北、湖南、四川、广东、广西等省区。肿节风全草能祛风清热、活血、止痛、通经、接骨。已有报导肿节风可用于治疗常见炎症性疾病,也用于治疗绦虫病、类风湿性关节炎及预防感冒等,对多种恶性肿瘤如胰腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌和食道癌等效果显著。肿节风主含黄酮苷、氰苷、香豆素、内酯、挥发油及其它多种成分。黄酮类,已知有落新妇苷(astibin);香豆素类有异嗪吡啶。中国发明专利申请(公开号CN1515565A)“肿节风黄酮类香豆素类总提物及其药物组合物和用途”涉及中药肿节风中黄酮类香豆素类总提物及其制备方法和含有该总提物的药物组合物,其中肿节风黄酮类、香豆素类总提物可通过将肿节风进行醇回流提取、醇渗漉提取、水煎煮提取得到,该总提物及其药物组合物可以用于治疗原发性及继发性血小板减少性紫癜,癌症辅助治疗,升白细胞,抗菌,抗肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎等疾病。
发明内容
本发明的目的是要提供一种比已有技术更新、更好的含有肿节风提取物的药物组合物及其制备方法和用途。
本发明的目的可以采取以下方法来实现:
一种含有肿节风提取物的药物组合物,其特征是它包括肿节风的黄酮类总提取物以及药学上可接受的附加剂。
所述的药学上可接受的附加剂是下列的一种或一种以上:蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、微晶纤维素、微粉硅胶、羟丙基纤维素、羧甲淀粉钠、交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、阿斯帕坦、甜菊甙、香精、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸镁、丙烯酸树脂、半合成脂肪酸脂、凡士林、液状石蜡、吐温-80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、聚乙二醇-32甘油月桂酸酯(gelucire44/14)、聚维酮K30。
可以使用制药领域中的常规方法制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾剂、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂等制剂。
制备含有肿节风提取物的药物组合物的方法包括下列步骤:
(1)提取肿节风总浸膏:
(a)回流提取:取肿节风粗粉,加6-10倍量的35-95%乙醇,浸渍1小时后,加热回流提取2-4次,每次1-4小时,回收乙醇,浓缩至每毫升溶液含生药量不少于0.5g;或
(b)渗漉提取:取肿节风粗粉,按照制作流浸膏的渗漉法,用25-95%乙醇作溶剂,浸渍后,以1-7ml/分钟的速度进行渗漉,收集渗漉液,回收乙醇,浓缩至每毫升含生药量不得少于0.5g;或
(c)煎煮提取:取肿节风药材加6-10倍量水煎煮,每次1-3小时,滤过,滤液合并,浓缩,浓缩至相对密度约1.01以上(55-60℃);
(2)分离精制:
取肿节风总浸膏,用水稀释后,用恒流泵泵入大孔吸附树脂12-1柱进行吸附;
用3倍柱体积水洗柱,洗柱液与吸附时流出液合并为溶液A;
水洗后用洗脱剂洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积,树脂重复使用2-5次;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为香豆素部位(I);
将香豆素部位分离后的溶液A泵入大孔吸附树脂吸附柱进行吸附,大孔树脂可用24-6、LD605、LD606、LD607、D4006、AB-8、HPD100、HPD300、HPD400、HPD500或HPD600,肿节风总黄酮上样浓度为3-15mg/ml,上样吸附流速为0.5-2.5ml/min;
吸附完毕,用3倍柱体积的水洗柱,洗柱液与吸附时的流出液合并,干燥得固形物,即为多糖部位(III);
大孔吸附树脂吸附柱用洗脱液洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为总黄酮部位II,精制后的黄酮类提取物的干燥方法可以采用烘干法、真空干燥法或喷雾干燥法。
采用所述的大孔吸附树脂12-1和HPD400的组合应用。
所述的大孔吸附树脂为12-1和HPD400,所述的吸附、分离肿节风总黄酮的最佳工艺条件为:所述的肿节风总黄酮上样浓度为10mg/ml,吸附流速为2.5ml/min,先用12-1大孔吸附树脂吸附去除异嗪吡啶等无效成分,12-1树脂柱的过柱液及水洗液合并为A,A液再泵入HPD400大孔吸附树脂柱,肿节风总黄酮最大吸附量为9.5mg/ml,上样吸附流速为2.5ml/min,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍柱体积,树脂可重复使用3次。
一种含有肿节风提取物的药物组合物在治疗原发性及继发性血小板减少性紫癜疾病的用途。
一种含有肿节风提取物的药物组合物在治疗咽喉炎、支气管炎、肺炎、阑尾炎、胆囊炎、蜂窝组织炎的用途。
一种含有肿节风提取物的药物组合物在作为抗菌药物的用途。
一种含有肿节风提取物的药物组合物在升自细胞、癌症辅助治疗的用途。
由于本发明采取了上述的技术措施,使得本发明对比已有技术有了更突出的实质性特点,药物有效率更高,肿节风黄酮类总提取物的提取、分离精制工艺更科学,研制出了高效、安全、质量可控的肿节风有效部位,并对其抗原发性和继发性血小板减少性紫癜进行了药效学研究,填补了肿节风研究中的空白。
具体实施方式
以下结合实施例详细描述本发明的实施方案。
本发明的中药肿节风黄酮类总提取物可以通过将肿节风进行醇回流提取、醇渗漉提取或水煎煮提取得到,其中:
醇回流提取方法是:取肿节风药材粗粉,用35%-95%乙醇6-10倍量作溶剂,浸渍1小时后,加热回流提取2-4次,每次1-4小时,回收乙醇,浓缩液经大孔树脂吸附处理,干燥,即得总提物;
醇渗漉提取方法是:取肿节风粗粉,用25%-95%乙醇作溶剂,浸渍后,以1-7ml/分钟的速度进行渗漉,收集渗漉液,回收乙醇;浓缩液经大孔树脂吸附处理,干燥,即得总提物;
煎煮提取的方法是:取肿节风药材加6-10倍量水煎煮,每次1-3小时,滤过,滤液合并,浓缩,浓缩液经大孔树脂吸附处理,干燥即得总提取物。
本发明制备方法的操作步骤及其特点描述如下:
一.提取肿节风总浸膏
1、回流提取:取肿节风粗粉一加6-10倍量的35-95%乙醇,浸渍1小时后,加热回流提取2-4次,每次1-4小时,回收乙醇浓缩至每毫升溶液含生药量不得少于0.5g。
2、渗漉提取:取肿节风粗粉,照流浸膏及浸膏剂项下的渗漉法(《中国药典》2000版一部附录IO),用25-95%乙醇作溶剂,浸渍后,以1-7ml/分钟的速度进行渗漉,收集渗漉液,回收乙醇;浓缩至每毫升含生药量不得少于0.5g。
3、煎煮提取:取肿节风药材加6-10倍量水煎煮2-3次,每次1-3小时,滤过,滤液合并,浓缩,浓缩至相对密度约1.01以上(55-60℃)。
总黄酮含量测定:
对照品溶液制备:精密称取105℃减压干燥至恒重的芦丁对照品100mg,置100ml容量瓶中,加60%乙醇70ml,置水浴上微热溶解,放冷,加60%乙醇稀释至刻度,摇匀,精密吸取10ml,置50ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。
标准曲线制备:
精密吸取对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,与6.0ml分别置25ml量瓶中,各加水5ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,用6ml水同法作空白,照分光光度法在500nm的波长处测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
供试品溶液制备:精密称取总提物20mg,置25ml容量瓶中,加70%乙醇10ml,溶解,加水稀释定容至刻度,摇匀,即得。精密吸取1ml,置25ml量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“各加水5ml”起依法操作,以供试品溶液1ml,加水稀释至25ml作空白,过滤,取滤液依法测定吸收度,从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量,计算,即得。
经测定,其地上部分回流提取每克生药含总黄酮类以芦丁计算含14.76毫克,煎煮提取每克生药含总黄酮类以芦丁计算含11.35毫克。
异嗪吡啶含量测定:
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)为流动相;检测波长344nm。理论塔板数按异嗪吡啶峰计算应不低于1200。
对照品溶液的制备:精密称取异嗪吡啶对照品适量,加入甲醇制成每1ml含4μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:精密称取总提取物20mg,置25ml容量瓶中,加水10ml,超声处理(功率300W,25kHz)10min,转移至分液漏斗中,加乙酸乙酯提取5次,每次10ml,合并乙酸乙酯提取液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至25ml的溶量瓶中,用甲醇定溶,摇匀,用0.22μm微孔滤膜过滤,作为样品溶液。
取对照品溶液和样品溶液各20μl注入高效液相色谱仪,以对照样峰面积为参照,样品溶液可适当稀释使对照峰面积与样品峰面积相当,通过峰面积的换算,计算样品的异嗪吡啶含量。
经测定,其地上部分回流提取每克生药含异嗪吡啶0.34毫克,前煮提取每克生药含异嗪吡啶0.25毫克。
二.分离精制
本发明制备方法中得到的提取物经分离精制,可以用效地去除杂质,将黄酮类成分与香豆素类成分异嗪吡啶分开,明显地提高总提取物的活性和药效。本发明分离精制方法为大孔树脂吸附法。下面对分离精制方法及其特点作进一步说明。
肿节风浸膏样品溶液的制备:取肿节风总浸膏72g用水稀释至1200ml,得肿节风浸膏样品溶液。
树脂的预处理:以乙醇湿法装柱,用95%乙醇洗脱,检查乙醇流出液,至乙醇流出液与水混合(1∶1 v/v)不呈白色浑浊为止,然后用大量的蒸馏水洗去乙醇。取出树脂备用。
吸附量的测定:准确移取2ml各种经预处理树脂于50ml具塞锥形瓶中,精密加入30ml肿节风浸膏样品溶液。室温于空气浴振荡器中振荡24小时(振荡频率为140转/分钟)。充分吸附后,过滤,测定滤液中的总黄酮含量,按下式计算各树脂室温下的吸附量(mg/ml),结果见表1。
Q=(C0-Cr)×V1/V2
式中:Q为吸附量(mg/ml),C0为起始浓度(mg/ml),Cr为剩余浓度(mg/ml),V1为溶液体积(ml),V2为树脂体积(ml)。
表1吸附树脂对肿节风总黄酮的吸附量(mg/ml),20℃
树脂 | 吸附量 | 树脂 | 吸附量 |
12-1 | 173 | AB-8 | 177 |
24-6 | 175 | HPD100 | 179 |
LD605 | 175 | HPD300 | 179 |
LD606 | 176 | HPD400 | 179 |
LD607 | 177 | HPD500 | 178 |
D4006 | 176 | HPD600 | 177 |
从表1可见,各树脂在达到饱和吸附后,吸附量几乎没有差异。
解吸率的测定:吸附树脂在分离中药有效成分方面的应用是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于树脂极性不同,解吸难易亦不同。因此,解吸剂及其解吸率的测定是树脂筛选试验的重要环节。
取充分吸附后的树脂,分别精密加入50%乙醇、95%乙醇、甲醇各20ml,浸泡振荡20小时,滤过,测定滤液总黄酮浓度,根据吸附量计算解吸率(%),结果见表2。
表2不同吸附剂对肿节风总黄酮的解吸率(%),20℃
树脂 | 50%乙醇 | 95%乙醇 | 甲醇 |
12-1 | 14.1 | 12.0 | 11.3 |
24-6 | 22.6 | 19.0 | 19.6 |
LD605 | 21.6 | 17.6 | 19.0 |
LD606 | 35.7 | 29.9 | 34.5 |
LD607 | 34.0 | 34.0 | 36.6 |
D4006 | 31.1 | 25.4 | 26.8 |
AB-8 | 32.1 | 30.0 | 32.8 |
HPD100 | 41.8 | 38.8 | 43.2 |
HPD300 | 45.0 | 41.4 | 42.2 |
HPD400 | 54.2 | 41.4 | 43.1 |
HPD500 | 36.0 | 36.0 | 36.0 |
HPD600 | 31.4 | 34.6 | 34.2 |
表2结果表明,各树脂对总黄酮的解吸率差异较大,且溶剂不同解吸率亦不同,溶剂的浓度与种类对肿节风总黄酮的解吸具有很大的选择性。其中HPD400对肿节风总黄酮的解吸率较高。
HPD400树脂纯化分离肿节风总黄酮的工艺参数的考察:
上样浓度的确定:将不同浓度的肿节风总黄酮溶液分别通过HPD400大孔吸附树脂柱,进行动态吸附。用1%的FeCl3乙醇溶液检测流出液,待反应呈阳性时,停止上样,记录上样量,计算总黄酮吸附量。结果见表3。
表3上样浓度的确定
上样浓度(mg/ml) | 总黄酮吸附量(mg/ml) |
3 | 7.4 |
7 | 15.9 |
10 | 24.6 |
15 | 18.2 |
从表3可知,上样浓度以10mg/ml为佳。
吸附流速的确定:将浓度为10mg/ml的肿节风样品溶液通过HPD400树脂柱,分别以0.5、1.6、2.5ml/min的流速进行动态吸附。用1%的FeCl3乙醇溶液检测流出液,待反应呈阳性时,停止上样,记录上样量,计算总黄酮吸附量。树脂柱依次用水、70%乙醇洗脱。收集乙醇洗脱液蒸干,称重,测定总黄酮含量,计算总黄酮回收率。结果见表4。
表4吸附流速的考察
上样流速ml/min | 总黄酮吸附量mg/ml | 总黄酮回收率% | 醇洗物总黄酮含量% |
0.5 | 10.8 | 96 | 95 |
1.6 | 9.5 | 86 | 96 |
2.5 | 9.5 | 93 | 94 |
综合考虑表4的数据及工艺的可行性,确定上样流速以2.5ml/min为宜。
穿透曲线的考察:按上述确定的上样条件,取肿节风样品溶液通过HPD400树脂柱,进行动态吸附,用1%的FeCl3乙醇溶液检测流出液,待反应呈阳性时,每10ml收集1份,共收集35份。每份进行总黄酮含量测定。结果见表5。
表5穿透曲线的考察
流份(序号) | 总黄酮含量mg/ml |
1 | 0.17 |
2 | 0.70 |
3 | 0.94 |
8 | 1.16 |
13 | 2.6 |
18 | 3.91 |
23 | 5.50 |
28 | 6.66 |
35 | 8.95 |
从表5结果可见,流出液收集的第1份与第2份的总黄酮含量差别很大,即形成穿透拐点,亦即流出液检测呈阳性反应时,为该条件下的树脂最大吸附量9.5mg/ml。洗脱剂的确定:按上述确定的上样条件,取肿节风样品溶液分别通过4根HPD400树脂柱,进行动态吸附。4根树脂柱分别用水洗脱至洗脱液无色,再分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱至用1%的FeCl3乙醇溶液检测呈阴性。将乙醇洗脱液分别蒸干,称重,测定总黄酮含量。计算总黄酮回收率。结果见表6。
表6洗脱剂的选择
洗脱剂 | 洗脱剂用量ml | 总黄酮回收率% |
30%乙醇 | 200 | 84.4 |
50%乙醇 | 135 | 92.5 |
70%乙醇 | 86 | 93.4 |
90%乙醇 | 60 | 82.4 |
洗脱剂可用甲醇、乙醇等。本着安全,无公害的原则。选择乙醇作洗脱剂。从表6可知,70%乙醇洗脱物中,总黄酮回收率最高,故确定70%乙醇为最佳洗脱剂。
洗脱曲线的考察:按上述确定的吸附和洗脱条件,取肿节风样品溶液进行上样、吸附和洗脱,分段收集洗脱液。每10ml收集1份,共收集11份。测定每份中的总黄酮含量。结果见表7。
表7不同流份洗脱液中总黄酮含量
流份(序号) | 总黄酮含量mg/ml | 流份(序号) | 总黄酮含量mg/ml |
1 | 0.12 | 7 | 0.86 |
2 | 0.25 | 8 | 0.46 |
3 | 10.70 | 9 | 0.21 |
4 | 12.50 | 10 | 0.13 |
5 | 4.38 | 11 | 0.07 |
6 | 1.90 |
从表7可知,第1流份与第10流份的黄酮含量相当,即至第10流份黄酮已洗脱完全。以树脂柱体积计,约为3倍柱体积可完全洗脱肿节风中的总酮。
树脂重复使用次数考察:按上述确定的吸附、洗脱条件,取肿节风样品溶液进行上柱、吸附和洗脱,在同一根树脂柱上重复操作5次,分别计算5次总黄酮的吸附量,结果见表8。
表8树脂重复使用次数考察
次数 | 总黄酮吸附量mg/ml | 总黄酮回收率% |
第1次 | 7.9 | 94 |
第2次 | 5.8 | 94 |
第3次 | 5.3 | 83 |
第4次 | 5.3 | 74 |
第5次 | 4.6 | 74 |
从表8可知,上样次数越多,总黄酮吸附量越低,总黄酮的回收率亦越低。综合考虑总黄酮的吸附量及总黄酮的回收率在85%左右,树脂柱重复使用3次后,树脂柱必须再生才可继续使用。
各大孔吸附树脂对肿节风总酮的最大吸附能力差别不大,但各树脂在不同溶剂中的解吸性能却有很大差异。HPD400树脂表现出较好的解吸性能,其吸附、分离肿工风总黄酮的工艺条件为:肿节风总黄酮上样浓度为10mg/ml,肿节风总黄酮最大吸附量为9.5mg/ml,吸附流速为2.5m/ml,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍柱体积,树脂可重复使用3次。
黄酮类与香豆素类异嗪吡啶的分离:通过对吸附解吸物的指纹图谱研究,大孔吸附树脂12-1对黄酮类成份吸附很弱,面对异嗪吡啶吸附较强。取50ml肿节风总浸膏,用水20倍稀释后,再用恒流泵泵入大孔吸附树脂12-1柱(45×445mm)进行吸附。用3倍柱体积水洗柱,洗柱液与吸附时流出液合并为溶液A。水洗后用3倍柱体积70%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇,干燥得固形物即为香豆素部位(I)。将香豆素部位分离的溶液A泵入HPD400吸附柱(2.6×800mm)进行吸附。吸附完毕,用3倍柱体积的水洗柱。洗柱液与吸附时的流出液合并,干燥得固形物即为多糖部位(III)。HPD400吸附柱用3倍柱体积70%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇,干燥得固形物即为总黄酮部位II。
大孔吸附树脂分离的各部位的固体量、总黄酮含量及异嗪吡啶含量结果:
三、干燥方法
本发明分离精制后的黄酮类提取物可以采用烘干法、真空干燥法、喷雾干燥法。烘干法、真空干燥法干燥时间长,真空干燥前须在水浴上预干燥,将水分控制在20%以内,真空干燥时易拉干成蜂窝状,干燥可在2-3天内完成,反之,含水量高,真空干燥时会溢出,而烘干法所需时间更长。喷雾干燥时间短,可在数小时内完成。三种方法如何选择,可视实际条件。
四、药效学实验
药品与试剂:强的松2mg/ml,湖北中天爱百颗药业有限公司(原湖北制药厂),批号:20030501;血康口服液10ml/支,江西天施康中药股份有限公司贵溪分公司,批号:20030725;肿节风浸膏1.2g生药/ml,江西江中药业股份有限公司,批号:0304001;部位I 5.8mg/ml;部位II 13mg/ml;部位III 27mg/ml;皮内注射用卡介苗,上海生物制品研究所,批号:2002041101;冻干酶联A蛋白纯品,上海生物制品研制所,批号20030501。
动物:BALB/C小鼠,体重18-22g,雌雄兼用,由江西医学院实验动物中心提供,合格证号:021-9602;豚鼠,大于3周龄,雌雄兼用,江西博雅生物制品有限公司提供。仪器:AC-900型全自动血球仪,江西中医学院附属医院提供;DG3022型酶联免疫检测仪,中国人民解放军第四军医大学、国营华东电子管厂联合研制。
方法:
肿节风浸膏的分离:根据分离目的,筛选出适合分离目的两种大孔吸附树脂。利用该两种大孔吸附树脂,我们将肿节风浸膏分为香豆素部位(I)、总黄酮部位(II)、多糖部位(III)三个作用部位。
抗原的制备:取BALB/C小鼠断头取全血,肝素抗凝,800r/min离心10分钟后,取上层富含血小板血浆(PRP)再3000r/min离心10分钟以沉淀血小板。用0.15mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血小板,每次均以3000r/min离心10分钟,弃去上层液体,连续3次。然后以0.15mol/LpH7.4PBS悬浮血小板,计数后备用。
免疫方法:取上述制备好的BALB/C小鼠血小板分别与等量完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂混合成油包水型乳剂。取完全弗氏佐剂抗原于0周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背部、腋窝等处,至少四点,每点0.2ml。取不完全弗氏佐剂抗原于1、2、4周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背部、腋窝等处,每次至少四点,每点0.2ml。每次注射完后在注射点用碘酒消毒以防感染。第五周乙醚麻醉豚鼠,股动脉取不抗凝全血,室温放置1小时,然后置4℃过夜,此时血清已与血块分离,吸出血清,1500r/min离心20分钟,取上清液即为豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清(GP-APS),贮存于-20℃冰箱中待用。抗血清(APS)效价的检测:参照ELISA法[5]加以改进,用国产冻干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶-蛋白A酶标抗体,原理相同。
抗血清(APS)的处理:将APS从-20℃中取出,于56℃水浴30分钟,用等量BALB/C小鼠红细胞(5%)吸附至少两次,用生理盐水稀释成1∶4的APS待用。
免疫性血小板减少性紫癜小鼠动物模型的建立:根据预试情况加以改进于0、2、3、5、6、7天分别于BALB/C小鼠腹腔注射1∶4稀释的APS,每天1次,每次100ul,同时在注射点用碘酒消毒,造成小鼠慢性持续性血小板减少。
肿节风及其I、II、III部位对免疫性血小板减少性紫癜小鼠动物模型的作用:取BALB/C小鼠160只,体重18-22g,雌雄各半,随机分成8组,每组20只,即正常对照组,模型组,强的松组,血康口服液组,肿节风浸膏组,部位I组,部位II组,部位III组。各给药组灌胃给药,正常对照组、模型组灌等体积的生理盐水,每天1次,连续3天后,除正常对照组外其它各组于0、2、3、5、6、7天分别腹腔注射1∶4稀释的APS,每天1次,每次100ul,同时在注射点用碘酒消毒,建立免疫性血小板减少性紫癜小鼠动物模型,正常组腹腔注射同体积的生理盐水。同时各给药组灌胃给药,正常对照组、模型组灌等体积的生理盐水,每天1次。除血康口服液组每次灌胃量为0.2ml/10g外,其它各组每次灌胃量均为0.1ml/10g。造摸第8天,将各组动物禁食12小时。至造模第9天,称体重、给药1小时后将各组动物用玻璃毛细管于眼眶静脉取血作外周血象检测,观察血小板数(PLT)、白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)的变化。最后将各组动物处死取脾脏、肾上腺、胸腺称重,将所得重量与体重相比即为脏器系数。实验结果用t检验法进行统计。
结果:
抗血清(APS)效价:经检测,抗血清按1∶4浓度稀释时,效价基本不变。
肿节风及其部位1、II、III对免疫性血小板减少性紫癜小鼠外周血象的影响:小鼠注射APS造模后,模型组的血小板数明显降低与正常对照组比较有极显著差异(P<0.01),说明免疫性血小板减少性紫癜小鼠动物模型的建立。白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量与正常对照组比较无明显变化,说明经过预处理过的APS除血小板减少外其它细胞组织不受影响。强的松、有效部位II可明显升高血小板数达到正常对照组的水平与模型组比较有极显著差异(P<0.01)。血康口服液、肿节风浸膏能升高血小板数但达不到正常对照组的水平与模型组比较有显著差异(P<0.05)。强的松能使外周白细胞数明显降低与正常对照组比较有极显著差异(P<0.01)。部位I、III组动物血小板数与模型组对比无显著差异(见表1)。
表1肿节风及其部位I、II、III对免疫性血小板减少性紫癜小鼠外周血象的影响( x±s,n=20)
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01。与模型组比较ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
肿节风及其部位I、II、III对免疫性血小板减少性紫癜小鼠脾脏、肾上腺、胸腺重量的影响:小鼠注射APS造模后,模型组动物脾脏显著增大与正常对照组比较有极显著差异(P<0.01),各给药组仅强的松组动物脾脏得到恢复接近正常动物水平。除部位I组、部位III组动物肾上腺重量有明显增加外,其它各组动物肾上腺重量没有明显变化。强的松组动物胸腺重量明显下降与正常对照组比较有极显著差异(P<0.01),部位I组、部位II组、部位III组动物胸腺重量明显增重与正常对照组比较有极显著差异(P<0.01)(见表2)。
表2肿节风及其部位I、II、III对免疫性血小板减少性紫癜小鼠脾脏、肾上腺、胸腺重量的影响( x±s,n=20)
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01。与模型组比较ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
免疫性血小板减少性紫癜(ITP)为临床常见的血小板减少所致的出血性疾病。已知由于体内产生抗自身血小板抗体,导致血小板寿命缩短,在网状内皮系统大量破坏,临床出现外周血小板减少,骨髓巨核细胞增多伴成熟障碍为特征,以全身皮肤、粘膜甚至内脏出血为表现的自身免疫性疾病。文献报道采用阿糖胞苷、环磷酰胺诱发血小板减少的模型,肿节风抗血小板减少的作用。本文采用注射外源性抗体法造成动物免疫性血小板减少的模型,首次研究肿节风对免疫性血小板减少性紫癜小鼠模型的血小板的作用。研究结果显示强的松、血康口服液、肿节风浸膏、肿节风分离部位II(总黄酮部分)都具有提升血小板数的作用,但强的松和部位II(总黄酮部分)疗效更好能使模型动物的血小板数恢复到正常水平。说明肿节风分离部位II(总黄酮部分)为抗免疫性血小板减少性紫癜的有效部位。强的松组动物白细胞数、胸腺重量明显下降且胸腺有多数出现严重萎缩,而肿节风及其分离部位则未出现萎缩。临床研究证明激素治疗免疫性血小板减少性紫癜的近期疗较好,而远期疗效较差。由于慢性ITP具有反复发作倾向,长期应用激素则有明显的副作用,而中药具有疗效稳定,无明显的副作用的优点显示出了广阔的应用前景。
给大鼠灌胃肿节风黄酮类提取物,能明显缩短大鼠断尾出血时间及凝血血时间,加强血小板的收缩功能,对抗兔血栓形成,对正常鼠、狗血小板量无明显影响,对用环磷酰胺、辐射所致鼠、狗血小板、白细胞减少有明显的提升作用,对苯、二甲苯所致鼠、狗血小板、白细胞减少有明显的提升作用,并使之恢复正常。
能增加小鼠免疫器官重量指数,抗炎作用试验表明肿节风黄酮类提取物高、中、低剂量组能抑制二甲苯引起的耳肿胀;抑制角叉菜胶致鼠的足跖肿胀;对棉球肉芽仅呈抑制趋势,与正常对照组比较无统计学差异。体外抗菌试验,采用金葡球菌、表皮葡萄球菌、甲链球菌、棒状杆菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、白色念球菌、及脆弱类杆菌等11种117株菌,经MIC和MBC试验表明肿节风黄酮类提取物有不同程度的抗菌作用。
Claims (6)
1.一种含有肿节风提取物的药物组合物,其特征是它由肿节风的黄酮类总提取物以及药学上可接受的附加剂组成,所述黄酮类总提取物通过下述方法制备:
(1)提取肿节风总浸膏:
(a)回流提取:取肿节风粗粉,加6-10倍量的35-95%乙醇,浸渍1小时后,加热回流提取2-4次,每次1-4小时,回收乙醇,浓缩至每毫升溶液含生药量不少于0.5g;或
(b)渗漉提取:取肿节风粗粉,按照制作流浸膏的渗漉法,用25-95%乙醇作溶剂,浸渍后,以1-7ml/分钟的速度进行渗漉,收集渗漉液,回收乙醇,浓缩至每毫升含生药量不得少于0.5g;或
(c)煎煮提取:取肿节风药材加6-10倍量水煎煮2-3次,每次1-3小时,滤过,滤液合并,浓缩,浓缩至相对密度1.01以上,55-60℃;
(2)分离精制:
取肿节风总浸膏,用水稀释后,用恒流泵泵入大孔吸附树脂12-1柱进行吸附;
用3倍柱体积水洗柱,洗柱液与吸附时流出液合并为溶液A;
水洗后用洗脱剂洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积,树脂重复使用2-5次;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为香豆素部位(I);
将香豆素部位分离后的溶液A泵入大孔吸附树脂吸附柱进行吸附,大孔树脂可用LD605、LD606、LD607、D4006、AB-8、HPD100、HPD300、HPD400、HPD500或HPD600,上样浓度为3-15mg/ml,上样流速为0.5-2.5ml/min;
吸附完毕,用3倍柱体积的水洗柱,洗柱液与吸附时的流出液合并,干燥得固形物即为多糖部位(III);
大孔吸附树脂吸附柱用洗脱剂洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为总黄酮部位(II),精制后的黄酮类提取物的干燥方法可以采用烘干法、真空干燥法或喷雾干燥法。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征是所述的药学上可接受的附加剂是下列的一种或一种以上:蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、微晶纤维素、微粉硅胶、羟丙基纤维素、羧甲淀粉钠、交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、阿斯帕坦、甜菊甙、香精、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸镁、丙烯酸树脂、半合成脂肪酸脂、凡士林、液状石蜡、吐温-80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、聚乙二醇-32甘油月桂酸酯、聚维酮K30。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征是可以是片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾剂、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
4.一种制备含有肿节风提取物的药物组合物的方法,其特征是它包括下列步骤:
(1)提取肿节风总浸膏:
(a)回流提取:取肿节风粗粉,加6-10倍量的35-95%乙醇,浸渍1小时后,加热回流提取2-4次,每次1-4小时,回收乙醇,浓缩至每毫升溶液含生药量不少于0.5g;或
(b)渗漉提取:取肿节风粗粉,按照制作流浸膏的渗漉法,用25-95%乙醇作溶剂,浸渍后,以1-7ml/分钟的速度进行渗漉,收集渗漉液,回收乙醇,浓缩至每毫升含生药量不得少于0.5g;或
(c)煎煮提取:取肿节风药材加6-10倍量水煎煮2-3次,每次1-3小时,滤过,滤液合并,浓缩,浓缩至相对密度1.01以上,55-60℃;
(2)分离精制:
取肿节风总浸膏,用水稀释后,用恒流泵泵入大孔吸附树脂12-1柱进行吸附;
用3倍柱体积水洗柱,洗柱液与吸附时流出液合并为溶液A;
水洗后用洗脱剂洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积,树脂重复使用2-5次;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为香豆素部位(I);
将香豆素部位分离后的溶液A泵入大孔吸附树脂吸附柱进行吸附,大孔树脂可用LD605、LD606、LD607、D4006、AB-8、HPD100、HPD300、HPD400、HPD500或HPD600,上样浓度为3-15mg/ml,上样流速为0.5-2.5ml/min;
吸附完毕,用3倍柱体积的水洗柱,洗柱液与吸附时的流出液合并,干燥得固形物即为多糖部位(III);
大孔吸附树脂吸附柱用洗脱剂洗脱,洗脱剂为甲醇或30-90%的乙醇,洗脱剂用量为2-4倍柱体积;
收集洗脱液,回收醇,干燥得固形物,即为总黄酮部位(II),精制后的黄酮类提取物的干燥方法可以采用烘干法、真空干燥法或喷雾干燥法。
5.根据权利要求4所述的药物组合物的制备方法,其特征是采用所述的大孔吸附树脂12-1和HPD400的组合应用。
6.根据权利要求4所述的药物组合物的制备方法,所述的大孔吸附树脂为12-1和HPD400,所述的吸附、分离肿节风总黄酮的最佳工艺条件为:肿节风总黄酮上样浓度为10mg/ml,吸附流速为2.5ml/min,先用12-1大孔吸附树脂吸附去除异嗪吡啶无效成分,12-1树脂柱的过柱液及水洗液合并为A,A液再泵入HPD400大孔吸附树脂柱,肿节风总黄酮最大吸附量为9.5mg/ml,上样吸附流速为2.5ml/min,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍柱体积,树脂可重复使用3次。
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