CN114748518A - 含有咖啡酸酯和灯盏花素的口服制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有咖啡酸酯和灯盏花素的口服制剂及其制备方法和应用，包括胶囊、片剂、口服液、滴丸或颗粒剂等常见口服剂型，本发明提供的制备工艺充分利用了灯盏细辛中咖啡酸酯成分以及降低了其他有害和无效物质含量，并且可将灯盏花素及咖啡酸酯成盐，提高药效，在提供肝保护的同时，具有抗肿瘤作用，为临床提供更加方便、有效、质量更加可控的现代中药。

Description

含有咖啡酸酯和灯盏花素的口服制剂及其制备方法
技术领域
尤其涉及一种灯盏花素或其盐和咖啡酸酯提取物或其盐的制备方法和应用，特别是在制 备治疗高脂血引起的心脑血管疾病及非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用，以及在制备抗肿瘤 药物中的应用。
背景技术
近年来，随着人口老龄化加速、城市化程度不断加深以及生活方式的逐步改变，疾病谱也发 生了重大变化。高血压病、冠心病、糖尿病等慢性非传染性疾病广泛流行，由此导致的心脑 血管疾病及恶性肿瘤的发病率也呈加速上升趋势。
灯盏细辛(灯盏花)是菊科飞蓬属植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz 的干燥全草，性味辛、微苦，温，具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通络止痛之功，用 于感冒头痛，风湿疼痛，脑血管意外引起的瘫痪等(《全国中草药汇编》)。灯盏细辛可单独成 药，现有上市的品种包括灯盏细辛注射液、灯盏细辛胶囊、灯盏细辛软胶囊、灯盏细辛滴丸、 益脉康、灯盏细辛颗粒等；灯盏细辛中的有效成分为黄酮类的灯盏花素和咖啡酸酯类成分， 而现有产品中主要强调的是灯盏花素为代表的灯盏花素类，灯盏花素类产品包括灯盏花素注 射液、注射用灯盏花素、灯盏花素片、灯盏花素滴丸等。即便是灯盏细辛胶囊，益脉康等灯 盏细辛提取物的产品，也不对咖啡酸酯的含量做出规定，更谈不上富集。灯盏细辛注射液是 唯一一个从工艺上对咖啡酸酯类富集的产品。但其咖啡酸酯的含量与黄酮类成分的比例也仅 在1:1.2-1:5.5范围内。通过对灯盏细辛植物中咖啡酸酯类物质的研究，发现灯盏细辛中的咖 啡酸酯成分十分丰富，包括了单咖啡酸酯和二咖啡酸酯类成分。植物中含有咖啡酸酯的科属 很多，例如菊科、忍冬科、杜仲科、川续断科、茜草科、旋花科等植物。目前已知菊科植物 与其他含咖啡酰奎宁酸植物不同的是其中还有一类咖啡酰辛酮糖酸类化合物，分别有单咖啡 酰、二咖啡酰及三咖啡酰辛酮糖酸类物质。灯盏细辛里含有的咖啡酰辛酮糖酸类的是二咖啡 酰辛酮糖酸类物质包括飞蓬酯乙和灯盏细辛酯，飞蓬酯乙是从菊科飞蓬属植物中分离得到的， 而灯盏细辛酯现仅从灯盏细辛中得到。JianpingZhao,等人(J.Nat.Prod.2014,77,509-515) 报道从果香菊属植物果香菊中得到的六个咖啡酰辛酮糖酸具有抗炎和抗代谢紊乱作用，因而 将此类特殊类型的二咖啡酸酯类化合物单独列出含量范围，可以更好地对从灯盏细辛里得到 的咖啡酸酯类成分做出明晰地分类和含量控制，从而使灯盏细辛的有效成分的含量更容易控 制，也可使这类产品质量更加可控。灯盏细辛草中还存在一类肝毒性物质γ-吡喃酮类成分， 代表化合物为焦袂康酸，以往的专利去除焦袂康酸的方法是采取柱层析方法，所利用的性质 为焦袂康酸的极性较大，在柱层析中用水洗的方法就能去除，但如果提取溶剂必须是低浓度 醇或者水提，否则叶绿素等杂质容易凝固在吸附柱上，造成无法洗脱或者导致柱子再生困难。 本专利通过将酸化上清液调节pH至中性后先微滤，将不溶性大分子杂质去除，包括大部分 叶绿素，蛋白，鞣质等，再通过纳滤膜浓缩，由于纳滤膜能将小分子和水滤过，作为既能溶 于水，且分子量仅有112Da的焦袂康酸，90％的焦袂康酸均能去除。去除后的浓缩液上柱， 使得上柱液能更有效地进行分离纯化。并且还能在第一步提取时候用50-80％乙醇提取，增加 提取率。提取精制后的灯盏花素和咖啡酸酯可以直接干燥成分后入药，也可将灯盏花素类和 咖啡酸酯类成分调节pH至中性，成盐后喷雾干燥，增加水溶性，更增加两类成分的成药性。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种含有咖啡酸酯和灯盏花素的口服制剂， 其中，该口服制剂含有咖啡酸酯或其盐和灯盏花素其盐以及药学可接受的辅料，咖啡酸酯或 其盐和灯盏花素或其盐的重量比为5:1～30:1。
目前所述灯盏细辛口服制剂所提取方法所限，通常制剂为咖啡酸酯、灯盏花素、以及其 他物质的混合物，无法对其进行精确混合。本发明采用独特的制备方法，分别对于其中的主 要成分进行提取，特别是对其盐类进行制备，有效的促进了药效。
优选地，本发明进一步提供一种含有咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐的口服制剂，所 述的咖啡酸酯或其盐包括二咖啡酸酯或其盐和单咖啡酸酯或其盐，其中二咖啡酸酯或其盐与 灯盏花素或其盐的重量比为3.8:1～8:1，单咖啡酸酯或其盐与二咖啡酸酯或其盐的重量比为 1:2-1:8。
优选地，本发明进一步提供一种含有咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐的口服制剂，所 述的二咖啡酸酯盐包括1,3-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,5-O- 二咖啡酰奎宁酸或其盐、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、飞蓬酯乙或其盐、灯盏细辛酯或其盐； 单咖啡酸酯或其盐包括3-O-咖啡酰奎宁酸或其盐，4-O-咖啡酰奎宁酸或其盐，5-O-咖啡酰奎 宁酸或其盐，灯盏花苷或其盐。
优选地，本发明进一步提供一种含有咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐的口服制剂，所 述的二咖啡酸酯或其盐中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,5-O- 二咖啡酰奎宁酸或其盐、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐，上述四个为同分异构体，合称简单取 代二咖啡酸酯或其盐；所述的飞蓬酯乙或其盐和灯盏细辛酯或其盐为同分异构体，其为二咖 啡酰辛酮糖酸或其盐类，其中简单取代二咖啡酸酯或其盐与二咖啡酰辛酮糖酸或其盐的比例 为2:1～0.9:1。
上述口服制剂优选为硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、口服液、滴丸、水丸、散剂、丸剂。
上述口服制剂的灯盏花素或其盐包括灯盏花乙素或其盐，灯盏花甲素或其盐，野黄芩素 其盐等从灯盏花中分离得到的灯盏花乙素或其盐相关的黄酮化合物或其盐。
上述制剂中咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐占该制剂重量百分比的80-99％，余量为辅 料。该口服制剂优选为胶囊剂或片剂等口服制剂，例如硬胶囊。
进一步地，所述二咖啡酸酯盐和灯盏花素盐均为钠盐或钾盐或其他能药用且溶于水的盐； 其重量比为5:1～30:1。优选6:1-15:1，更优选6.5:1-12:1，最优选7:1-10:1，最优选实施例 8:1左右，即其他产物也应该优选为钠盐。
本发明进一步提供一种口服制剂的制备方法，所述制备方法如下：
取灯盏细辛加10-90％浓度含水乙醇提取，提取液减压浓缩成浸膏；浸膏加水溶解，调节 pH 7-9，滤过，加酸调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液及沉淀，沉淀用水和乙醇精制， 干燥后得到灯盏花素；沉淀精制后加入碱调节pH值至7～8，喷雾干燥得灯盏花素盐；所述 酸化的滤液调节pH值至7～9，用陶瓷微滤膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用有机纳滤 膜进行浓缩，浓缩液通过聚酰胺层析柱，用水洗脱后，用50-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液， 浓缩后干燥得到咖啡酸酯；乙醇洗脱液浓缩后调节pH值至7～9，过滤，滤液喷雾干燥得咖 啡酸酯盐。将二咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐的重量比为5:1～30:1，优选6:1-15:1，更 优选6.5:1-12:1，最优选7:1-10:1，最优选实施例8:1的比例配伍，得到灯盏细辛口服制剂， 加入适当辅料，可制成片剂，胶囊剂，软胶囊剂，滴丸，颗粒剂和口服液体制剂。
在上述口服制剂的制备方法中，所述的所述的碱调节溶液pH值用的是NaOH,Na2CO3, NaHCO3,KOH,K2CO3或KHCO3，或其他可用于调节pH值的碱溶液；所述的酸调节溶液pH值用 的是HCl，H2SO4或H3PO4，或其他可用于调节pH值的酸溶液。
所述的聚酰胺层析柱所用乙醇洗脱的乙醇浓度为50-95％。
上述药用组合物在制备治疗高脂血引起的心脑血管疾病及非酒精性脂肪肝疾病药物中的 应用；尤其是，经过重复性药理药效学实验证明，本发明的上述组合物还具有抗肿瘤作用， 即，本发明的上述药物组合物还具有在制备抗肿瘤药物中的应用。上述肿瘤包括肠癌、肺癌、 肝癌等呼吸或消化系统的肿瘤。适合于非酒精性脂肪肝病人的消化系统肿瘤的发生，包括结 直肠癌、肝癌等。
目前市场上存在的灯盏细辛单方口服制剂没有去除肝毒性成分焦袂康酸的步骤，也没有 精制咖啡酸酯类或其盐成分尤其是二咖啡酸酯或其盐类成分的步骤或过程。例如灯盏细辛胶 囊的现有工艺为取灯盏细辛2000g，用80％乙醇加热回流提取二次第一次1.5小时，第二次 1小时，合并提取液，加入活性炭约640g，煮沸，滤过，滤液减压浓缩至稠膏状，加人适 量的淀粉，减压干燥，粉碎，过筛，用3％聚乙烯醇溶液包衣，加人硬脂酸镁0.5g，混匀， 装人胶囊，制成1000粒，即得。
文献报道咖啡酰奎宁酸类化合物具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗病毒，抗高血糖、高血脂， 免疫调节等作用，是一类活性成分。因而将此类活性物质精制，并做定量规定是使灯盏细辛 产品更好地为临床服务的必要工作。灯盏花素和咖啡酸酯类物质的水溶性和脂溶性都较差， 导致生物利用度低，成药性弱。本发明从制法上采用碱溶酸沉，先将黄酮类成分灯盏花素进 行沉淀，进而精制；同时保留酸化上清液部分，酸化上清液部分为另一类活性成分咖啡酸酯 类，通过膜分离技术，先用微滤去除大分子不溶性物质，再用纳滤膜浓缩去除大部分的焦袂 康酸再进行柱层析，富集二咖啡酸酯类成分，再次出去而具有肝毒性的焦袂康酸。经过纳滤 膜和柱层析后，焦袂康酸去除了99％以上。
这一结果通过实验得以证实：
表1.灯盏细辛酸化上清液调pH后膜过滤后成分含量变化表
Figure BDA0003435784810000041
从表1可以看出，灯盏细辛酸化上清液调节pH接近中性后过澄清膜和纳滤浓缩膜后有 效物质二咖啡酸酯得到较好地保留，而有害物质焦袂康酸的去除84％。经过柱层析后，二咖 啡酸酯含量保留较好，进一步去除了焦袂康酸。
所述微滤澄清膜优选100nm或200nm，所述纳滤浓缩膜优选300D-400D。
当其中黄酮类成分和咖啡酸酯类成分成盐后，小鼠体外溶出度实验证明溶出高于原型， 因而在成药性上好于原型。评价了灯盏细辛片和灯盏细辛钠盐片在不同溶出介质中的溶出曲 线。研究结果表明两种片剂在0.1MHCl中的溶出度都较低，5min时即达到饱和，累积溶出 百分量小于15％；。在pH4.5的醋酸盐缓冲液溶出介质中，两种片剂片在pH4.5的醋酸盐中累 积释放量在30min基本达到饱和，但30min时累积溶出百分率灯盏细辛钠盐片高于原型片， 均小于60％。在pH6.8的磷酸盐缓冲液溶出介质中，当转速为50rpm时灯盏细辛钠盐片在pH6.8 的磷酸盐缓冲液中15min时已完全溶出，而灯盏细辛片需到45min时累积溶出百分率大于 85％；在30min时累积溶出百分率灯盏细辛钠盐片大于灯盏细辛片。
通过MCD(Methionine and Choline Deficient L-Amino Acid Diet)蛋氨酸及胆碱缺乏饲料 饲喂C57小鼠，构建非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型，探究现有灯盏细辛胶囊和发明工 艺灯盏细辛胶囊对NASH的治疗效果。
1.试验试剂
MCD饲料，货号A02082002BR，厂家：Research Diets(USA)
2、试验过程
(1)、动物分组及处理将20只C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养1周后随机分为4组，每组5只。对照组为正常维持饲料，模型组饲喂MCD饲料，现有灯盏细辛胶囊粉组和发明 工艺灯盏细辛胶囊粉组(处方见实施例6)，口服液灌胃给药(100mg/kg.bw)，每天1次。 实验动物自由摄食和饮水，干预4周。(2)、小鼠体重和肝重测定称取各组小鼠体重、肝 湿重，并计算肝脏指数。
3、试验结果
(1)、对小鼠体重、肝重和肝脏指数的影响饲养4周后，模型组、现有灯盏细辛胶囊粉组、 发明工艺灯盏细辛胶囊粉组小鼠体重、肝重及肝脏指数与对照组相比均显著降低，说明受试 药物不能有效改善MCD饮食诱导的体重、肝重的降低。另外，2种受试药物和模型组在体重、 肝重及肝脏指数相比无明显差异，见表2。
表2.灯盏细辛胶囊粉对小鼠体重、肝重、肝脏指数的影响
组别 体重(g) 肝重(g) 肝脏指数(％)
对照组 27.08±1.46 1.43±0.15 5.31±0.36
模型组 21.94±1.25 1.91±0.24 8.69±0.75
发明工艺灯盏细辛组 22.12±0.56 1.88±0.11 8.49±0.36
现有工艺灯盏细辛组 22.68±0.22 1.97±0.35 8.77±0.22
(2)、对小鼠肝功能指标的影响与对照组相比，模型组小鼠血清谷丙转氨酶(AST)、谷草 转氨酶(ALT)水平明显升高(P＜0.001)。发明工艺灯盏细辛胶囊粉组小鼠血清AST、ALT 水平均高于对照组，但与模型组相比，发明工艺灯盏细辛胶囊粉显著抑制了MCD饮食诱导 的小鼠血清AST、ALT的升高；现有工艺灯盏细辛组可明显降低ALT水平，对AST有降低 趋势，但无统计学意义，见表3。
表3.发明工艺灯盏细辛胶囊粉和现有灯盏生脉胶囊粉对小鼠肝功能指标的影响
组别 谷丙转氨酶(U/L) 谷草转氨酶(U/L)
对照组 37.2±6.57 103.2±22.9
模型组 160.8±49.2<sup>###</sup> 181.2±34.1<sup>###</sup>
发明工艺灯盏细辛组 101.6±28.2*<sup>#</sup> 132.1±22.1*
现有工艺灯盏细辛组 100.1±22.4*<sup>#</sup> 162.2±21.6<sup>##</sup>
###P<0.005vs对照组；##P<0.01vs对照组；#P<0.05vs对照组；*P<0.05vs模型组
4、分析与结论
(1)、对体重的影响MCD饮食诱导的NASH小鼠体重减轻是该膳食模型的一个缺点。本 次研究发现，发明工艺灯盏细辛胶囊粉、现有工艺灯盏细辛胶囊粉并不能抑制MCD饮食诱 导的体重减轻，这可能与MCD饮食的结构有关。
(2)、对肝功能的影响MCD饮食喂养的小鼠血清ALT和AST水平均显著升高，说明示MCD饮食诱导的NASH模型建立成功。本次研究发现，发明工艺灯盏细辛胶囊粉、现有工 艺灯盏细辛胶囊粉能够改善MCD饮食诱导的NASH，而发明工艺灯盏细辛胶囊粉对ALT和 AST均具有下调作用。
现有灯盏细辛胶囊粉为灯盏花素盐与咖啡酸酯盐以权利要求范围内的比例配制而成，用灯 盏花素或其盐与咖啡酸酯或其盐配制成的粉具有相似的效果。现有技术和本发明，区别在于 生产方法不同，得到的成分，不同的含量具有明显的差异，虽然之前的文献证明野黄芩苷或 灯盏乙素具有改善肝脏因子的作用，但在灯盏细辛胶囊层次，以口服方式进行验证，发现不 同工艺之间，本发明所得到的胶囊功能更加全面地改善非酒精行脂肪肝的相关因子。
由于非酒精性脂肪肝通常与高脂高碳水化合物饮食相关，以前的文献发现，脂肪肝常常与 消化道肿瘤，例如胃癌、肠癌的发生率显著相关，为了阐明发明药物在治疗非酒精性脂肪性 肝病的同时，是否具有抗肿瘤功能，申请人的研究人员专门对于实施例6进行多重组合的配 比，重点考证是否具有抗肠癌的功能。
附图说明：
图1灯盏细辛对人肠癌细胞HCT116毒性试验；
图2灯盏细辛对人肠癌细胞Caco2毒性试验；
图3灯盏细辛抑制HCT116细胞增殖作用；
图4灯盏细辛1.25：1配比各浓度抑制HCT116细胞增殖作用；
图5灯盏细辛2：1配比各浓度抑制HCT116细胞增殖作用；
图6灯盏细辛4：1配比各浓度辛抑制HCT116细胞增殖作用；
图7灯盏细辛6：1配比各浓度抑制HCT116细胞增殖作用；
图8灯盏细辛8：1配比各浓度抑制HCT116细胞增殖作用；
图9对照灯盏细辛各浓度抑制HCT116细胞增殖作用；
图10灯盏细辛抑制Caco2细胞增殖作用；
图11灯盏细辛1.25：1配比组各浓度抑制Caco2细胞增殖作用；
图12灯盏细辛2：1配比组各浓度抑制Caco2细胞增殖作用；
图13灯盏细4：1配比组各浓度辛抑制Caco2细胞增殖作用；
图14灯盏细辛6：1配比组各浓度抑制Caco2细胞增殖作用；
图15灯盏细辛8：1配比组各浓度抑制Caco2细胞增殖作用；
图16对照灯盏细辛抑制Caco2细胞增殖作用；
图17体重变化；
图18灯盏细辛对荷瘤小鼠生存率影响；
图19各组小鼠的结直肠长度(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vs sham)；
图20肿瘤个数(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vs sham)；
图21肿瘤负荷(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vs sham)。
肿瘤研究部分：
一、细胞试验
1.实验材料：
细胞：生长状态良好的两种人结直肠癌细胞：HCT116，CaCo2。
培养基：HCT116：IMDM+10％FBS；CaCo2：MEM+15％FBS。
培养条件：37℃，5％CO2。
实验药品：实验灯盏细辛(发明工艺)各配比药物，对照灯盏细辛(现有工艺)胶囊内 容物：药物粉末于4℃保存，细胞加药时用培养基配制为1mg/mL的母液，涡旋振荡至完全溶解，并稀释成相应浓度待用。
2.细胞毒性实验：(药物对肿瘤细胞的杀伤作用)
2.1实验方法：
细胞消化后制成单细胞悬液，HCT116细胞和CaCo2细胞分别以4*104个/孔、1.5*104个/孔的密度接种在96孔板中。
接种24小时后，将96孔板换为含有配比药物(发明工艺，二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐 1.25:1、2:1、4:1、6:1、8:1)和对照药物(ds:现有工艺昊邦灯盏细辛胶囊内容物)的培养基， 终浓度为30/100/300μg/mL。每个浓度设置5个复孔，同时设置5个溶剂对照孔和1个cck-8 检测对照孔。
加药后24小时后进行cck-8测定，并根据测定数据绘制细胞毒性曲线。
2.2实验结果：
2.2.1灯盏细辛对人直肠癌细胞HCT116的杀伤作用
细胞经不同浓度的配比药物处理24小时后，使用cck-8法检测存活细胞。结果如图1所 示，采用HCT116细胞，实验灯盏细辛(发明工艺)二咖啡酸酯盐和灯盏花素盐6:1、8:1两配比在药物浓度大于100μg/mL剂量下对肠癌细胞有一定杀伤作用，但没有显著性；二咖啡酸酯盐和灯盏花素盐4:1、6:1、8:1三配比在药物浓度大于300μg/mL剂量下有细胞毒作用，但没有显著性。
2.2.2灯盏细辛对人直肠癌细胞Caco2的细胞杀伤作用
对于人肠癌CaCo2细胞，不同配比实验灯盏细辛(发明工艺)均显示一定杀伤作用，二 咖啡酸酯盐和灯盏花素盐8:1配比组在30μg/mL剂量下就能产生显著细胞毒性；4:1，6:1， 8:1组在100μg/mL剂量下产生显著细胞毒性；不同配比药物在300μg/mL剂量下都具有显著 的细胞毒作用，4:1，6:1，8:1组优于1.25:1，2:1组，更优于对照组(现有工艺)，(图2)统计学差异计算结果详见表4。
表4.灯盏细辛对人肠癌细胞Caco2毒性试验
比较\组别 ds 1.25:1 2:1 4:1 6:1 8:1
0vs 30 ns ns ns ns ns **
0vs 100 ns ns ns ** ** **
0vs 300 * ** ** *** *** ***
细胞贴壁后加药处理24小时，并使用cck-8法进行检测。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs 空白对照；ns：无显著性)。
3.细胞增殖实验方法：(药物对肿瘤细胞生长的抑制作用)
3.1实验方法：
细胞消化后制成单细胞悬液，HCT116细胞和CaCo2细胞分别以5*103个/孔、1.5*103个 /孔的密度接种在6个96孔板中。接种24小时后，先取一块96孔板进行cck-8测定，记录 为0day；剩余96孔板分别加入含不同配比药物(1.25:1、2:1、4:1、6:1、8:1)和对照药 物(ds:振邦灯盏细辛胶囊内容物)的培养基，HCT116细胞采用终浓度为10、30、100μg/mL 的药物剂量，CaCo2细胞采用3、10、30μg/mL的药物剂量，每浓度5复孔，另外设置5个 溶剂对照孔和1个cck-8检测对照孔。中间在3day时给细胞换液(含药物)一次。分别于 加药后的第24、48、72、96和120小时进行cck-8测定，记录为1day、2day、3day、4day、 5day。分析相应数据，并绘制细胞生长曲线。
3.2试验结果
3.2.1灯盏细辛对结直肠癌细胞HCT116增殖的抑制作用
不同配比药物抑制HCT116细胞增殖的作用结果见图3—图9，详细的统计学差异见附表 2。结果可知，在给药第1，第2天，药物抑制HCT116细胞增殖的作用不明显；给药第三天灯盏细辛(发明工艺)二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐6:1(100ug/mL)，8:1(100ug/mL)配比组 出现显著抑制细胞增殖作用；给药第四天1.25:1(100ug/mL)、2:1(30ug/mL,100ug/mL)、4:1(10ug/mL,30ug/mL,100ug/mL)、6:1(100ug/mL)、8:1(30ug/mL,100ug/mL)各组具有显著 抑制细胞增殖作用；给药第5天、6:1(100ug/mL)、8:1(30ug/mL,100ug/mL)配比组具有显 著抑制作用。各组比较，8:1配比组对HCT116细胞增殖抑制作用最优。(图4-图9)
表5 灯盏细辛抑制人结直肠癌细胞HCT116增殖的作用
Figure BDA0003435784810000091
Figure BDA0003435784810000101
(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs对照；ns，无显著性)。
3.2.2灯盏细辛对结直肠癌细胞Caco2增殖的抑制作用
药物抑制Caco2细胞增殖的作用结果见图10-16，详细的统计学差异见附表6。结果说明， 在给药后第1天，药物抑制Caco2细胞增殖的作用不明显，给药后第二天灯盏细辛(发明工 艺)二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐8:1(30ug/mL、100ug/mL)显著抑制细胞增殖；给药后第三天6:1(100ug/mL)、8:1(30ug/mL、100ug/mL)显著抑制细胞增殖，给药后第四天及第 5天1.25:1(30ug/mL)、2:1(30ug/mL)、4:1(30ug/mL)6:1(10ug/mL、30ug/mL)，8:1(10ug/mL、30ug/mL)。对照灯盏细辛无抑制结直肠癌细胞Caco2增殖作用。实验灯盏细辛(发明工艺)各配比组对Caco2细胞增殖抑制作用优于对照灯盏细辛(现有工艺)，其中以8:1配比组效果最优。
表6 灯盏细辛抑制人结直肠癌细胞HCT116增殖的作用
Figure BDA0003435784810000102
Figure BDA0003435784810000111
(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs空白；ns：无显著性) 二、动物试验
1.实验材料：
表7 供试品信息
名称 灯盏细辛配比药物 对照药
生产商 云南生物谷药业 云南昊邦灯盏细辛胶囊
批号
物理状态 棕色粉末 棕色粉末
储存条件 4度冷藏、密闭 4度冷藏、密闭
表8 试验动物信息
Figure BDA0003435784810000112
Figure BDA0003435784810000121
表9 饲料信息
饲料性质 对照饲料(NCD) 加药饲料
饲料名称 大小鼠维持饲料 含特定药物的大小鼠维持饲料
饲料配方 基础饲料 0.4％，药物重/饲料重(w/w)
供应商 小黍有泰 小黍有泰
储存条件 4℃ 4℃
2.试验方法：
(1)试验分组：C57BL/6N品系5周龄小鼠，适应环境1周后体重达到18-20克，分为假手术(sham)组、模型(model)组和药物治疗组。其中，模型和给药组小鼠通过腹腔注射AOM(azoxymethane，氧化偶氮甲烷，10mg/kg)进行造模，而sham组小鼠注射等体积的生 理盐水。
(2)给药：AOM注射一周后，治疗组小鼠开始喂食含药饲料(0.4％，w/w)，而sham 和模型组小鼠继续喂食普通大小鼠维持饲料。同时，模型和治疗组小鼠在饮水中添加DSS(Dextran Sulfate Sodium Salt，葡聚糖硫酸钠)以促进肿瘤发生。
(3)检测指标如下：
摄食量：每周1次称量并记录每笼饲料消耗量；
体重：每周称1次体重，观察动物的体重变化；
结直肠长度及组织病理学改变；
记数肿瘤个数，用游标卡尺测量每个肿瘤的直径(mm)，将每只小鼠肠道所有肿瘤的直径 求和，计算个体总的肿瘤负荷(tumor load)。
3.试验结果
3.1小鼠体重
造模及给药期间每周测定一次动物体重，结果见图17，表9。
造模期间，与假手术(sham)组相比，模型组小鼠分别在第3周首次给予1％DSS，以及第8周首次给予2％DSS后，出现了显著的体重下降。各给药组小鼠的体重在第3周首次 给予1％DSS后，没有出现严重的体重下降；第8周首次给予2％DSS后，各给药组和模型 组都出现了明显的体重下降，但相对来讲，灯盏细辛(发明工艺)有缓解实验动物体重下降 作用，其中二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐8:1配比组作用最优。对照灯盏细辛(现有工艺)无 减少荷瘤动物体重减轻作用。
表9.体重变化
group\week(s) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mode vs control ns ns ns # ns ns ns ns ## ##
mode vs ds ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
mode vs 1.25:1 ns ns ns ** ns ns ns ns ns ns
mode vs 2:1 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
mode vs 4:1 ns ns ns ** ns ns ns * ns ns
mode vs 6:1 ns ns ns * ns ns ns * ns ns
mode vs 8:1 ns ns ns ** ns ns ns ** ns ns
A：造模组与假手术(sham)组小鼠体重的比较；B：给药组小鼠的体重变化。(*P<0.05vs model， **P<0.01vs model，#P<0.05vs sham，##P<0.01vs sham；ns:无显著性)
3.2小鼠生存期
实验终点时，各组动物的存活情况如图18，表10所示。其中，大部分小鼠是在第8周进行2％DSS处理后死亡的。实验灯盏细辛(发明工艺)二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐8:1及 6:1配比组小鼠存活率较高，提示这些药物有提高荷瘤动物生存期作用。
表10.灯盏细辛对荷瘤小鼠生存率影响
组别 sham model ds 1.25:1 2:1 4:1 6:1 8:1
终点存活(只) 10 8 5 5 8 7 10 11
入组(只) 10 12 12 12 12 12 12 12
存活率(％) 100 66.7 41.7 41.7 66.7 58.3 83.3 91.7
3.3小鼠结直肠肿瘤指标
实验终点时，处死小鼠并取结直肠进行测量，结果如图19所示，与假手术组相比，模型 组的结直肠长度显著变短，实验灯盏细辛(发明工艺)二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐8:1配比 组有显著恢复结直肠长度作用。其它各组与模型组相比无统计学差异。
对小鼠结直肠内的肿瘤进行个数和体积测量，结果如图20，21所示，与模型组相比。实 验灯盏细辛(发明工艺)二咖啡酸酯盐：灯盏花素盐8:1配比组显著减少肿瘤个数(图20) 和肿瘤负荷(图21)，6:1配比组也有减少肿瘤个数和肿瘤负荷作用。其它各组作用不明显。
分析与结论
(1)、新工艺下的灯盏细辛提取物具有在较好抗肠癌作用；
(2)、灯盏细辛抗肠癌效应与其中两种重要成分二咖啡酸酯及灯盏花素配比相关；
(3)、对照药灯盏花素无明显抗肠癌作用，可能与药物的制备工艺、有效成分含量及配比 相关。
具体实施方式：
实施例1：原料药提取物制备
取灯盏细辛2000g加50％的含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓 缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％氢氧化钠溶液，调节pH 7.5～8.5，滤过，加10％硫酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液 及沉淀，沉淀乙醇精制，后加入5％氢氧化钠调节pH值至7～8，喷雾干燥得粉1；酸化的滤 液调节pH值至7～9，用100nm陶瓷膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用350D有机膜进 行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析柱(直径与长度比1:4)，用水洗脱3个柱体积后， 用65％乙醇洗脱4个柱体积，收集乙醇洗脱液，浓缩后调节pH值至7～9喷雾干燥得粉2； 将粉1与粉2按比例混合，得到灯盏花素钠盐粉和咖啡酸酯钠盐粉1:4的混合物，得到本发 明的药用组合物的原料药组合物成分。其中粉1含灯盏花乙素钠盐36.3％共计5.4g。粉2含 二咖啡酸酯盐21.0％共计30.9g，单咖啡酸酯盐9.1g。其中简单取代二咖啡酸酯盐为19.0g,二 咖啡酰辛酮糖酸盐为11.9g。得到的灯盏细辛总混粉162g。
实施例2：原料药提取物制备
取灯盏细辛2000g加50％的含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓 缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％氢氧化钠溶液，调节pH 7.5～8.5，滤过，加10％硫酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液 及沉淀，沉淀乙醇精制，减压干燥得粉1；酸化的滤液调节pH值至7～9，用100nm陶瓷膜 进行澄清，澄清后得到的澄清液再用350D有机膜进行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析 柱(直径与长度比1:4)，用水洗脱3个柱体积后，用65％乙醇洗脱4个柱体积，收集乙醇洗 脱液，浓缩后减压干燥得粉2；将粉1与粉2按比例混合，得到灯盏花素粉和咖啡酸酯粉1:4 的混合物，得到本发明的药用组合物的原料药组合物成分。其中粉1含灯盏花乙素35.7％共 计5.6g。粉2含二咖啡酸酯21.5％共计31.4g，单咖啡酸酯9.1g。其中简单取代二咖啡酸酯为18.5g,二咖啡酰辛酮糖酸为12.9g。得到的灯盏细辛总混粉161.7g。
实施例3：原料药提取物制备
取灯盏细辛3000g加入60％的含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压 浓缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％氢氧化钠 溶液，调节pH 7～9，滤过，加10％盐酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液及沉淀，沉淀乙醇精制，加入5％氢氧化钠调节pH值至7～8，喷雾干燥得粉1；
酸化的滤液调节pH值至7～9，用200nm陶瓷膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用400D有机膜进行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析柱(直径与长度比1:4)，用3个柱体积的水洗脱后，用3个柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩后调节pH值至7～9 喷雾干燥得粉2；得到粉1约18.7g，粉2约208.3g，将粉1和粉2按比例混合，得到灯盏花 素钠盐粉和咖啡酸酯钠盐粉1:3的混合物，得到本发明的药用组合物的原料药组合物成分。
其中粉1含灯盏花乙素钠盐45％共计8.4g。粉2含二咖啡酸酯盐18.6％共计38.7g，单 咖啡酸酯盐7.3g。其中简单取代二咖啡酸酯盐为18.3g,二咖啡酰辛酮糖酸盐为20.4g。
实施例4：原料药提取物制备
取灯盏细辛3000g加入65％的含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压 浓缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％氢氧化钠 溶液，调节pH 7～9，滤过，加10％盐酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液及沉淀，沉淀乙醇精制，减压得粉1；酸化的滤液调节pH值至7～9，用200nm陶瓷膜进行澄清， 澄清后得到的澄清液再用400D有机膜进行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析柱(直径与长度比1:4)，用3个柱体积的水洗脱后，用3个柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液， 浓缩后调节pH值至7～9喷雾干燥得粉2；得到粉1约25.3g，粉2约223g，将粉1和粉2 按比例混合，得到灯盏花素和二咖啡酸酯钠盐粉1:3.5的混合物，得到本发明的药用组合物的 原料药组合物成分。
其中粉1含灯盏花乙素32％共计8.1g。粉2含二咖啡酸酯盐12.7％共计28.4g，单咖啡 酸酯盐7.3g。其中简单取代二咖啡酸酯盐为13.4g,二咖啡酰辛酮糖酸盐为15g。
实施例5：原料药提取物制备
取灯盏细辛2500g加75％浓度含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压 浓缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％氢氧化钠 溶液，调节pH 7.5～9.0，滤过，加10％硫酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液及沉淀，沉淀乙醇精制，加入5％氢氧化钠调节pH值至7～8，喷雾干燥得粉1；
酸化滤液调节pH值至7～9，用100nm陶瓷膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用300D 有机膜进行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析柱(直径与长度比1:4)，用3.5个柱体积水 洗脱后，用3个柱体积的75％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩后调节pH值至7～9喷雾干 燥得粉2；得到13.5g的粉1和164g的粉2，将得到的灯盏花素钠盐粉和咖啡酸酯钠盐粉按 照1:2混合，得到本发明的药用组合物的原料药组合物成分。其中粉1含灯盏花乙素钠盐51％ 共计6.9g。粉2含二咖啡酸酯盐19.5％共计32.0g，单咖啡酸酯盐9.7g。其中简单取代二咖啡 酸酯盐为19.6g,二咖啡酰辛酮糖酸盐为12.4g。
发明人也同时分别用10％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、75％、90％不同浓度 的含水乙醇来提取灯盏细辛，其他步骤与实施例1相同，在经过酸化过膜浓缩之后，得到喷 雾干粉，实验证明10-90％的乙醇提取均可得到灯盏提取物，但从得率、过膜速率、杂质含量、 粉末的堆密度和均匀度、工业生产成本等指标衡量，40％以上的乙醇得到的提取物相对更优 于40％以下的乙醇提取物，40-75％的乙醇提取物明显更好更适合本发明的工艺，其中最优选 采用50％的乙醇来提取灯盏细辛。
实施例6：发明工艺与现有工艺中有效成分含量区别
发明工艺：取灯盏细辛2000g加50％的含水乙醇煎煮两次，每次2小时，滤过，合并滤 液，减压浓缩成浸膏(相对密度1.15-1.25，75℃)；浸膏加5倍量的水溶解，搅拌下加入5％ 氢氧化钠溶液，调节pH 7.5～8.5，滤过，加10％硫酸溶液调节pH 1～3，放置过夜，滤过， 收集滤液及沉淀，沉淀乙醇精制，后加入5％氢氧化钠调节pH值至7～8，喷雾干燥得粉1； 酸化的滤液调节pH值至7～9，用100nm陶瓷膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用350D有机膜进行浓缩，浓缩液通过30-60目聚酰胺层析柱(直径与长度比1:4)，用水洗脱3个柱体积后，用65％乙醇洗脱4个柱体积，收集乙醇洗脱液，用乙酸乙酯精制，浓缩后调节pH值至7～9喷雾干燥得粉2；将15g粉1与15g粉2混合，得到灯盏花素钠盐粉和咖啡酸酯钠盐 粉。
现有工艺：取灯盏细辛2000g，用80％乙醇回流提取二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并提取液，加入活性炭约640g，煮沸，滤过，滤液减压浓缩至稠膏状，加入适量淀粉，减压干燥，粉碎，过筛。得到灯盏细辛提取粉。
以总混粉重量为分母，各类型成分重量为分子计算含量表11
表11.现有工艺与发明工艺各成分比较
Figure BDA0003435784810000171
灯盏花素为药典所规定提取物，主要成分为灯盏花乙素以及其他物质，例如灯盏花甲素、 芹菜素，野黄芩素等，但含量测定以灯盏花乙素表示。
实施例5：胶囊的制备
取实施例1制备的提取混合物167g,加入淀粉18g,混匀，填充胶囊中，即得。
实施例6：胶囊的制备
取实施例2制备的提取混合物151g,加入淀粉29g,混匀，填充胶囊中，即得。
实施例7：胶囊的制备
取实施例1制备的提取混合物142g,加入淀粉34g,硬脂酸镁4g混匀，填充胶囊中即得。
实施例8：片剂的制备
取实施例2制备的提取混合物151g，淀粉100g，糊精10g，过14目筛制粒，60-70℃通风干燥，加硬脂酸镁3g。压制成片，包衣即得。
实施例9：滴丸的制备
取实施例3制备的提取混合物15g，投入45g聚乙二醇4000，混合均匀，熔融，滴入低温液体石蜡中，选丸，除液体石蜡，即得。
实施例10:口服液的制备
取实施例1制备的提取混合物20g，与蜂蜜300g、蔗糖50g、苯甲酸钠2g及蒸馏水300ml 混合，加热溶解，保温过滤，即得。
实施例11：颗粒剂的制备
取实施例3制备的提取混合物9g，与40g微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液 制软材，过18目筛制颗粒，600℃干燥30～45分钟，整粒，加入4g滑石粉，混匀，整 粒，装袋，即得。
实施例12：软胶囊的制备
取实施例3制备的提取混合物120g，加入甘油5％、甘氨酸1％，加聚乙二醇400至400g， 混匀，压制成软胶囊1000粒，即得。

Claims (10)

1.一种含有咖啡酸酯和灯盏花素的口服制剂，其特征在于，该口服制剂含有咖啡酸酯或其盐和灯盏花或其盐以及药学可接受的辅料，咖啡酸酯盐或其盐和灯盏花素或其盐的重量比为5:1～30:1。
2.如权利要求1所述的口服制剂，其特征在于，所述的咖啡酸酯或其盐包括二咖啡酸酯或其盐和单咖啡酸酯或其盐，其中二咖啡酸酯或其盐与灯盏花素或其盐的重量比为3.8:1～8:1，单咖啡酸酯或其盐与二咖啡酸酯或其盐的重量比为1:2～1:8。
3.如权利要求2所述的口服制剂，其特征在于，所述的二咖啡酸酯或其盐包括1,3-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、飞蓬酯乙或其盐、灯盏细辛酯或其盐；单咖啡酸酯盐包括3-O-咖啡酰奎宁酸或其盐，4-O-咖啡酰奎宁酸或其盐，5-O-咖啡酰奎宁酸或其盐，灯盏花苷或其盐。
4.如权利要求3所述的口服制剂，其特征在于，所述的二咖啡酸酯盐中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸或其盐合称简单取代二咖啡酸酯或其盐；所述的飞蓬酯乙或其盐和灯盏细辛酯或其盐为同分异构体，其为二咖啡酰辛酮糖酸或其盐类，其中简单取代二咖啡酸酯或其盐与二咖啡酰辛酮糖酸或盐的比例为2:1～0.9:1。
5.如权利要求1-4任一项所述的口服制剂，其特征在于，该口服制剂为硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、口服液、滴丸、水丸、散剂、丸剂。
6.如权利要求5所述的口服制剂，其特征在于，所述咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐重量比为5:1～30:1，咖啡酸酯盐和灯盏花素盐为钠盐或钾盐或其他能药用且溶于水的盐；。
7.如权利要求1所述口服制剂的制备方法，其特征在于：取灯盏细辛加10-90％浓度含水乙醇提取，提取液减压浓缩成浸膏；浸膏加水溶解，调节pH 7-9，滤过，加酸调节pH 1～3，放置过夜，滤过，收集滤液及沉淀，沉淀用水和乙醇精制，干燥后得到灯盏花素；沉淀精制后加入碱调节pH至7～8，喷雾干燥得灯盏花素盐；所述酸化的滤液调节pH至7～9，用陶瓷微滤膜进行澄清，澄清后得到的澄清液再用有机纳滤膜进行浓缩，浓缩液通过聚酰胺层析柱，用水洗脱后，用50-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩后干燥得到咖啡酸酯；乙醇洗脱液浓缩后调节pH至7～9，过滤，滤液喷雾干燥得咖啡酸酯盐；将咖啡酸酯或其盐和灯盏花素或其盐按5:1～30:1的比例配伍，得到灯盏细辛口服制剂，加入适当辅料，可制成片剂，胶囊剂，软胶囊剂，滴丸，颗粒剂和口服液体制剂。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的碱调节溶液pH值用的是NaOH,Na2CO3,NaHCO3,KOH,K2CO3或KHCO3，或其他可用于调节pH值的碱溶液；所述的酸调节溶液pH值用的是HCl，H2SO4或H3PO4，或其他可用于调节pH值的酸溶液。
9.权利要求1所述的口服制剂在制备治疗高脂血引起的心脑血管疾病及非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用。
10.权利要求1所述的口服制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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