CN101156907B - 一种葛根芩连提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种葛根芩连提取物,该提取物是将葛根、黄芩、黄连、甘草四味药物按8∶3∶3∶2的重量比混合,提取有效部位并精制后得到,其中含有如下重量百分比的主要有效部位:葛根总异黄酮13.5~21.0%,黄芩总黄酮20.5~32.5%,黄连总生物碱10.5~18.5%,甘草酸2.0~5.0%。本发明提取物加入药用辅料,采用常规的方法可制备出治疗菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻的各种口服制剂。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,具体涉及中药复方提取物,特别是葛根芩连提取物。
背景技术
葛根芩连汤出自《伤寒论.太阳篇》,为医圣张仲景名方,由葛根24g、黄芩9g、黄连9g、甘草6g水煎而成,有解表清里,升清止利之功效,主要用于治疗“协热下利”症,对菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻等有良好疗效。2005版药典收载该方的制剂有葛根芩连片、微丸,但这些制剂直接以原药材粉末或药材的粗提取物、浸膏等制成,提取工艺简单,方中各有效成分含量低,质量难以控制,不能保证疗效稳定。
国知局2006年10月25日公开了一项“葛根芩连汤的制备方法”的发明专利申请(申请号为200610038718.5),该申请公开了一种制备葛根芩连汤的方法,该方法具体是以水为溶剂,将葛根、黄芩、甘草合煎、黄连单煎,喷雾干燥后按比例混合,即可。用该方法制备葛根芩连汤,药材中的葛根素、黄芩苷和小檗碱的转移率达到65%以上,但是该方法对药材仍采用粗提方法,所得提取物中含有较多杂质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效成分含量高的葛根芩连提取物,以便于控制产品质量,保证疗效稳定。
本发明解决上述技术问题的技术方案是:
一种葛根芩连药物提取物,该提取物中含有以下重量百分比的主要活性物质:
葛根总异黄酮13.5~21.0%,黄芩总黄酮20.5~32.5%,黄连总生物碱10.5~18.5%,甘草酸2.0~5.0%;所述的提取物由下列方法制得:
(1)按葛根∶黄芩∶黄连∶甘草=8∶3∶3∶2的重量比取原料药混合,加6~12倍水煎煮0.5~1.5h,过滤,滤渣中再加入4~10倍水煎煮0.5~1.5h,过滤,合并两次滤液,浓缩至原体积的1/4~1/3,加浓盐酸调pH1~2,静置12~24h,分离沉淀物和上清液;取沉淀物水洗至pH5~6备用;上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.10~1.20,加乙醇至含醇量为65~75%,过滤,滤液浓缩至药材重量的1/3~1/2,得浓缩液备用。
(2)取浓缩液通过大孔树脂柱,其中树脂用量为药材用量的1.3~3.0倍;先以4~6倍柱体积去离子水洗脱,再以3~5倍树脂体积的40%~70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与步骤(1)所得的沉淀物混合,烘干即得。
本发明所述的葛根芩连提取物,该提取物的制备方法由下列步骤组成:
(1)按葛根∶黄芩∶黄连∶甘草=8∶3∶3∶2的重量比取原料药混合,加6~12倍水煎煮0.5~1.5h,滤过,滤渣中再加入4~10倍水煎煮0.5~1.5h,滤过,合并两次滤液,浓缩至原体积的1/4~1/3,加浓盐酸调pH1~2,静置12~24h,分离沉淀物和上清液;取沉淀物水洗至pH5~6备用;上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.10~1.20,加乙醇至含醇量为65~75%,过滤,滤液浓缩至药材重量的1/3~1/2,得浓缩液备用。
(2)取浓缩液通过大孔树脂柱,其中树脂用量为药材用量的1.3~3.0倍;先以4~6倍柱体积去离子水洗脱,再以3~5倍树脂体积的40%~70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与步骤(1)所得的沉淀混合,烘干即可。
本发明所述的提取物中主要有效部位的含量测定方法如下所述:
1、黄连总生物碱
对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加乙醇制成每1ml含10μg的溶液。
供试品溶液的制备:精密称取提取物0.3g,置于100ml容量瓶中,加乙醇适量,70℃水浴10min,超声30min,放至室温,加乙醇稀释至100ml,摇匀,滤过,取续滤液1ml,置于中性氧化铝柱(内径约7mm,长120mm,4g氧化铝)上,以25ml乙醇洗脱,收集洗脱液,乙醇定容至25ml。
测定法:用紫外分光光度法,以乙醇为空白,测定对照品溶液和供试品溶液在350nm处吸光度,根据吸光度计算黄连总生物碱的含量。
2、葛根总异黄酮
对照品溶液的制备:取葛根素对照品适量,精密称定,加乙醇制成每1ml含10μg的溶液。
供试品溶液的制备:精密称取提取物0.1g,置于100ml容量瓶中,加乙醇适量,70℃水浴10min,超声30min,放至室温,加乙醇稀释至100ml,摇匀,滤过,取续滤液1ml,置于中性氧化铝柱(内径约7mm,长120mm,4g氧化铝)上,先以25ml乙醇洗脱,再用35ml水饱和正丁醇洗脱,收集正丁醇洗脱液,蒸干,残渣加乙醇溶解,定容至25ml。
测定法:用紫外分光光度法,以乙醇为空白,测定对照品溶液和供试品溶液在250nm处吸光度,根据吸光度计算葛根总异黄酮的含量。
3、黄芩总黄酮
对照品溶液的制备:取黄芩苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液。
供试品溶液的制备:精密称取提取物0.02g,置于100ml容量瓶中,加甲醇适量,70℃水浴10min,超声30min,放至室温,加甲醇稀释至100ml,摇匀,滤过,取续滤液5ml至50ml容量瓶中,加甲醇定容,摇匀。
测定法:采用差示紫外分光光度法。取供试品溶液2ml两份,置于甲、乙两个25ml容量瓶中,甲瓶中精密加入5%ALCL3甲醇溶液10ml,摇匀,加甲醇稀释至刻度,摇匀,放置30min;乙瓶加甲醇溶液稀释至刻度;甲瓶溶液以5%ALCL3甲醇溶液为空白溶液,乙瓶溶液以甲醇为空白溶液测定339nm处吸光度,计算甲乙两瓶溶液的吸光度之差,同时同法测定对照品溶液的吸光度之差,根据样品及对照品吸光度之差计算黄芩总黄酮的含量。
4、甘草酸
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇∶0.02mol/L乙酸铵∶冰醋酸(66∶33∶1)为流动相;检测波长254nm;理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备:取甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含50μg的溶液。
供试品溶液的制备:精密取提取物1.0g,置于100ml容量瓶中,加甲醇适量,70℃水浴10min,超声30min,放至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
测定法:分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算。
本发明提取物加入药用辅料,采用常规的方法可制备出治疗菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻的各种口服制剂。根据不同制剂的要求,添加不同的药用辅料可制备成普通片剂、分散片、胶囊剂、颗粒剂、微丸、软胶囊。
本发明提取物的原料配方虽然出自传统方药葛根芩连汤,但是将粗提物的有效部位再进一步纯化,所得到的有效部位——葛根总异黄酮、黄芩总黄酮、黄连总生物碱、甘草酸的含量显著提高、药品质量及疗效均稳定。
下面将通过动物实验来证明本发明的优点,以下实验中所用到的本发明提取物均为制备例2所述的提取物。
1.抗腹泻试验
取SPF级昆明小鼠,18-22克,雌雄各半,随机分5组:模型对照组(空白对照组)、黄连素(阳性对照组)、葛根芩连微丸对照组(每克微丸相当于7克药材,由广西花红药业有限公司生产)、本发明提取物取制备例2所述的提取物(每克提取物相当13.5克药材)。动物禁食不禁水12小时后,各组灌胃蓖麻油0.1ml/10g,0.5h后灌胃给药。将动物扣在小鼠笼盖上的烧杯下,内垫有滤纸.连续观察3小时,按周干南的方法,统计每只小鼠的总便数、稀便数。并按照周氏法计算腹泻指数(DI):稀便率与稀便级的乘积。稀便级的标准如下:
级数 1 2 3 4
污迹直径<1cm 1-1.9cm 2-3cm >3cm
统计指标的确定:粪便次数以每粒或每堆(不能分清粒数者一次)。干便与稀便的区分以滤纸上有无污迹为标准。级数直径的测量:圆形者测其直径,椭圆形或不规则形测其最长和近似圆的直径,两者取平均数。以腹泻指数为考察指标,统计方法按照SPSS11.0软件处理,采用重复测量数据的方差分析。
表1本发明提取物对动物腹泻指数的影响
注:*,与模型相比,P<0.01,1,与模型相比,P<0.05.
结论:给药1小时后,黄连素组、微丸组、本发明提取物组腹泻指数与模型组相比,差异有显著性意义,说明本发明提取物能够降低腹泻动物的腹泻指数。给药2小时后黄连素组、微丸组、本发明提取物组腹泻指数与模型组相比,差异有显著性意义,说明本发明提取物能够降低腹泻动物的腹泻指数。给药3小时后微丸组的腹泻指数与模型组相比则差异无显著性意义。说明给药3小时后微丸不能减少腹泻动物的腹泻指数。而黄连素组、本发明提取物组腹泻指数与模型组相比,差异有显著性意义,说明本发明提取物3小时后还能够降低腹泻动物的腹泻指数。
2.小肠推进运动实验
18-22g的SPF昆明小鼠,18-22克,雌雄各半,随机分为5组:正常对照组、复方地芬诺酯阳性对照组、葛根芩连微丸对照组、本发明提取物组(药材服用量与微丸相等)。动物禁食不禁水12小时后,各组均灌胃给药1次,给药后1h每只动物灌胃4%活性炭羧甲基纤维素0.2ml/只,20分钟后脱颈椎处死,开腹分离肠系膜,剪取上端至幽门下端至回盲部的肠管,置于托盘上,轻轻将肠管拉直,用水冲洗。测量总长度,将幽门至活性炭前沿的距离作为活性炭在小肠内推进距离,按照推进率=小肠推进距离/小肠总长度计算。以推进率为指标考察,统计方法按照SPSS11.0软件处理,采用单因素方差分析方法。
表2本发明提取物对正常动物小肠推进运动的影响
注:*,与模型相比,P<0.01.
结论:复方地芬诺酯组、葛根芩连微丸组、本发明提取物组的小肠推进率与正常组相比差异有显著性意义,说明本发明提取物能够减少正常动物小肠的推进率。
3.对新斯的明引起小鼠肠功能推进亢进的影响
18-22g的SPF昆明小鼠,18-22克,雌雄各半,随机分为6组:正常对照组、模型对照组、复方地芬诺酯阳性对照组、葛根芩连微丸对照组、本发明提取物组(药材服用量与微丸相等)。动物禁食不禁水12小时后,各组均灌胃给药1次,各组动物均皮下注射甲硫酸新斯的名0.15mg/kg,15分钟后,每只动物灌胃4%活性炭羧甲基纤维素0.2ml/只,20分钟后脱颈椎处死,开腹分离肠系膜,剪取上端至幽门下端至回盲部的肠管,置于托盘上,轻轻将肠管拉直,用水冲洗。测量总长度,将幽门至活性炭前沿的距离作为活性炭在小肠内推进距离,按照推进率=小肠推进距离/小肠总长度计算。以推进率为指标考察,统计方法按照SPSS11.0软件处理,采用单因素方差分析方法。
表3本发明提取物对新斯的明引起小鼠肠功能推进亢进的影响
注:*,与模型相比,P<0.01.
结论:复方地芬诺酯组、葛根芩连微丸组、本发明提取物组小肠推进率与模型组相比差异有显著性意义,说明本发明提取物能够抑制新斯的明造成的小肠推进功能亢进,减少动物小肠的推进率。
4.解热实验
SPF大鼠,140-160克,雌。实验前测量大鼠肛温,取温度范围在36.8-38.3之间的动物,然后除正常对照组外在其余各组动物颈部以下的背部皮下注射15%的啤酒酵母生理盐水溶液10ml/kg,正常对照组注射同体积生理盐水。并且按摩注射部位以利充分吸收。室温保持在22-24℃,注射后即禁食。18小时后再次测量动物的肛温,体温低于38℃的不能用于实验。然后随机分为6组:模型对照组、安乃近阳性组、葛根芩连微丸对照组、本发明提取物组(药材服用量与微丸相等)。并灌胃给药,给药1小时、2小时、3小时、4小时分别测量动物肛温。以各组动物给药前后的温度差为指标考察,统计方法按照SPSS11.0软件处理,采用重复测量数据的方差分析。
表4本发明提取物对发热动物的影响
注:*,与模型相比,P<0.01.
结论:给药1小时后,安乃近组、微丸组、本发明提取物组动物体温升高的度数与模型组相比有减少的趋势,但是差异没有显著性意义。正常组动物体温的变化与模型组相比差异有显著性意义,说明造模成功。给药2小时后,安乃近组、微丸组、本发明提取物组动物体温升高的度数与模型组相比减少,差异有显著性意义。给药3小时后,安乃近组、微丸组、本发明提取物组动物体温升高的度数与模型组相比减少,差异有显著性意义。给药4小时后,安乃近组、微丸组、本发明提取物组动物体温升高的度数与模型组相比减少,差异有显著性意义。说明本发明提取物组能够降低发热大鼠的体温。
上述动物实验说明本发明所述提取物能有效减少动物腹泻、小肠推进,并具有控制体温升高以及退热的作用。
具体实施方式
制备例
例1
取葛根2.4Kg,黄芩0.9Kg,黄连0.9Kg,甘草0.6Kg,以6倍量、4倍量水煎煮两次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,浓缩至1/4原体积,加浓盐酸调pH1~2,静置12h,分离沉淀物和上清液;取沉淀用水洗至pH5~6;取上清液调至pH5~6,浓缩至密度为1.10,加乙醇至含醇量为65%,过滤,滤液浓缩至1.6Kg,上大孔树脂柱(大孔树脂用量为6.2Kg),先以4倍柱体积去离子水洗脱,再以3倍树脂体积的40%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与上述沉淀混合,烘干,得总提取物约238g,其中含葛根总异黄酮13.5%,黄芩总黄酮20.5%;黄连总生物碱10.5%,甘草酸2.0%。
例2
取葛根2.4Kg,黄芩0.9Kg,黄连0.9Kg,甘草0.6Kg,以10倍量、8倍量水煎煮两次,每次1小时,滤过,合并滤液,浓缩至1/3原体积,加浓盐酸调pH1~2,静置18h后分离沉淀和上清液;取沉淀水洗至pH5~6备用;取上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.15,加乙醇至含醇量为70%,过滤,滤液浓缩至2.0Kg,上大孔树脂柱(大孔树脂用量为9.6Kg),先以5倍柱体积去离子水洗脱,再以4倍树脂体积的50%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与上述沉淀混合,烘干,得总提取物约354g,其中含葛根总异黄酮17.0%,黄芩总黄酮25.6%;黄连总生物碱14.5%,甘草酸3.6%。
例3
取葛根2.4Kg,黄芩0.9Kg,黄连0.9Kg,甘草0.6Kg,以12倍量、10倍量水煎煮两次,每次1.5小时,滤过,合并滤液,浓缩至1/3原体积,加浓盐酸调pH1~2,静置24h后分离沉淀和上清液;取沉淀水洗至pH5~6备用;取上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.20,加乙醇至含醇量为75%,过滤,滤液浓缩至2.4Kg,上大孔树脂柱(大孔树脂用量为14.4Kg),先以6倍柱体积去离子水洗脱,再以5倍树脂体积的70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与上述沉淀混合,烘干,得总提取物约542g,其中含葛根总异黄酮21.0%,黄芩总黄酮32.5%;黄连总生物碱18.5%,甘草酸5.0%。
例4
取葛根2.4Kg,黄芩0.9Kg,黄连0.9Kg,甘草0.6Kg,以6倍量、4倍量水煎煮两次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,浓缩至1/4原体积,加浓盐酸调pH1~2,静置18h,分离沉淀物和上清液;取沉淀用水洗至pH5~6;取上清液调至pH5~6,浓缩至密度为1.10,加乙醇至含醇量为70%,过滤,滤液浓缩至1.8Kg,上大孔树脂柱(大孔树脂用量为6.5Kg),先以5倍柱体积去离子水洗脱,再以4倍树脂体积的40%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与上述沉淀混合,烘干,得总提取物约246g,其中含葛根总异黄酮14.1%,黄芩总黄酮21.6%;黄连总生物碱11.8%,甘草酸2.9%。
例5
取葛根2.4Kg,黄芩0.9Kg,黄连0.9Kg,甘草0.6Kg,以8倍量、6倍量水煎煮两次,每次1小时,滤过,合并滤液,浓缩至1/3原体积,加浓盐酸调pH1~2,静置24h,分离沉淀物和上清液;取沉淀用水洗至pH5~6;取上清液调至pH5~6,浓缩至密度为1.15,加乙醇至含醇量为70%,过滤,滤液浓缩至2.4Kg,上大孔树脂柱(大孔树脂用量为10.0Kg),先以5倍柱体积去离子水洗脱,再以5倍树脂体积的60%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与上述沉淀混合,烘干,得总提取物约375g,其中含葛根总异黄酮18.2%,黄芩总黄酮26.5%;黄连总生物碱15.4%,甘草酸3.8%。
应用例
例1(胶囊剂)
取制备例1所述的提取物100g,与188g乳糖、12g交联PVP混合均匀,以70%乙醇为粘合剂制颗粒,低于60℃干燥,整粒,装胶囊1000粒。成人每日服用3粒×3次。
例2(颗粒剂)
取制备例3所述提取物226g,与520g蔗糖粉、254g糊精混合均匀,以50%乙醇为粘合剂制颗粒,干燥,整粒,分装为1000袋,即得。成人每日服用3袋×3次。
例3(片剂)
取制备例2所述的提取物148g,与127g微晶纤维素,以50%乙醇为粘合剂制颗粒,干燥,整粒,加入25g交联CMC-Na,混合均匀,压片1000片。成人每日服用3片×3次。
例4(分散片)
取制备例1所述提取物100g,粉碎成细粉,与230g微晶纤维素、100g交联CMC-Na、20g阿斯巴甜混合均匀,以50%乙醇为粘合剂制颗粒,干燥,整粒,压片1000片。成人每日服用3片×3次。
例5(微丸剂)
取制备例3所述的提取物226g,与滑石粉140g,微晶纤维素584g,阿斯巴甜50g,以50%乙醇为粘合剂过24目筛制颗粒,放入制丸机中制丸,干燥,分装,包装,得1000袋。成人每日服用3袋×3次。
例6(软胶囊)
取制备例2所述的提取物148g,粉碎成细粉,352gPEG-400混合均匀,分装成1000粒,成人每日服用3粒×3次。
Claims (4)
1.一种葛根芩连药物提取物,该提取物中含有以下重量百分比的主要活性物质:
葛根总异黄酮13.5~21.0%,黄芩总黄酮20.5~32.5%,黄连总生物碱10.5~18.5%,甘草酸2.0~5.0%;所述的提取物由下列方法制得:
(1)按葛根∶黄芩∶黄连∶甘草=8∶3∶3∶2的重量比取原料药混合,加6~12倍水煎煮0.5~1.5h,过滤,滤渣中再加入4~10倍水煎煮0.5~1.5h,过滤,合并两次滤液,浓缩至原体积的1/4~1/3,加浓盐酸调pH1~2,静置12~24h,分离沉淀物和上清液;取沉淀物水洗至pH5~6备用;上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.10~1.20,加乙醇至含醇量为65~75%,过滤,滤液浓缩至药材重量的1/3~1/2,得浓缩液备用;
(2)取浓缩液通过大孔树脂柱,其中树脂用量为药材用量的1.3~3.0倍;先以4~6倍柱体积去离子水洗脱,再以3~5倍树脂体积的40%~70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与步骤(1)所得的沉淀物混合,烘干即得。
2.权利要求1所述的葛根芩连提取物的制备方法,该方法由下列步骤组成:
(1)按葛根∶黄芩∶黄连∶甘草=8∶3∶3∶2的重量比取原料药混合,加6~12倍水煎煮0.5~1.5h,滤过,滤渣中再加入4~10倍水煎煮0.5~1.5h,滤过,合并两次滤液,浓缩至原体积的1/4~1/3,加浓盐酸调pH1~2,静置12~24h,分离沉淀物和上清液;取沉淀物水洗至pH5~6备用;上清液调pH5~6,浓缩至密度为1.10~1.20,加乙醇至含醇量为65~75%,过滤,滤液浓缩至药材重量的1/3~1/2,得浓缩液备用;
(2)取浓缩液通过大孔树脂柱,其中树脂用量为药材用量的1.3~3.0倍;先以4~6倍柱体积去离子水洗脱,再以3~5倍树脂体积的40%~70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浸膏与步骤(1)所得的沉淀混合,烘干即可。
3.一种治疗菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻的口服制剂,其特征是它由权利要求1所述的葛根芩连提取物和药用辅料组成。
4.根据权利要求3所述的一种治疗菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻的口服制剂,其特征是所述的口服制剂是普通片剂、分散片、胶囊剂、颗粒剂、微丸、软胶囊。
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