CN100425253C - 一种地乌总皂苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

关节炎及风湿性关节炎是一种常见病、多发病，特别是类风湿性关节炎，系自身免疫性疾病，其病机相当复杂，牵涉面极广，具有相当的顽固性。本发明涉及的地乌总皂苷能够治疗关节炎及风湿性关节炎，又具有毒副作用小的特点。本发明提供了一种地乌总皂苷的制备方法，该方法能满足工业生产需要和开发新药用途，得到的地乌总皂苷的杂质少，纯度高。

Description

一种地乌总皂苷的制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取物，更具体地说，涉及从中药地乌(毛茛科植物林荫银莲花Anemone flaccida Fr.Schmidt)的根茎中提取精制而成的地乌总皂苷的方法。

技术背景

关节炎及风湿性关节炎是一种常见病、多发病，特别是类风湿性关节炎，系自身免疫性疾病，其病机相当复杂，牵涉面极广，具有相当的顽固性，我国很早就有关于骨关节疾病的记载，称之为痹证。西医认为风湿病是各种原因引起的以骨、关节、肌肉及其附属组织疼痛为主要表现的一大类疾病。目前美国风湿病学会(ARA)，将风湿病共分为10大类，已被世界卫生组织采纳。这些疾病主要有风湿性关节炎、类风湿性关节炎、增生性关节炎、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、雷特(Reiter)综合症，银屑病性关节炎、痛风及假性痛风、系统性硬皮病、皮肌炎、干燥综合症、肠炎性关节炎、白塞氏病、过敏性紫癜、混合性结缔组织病等。其中尤其以风湿及类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风、强直性脊柱炎等几种疾病高发，且预后较差，致残率较高(尤其是耽误治疗疾病发展至晚期阶段)。类风湿关节炎在我国的发病率为0.32％-0.34％。欧美白人发病率为1％-2％。我国局部地区患病率在0.4％-1.0％。其病因及发病机制不明，病程长，治疗难，致残率高，且任何年龄均可发病，估计全国人数达160万，以25-55岁最常见，女性发病高于男性2-3倍。其临床病程不一，约15％单次发作后缓解，25％间歇性发作，50％持续性发作，迅速进展成重症者占10％。

该类疾病往往反复发作，病情控制不够满意。就目前来说还没有令人满意的治疗药物。很多抗风湿药物对胃肠均有损伤，如消炎痛、炎痛喜康、布洛芬等。另大多数免疫抑制剂，如环磷酰胺，氨甲喋呤，硫唑嘌呤一类药物，毒副作用教大，特别对孕妇、婴儿胎儿尤为严重。而皮质激素类药物，虽起效快但并不能“断根”，停药后常有“反跳现象”，而且副作用大。而常用的中药“雷公藤制剂”其毒副作用大，患者往往难以忍受。

因此，本发明的药物既能治疗类风湿性关节炎，又具有毒副作用小的特点，伴随中国的“入世”，意义重大。

中药地乌：性温味辛、微苦。地乌提取物(地乌总皂苷)具有优异的驱风湿、强筋骨，抗炎、调节免疫功能和镇静、镇痛等作用。现有的制备方法是采用水提法、醇提法、水提醇沉法，这些方法得到的地乌总皂苷的杂质多，纯度较低，无法达到工业化生产和开发新药用途的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够满足工业生产需要和开发新药用途的地乌总皂苷的制备方法，这种方法得到的地乌总皂苷的杂质少，纯度高。

本发明的地乌的制备方法制备方法，包括以下工艺步骤：

(1)、取地乌根茎，筛选，粉碎呈粉末，过20---50目筛；

(2)、取地乌粉末，加入6-10倍重量的水，煎煮1-3小时，滤过，重复以上操作2-4次，合并滤液；

(3)、将滤液浓缩成浸膏，浸膏密度在40℃-70℃为1.04---1.10g/cm³，放冷至室温；

(4)、向浸膏中加入95％乙醇溶解，使溶液含醇量为50％---70％，将溶液摇匀，静置8---16小时，滤过，回收乙醇至无醇味；

(5)、回收乙醇后的溶液上大孔吸附树脂柱，用水洗至流出液无色，弃去，再用地乌粉末重量4-7倍的50％---70％乙醇洗脱，流速为8ml/min--10ml/min，收集洗脱液；

(6)洗脱液回收乙醇至无醇味，浓缩，于60--100℃、560～760mmHg干燥8-13小时，粉碎，过筛，得地乌总皂苷粉末。

上述制备方法的工艺条件的优选条件为：步骤(2)中加入7-8倍水煎煮；步骤(3)中浸膏密度为60℃时1.06---1.08g/cm³；步骤(4)浸膏加乙醇溶解后，溶液含醇量为60％，溶液静置12小时；步骤(5)用于洗脱的乙醇浓度为70％，用量为地乌粉末重量6倍，洗脱流速为8ml/min--10ml/min；步骤(6)的干燥条件为于80℃、760mmHg、干燥12小时。本发明中的乙醇浓度均指体积百分比。

用本发明方法提取地乌总皂苷工艺过程简单，无特殊设备，安全易于操作，且成本低，得到的地乌总皂苷杂质少、纯度高达85％，完全能够满足工业生产和药物开发的需要。本发明先用水提，醇沉最后过树脂柱的方法，即地乌经过水提取冷却后进行醇沉，可除去淀粉、多糖、蛋白质等与功能主治无关的杂质，滤液回收乙醇后过D101型大孔吸附树脂(此类树脂对非极性有机化合物吸附较强如在分离皂苷类成分非常有效且树脂可以再生并处理简单对环境污染少)，最终得到地乌总皂苷的纯度高，杂质少，其总皂苷的含量在总提取物的85％以上。

下面通过实施例进一步说明本发明，但不限制本发明：

实施例1

取地乌药材1.5kg，加水9kg，煎煮2小时，滤过，重复操作三次，合并滤液，浓缩成浸膏，在60℃时用比重计测得相对密度为1.07(60℃)的浸膏，放冷至室温，加95％乙醇使含醇量为60％，摇匀，静置12小时，滤过，回收乙醇至无醇味，滤液置D101型的大孔树脂柱上，用水洗至流出液无色，弃去水；再用8kg70％乙醇洗脱，流速为9ml/min，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，浓缩成稠膏，放入真空干燥机中，在760mmHg、80℃真空干燥12小时，得到块状晶体，粉碎，过筛，即得纯度为88％的粉末99.9g。

本发明中采用的地乌总皂苷纯度测定方法为：

照比色法(中华人民共和国药典2000年版一部 附录VB)测定。

对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的地乌皂苷W3对照品，加甲醇制成每1ml含5.0mg的溶液。

供试品溶液的制备取本品约0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇10ml，密塞，精密称定重量，超声处理(功率450W频率59KHz)45分钟，放冷至室温，用水饱和正丁醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法照分光光度法(中华人民共和国药典2000年版一部，附录VB)试验，以甲醇作空白溶液。精密吸取对照品溶液40μl，供试品溶液50μl，空白溶液50μl，置10ml具塞试管中，热风吹干，各精密加入5％香草醛冰乙酸溶液-高氯酸(1∶4)1ml，充分振摇，置60℃恒温水浴中加热15分钟，立即置冰水浴中，冷却5分钟，取出，立即精密加入冰乙酸5ml，摇匀，在545nm波长处测定吸收度，按紫外分光光度法[中华人民共和国药典2000年版一部，附录VA项下(1)]对照品比较法计算式计算，即得。

供试品溶液浓度计算公式：

C_x＝(A_x/A_R)×C_R

C_x为供试品溶液的浓度；

A_x为供试品溶液的吸收度；

C_R为对照品溶液的浓度；

A_R为对照品溶液的吸收度。

样品含量计算公式：

含量＝(C_x×V_x)/M_总

V_x为供试品溶液的体积；

M_总为样品总的质量。

实施例2

取地乌药材1.5kg，加水12kg，煎煮1小时，滤过，重复操作二次，合并滤液，浓缩成浸膏，在40℃时用比重计测得相对密度为1.04的浸膏，放冷，加95％乙醇使含醇量为50％，摇匀，静置8小时，滤过，回收乙醇至无醇味，滤液置D101型的大孔树脂柱上，用水洗至流出液无色，弃去水；再用6kg50％乙醇洗脱，流速为8ml/min，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，浓缩成稠膏，放入真空干燥机中，在700mmHg、60℃真空干燥8小时，得到块状晶体，粉碎，过筛，即得纯度为86％的粉末100.2g。

实施例3

取地乌药材1.5kg，加水15kg，煎煮3小时，滤过，重复操作四次，合并滤液，浓缩成浸膏，在70℃时用比重计测得相对密度为1.10的浸膏，放冷，加95％乙醇使含醇量为70％，摇匀，静置16小时，滤过，回收乙醇至无醇味，滤液置D101型的大孔树脂柱上，用水洗至流出液无色，弃去水；再用10.5kg60％乙醇洗脱，流速为8ml/min，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，浓缩成稠膏，放入真空干燥机中，在560mmHg、100℃真空干燥13小时，得到块状晶体，粉碎，过筛，即得纯度为85％的粉末99.7g。

实施例4

地乌总皂苷的抗炎作用

1.实验材料

1.1实验药物：地乌提取物(地乌总皂苷)，由湖北中医学院中药研究所提供，批号：960610

1.2实验动物：清洁级Wistar大鼠，清洁级昆明种小白鼠，清洁级日本大耳兔。均由同济医科大学实验动物学部提供，合格证号分别为医动字第19-050号，医动字第19-052号。

1.3试剂：二甲苯，武汉联碱厂，分析纯，批号：080112。巴豆油，自制。角叉菜胶，东京化成工业株式会社、东京化成贩壳株式会社，批号：900360000。伊文思蓝，上海化学试剂采购供应站分装厂，批号：90-06-21。冰醋酸，江苏东台市试剂厂，分析纯，批号：910618。卡介苗：兰州生物制品研究所，批号：950513。液体石蜡：南京化学试剂厂。

1.4仪器：足容积测定装置，千分卡尺，软尺，751分光光度计，721型分光光度计：上海第三分析仪器厂，JN-A型精密扭力天平：上海第二天平仪器厂，显微镜，心电图机，二导仪。

1.5对照药物：醋酸泼尼松片，广州白云山制药总厂，批号：950101。规格：5mg/片。

2.实验方法与结果

一、地乌提取物(地乌总皂苷)对大白鼠佐剂关节炎的影响

2.1方法：

(1)观察地乌提取物(地乌总皂苷)对原发病变的影响

取体重180g左右的Wistar大白鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5组，测其左后跖正常容积(ml)。每鼠左后跖皮内注射Freuneds完全佐剂〔采用液体石蜡和羊毛脂(2∶1)共热至70℃振摇，高压灭菌〕然后按每毫升加入卡介苗6毫克制成0.1毫升致炎。自注入佐剂的前1日起开始给药。观察该药对原发病变的影响。

地乌提取物3个剂量组，剂量分别为288、144、72mg/kg；醋酸泼尼松片组20mg/kg；蒸馏水组20ml/kg。均灌胃给药，每日1次，连续10次。每天测量各鼠左后跖容积，结果与蒸馏水组比较(t检验)。

(2)观察地乌提取物(地乌总皂苷)对继发病变的预防作用

取体重180g左右的Wistar大白鼠50只，雌雄各半，随机分为5组。分组情况及给药剂量同(1)。于注射佐剂第7天开始给药，连续7天，观察对侧的足跖肿胀度，体积变化，耳部、前肢和尾部病变的发生率，结节数或严重度，每隔3天测体重1次。结果与蒸馏水组比较t检验(确切概率法)。

(2)观察地乌提取物(地乌总皂苷)对继发病变的治疗作用

另取出现继发病变大白鼠50只，于注射佐剂第19天开始给药。观察佐剂注射对测的足跖肿胀度，体积变化，连续给药观察至第30天。每隔3天测体重1次。结果与蒸馏水组比较(t检验)。

2.2结果

(1)地乌提取物(地乌总皂苷)对原发性病变的作用结果见表1。

表1地乌提取物对佐剂关节炎大鼠原发病变的影响(X±S，n＝10)

与蒸馏水组比较(t检验)^*p＞0.05；^**p＜0.05，^***p＜0.01，^****p＜0.001

结果表明：地乌提取物各剂量组致炎后，足跖肿胀程度在相同时间与蒸馏水组比较，均具有高度显著性差异(p＜0.05；p＜0.01，p＜0.001)，提示该药具有抗佐剂关节炎原发病变的作用。

(2)地乌提取物对继发性病变的预防作用结果见表2、3、4。

表2地乌提取物对继发性病变的预防作用(X±S，n＝10)

与蒸馏水组比较(t检验)^*p＞0.05；^**p＜0.05，^***p＜0.01，^****p＜0.001。

表3地乌提取物对继发性病变预防用药时体重经时改变的影响(X±S，n＝10)

与蒸馏水组比较(t检验)^*p＞0.05；^**p＜0.05，^***p＜0.01，^****p＜0.001。

表4地乌提取物预防用药对佐剂关节炎大白鼠继发病变动物数的影响

与蒸馏水组比较(确切概率法)^*p＞0.05；^**p＜0.05。

结果表明，地乌提取物各剂量组具有抑制注射佐剂对侧(右后足跖)因迟发型超敏反应引起的足肿胀，继发病变的发生率(耳部、前肢和尾部病变的发生率)，结节数及严重程度均低于模型组，体重变化与模型组相比较显著性差异。提示该药具有抑制佐剂关节炎大白鼠迟发型超敏反应的作用。

(3)地乌提取物对继发性病变的治疗作用结果见表5。

表5地乌提取物对佐剂关节炎大白鼠继发性病变的治疗作用

(右后足跖容积，X±S，n＝10)

与蒸馏水组比较(t检验)^*p＞0.05；^**p＜0.05，^***p＜0.01，^****p＜0.001。

结果表明：地乌提取物可使佐剂关节炎大白鼠右后足跖肿胀的严重程度降低，与蒸馏水组相比较有显著性差异。提示该药具有治疗佐剂关节炎的作用。

二、地乌提取物(地乌总皂苷)对二硝基氯苯(DNCB)所致迟发型皮肤过敏反应的影响

1.方法：取体重18～22克小白鼠50只，雌雄兼用，随机分为5组，分组及用药剂量同以上实验。致敏前一天，用硫化钠糊脱去颈部毛，致敏之日给药后即于脱毛的颈部皮肤上滴0.5g/mlDNCB丙酮溶液20μl/只致敏。10天后，在事先用硫化钠糊脱毛的同一小白鼠腹部皮肤上滴0.025g/mlDNCB丙酮溶液20μl/只进行攻击。24小时后每鼠尾部静脉注射1％伊文思蓝10ml/kg。30分钟后处死小白鼠，取小白鼠腹部蓝染皮肤，剪碎，置试管中用1∶1丙酮生理盐水混合液5ml浸泡24小时。将浸泡液过滤，取滤液用751型分光光度计610nm处测定光密度。

2.结果

地乌提取物对DNCB所致迟发型皮肤过敏反应的影响实验结果见表6。

表6地乌提取物对DNCB所致迟发型皮肤过敏反应的影响

与蒸馏水组比较(t检验)^***p＜0.01，^****p＜0.001。

结果表明：地乌提取物各剂量组均能明显降低DNCB所致小鼠迟发型皮肤过敏反应OD值，与蒸馏水相比较具有显著性差异。提示该药具有抑制T淋巴细胞转化为致敏淋巴细胞的作用，降低机体细胞免疫的功能。

三、地乌提取物镇静、镇痛作用

1.镇静作用

方法：在25～26℃安静环境下，取小白鼠100只，体重18～22g，雌雄兼用，随机分成5组，每组20只。地乌提取物3个剂量组，剂量分别为416、208、104mg/kg，安定片10mg/kg；蒸馏水组20ml/kg。均灌胃给药，30分钟后，腹腔注射戊巴比妥钠溶液28mg/kg。翻正反射小时达1分钟者，记作发生睡眠，记录发生睡眠的动物只数，比较各给药组与对照组动物翻正反射消失的个数。

结果：地乌提取物对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响见表7。

表7地乌提取物对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

与蒸馏水组比较(t检验)^***p＞0.05，^***p＜0.01。

结果表明：地乌提取物能使戊巴比妥钠的作用增强，使小白鼠的入睡动物数增加，高、中剂量组与蒸馏水组相比较具有高度显著性差异(P＜0.01。提示该药与戊巴比妥钠有协同作用。

2.镇痛作用

方法：取小白鼠50只，体重18～22g，雌雄兼用，随机分成5组，每组10只。地乌提取物3个剂量组，剂量分别为416、208、104mg/kg，哌替啶注射液组25mg/kg(腹腔注射)；蒸馏水组20ml/kg。给药后30分钟，均腹腔注射0.6％乙酸溶液0.2ml/只，然后观察每只小白鼠的疼痛症状：后肢伸展、腹部贴板扭曲及腹肌收缩内凹，臀部抬高(为一次扭体动作)，以扭体次数为疼痛指标，记录30分钟内小白鼠扭体次数。

结果：扭体实验结果见表8。

表7地乌提取物对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

与蒸馏水组比较(t检验)^***p＜0.01，^****p＜0.001。

结果表明：地乌提取物各剂量组均能明显减少乙酸致小白鼠扭体的次数，与蒸馏水组相比较具有高度显著性差异。提示该药具有镇痛作用。

综上结果显示：本发明方法制备的地乌提取物(地乌总皂苷)在消炎镇痛，镇静安神，调节免疫机能等方面均有良好的效果。

用本发明方法制备的地乌提取物(地乌总皂苷)，可以制成任何一种药剂学上所说的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉针剂、滴丸、注射剂、缓释剂、控释剂等。

实施例5

地乌提取物(地乌总皂苷)胶囊剂 处方

地乌提取物(地乌总皂苷)：200g

淀粉：适量

共制成1000粒。

取地乌提取物与淀粉混合均匀，制粒，干燥，粉碎(或取地乌提取物与淀粉混合均匀)过80目筛，填入合适的胶囊中，制成每粒含地乌提取物(地乌总皂苷)0.2g。

实施例6

地乌提取物(地乌总皂苷)片剂 处方

地乌提取物(地乌总皂苷)：200g

药用辅料(包括淀粉、滑石粉、纤维素等)：适量

共制成1000片。

取地乌提取物与淀粉混合均匀，制粒，干燥，粉碎(或取地乌提取物与淀粉混合均匀)过80目筛，压制成片，制成每片含地乌提取物(地乌总皂苷)0.2g。

实施例7

地乌提取物(地乌总皂苷)粉针剂处方

地乌提取物(地乌总皂苷)：200g

甘露醇：60g

蒸馏水：5ml

上述各组分混合均匀后，冷冻干燥，制成1000支。

Claims (6)

1、一种地乌总皂苷的制备方法，包括以下工艺步骤：

(1)、取地乌根茎，筛选，粉碎呈粉末；

(2)、取地乌粉末，加入地乌粉末的6-10倍重量的水，煎煮1-3小时，滤过，重复以上操作2-4次，合并滤液；

(3)、将滤液浓缩成浸膏，浸膏密度在40℃-70℃为1.04---1.10g/cm³，放冷至室温；

(4)、向浸膏中加入乙醇溶解，使溶液含醇量为50％---70％，将溶液摇匀，静置8---16小时，滤过，回收乙醇至无醇味；

(5)、回收乙醇后的溶液通过大孔吸附树脂柱，用水洗至流出液无色，弃去，再用地乌粉末重量4-7倍的50％---70％乙醇洗脱，流速为：8ml/min--10ml/min，收集洗脱液；

(6)洗脱液回收乙醇至无醇味，浓缩，于60--100℃、560～760mmHg干燥8-13小时，粉碎，过筛，得地乌总皂苷粉末。

2、根据权利要求1的地乌总皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中加入7-8倍水煎煮。

3、根据权利要求2的地乌总皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(3)中浸膏密度在60℃为1.06---1.08g/cm³。

4、根据权利要求3的地乌总皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(4)浸膏加乙醇溶解后，溶液含醇量用体积比表示为55％-65％，溶液静置12小时。

5、根据权利要求3的地乌总皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(5)用于洗脱的乙醇浓度为70％，用量为地乌粉末重量6倍，洗脱流速为9ml/min。

6、根据权利要求3的地乌总皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(6)为：洗脱液回收乙醇，浓缩，于80℃、760mmHg干燥12小时，粉碎，过筛，得地乌总皂苷粉末。