CN116492324A - 咖啡酸在预防和治疗结直肠癌中的应用、含咖啡酸的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种咖啡酸在预防和治疗结直肠癌中的应用、含咖啡酸的药物，包括：在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用、在制备结直肠癌细胞干性维持抑制剂中的应用、在制备抑制或治疗结直肠癌肿瘤迁移的药物中的应用、在制备防复发和/或治疗结直肠癌肿瘤的药物中的应用中的一种或几种。本发明所述的应用为结直肠癌提供了有效的预防及治疗手段；表观遗传抗癌药物与传统化疗药物之间的联合应用，可实现多靶点治疗及最大限度发挥增效作用。
Description
技术领域
本发明涉及咖啡酸的新用途，尤其是涉及一种咖啡酸在结直肠癌治疗中的应用，更具体的说，是利用咖啡酸作为分子靶向药物，抑制结直肠癌肿瘤细胞的生长，复发、转移等。
背景技术
目前结直肠癌的主要治疗模式仍然是手术治疗为主，结合化疗、放疗的综合治疗方法。大约50％的完全手术切除的患者将会复发并最终死于化疗耐药的转移性疾病。虽然复发的原因尚未完全阐明，但肿瘤内自我更新的癌症干细胞(CSCs)的存在被认为是肿瘤转移和复发的主要促成因素之一。因此，选择性靶向和消除CSCs最终将改善接受结直肠癌治疗的患者的预后；现有的报道，存在利用咖啡因抑制结直肠癌，但是，由于咖啡因是一种植物生物碱，存在一定的毒性，过量使用会导致不良后果。
基于此，本发明提供一种咖啡酸在结直肠癌治疗中的新应用。
发明内容
本发明提供了一种咖啡酸在预防和治疗结直肠癌中的应用、含咖啡酸的药物。
具体地，其技术方案如下：
一种咖啡酸在预防和治疗结直肠癌中的应用，包括以下应用中的一种或几种：
在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用、
在制备结直肠癌细胞侵袭抑制剂中的应用、
在制备结直肠癌细胞干性维持抑制剂中的应用、
在制备抑制或治疗结直肠癌肿瘤迁移的药物中的应用、
在制备防复发和/或治疗结直肠癌肿瘤的药物中的应用。
所述咖啡酸作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点抑制干性核心转录因子SOX2、CD44的转录活性及表达，影响所述干性核心转录因子的表观遗传修饰功效，从而抑制结直肠癌肿瘤的增殖、迁移和侵袭能力。
一种含咖啡酸的药物，包括：
咖啡酸或咖啡酸化学衍生物，用于作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点抑制干性核心转录因子SOX2、CD44的转录活性及表达，影响所述干性核心转录因子的表观遗传修饰功效，抑制结直肠癌肿瘤细胞的生长和/或抑制结直肠癌肿瘤的复发、转移。
所述咖啡酸在结直肠癌治疗中作为表观遗传学药物，实现多个靶点治疗。
所述的药物，可以为：
片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂中的任一剂型。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明所述的应用，利用咖啡酸作为咖啡酸或咖啡酸化学衍生物，用于作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点抑制干性核心转录因子SOX2和CD44的转录活性及表达，影响所述干性核心转录因子的表观遗传修饰功效，从而抑制人结直肠癌肿瘤细胞的生长和/或抑制肿瘤的复发、转移，减慢癌细胞繁殖速度，为结直肠癌提供了有效的预防及治疗手段；并且可用于表观遗传抗癌药物与传统化疗药物之间的联合应用，可实现多靶点治疗及最大限度发挥减毒增效作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：人结直肠癌肿瘤细胞增值抑制率曲线图；
图2：人结直肠癌肿瘤细胞克隆形成实验示意图；
图3：人结直肠癌肿瘤细胞克隆形成实验柱状统计图；
图4：不同浓度咖啡酸处理后对结直肠癌肿瘤细胞迁移的抑制作用；
图5：不同浓度咖啡酸处理后对结直肠癌肿瘤细胞侵袭的抑制作用；
图6：不同浓度咖啡酸处理后对结直肠癌肿瘤细胞划痕愈合的作用；
图7：不同浓度咖啡酸处理后对结直肠癌肿瘤细胞中PI3-K分子靶点及干性核心转录因子蛋白SOX2，CD44表达的影响；
图8：不同浓度咖啡酸处理后结直肠癌肿瘤细胞异体移植瘤活体图。
具体实施方式
本领域技术人员可以理解实施场景中的装置中的模块可以按照实施场景描述进行分布于实施场景的装置中，也可以进行相应变化位于不同于本实施场景的一个或多个装置中。上述实施场景的模块可以合并为一个模块，也可以进一步拆分成多个子模块。
本实施例所述的咖啡酸(CaffeicAcid)，又称3,4一二羟基肉桂酸，是一种从中药如丹参、野胡萝卜、光叶水苏、荞麦、木半夏、咖啡菊科植物等中提取的天然产物；可以从市场上买到，也可以根据现有技术制备，符合药用标准；并且，咖啡酸化学衍生物与所述咖啡酸具有等同作用的，同样可以替代本实施例所述的咖啡酸。
分子靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。
本实施例所述的咖啡酸作为结直肠癌肿瘤细胞内干性富集的关键分子SOX2、CD44的抑制剂；具体的，咖啡酸作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点可抑制干性核心转录因子SOX2的转录活性及表达，影响其表观遗传修饰功效，从而在结直肠癌细胞增殖及干性维持中发挥抑制作用；咖啡酸可以有效抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移，且没有明显毒性；并在裸鼠体内实验中降低皮下肿瘤的生长速度；咖啡酸治疗结直肠癌的作用机制与下调PI3-K分子，抑制干性核心转录因子SOX2、CD44表达相关。
具体实施例I：
在本实施例中，将详细说明咖啡酸对结直肠癌肿瘤细胞的影响；
1.人结直肠癌肿瘤细胞的复苏及培养：
将冻存的人结直肠癌肿瘤细胞名称分别为：HCT-116和SW480从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中使细胞融化。生物安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中，800rpm/min离心5分钟；弃上清液，用1mL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80％-90％接触融合时进行传代，0.1％胰酶消化成单细胞悬液，800rpm/min离心5分钟；弃上清，加1-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个装有适量培养基的培养皿中，继续培养。
2.不同浓度咖啡酸对细胞生长的抑制作用：
(1)CCK8法测定药物对细胞增殖的抑制作用：
将处于对数生长期的贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，每孔100μL细胞悬液，2000cells/孔。将上述96孔培养板置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴壁。待24小时后细胞完全贴壁后，弃去培养液，试验组分别加入含有不同浓度的咖啡酸的细胞培养液，并设置不加药物只加相应药物溶剂的对照孔，同时设置只加培养基不含细胞的调零孔。每组设3个复孔，然后将96孔板置37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。分别在0h，12h，24h，48h，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育4h。然后用酶标仪测定450nm处的吸光度，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。如图1所示，检测的不同浓度咖啡酸对不同的人结直肠癌细胞的生长的抑制作用曲线图，横坐标为给药时间(h)，纵坐标为人结直肠癌肿瘤细胞的吸光度值(OD)；其中，Untreated为对照组，其他组为使用浓度为5μM、10μM、50μM的咖啡酸的实验组，从图1中可以得出咖啡酸与对人结直肠癌细胞的生长具有抑制作用；并且，在低浓度时即呈现明显的抑制作用，而且随着咖啡酸浓度的增大，对人结直肠癌细胞的增殖抑制作用逐渐增强，且呈现明显的浓度依赖性；
(2)克隆形成实验：
将细胞以500个/孔接种于6孔板，待贴壁后加入浓度为5μM、10μM、20μM、50μM的咖啡酸配成的完全培养基，以不加咖啡酸为对照，每天加药换液，于第15天福尔马林溶液固定，结晶紫染色，白光下拍照。计数成团细胞数作图。图2的平板克隆图和图3柱状统计图中，Untreated为对照组，其他组为使用浓度为5μM、10μM、20μM、50μM的咖啡酸的实验组，图3柱状统计图中，横坐标为不同的结直肠癌细胞，纵坐标为人结直肠癌肿瘤细胞克隆数(个)。由图2-3中可以看出，咖啡酸可以降低人结直肠癌细胞的平板克隆形成能力；
3.不同浓度咖啡酸对人结直肠癌细胞迁移及侵袭的影响：
(1)体外迁移及侵袭实验：将浓度为5μM、20μM的咖啡酸处理后的细胞，无血清饥饿12h，以5×104(迁移实验)或7.5×104(侵袭实验，Matrigel包被)接种于转移小室(孔径8um)，根据穿过细胞数量，24h或48h后终止实验，福尔马林溶液固定，结晶紫染色，镜下计数并统计分析差异；图4的迁移和图5的侵袭图中，Untreated为对照组，其他组为使用浓度为5μM、20μM的咖啡酸实验组，柱状统计图中，横坐标为不同的人结直肠癌细胞，纵坐标为人结直肠癌肿瘤细胞数(个)。由图4-5中可以看出，咖啡酸可以降低人结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，能够有效预防人结直肠癌的发生；
(2)划痕实验：将浓度为10μM、50μM的咖啡酸处理后的细胞接种于6孔板，待细胞至90-100％融合度时，用20μL枪头垂至于板底的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。PBS清洗3次后，试验组继续加入含有不同浓度的咖啡酸无血清培养基，空白对照组加入同等体积的无血清培养基。分别在0h，24h，36h，48h，72h，96h时于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。图6的划痕愈合实验中，Untreated为对照组，其他组为使用浓度为10μM、50μM的咖啡酸实验组，由图6中可以看出，咖啡酸可以降低人结直肠癌细胞的迁移能力，延缓肿瘤细胞的生长愈合。
4.Westernblot检测咖啡酸相关蛋白表达：
(1)蛋白提取；
将5×105细胞接种于6孔板，待24小时细胞贴壁后，将浓度为5μM、20μM的咖啡酸加入培养基中，48h后吸弃培养基，用PBS清洗，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解，震荡，12000rpm、4℃离心10min；上清即为蛋白。
(2)蛋白定量及上样蛋白配置；
用BCA蛋白定量试剂盒，标准品及工作液按照说明书配制，工作液按照200μL/孔计算，用PBS作为稀释底液，将蛋白样本稀释到适当的浓度，
(3)样本上样检测：
96孔板，每孔加入200μL BCA工作液，标准品及稀释好的蛋白样本按10μL/孔加入37℃摇床孵育30min，于酶标仪540-590nm波长范围检测吸光值，用标准品已知的浓度及其吸光值绘制标准曲线以计算蛋白浓度。
(4)蛋白样本配置：
选用蛋白裂解液或PBS将蛋白样本的浓度调成一致，加入一定量的5xSDS上样缓冲液，样本配置完放入100℃金属浴10min使蛋白变性。
(5)Westernblot实验：
制胶：选择1.0mm玻璃板，放进板架，加入下层分离胶，用水封胶。待凝固后倒掉水加入上层胶，插入梳子，待凝固。
上样电泳：配置好的胶拔出梳子后成对固定在电泳槽里面，加入电泳缓冲液，孔内加入上样蛋白及Marker(标记作用)，90V/120V跑胶。
转膜：电泳结束，取出分离胶部分，将胶中蛋白采用“三明治”方式将分离胶放入负极面的滤纸上，将提前准备好的PVDF膜覆盖在分离胶上面，用工具轻轻赶压PVDF膜以保证膜与胶充分贴合且没有气泡存在，膜上方加入合适厚度的滤纸，再次赶压气泡，最后将正负极两面板子同时夹在一起，固定，同样按正负极方向放入转模槽；转模槽空隙放入提前冻存好的冰盒，倒入预冷好的转膜缓冲液，80V转膜150min。
封闭：转膜结束，取出PVDF膜，封闭液选择5％脱脂奶粉或者5％BSA均可，摇床孵育1h。
一抗孵育：将封闭好的PVDF膜放入对应的一抗孵育液内，4℃冰箱过夜孵育。TBST少量多次洗膜。
二抗孵育：洗膜结束，根据一抗来源选择合适的二抗，常温孵育1-2h。
显色：显色液为ECL显色液，A液与B液1:1混合，现配现用，显色液均匀覆盖在PVDF膜表面，根据抗体显色最佳时间终止，将膜置于凝胶成像仪器，选择合适的曝光时间进行显色，保存结果以备分析。
如图7，不同浓度咖啡酸处理后可调节PI3-K通路，在标准化内参GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)一致的情况下，引起结直肠癌肿瘤细胞中干性核心转录因子SOX2、CD44蛋白表达的下调，可见咖啡酸治疗结直肠癌的作用机制与下调PI3-K分子，抑制干性核心转录因子SOX2、CD44表达等有关。
5.咖啡酸干预下免疫缺陷裸小鼠结直肠癌肿瘤皮下成瘤：
取免疫缺陷裸小鼠18只，随机分成3组，每组6只，分别为对照组(Untreated组)、浓度为50mg/kg的剂量组和浓度为100mg/kg的剂量组；对照组给予等体积生理盐水外，其余组每日腹腔注射咖啡酸50mg/kg、100mg/kg，实时活体追踪小鼠的成瘤过程，各组裸鼠皮下成瘤后每周用游标卡尺测量瘤体大小，肿瘤体积的计算公式V＝ab2/2((V：体积，a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)。终止试验后，绘制肿瘤生长曲线图，观察体重变化；分离肿瘤并称重，计算抑瘤率。图8中，可以看出，咖啡酸可以抑制裸小鼠的成瘤能力并减小瘤体体积，在30天时间节点中，咖啡酸的腹腔注射都可以抑制裸鼠的成瘤，达到防复发和治疗结直肠癌肿瘤的作用；
总之，本实施例利用咖啡酸作为分子靶向药物抑制人结直肠癌肿瘤细胞的生长和/或抑制肿瘤的复发、转移，减慢癌细胞繁殖速度，为结直肠癌提供了有效的预防及治疗手段；表观遗传抗癌药物与传统化疗药物之间的联合应用，可实现多靶点治疗及最大限度发挥减毒增效作用。
具体实施例II：
本发明所述的咖啡酸及其化学衍生物可以应用在制备治疗结直肠癌的抑制剂或药物中，而上述的药物至少包括以下药物种类，如：抑制或治疗结直肠癌肿瘤迁移的药物、防复发和/或治疗结直肠癌肿瘤的药物；上述的药物可以根据需要选择剂型，如片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂等。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施场景，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。上述本发明序号仅仅为了描述，不代表实施场景的优劣。
Claims (4)
1.咖啡酸在预防和治疗结直肠癌中的应用，其特征在于，包括以下应用中的一种或几种：
在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的应用、
在制备结直肠癌细胞侵袭抑制剂中的应用、
在制备结直肠癌细胞干性维持抑制剂中的应用、
在制备抑制或治疗结直肠癌肿瘤迁移的药物中的应用、
在制备防复发和/或治疗结直肠癌肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述咖啡酸作为磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点抑制干性核心转录因子SOX2、CD44的转录活性及表达，影响所述干性核心转录因子的表观遗传修饰功效，从而抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭能力。
3.一种基于如权利要求1-2任一权利要求所述应用的含咖啡酸的药物，其特征在于，包括：
咖啡酸或咖啡酸化学衍生物，用于作为磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，通过特异性阻断PI3-K分子靶点抑制干性核心转录因子SOX2、CD44的转录活性及表达，影响所述干性核心转录因子的表观遗传修饰功效，抑制结直肠癌肿瘤细胞的生长和/或抑制结直肠癌肿瘤的复发、转移。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，包括：
片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂中的任一剂型。
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