CN105163728A

CN105163728A - 包含蜂胶提取物的治疗性组合物和其用途

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Publication number: CN105163728A
Application number: CN201480022371.8A
Authority: CN
Inventors: K·保罗; O·卡奇普尔; K·米切尔
Original assignee: Manuka Health New Zealand Ltd
Current assignee: Manuka Health New Zealand Ltd
Priority date: 2013-04-05
Filing date: 2014-04-07
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2034-04-07
Also published as: EP2981254A1; AU2014250138A1; US20160030364A1; HK1215859A1; EP2981254A4; CN105163728B; AU2014250138B2; WO2014163512A1; JP6444984B2; JP2016515615A; TW201517901A; EP2981254B1

Abstract

本发明提供了包含如下化合物的医药组合物：包括5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯。还提供了使用这类组合物的方法，特别是治疗或预防胃肠癌以及使胃肠癌对疗法重新敏感。

Description

包含蜂胶提取物的治疗性组合物和其用途

技术领域

本发明涉及用于治疗和预防胃肠癌的组合物。特别地，本发明涉及含有来源于蜂胶的化合物的抗胃肠癌组合物，包括包含富集有这些化合物中的一者或多者的一种或多种蜂胶提取物的抗胃肠癌组合物。特别预期这类组合物治疗或预防结肠直肠癌、咽喉癌以及胃癌的用途。

背景技术

结肠直肠癌据报导分别是来自发达国家的女性和男性中的第二大和第三大最常见癌症。结肠直肠癌在发达国家中更为普遍-美国、澳大利亚、欧洲以及新西兰具有最高比率-其发病率比发展中国家高多达10倍。虽然手术可以是有效的，但早期检测对于积极的手术结果是关键的。其它疗法主要针对寿命延长和姑息护理，因为当前化学疗法和放射疗法治疗原发性肿瘤或在淋巴结外部的转移的功效有争论。

咽喉癌，也称作食管癌、咽癌或喉癌，包涵在咽、鼻咽、口咽、下咽部、喉(喉头)或扁桃体的组织中发展的肿瘤。用于咽喉癌的疗法包括手术、放射疗法或化学疗法。用于咽喉癌的治疗可以损伤咽喉并且可能导致患者饮食、呼吸以及睡眠的方式改变。

胃癌是世界上癌症相关死亡的第二大最常见原因。诊断常常延迟，因为症状在疾病的早期可能不出现。用以去除胃的手术(胃切除术)是可以治愈胃癌的唯一治疗。在手术之后的化学疗法和辐射疗法可以改善治愈的机率。

因此，需要抗胃肠癌组合物，包括适合用于治疗或预防结肠直肠癌、胃癌或咽喉癌的那些和能够支持针对结肠直肠癌、胃癌或咽喉癌的抗胃肠癌活性的维持或加强抗胃肠癌活性的那些。

本发明的一个目的在于提供用于治疗或预防包括结肠直肠癌、胃癌以及咽喉癌的胃肠癌的抗胃肠癌组合物，包括稳定的抗胃肠癌组合物，或至少为公众提供有用的选择。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及一种医药组合物，其包含治疗有效量的式(I)或(II)化合物：

其中：

Z为O或羟基；

X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_1-6烷基；

______当Z为O时为单键或当Z为羟基时不存在；

为单键或双键；并且

R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是R¹和R²中的至少一者为羟基；并且

条件是当X为H并且为双键时R¹和R²不都为羟基；

其中：

R^a为氢、C_2-6烯基、芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基；

m为1或2；并且

R¹⁰和R²⁰各自独立地为氢、羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是当R¹⁰和R²⁰都为羟基时R^a不为芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基。

在一个实施方案中，式(I)化合物是式(IA)化合物：

在一个实施方案中，X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_2-5烷基。

在一个实施方案中，X为氢或C_1-6烷基C(O)O。

在一个实施方案中，C_1-6烷基C(O)O为MeC(O)O。

在一个实施方案中，R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基。

在一个实施方案中，R¹为羟基并且R²为C_1-6烷氧基，R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基，或R¹和R²各自为羟基。

在一个实施方案中，C_1-6烷氧基为OMe。

在一个实施方案中，Z为O；______为单键；为单键；X为C_1-6烷基C(O)O；并且R¹和R²各自为羟基。

在一个实施方案中，Z为O并且______为单键或Z为羟基并且______不存在；为双键；X为氢；并且R¹为羟基并且R²为C_1-6烷氧基或R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基。

在一个实施方案中，R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基。

在一个实施方案中，Z为O；并且______为单键。

在一个实施方案中，Z为羟基；并且______不存在。

在一个实施方案中，式(II)化合物是式(IIA)化合物：

在一个实施方案中，R¹⁰和R²⁰各自为氢，R¹⁰和R²⁰各自为羟基，R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

在一个实施方案中，C_1-6烷氧基为OMe。

在一个实施方案中，其中R^a为氢、C_2-6烯基或芳基C_1-6烷基。

在一个实施方案中，C_2-6烯基为戊二烯基或异戊二烯基。

在一个实施方案中，芳基C_1-6烷基为苯甲基。

在一个实施方案中，芳基C_1-6烯基为肉桂基。

在一个实施方案中，m为2。

在一个实施方案中，Ra为氢并且R¹⁰和R²⁰各自为氢。

在一个实施方案中，m为1。

在一个实施方案中，R^a为C_2-6烯基或芳基C_1-6烷基；并且R¹⁰和R²⁰各自为羟基，R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

在一个实施方案中，R^a为C_2-6烯基；并且R¹⁰和R²⁰各自为羟基。

在一个实施方案中，Ra为芳基C_1-6烷基；R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

因此，在第二个方面，本发明涉及一种抗胃肠癌组合物，其包含至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

为避免疑义，5-苯基戊-2,4-二烯酸具有式(A)，3-甲基-3-丁烯基咖啡酸具有式(B)，1,1-二甲基烯丙基咖啡酸具有式(C)，短叶松素-3-乙酸酯具有式(D)，杨芽黄素具有式(E)，球松素查尔酮具有式(F)，阿魏酸苯甲酯具有式(G)并且异阿魏酸苯甲酯具有式(H)，如下所示。

在一个实施方案中，抗胃肠癌组合物是抗结肠直肠癌组合物。在另一个实施方案中，抗胃肠癌组合物是抗胃癌组合物。在另一个实施方案中，抗胃肠癌组合物是抗咽喉癌组合物。

在另一个方面，本发明涉及一种医药组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

在一个实施方案中，组合物用于维持或改善肠道健康。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于改善肠道健康的组合物，这种组合物包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防受试者中的胃肠癌的方法，这种方法包括施用有效量的组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯

至有需要的受试者。

在一个实施方案中，胃肠癌是结肠直肠癌。在另一个实施方案中，胃肠癌是胃癌。在另一个实施方案中，胃肠癌是咽喉癌。

在另一个方面，本发明涉及一种在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌的方法，这种方法包括独立、同时或依序施用有效量的组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯

至有需要的受试者。

在一个实施方案中，胃肠肿瘤是结肠直肠肿瘤。在另一个实施方案中，胃肠肿瘤是胃肿瘤。在另一个实施方案中，胃肠肿瘤是咽喉肿瘤。

本发明的另一个方面涉及一种诱导受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡的方法，这种方法包括施用有效量的组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯

至有需要的受试者。

在一个实施方案中，凋亡是结肠直肠肿瘤细胞的凋亡。在另一个实施方案中，凋亡是胃肿瘤细胞的凋亡。在另一个实施方案中，凋亡是咽喉肿瘤细胞的凋亡。

本发明的另一个方面涉及一种调节受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的增殖的方法，这种方法包括将有效量的本发明组合物施用于有需要的受试者。

举例来说，在一个实施方案中，调节是减少。因此，本发明涉及一种减少受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的增殖的方法，这种方法包括施用有效量的组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：选自5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯的一种或多种化合物。

在一个实施方案中，增殖是结肠直肠肿瘤细胞的增殖。在另一个实施方案中，增殖是胃肿瘤细胞的增殖。在另一个实施方案中，增殖是咽喉肿瘤细胞的增殖。

本发明的另一个方面涉及一种增加受试者对胃肠癌疗法的反应性的方法，其包括向受试者施用如本文所描述的本发明组合物。

在一个实施方案中，胃肠癌疗法是结肠直肠癌疗法。在另一个实施方案中，胃肠癌疗法是胃癌疗法。在另一个实施方案中，胃肠癌疗法是咽喉癌疗法。

本发明的另一个方面涉及一种增加受试者中的胃肠肿瘤对癌症疗法的敏感性的方法，其包括向受试者施用如本文所描述的本发明组合物。

在另一个方面，本发明涉及一种使对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感的方法，这种方法包括将有效量的如本文所描述的本发明组合物施用于一种或多种胃肠癌细胞。

在一个实施方案中，胃肠癌细胞包含存在于受试者中的肿瘤。

本发明还涉及一种至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对癌症疗法的抗性的方法，这种方法包括向受试者施用如本文所描述的本发明组合物。

本发明进一步涉及一种完全或部分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性的方法，这种方法包括向所述患者施用如本文所描述的本发明组合物的步骤。

在另一个方面，本发明提供了一种使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所描述的本发明组合物的步骤。

在一个实施方案中，肿瘤对使用化学治疗剂的治疗具抗性。

在另一个方面，本发明涉及一种改善肠道健康的方法，这种方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的本发明组合物。

在一个实施方案中，组合物是协同治疗性组合物。在一个实施方案中，组合物提供协同治疗作用。

在一个实施方案中，组合物包含本文所描述的化合物和至少一种额外治疗剂，其提供大于单独任一者的作用或大于单独任一者的相加作用的协同治疗作用。举例来说，对诱导凋亡、胃肠癌细胞存活或增殖、对疗法重新敏感、治疗或预防胃肠癌、或受试者或肿瘤对治疗方法的反应性存在更大作用。在一个实施方案中，化合物和至少一种额外治疗剂允许在适当时共同施用或依序施用的胃肠癌疗法的施用在剂量方面或在施用时长方面减小或增大。

在一个实施方案中，协同治疗性组合物包含至少一种来源于蜂胶的额外化合物或提取物。举例来说，组合物另外包含选自包含松属素、CAPE、白杨素、高良姜素、咖啡酸苯甲酯或咖啡酸的群组的至少一种化合物。

本发明的另一个方面涉及至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物的用途

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯

其用于制造达成如本文所描述的目的的组合物。

在一个实施方案中，用途是与至少一种额外治疗剂一起用于制造达成如本文所描述的目的的组合物。

本发明的另一个方面涉及组合物的用途，这种组合物包含至少一种如本文所定义的化合物，包括式(I)或(II)化合物，或选自以下任一者或多者的化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯

与至少一种额外治疗剂一起用于制造达成如本文所描述的目的的组合物，其中这种组合物经过配制以提供至少一种化合物和至少一种额外治疗剂的独立、同时或依序施用。

在一个实施方案中，复合物包含环糊精。在另一个实施方案中，提供溶解于溶剂，例如乙醇或丙二醇中的化合物。

本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：选自以下任一者或多者的至少一种化合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

在一个实施方案中，化合物经过分离、纯化或实质上纯化。

在一个实施方案中，组合物是已经添加有选自以下任一者或多者的至少一种化合物的组合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

在一个实施方案中，组合物是已经添加有选自以下任一者或多者的至少一种经过分离、纯化或实质上纯化的化合物的组合物

a)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

d)短叶松素-3-乙酸酯，

e)杨芽黄素，

f)球松素查尔酮，

g)阿魏酸苯甲酯，以及

h)异阿魏酸苯甲酯。

本发明的另一个方面涉及一种本发明组合物，其用于在人类受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导人类受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加人类受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加人类受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使人类受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的人类受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷胃肠癌的人类患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的人类患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。

在一个实施方案中，本发明涉及一种本发明组合物，其用于治疗或预防胃肠癌。

以下实施方案可以涉及上述方面中的任一者。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的5-苯基戊-2,4-二烯酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的3-甲基-3-丁烯基咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的1,1-二甲基烯丙基咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的短叶松素-3-乙酸酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的杨芽黄素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的球松素查尔酮浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的阿魏酸苯甲酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的异阿魏酸苯甲酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的CAPE浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的松属素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的高良姜素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的白杨素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的短叶松素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的咖啡酸苯甲酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，一种或多种化合物以富集有选自5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯的一种或多种化合物的蜂胶提取物或蜂胶级分的形式存在于抗胃肠癌组合物中。在一个实施方案中，富集是相对于存在于粗蜂胶中的水平的富集。在这个实施方案中，富集是相对于存在于脱蜡蜂胶中的非脂质组分的富集。因此，在一个实施方案中，所预期的富集是相对于在粗蜂胶的脱蜡或其它加工以去除蜡(诸如存在于粗的或未加工的蜂胶中的蜡)之后存在于蜂胶提取物或蜂胶级分中的组分。在另一个实施方案中，富集是相对于本文中的表1中所鉴别的化合物中的一者或多者的富集。

在另一个实施方案中，一种或多种化合物以富集有选自5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯的一种或多种化合物的蜂胶提取物或蜂胶级分的形式存在于抗胃肠癌组合物中，其中富集是相对于存在于精制蜂胶中的水平。因此，所预期的富集是相对于在粗蜂胶的脱蜡或其它加工以去除蜡，继之以诸如实施例1中所描述和本领域中已知的进一步分级步骤之后存在于蜂胶提取物或蜂胶级分中的组分，这或这些分级步骤为例如使用HPLC、柱色谱法、从诸如HP-20或Sephadex的聚合树脂吸附和解吸、溶剂分配而分离成级分。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有5-苯基戊-2,4-二烯酸。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有3-甲基-3-丁烯基咖啡酸。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有1,1-二甲基烯丙基咖啡酸。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有短叶松素-3-乙酸酯。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有杨芽黄素。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有球松素查尔酮。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有阿魏酸苯甲酯。在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有异阿魏酸苯甲酯。

在各种实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯中的两者或更多者的任何组合。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的5-苯基戊-2,4-二烯酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的3-甲基-3-丁烯基咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的1,1-二甲基烯丙基咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的短叶松素-3-乙酸酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的杨芽黄素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的球松素查尔酮浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的阿魏酸苯甲酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分具有大于约0.1、0.5、0.75、1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的异阿魏酸苯甲酯浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约0.1至约1、约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。

在一个实施方案中，蜂胶提取物或蜂胶级分富集有选自包含咖啡酸苯基醚酯(CAPE)、松属素、咖啡酸、白杨素、高良姜素或咖啡酸苯甲酯的群组的化合物中的至少一者。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的CAPE浓度。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的松属素浓度。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的高良姜素浓度。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的白杨素浓度。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的咖啡酸苯甲酯浓度。

在一个实施方案中，蜂胶或蜂胶级分具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约999mg/g的咖啡酸浓度。

在各种实施方案中，组合物包含至少一种额外治疗剂或与至少一种额外治疗剂独立、同时或依序施用，这至少一种额外治疗剂优选地是抗肿瘤剂，这种抗肿瘤剂优选地选自抗肿瘤食物因子、化学治疗剂或免疫治疗剂。

在各种实施方案中，胃肠癌疗法、治疗剂或抗肿瘤剂有效诱导凋亡，例如，诱导一种或多种胃肠癌细胞或一种或多种赘生性细胞的凋亡。

在一个实施方案中，胃肠癌疗法、治疗剂或抗肿瘤剂是丁酸盐或丁酸盐的来源。

在一个实施方案中，组合物是消费品。

在一个实施方案中，组合物是食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、药物或医药品。

在各种实施方案中，组合物可以经过配制以供经口、局部或肠道外施用。

在一个实施方案中，组合物包含一种或多种额外抗胃肠癌药剂。

在一个实施方案中，组合物是医药组合物。在另一个实施方案中，组合物是营养组合物。

在各种实施方案中，化学治疗剂选自包含以下的群组：有丝分裂抑制剂，诸如长春花生物碱，包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)，紫杉烷，包括多烯紫杉醇(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)以及替司他赛(tesetaxel)，以及埃博霉素(epothilone)，诸如伊沙匹隆(ixabepilone)；拓扑异构酶I抑制剂，诸如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱(camptothecin)、鲁吡替康(rubitecan)以及贝洛替康(belotecan)，拓扑异构酶II型抑制剂，包括安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)以及替尼泊苷(teniposide)，蒽环霉素(anthracycline)，诸如阿柔比星(aclarubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)以及佐柔比星(zorubicin)，以及蒽二酮(anthracenedione)，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)和匹杉群(pixantrone)；抗代谢物，包括二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)，胸苷酸合成酶抑制剂，诸如雷替曲塞(raltitrexed)和培美曲塞(pemetrexed)，腺苷脱氨酶抑制剂，包括喷司他丁(pentostatin)，卤化或核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)以及氟达拉滨(fludarabine)，硫嘌呤，包括硫鸟嘌呤和巯基嘌呤，胸苷酸合成酶抑制剂，包括氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、替加氟(tegafur)、卡莫氟(carmofur)以及氟尿苷(floxuridine)，DNA聚合酶抑制剂，诸如阿糖胞苷(cytarabine)，核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如吉西他滨(gemcitabine)，低甲基化剂，包括阿扎胞苷(azacitidine)和地西他滨(decitabine)，以及核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如羟基脲；细胞周期非特异性抗肿瘤剂，包括烷化剂，诸如氮芥，包括二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、曲洛磷胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、泼尼莫司汀(prednimustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)，亚硝基脲，包括卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)以及链脲菌素(streptozocin)，烷基磺酸酯，包括白消安(busulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)以及曲奥舒凡(treosulfan)，氮丙啶，包括卡波醌(carboquone)、塞替哌(thioTEPA)、三亚胺醌(triaziquone)以及三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，类烷化剂，包括铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)、四硝酸三铂(triplatintetranitrate)、赛特铂(satraplatin)，肼，诸如丙卡巴肼(procarbazine)，三氮烯，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)以及二溴甘露醇(mitobronitol)，以及链霉素，诸如放线菌素(actinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunomycin)、丝裂霉素(mitomycin)以及普卡霉素(plicamycin)；光敏剂，包括氨基酮戊酸、氨基酮戊酸甲酯、乙丙昔罗(efaproxiral)，以及卟啉衍生物，诸如卟吩姆钠(porfimersodium)、他拉泊芬(talaporfin)、替莫卟吩(temoporfin)以及维替泊芬(verteporfin)；酶抑制剂，包括法尼基转移酶抑制剂，诸如替吡法尼(tipifarnib)，周期素依赖性激酶抑制剂，诸如阿伏西地(alvocidib)和赛利昔布(seliciclib)，蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(bortezomib)，磷酸二酯酶抑制剂，诸如阿那格雷(anagrelide)，IMP脱氢酶抑制剂，诸如噻唑呋林(tiazofurine)，脂氧合酶抑制剂，诸如马索罗酚(masoprocol)，以及PARP抑制剂，诸如奥拉帕尼(olaparib)；受体拮抗剂，诸如内皮素受体拮抗剂，包括阿曲生坦(atrasentan)，视黄素X受体拮抗剂，诸如贝沙罗汀(bexarotene)和睾内酯(testolactone)；以及其它化学治疗剂，包括安吖啶、曲贝替定(trabectedin)，视黄素，诸如阿利维甲酸(alitretinoin)和维甲酸(tretinoin)，三氧化二砷，天冬酰胺消耗剂，诸如天冬酰胺酶或培门冬酶、塞来昔布(celecoxib)、秋水仙胺(demecolcine)、伊利司莫(elesclomol)、依沙芦星(elsamitrucin)、依托格鲁(etoglucid)以及氯尼达明(lonidamine)。

预期，提及本文所公开的数字的范围(例如，1至10)还合并了提及在那个范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9以及10)以及在那个范围内的有理数的任何范围(例如，2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是特定预期的实例，并且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本申请中以类似方式明确陈述。

在本说明书中，在已经提及专利说明书、其它外部文献或其它信息来源的情况下，这一般是出于提供用于论述本发明的特征的内容的目的。除非另有特别规定，否则提及这类外部文献不应被解释为承认这类文献或这类信息来源在任何管辖区中是先有技术，或形成本领域中的公知常识的一部分。

本发明还可以广泛地说在于本申请的说明书中个别地或共同地提及或指示的部分、要素以及特征，所述部分、要素或特征中的两者或更多者的任何或所有组合，并且在本文所提到的特定整体具有在本发明所涉及的领域中的已知等效物的情况下，这类已知等效物被视为并入本文中，如同个别地阐述一样。

具体实施方式

本发明是基于发现包含选自5-苯基戊-2,4-二烯酸、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯以及异阿魏酸苯甲酯中的任一者或多者的化合物的组合物。本发明的医药组合物，例如，本发明的抗癌组合物，增强蜂胶或含有蜂胶的物质的活性和物理化学特性。

因此，只要抗胃肠癌组合物经过配制以适合施用于哺乳动物受试者，例如，其由对人体安全的物质组成，那么其可以用于制造抗胃肠癌医药组合物和药物，以及营养组合物、消费品，诸如饮料、食品等等。

此外，因为本发明的组合物的实施方案的抗胃肠癌活性维持持久的时段，所以可以减小组合物的施用剂量或频率，或提供更高活性，或两者。

短语本发明的“抗胃肠癌组合物”或“具有抗胃肠癌活性的组合物”(在本文中可互换使用)涵盖适合施用于受试者的任何种类的组合物。实例包括含有来源于蜂胶的化合物的抗结肠直肠癌、抗胃癌或抗咽喉癌组合物。

术语“和/或”可以意指“和”或者“或”。

术语“癌症”和“癌性”指的是哺乳动物中通常特征为异常或不受调控的细胞增殖、细胞存活、细胞运动、赘生性和/或致瘤性的生理病状。癌症和癌症病理学可以与以下相关联：例如，转移、干扰邻近细胞的正常功能、释放异常水平的细胞因子或其它分泌产物、抑制或加剧发炎或免疫反应、瘤形成、初癌、恶性肿瘤、侵入周围或远端组织或器官(诸如淋巴结)，等等。特定地包括结肠直肠癌和癌前病状，其可以包括上皮肿瘤、非上皮肿瘤、癌瘤(例如，原位癌瘤)，以及侵入性结肠直肠癌。还包括胃癌和癌前病状，其可以包括上皮肿瘤、腺癌、胃淋巴瘤、类癌肿瘤、间质肿瘤。还包括咽喉癌和癌前病状，其可以包括上皮肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌。癌症可以是例如原位癌瘤以及侵入性癌症。

如本说明书中所用的术语“包含”意指“至少部分由……组成”。当解释在本说明书中包括那个术语的陈述时，在每个陈述中以那个术语为开端的特征全部需要存在，但其它特征也可以存在。诸如“包含了”和“包含有”的相关术语以相同的方式加以解释。

“有效量”是赋予治疗作用所需的量。用于动物和人类的剂量的相互关系(基于每平方米体表的毫克数)由Freireich等(1966)描述。体表面积可以从受试者的身高和体重近似地确定。参看例如ScientificTables,GeigyPharmaceuticals,Ardley,NewYork,1970,537。如本领域的技术人员所认识到，有效剂量也有变化，这取决于施用途径、赋形剂使用等等。

如本文所用，适合用于本发明中的蜂胶“提取物”或“级分”富集有本文所描述的化合物中的一者或多者以使得其展现抗胃肠癌活性。这类功能提取物或功能级分可以具有比原生蜂胶更大或更小的活性。在一个实例中，功能提取物或功能级分所具有的原生蜂胶的生物活性中的一者或多者可以在比原生蜂胶中所发现的更大或更小的程度下存在于功能提取物或功能级分中。在另一个实例中，功能提取物或功能级分所具有的原生蜂胶的生物活性中的每一者在比原生蜂胶中所发现的更大或更小的程度下存在于功能提取物或功能级分中。在另一个实例中，可能需要提供如下功能提取物或功能级分：其中原生蜂胶的生物活性中的一者或多者得以维持或在比原生蜂胶中所发现的更大的程度下存在，但原生蜂胶的一种或多种其它生物活性不存在或在比原生蜂胶中所发现的更小的程度下存在。这类功能提取物的实例包括本文实施例中所描述的抗胃肠癌酊剂。

用以确定由本文所描述的化合物引发的一种或多种生物作用的方法和试验在本领域中众所周知并且实例描述于本文中，并且这类方法和试验可以用于鉴别或验证蜂胶的一种或多种功能提取物或功能级分。举例来说，蜂胶增加细胞中的一种或多种致瘤性状(诸如本文实施例中所描述的那些)的能力的试验可负责鉴别蜂胶的一种或多种功能提取物或功能级分。

如本文所用的“蜂胶”涵盖由蜜蜂从能够提供本文所论述的化合物中的一者或多者的任何植物来源产生的蜂胶。在一个实施方案中，蜂胶是“欧洲”蜂胶。“欧洲”蜂胶也以不同名称已知，诸如“杨树”蜂胶。举例来说，蜂胶来源于杨树、桦树、落叶松或柳树的一种或多种种类的芽和叶渗出物。蜂胶已经基于植物来源被分类为七大类(Sforcin和Bankova,2011.蜂胶：存在开发新药物的潜力吗？(Propolis:isthereapotentialforthedevelopmentofnewdrugs？)J.Ethnopharmacology,133:253-260.)。这些种类是来自欧洲、北美洲、南美洲南部、新西兰的“杨树蜂胶”；“巴西绿蜂胶”，其含有阿特匹林C(artepillanC)；来自俄罗斯的“桦树蜂胶”；来自古巴、巴西、墨西哥的“红蜂胶”；来自希腊、西西里岛、克里特岛、马耳他并且源自针叶树的“地中海蜂胶”；来自古巴和委内瑞拉的“克鲁西(Clusia)蜂胶”；以及来自冲绳、台湾、印尼的“太平洋蜂胶”，其含有‘普林斯(propolins)’。

来自各个国家的蜂胶中所报导的例示性化合物和化合物浓度呈现于下表1中。这些化合物适用于例如鉴别蜂胶的来源，或表征和鉴别适合用于本发明中的蜂胶。

当关于具有抗胃肠癌活性的药剂，诸如本发明组合物或本发明组合物的组分使用时，短语“保留抗胃肠癌活性”以及其语法等效物和派生词欲意指药剂仍然具有适用的抗胃肠癌活性。优选地，所保留的活性为原始活性的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约35％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、以及约90％至约100％)。本发明的例示性组合物能够支持其所包含的抗胃肠癌药剂的适用抗胃肠癌活性的维持，并且可以被称为保留抗胃肠癌活性，理想地直至在本文所预期的方法中利用。

当关于本发明组合物或本发明组合物的组分使用时，短语“增强抗胃肠癌活性”以及其语法等效物和派生词欲意指当存在于组合物中时，等效量或浓度的抗胃肠癌药剂与不存在组合物的情况下药剂(诸如分离的药剂)的抗胃肠癌活性相比具有增加的抗胃肠癌活性。优选地，增强的活性为原始活性的至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％或更高，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约105％至约150％、约120％至约180％、约140％至约200％、约160％至约200％、约180％至约200％、以及约190％至约200％)。在某些实施方案中，本发明的组合物可以展现增强的抗胃肠癌活性，即，展现单独蜂胶的抗胃肠癌活性的至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％或更高。类似地，本发明的优选组合物能够支持增强的抗胃肠癌活性的维持，并且可以被称为保留增强的抗胃肠癌活性，理想地直至使用本文所预期的方法而利用。在不希望受任何理论约束的情况下，增强的活性(包括增强的活性维持)据信是本发明组合物的各种组分之间协同作用的结果。

如本文所用的术语“稳定”当关于本发明的组合物使用时，意指组合物能够支持抗胃肠癌活性，优选地超过两小时、超过三小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、20小时、超过一天、优选地约两天、约三天、约四天、优选地约五天、更优选地约六天、优选地一周、两周、三周、一个月或更长时间。

术语“经口施用”包括经口、经颊、经肠以及胃内施用。

术语“肠道外施用”包括(但不限于)局部(包括施用于任何真皮、表皮或粘膜表面)、皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内以及肿瘤内(包括任何直接施用于肿瘤)施用。

术语“医药学上可接受的载剂”欲指代可以作为本发明组合物的组分施用于受试者的载剂，包括(但不限于)赋形剂、稀释剂或助剂。优选的载剂并不降低组合物的活性，并且当以足以递送有效量的5-苯基戊-2,4-二烯酸，3-甲基-3-丁烯基咖啡酸、1,1-二甲基烯丙基咖啡酸、短叶松素-3-乙酸酯、杨芽黄素、球松素查尔酮、阿魏酸苯甲酯或异阿魏酸苯甲酯中的任一者或多者或者另一种抗胃肠癌药剂(当施用时)的剂量施用时是无毒的。

在名词之后的术语“(s)”涵盖单数或复数形式，或两者。

术语“受试者”欲指代动物，优选哺乳动物，更优选哺乳动物的伴侣动物或人类。优选的伴侣动物包括猫、狗以及马。其它哺乳动物受试者包括农业动物，包括马、猪、绵羊、山羊、母牛、鹿或家禽，或实验动物，包括猴、大鼠或小鼠。

术语“治疗”和其派生词应以其最宽泛的可能情形来解释。这个术语不应被视为暗示治疗受试者直至完全恢复。因此，“治疗”广泛地包括将受试者的疾病进程或症状维持于实质上静态的水平下，增加受试者的恢复速率，改善和/或预防症状的发作或特定病状的严重性，或延长患者的生活质量。术语“治疗”还广泛地包括维持敏感个体的良好健康状况以及建立疾病预防的持久力。

本发明的例示性用途

本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防结肠直肠癌、与结肠直肠癌细胞相关的赘生性病症，以及结肠直肠癌、结肠直肠癌治疗和相关病症的症状。

结肠直肠癌是影响大肠，特别是结肠和直肠的赘生性病状-因此，其通常被称作结肠癌或肠癌。风险因素包括年龄、膳食(特别是脂肪、酒精或红肉的高摄入量)、男性性别、肥胖、吸烟以及缺乏锻炼。

结肠直肠癌起源于胃肠道的结肠或直肠中的上皮细胞，并且最通常与Wnt-APC-β-连环蛋白信号传导路径中的缺陷相关联。在可能的情况下，优选的治疗是可以治愈的完全手术去除。如果转移已经发生并且癌症已经进入淋巴结，那么已经报导了化学治疗剂氟尿嘧啶或卡培他滨增加预期寿命。考虑使用的其它化学治疗剂包括氟尿嘧啶、卡培他滨、UFT、甲酰四氢叶酸、伊立替康或奥沙利铂，以及这些药剂的组合。然而，在癌症更广泛扩散的情况下，或当不可能进行手术时，治疗一般集中于姑息护理和延长预期寿命。辐射与化学疗法的组合可以被考虑用于直肠癌，但放射疗法由于肠的放射敏感性而通常并不用于结肠癌中。

本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防胃癌、与胃癌细胞相关的赘生性病症，以及胃癌、胃癌治疗和相关病症的症状。

胃癌是从胃的任何部分产生的赘生性病状。因为大多数患者呈现有晚期疾病，所以预后不良。风险因素包括年龄、膳食(特别是烟熏食品、咸鱼、腌肉以及泡菜的高摄入量)、吸烟、男性性别，以及自体免疫萎缩性胃炎或肠化生的历史。

约90％的癌症是在胃粘膜的腺上皮中起源的腺癌。其它类型包括淋巴瘤(MALTomas或MALT淋巴瘤)以及类癌和间质肿瘤。在可能的情况下，优选的治疗是胃的全部或一部分和周围淋巴结的完全手术去除。胃癌对化学治疗剂并不特别敏感，然而，包括氟尿嘧啶、卡培他滨、BCNU(卡莫司汀)、甲基-CCNU(司莫司汀)和阿霉素(亚德里亚霉素)、丝裂霉素C、顺铂以及泰索帝(taxotere)的化学治疗剂已经用于姑息护理方案中。辐射与化学疗法的组合有时用于治疗胃癌。

本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防咽喉癌、与咽喉癌细胞相关的赘生性病症，以及咽喉癌、咽喉癌治疗和相关病症的症状。

咽喉癌，也称作食管癌、咽癌或喉癌，包涵在咽、鼻咽、口咽、下咽部、喉(喉头)或扁桃体的组织中发展的肿瘤。约90％的咽喉癌是起源于这些区域的粘膜内衬(上皮)的鳞状细胞癌。风险因素包括膳食(特别是酒精的高摄入量)、吸烟、使用无烟烟草、咀嚼槟榔以及暴露于环境致癌物，包括镍精炼、纺织纤维以及木工的职业暴露。

最常见疗法是肿瘤的手术切除和辐射疗法。化学治疗剂可以用于联合手术和/或辐射中。药剂包括太平洋紫杉醇、卡铂、西妥昔单抗(cetuximab)、泰索帝以及多烯紫杉醇。

稳固的肠道健康与肠舒适、抵抗感染性疾病以及预防慢性胃肠疾病相关联。

这包括治疗或预防与不良肠道健康、低免疫力以及胃肠道发炎相关的病状。举例来说，本发明的方法和组合物适用于治疗或预防发炎性肠病、肠易激综合症、环境性肠病、感染性腹泻以及消除或减轻内脏痛。

本发明的组合物

本发明的例示性抗胃肠癌组合物包括医药组合物。用于维持肠道健康的本发明的例示性组合物包括医药组合物和营养组合物，连同消费产品等等。

一般已知的其它抗胃肠癌物质可以与本发明的抗胃肠癌组合物组合，这取决于组合物所投入的应用。

适合施用于受试者的组合物可以被配制成食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗用品、医疗装置、药物或医药品。适当的配方可以由本说明书的技术和教导有关的技术人员来制备。

在一个实施方案中，本发明涉及本文所描述的化合物中的一者或多者，任选地与至少一种抗胃肠癌药剂的用途，或富集有本文所描述的化合物中的一者或多者的一种或多种蜂胶级分或蜂胶提取物的用途，其用于制造食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗装置、医疗用品、药物或医药品。在一个实施方案中，组合物经过配制以供经口施用。在另一个实施方案中，组合物经过配制以供肠道外(包括局部)施用。在某些实施方案中，组合物用于诱导凋亡、治疗或预防胃肠癌，或如上文所描述的一种或多种其它用途。

在一个实施方案中，组合物呈粉末、片剂、囊片、丸剂、硬或软胶囊或糖锭的形式。

在一个实施方案中，组合物呈香包、可分散粉末、颗粒、悬浮液、酏剂、液体、饮料的形式，或可以添加至食品或饮料中的任何其它形式，包括例如水或果汁。在一个实施方案中，组合物是肠内产品、固体肠内产品或液体肠内产品。

在一个实施方案中，组合物进一步包含防止或减少组合物在储存期间或在施用之后降解的一种或多种成分(诸如抗氧化剂)。

在一个实施方案中，适用于本文中的组合物包括能够携带一种或多种环糊精的任何可食用消费产品。当组合物包含和类蛋白质因子一样的至少一种额外抗胃肠癌药剂时，可食用消费产品是能够携带蛋白质的产品。

在各种实施方案中，组合物包含环糊精。在一个实施方案中，环糊精是γ-环糊精，或环糊精以包含γ-环糊精的环糊精的组合存在。

在一个实施方案中，环糊精是化学改性的环糊精。

适合的可食用消费产品的实例包括烤焙物、粉末、液体、糖果产品、复原的水果产品、小吃棒、食物棒、牛奶什锦棒、涂抹酱、沙司、蘸料；乳产品，包括冰淇淋、酸乳酪以及干酪；饮料，包括乳基和非乳基饮料(诸如牛奶饮料，包括奶昔，和酸乳饮料)；奶粉；运动或营养补充剂，包括乳基和非乳基运动或营养补充剂；食品添加剂，诸如蛋白质撒剂；以及膳食补充产品，包括每日补充片剂。在这个实施方案内，适用于本文中的组合物还可以是呈粉末或液体形式的婴儿配方。适用于本文中的适合营养组合物可以按类似形式提供。特别预期另外包含牛奶或一种或多种牛奶产品或牛奶组分的组合物，诸如牛奶蛋白、乳清蛋白、初乳、乳脂，或者牛奶或一种或多种牛奶产品或牛奶组分的任何级分，诸如乳脂级分、牛奶蛋白级分、乳清蛋白级分、初乳级分等等。

适用于本文中的组合物可以进一步包括其它因子，诸如钙、锌、镁、硒、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2、复合碳水化合物；可食用或烹调油，包括棕榈、橄榄、大豆、芥花、玉米、向日葵、红花、花生、葡萄籽、芝麻、坚果、杏仁、腰果、榛子、澳洲坚果、美洲山核桃、阿月浑子以及胡桃；以及其它可食用物，包括阿萨伊(acai)、苋菜、杏、摩洛哥坚果(argan)、朝鲜蓟、鳄梨、巴巴苏(babassu)、山嵛(ben)、黑加仑籽、琉璃苣籽、婆罗洲脂坚果(borneotallownut)、瓢葫芦、印度葫芦、角豆荚(长角豆)、羽叶棕榈、芫荽籽、月见草、亚麻荠、大麻、木棉籽、扁柄草、池花籽、芥菜、秋葵籽(木槿籽)、紫苏籽、佩基(pequi)、松果、罂粟籽、梅仁、南瓜籽、藜麦、盏金花、米糠、茶(山茶)、蓟、西瓜籽或小麦胚芽油；或其组合。

适用于本文中的组合物可以经过配制以允许通过任何所选途径施用于受试者，这种途径包括(但不限于)经口或肠道外(包括局部、皮下、肌肉内以及静脉内)施用。本领域的技术人员应了解，施用于受试者的途径将通常考虑到施用组合物的目的-例如，在施用本发明的医药组合物以维持肠道健康的情况下，将通常在考虑这种病症的性质下选择施用途径。

一般来说，对于经口施用，适用于本文中的膳食(例如，食品、食品添加剂或食品补充剂)、营养或医药组合物可以由技术人员根据已知的配制技术来配制。

因此，根据本发明适用的医药组合物可以用针对预定施用途径和标准医药惯例而选择的适当医药学上可接受的载剂(包括赋形剂、稀释剂、助剂以及其组合)来配制。参看例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编,MackPublishingCo.,1980。

虽然优选的施用途径是经口，但应了解，任何施用模式可能适合于本发明的任何组合物，包括通过多种途径施用，包括用于不同药剂的不同途径。因此，还预期本发明的任何组合物的吸入(经鼻或经颊吸入)以及经阴道和经直肠施用。还预期本发明的任何组合物的髓内、硬膜外、关节内以及胸膜内施用。还预期本发明的组合物，任选地与至少一种额外抗胃肠癌因子的施用，这是通过第一施用途径，伴随着通过第二施用途径独立、同时或依序施用一种或多种其它药剂，包括一种或多种其它抗胃肠癌药剂；例如，经口施用本发明的组合物，伴随着局部施用至少一种额外抗胃肠癌药剂。

本发明的组合物还可以被配制成剂型。适用于本文中的剂型可以作为粉末、液体、片剂或胶囊经口施用。适合的剂型视需要可以含有额外试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，或具有肠溶包衣。适合的肠溶包衣是已知的。包围活性成分的肠溶包衣防止活性成分在胃中释放，但允许在剂型已经离开胃之后释放。适用于本文中的剂型可以适于活性组分的立即、延迟、修饰、持续、脉冲或控制释放。适合的配方视需要可以含有额外药剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂。

胶囊可以含有任何标准医药学上可接受的物质，诸如明胶或纤维素。片剂可以根据常规程序通过压缩活性成分与固体载剂和润滑剂的混合物来配制。固体载剂的实例包括淀粉和糖膨润土。活性成分还可以按含有粘合剂(例如，乳糖或甘露糖醇)、常规填充剂以及压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式施用。医药组合物还可以经由肠道外途径施用。肠道外剂型的实例包括活性剂的水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖，或其它熟知的医药学上可接受的赋形剂。熟习本领域者所熟知的增溶剂可以用作医药赋形剂以供递送抗胃肠癌药剂。

可注射剂型可以被配制成液体溶液或悬浮液。还可以制备固体形式，其适合于在注射之前呈液体中的溶液或液体中的悬浮液。还可以乳化剂型。来源于蜂胶的一种或多种化合物和至少一种额外抗胃肠癌因子(当存在时)可以与载剂混合，这些载剂诸如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等，以及其组合。

可以制备持续释放制剂，其合并有所预期的化合物中的一者或多者。持续释放制剂的适合实例包括含有化合物中的一者或多者和至少一种额外抗胃肠癌药剂(当存在时)的固体疏水聚合物的半渗透基质。基质可以呈成形物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的非限制性实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(参看US3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，以及可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)组成的可注射微球体)。

本发明还涉及一种肠道外单位剂型，其包含本文特定描述的化合物中的一者或多者，任选地与至少一种额外治疗剂一起。

在各种实施方案中，至少一种额外治疗剂是抗生素，诸如氨基糖苷，诸如阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramicin)或巴龙霉素(paromomycin)；袢霉素(ansamycin)，诸如格尔德霉素(geldanamycin)或除莠霉素(herbimycin)；碳头孢烯(carbacephem)，诸如氯碳头孢(loracarbef)；碳氢霉烯(carbapenem)，诸如厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin)，或美罗培南(meropenem)；头孢菌素(cephalosporin)(第一代)，诸如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、噻孢霉素(cefalotin)或头孢噻吩(cefalothin)，或头孢氨苄(cefalexin)；头孢菌素(第二代)，诸如头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)或头孢呋辛(cefuroxime)；头孢菌素(第三代)，诸如头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)或头孢曲松(ceftriaxone)；头孢菌素(第四代)，诸如头孢吡肟(cefepime)；头孢菌素(第五代)，诸如头孢托罗(ceftobiprole)；糖肽，诸如替考拉宁(teicoplanin)或万古霉素(vancomycin)；大环内酯，诸如阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、三乙酰竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)或壮观霉素(spectinomycin)；单胺菌素(monobactam)，诸如氨曲南(aztreonam)；青霉素，诸如阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(meticillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素、哌拉西林(piperacillin)或替卡西林(ticarcillin)；多肽，诸如杆菌肽(bacitracin)、粘杆菌素(colistin)或多粘菌素b(polymyxinb)；喹诺酮(quinolone)，诸如环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)；磺酰胺，诸如磺胺米隆(mafenide)、磺酰胺基柯衣汀(sulfonamidochrysoidine)(古语词)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、对氨基苯磺酰胺(sulfanilimide)(古语词)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异恶唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)或甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)(复方新诺明(co-trimoxazole))(tmp-smx)；四环素(tetracycline)，诸如地美环素(demeclocycline)、强力霉素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)、四环素；其它药剂，诸如胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidicacid)、呋喃唑酮(furazolidone)、异烟肼(isoniazid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、呋喃妥英(nitrofurantoin)、平板霉素(platensimycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、喹奴普丁/达福普丁(quinupristin/dalfopristin)、利福平(rifampicin，在美国是rifampin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、替硝唑(tinidazole)、氨苯砜(dapsone)、氯法齐明(clofazimine)；或环脂肽，诸如达托霉素(daptomycin)，甘氨四环素(glycylcycline)，诸如替加环素(tigecycline)，或恶唑烷酮，诸如利奈唑胺(linezolid)。

在其它实施方案中，至少一种额外治疗剂是抗真菌剂，诸如多烯抗真菌剂，诸如纳他霉素(natamycin)、龟裂霉素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B(amphotericinB)、坎狄辛(candicin)；咪唑，诸如咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)或噻康唑(tioconazole)；三唑，诸如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)或特康唑(terconazole)；噻唑，诸如阿巴芬净(abafungin)；烯丙胺，诸如特比萘芬(terbinafine)、阿莫罗芬(amorolfine)、萘替芬(naftifine)或布替萘芬(butenafine)；棘白菌素(echinocandin)，诸如阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)或米卡芬净(micafungin)；其它药剂，诸如苯甲酸、环匹罗司(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸、氟胞嘧啶(flucytosine)或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、卤普罗近(haloprogin)以及碳酸氢钠；或替代物，诸如蒜素、茶树油、香茅油、碘、柠檬草、橄榄叶、橙油、玫瑰草油、广藿香、柠檬香桃木、印楝籽油、椰子油、锌或硒。

或者，药剂选自本文所描述的那些中的任一者。

可以在体外与体内评价根据本发明适用的组合物的功效。简单地说，在一个实施方案中，可以测试组合物例如在体外抑制赘生性细胞增殖的能力。对于体内研究，可以将组合物馈送至或注射至动物(例如，小鼠)中，并且然后评估其对癌细胞存活、增殖、转移，或者胃肠癌或相关疾病或病症的一种或多种症状的作用。基于这些结果，可以确定适当剂量范围、频率以及施用途径。

适用于本文中的组合物可以单独使用，或与一种或多种其它抗胃肠癌药剂或者一种或多种额外治疗剂组合使用。抗胃肠癌药剂或额外治疗剂可以是或包含食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、食品组分、饮料组分、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗装置、医疗用品、药物或医药品。抗胃肠癌药剂或额外治疗剂优选地有效削弱一种或多种赘生性疾病或病症或者一种或多种赘生性疾病或病症的症状中的一者或多者，或以其它方式向其所施用的受试者赋予效益。优选的治疗剂包括治疗性食物因子、免疫原性或免疫刺激剂、伤口愈合剂等等。

应了解，上文所列的额外抗胃肠癌药剂或治疗剂(基于食物的与医药剂)也可以在根据本发明的方法中采用，在此其与适用于本文中的组合物独立、同时或依序施用。

如应了解，所施用的组合物的剂量、施用时段以及一般施用方案可以因受试者而异，这取决于如下变量：诸如受试者的症状的严重性、所治疗的病症的类型、所选择的施用模式，以及受试者的年龄、性别和/或一般健康状况。然而，作为一般实例，每次施用或每天，施用约1毫克至约5000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约4000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约3000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约2000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约1000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，优选地约50至约1000毫克/公斤，优选地每天。在一个实施方案中，施用约0.05毫克至约250毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物。

在各种实施方案中，每次施用或每天，施用足够的组合物以递送约0.001毫克至约50毫克/公斤体重的至少一种本文所描述的化合物、约0.001毫克至约40毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约30毫克/公斤体重的蜂胶、约0001毫克至约20毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约10毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约5毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约1毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约0.5毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约0.1毫克/公斤体重的蜂胶，或约0.001毫克至约0.05毫克/公斤体重的蜂胶。

应了解，施用可以包括单次剂量，诸如单次日剂量，或施用许多不连续的分次剂量可能是适当的。应了解，本领域的一般技术人员将能够在没有过度实验的情况下，考虑到那个技术和本公开来确定对于给定病状的有效给药方案(包括施用剂量和时序)。

当与另一种抗胃肠癌药剂或治疗剂组合使用时，适用于本文中的组合物和其它抗胃肠癌药剂或治疗剂的施用可以是同时或依序的。同时施用包括施用包含所有组分的单一剂型或实质上同时施用独立剂型。依序施用包括根据不同时程施用，优选地使得提供适用于本文中的组合物和其它治疗剂的时段有重叠。

另外，预期根据本发明的组合物可以用额外活性成分来配制，这些活性成分可以在特定情况下对受试者有益。举例来说，可以使用靶向疾病过程的相同或不同方面的治疗剂。

因此，本发明的“包含抗胃肠癌组合物的食品和饮料”可以用于一般食品和健康食品。因为本发明的抗胃肠癌组合物掩盖了本文所描述的化合物的味道或蜂胶的味道，所以其可以作为粉末或呈粉末形式被食用。抗胃肠癌组合物可以用作蛋糕、饼干、曲奇、巧克力、甜品以及其它糖食(包括水果糖或口香糖)的成分或原料。本发明的组合物可以添加至水中作为饮料，可以用作诸如牛奶、茶、咖啡、热巧克力等饮料的甜味剂，并且作为果汁饮料、运动饮料等的成分或原料。

现在将参考以下实施例来描述本发明的例示性组合物和用于制备这类组合物的方法。

实施例

实施例1

这个实施例描述了通过制备型色谱法产生的蜂胶级分的抗胃肠癌活性的评估。使用增殖试验在结肠癌腺癌细胞系DLD-1中进行这项研究。

材料和方法

如通过MTT试验所评估，评估下表2中所示的测试样品调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照(阴性对照)之外还包括阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。通过蜂胶酊剂的分级来获得测试样品。

通过柱色谱法产生蜂胶酊剂级分

使用装填有已经用甲醇(MeOH，200mL)洗涤并且用20％EtOH水溶液(500mL)平衡的MerckLichroprepCI8反相固定相(16×4cm)的玻璃柱进行分级。使用活塞泵将溶解于乙醇(EtOH，5mL)中的蜂胶(5.446g)加载至柱的顶部。以由20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％以及90％EtOH水溶液组成的阶梯式梯度(250mL)，继之以两个100％EtOH步骤进行洗脱，然后用2-丙醇(IPA)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮以及氯仿(CHCl₃)洗脱。在真空下在旋转蒸发器上从各种级分中去除溶剂，继而冷冻干燥过夜。汇集两个100％EtOH级分，并且剩余的四个非极性级分(IPA、EtOAc、丙酮以及CHCl₃)因其相对低的质量而用于生物试验工作。

级分在表2中根据从柱洗脱的步骤中所用的乙醇的百分比示出，例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％以及90％EtOH水溶液和100％EtOH。

用于DLD-1结肠癌抗增殖试验的材料和方法

如通过MTT试验所评估，评估下表2中所示的测试样品调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照(阴性对照)之外还包括阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。

表2.测试样品

测试材料和测试方法的描述

使人类结肠直肠腺癌上皮细胞系从冷冻储存中复活，并且在测试和参考样品存在下培养。细胞的培养条件是由细胞供应者(ATCC)所描述的那些。然后对培养物进行MTT试验以确定样品对细胞增殖的影响。

方法是基于以下所报导的程序：

Smolka,AJ,Goldenring,JR,Gupta,S以及CharlesEHammond,CE.由吡咯里嗪衍生物ML3000抑制胃H,K-ATPase活性和胃上皮细胞IL-8分泌(InhibitionofgastricH,K-ATPaseactivityandgastricepithelialcellIL-8secretionbythepyrrolizinederivativeML3000).(2004).BMCGastroenterology.4:4。

Chailler,P和Menard,D(2005).展现屏障功能、祖细胞以及前酶原性特征的人类胃上皮(HGE)细胞系的建立(EstablishmentofHumanGastricEpithelial(HGE)CellLinesExhibitingBarrierFunction,Progenitor,andPrezymogenicCharacteristics).JournalofCellularPhysiology202:263-274。

Trainer,D.L.,Kline,T.,McCabe,F.L.,Faucette,L.F.,Field,J.,Chaikin,M.,Anzano,M.,Rieman,D.,Hoffstein,S.,Li,D-J.,Gennaro,D.,Buscarino,C.,Lynch,M.,Poste,G.以及Greig,R.(1988).人类结肠直肠癌细胞系中的生物表征和癌基因表达(Biologicalcharacterizationandoncogeneexpressioninhumancolorectalcarcinomacellslines).InternationalJournalofCancer41:287-296。

样品制备

通过将测试级分溶解于15％乙醇(ETOH)/HBSS中达到2mg/mL固含量的浓度来制备工作溶液。

实验程序

测试系统的表征

1.人类结肠直肠腺癌细胞(ATCCCCl-221，DLD-1)。

2.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、10mg/mL链霉素的0.9％NaCl(Sigma目录号P-0781)。储存于-20℃下。

3.DMEM培养基(Invitrogen目录号12100-046)。储存于-20℃下。

4.胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25％胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号15400054(×10，于储备液中)。

5.磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由TBL制备)。

6.汉克斯平衡盐溶液(HanksBalancedSaltSolution，HBSS)(GIBCO目录号14185-052)。储存于4℃下。

7.胎牛血清(GIBCO目录号10091-148)。储存于-20℃下。

8.MTT试剂：100mg/小瓶(SIGMA目录号M-2128)，以10mg/mL溶解于PBS中并且储存于-20℃下。在PBS中制备5mg/mLMTT溶液并且储存于4℃下作为工作溶液。

9.MTT裂解缓冲液：10％十二烷基硫酸钠(SDS)/45％二甲基甲酰胺(将20gSDS溶解于100mL双蒸馏水(DDW)中，并且将90mL二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中)。用冰醋酸将pH调整至4.7，并且添加DDW直至200mL的最终体积。

10.5-氟尿嘧啶(5-FU)(Sigma目录号F-6627)。以150ng/mL和75ng/mL制备两种工作溶液，溶解于15％乙醇/HBSS中。最终浓度为7.50ng/mL和3.75ng/mL。

培养基制备

用于繁殖结肠直肠腺癌(DLD-1)细胞的培养基是补充有青霉素-链霉素溶液(10毫升/升)的DMEM。在即将使用之前添加FBS以得到10％w/v。

细胞培养

1.使获自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollectionUSA)的人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)从冷冻储存中复活。

2.在使用上文所描述的培养基(参看培养基制备)进行初始繁殖之后，如下使用胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的DMEM培养基来中和胰蛋白酶，并且在4℃下使培养物以300g(1200rpm)离心5分钟。

3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于培养基DMEM、FBS(10％)、青霉素(100单位/毫升)、链霉素(100μg/mL)中。在37℃下于5％CO₂/95％空气中培养细胞。

4.在达到汇合之后，如上文2中所描述使用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落并且离心。

5.弃去上清液，并且如上文3中所描述以1.0×10⁴个细胞/毫升使细胞再悬浮于DMEM和补充物中。

6.向96孔板的每个孔中添加180μl细胞(1,800个细胞/孔)或培养基。将板在5％CO₂/95％空气中于37℃下孵育48小时，这足以允许细胞附着。

7.向每个孔中添加20μl测试样品或阳性对照中的每一者。对于‘培养基’或‘仅细胞’对照，将20μl15％ETOH/HBSS添加至每个孔中。以6个重复测定来评估每个样品，而以9个重复测定(组合的三重测定)来评估三个板中的每一者上的对照。每个孔中样品的最终浓度为200μg/mL。

8.每个孔中的总体积为200μl。

9.将板在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育19小时。

细胞增殖试验

1.在孵育完成时，将20μlMTT工作溶液(5mg/mL)添加至所有孔中，并且在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育3-4小时。

2.在这个孵育时段期间，注意到强烈的色彩意想不到地出现在许多样品的一些孔中、在细胞加样品孔与样品加培养基空白孔中。在这个时段结束时，从每个孔中去除上清液并且用HBSS轻轻洗涤每个孔两次，以去除紫色，随后如下文步骤3中所描述添加MTT裂解缓冲液。

3.然后添加100μlMTT裂解缓冲液，并且将板在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育过夜。使板以1200rpm离心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200μl等分试样从每个孔转移至新的96孔板中。在570nm下用VersaMax微板读取器读取板。

4.结果表示为与仅细胞对照相比在样品存在下培养的细胞的增殖百分比。从所有孔扣除作为背景读数的空白读数。

结果

对照和测试样品对细胞增殖的影响的汇总呈现于下表3中。

·在200μg/mL下，结肠癌细胞增殖的最强抑制剂是蜂胶级分#1(68.1％)、蜂胶级分#2(72.8％)、蜂胶级分#5(41.0％)以及蜂胶级分#8(72.0％)。

·在200μg/mL下，蜂胶酊剂使结肠癌细胞的增殖抑制32.6％。

表3.测试样品对细胞DLD-1增殖的影响

进行进一步研究以确定存在于最具活性的级分中的化合物。这些研究描述于实施例2中。

实施例2

这个实施例描述了与纯化合物标准相比，本发明组合物的抗胃肠癌活性的评估。如实施例1中所描述使用增殖试验在结肠癌腺癌细胞系DLD-1中进行这项研究。

制备型HPLC

通过制备型HPLC对实施例1所产生的20％、30％、60％以及90％EtOH水溶液洗脱级分进行进一步分级。将干燥的20％和30％EtOH级分溶解于EtOH/H₂O(1:1)中，而将60％和90％EtOH级分溶解于纯的EtOH中。通过制备型HPLC在PhenomenexSynergi4|i,-RPMax80A250×30mmC-12柱上使用Gilson321制备型泵和Agilent1100系列二极管阵列检测器对每种溶液进行色谱分析。采用0.5与1.5mL之间的注射体积。采用20mL/min的流动速率。对于20％、30％以及60％EtOH级分，使用70％水(含有0.1％三氟乙酸[TFA]vol/vol.)和30％MeOH(含有0.1％TFAvol./vol.)的初始溶剂组成。使溶剂组成在初始条件下保持恒定10分钟，随后使MeOH浓度经8分钟线性增加至40％，并且在这种组成下保持5分钟，随后经32分钟增加至80％，然后经5分钟增加至100％。

在约18℃的室温下进行色谱法。手动收集级分，并且在268nm(对于类黄酮)和327nm(对于咖啡酸衍生物)进行在线检测。对所有收集的级分进行分析型HPLC并且将显示单一化合物或已经在真空下在旋转蒸发器上去除溶剂的高度纯化化合物的那些进行称重，并且准备用于生物试验。将未提交用于进一步试验的来自20％和30％系列的级分组合以形成用于生物试验的‘非峰’20％和30％级分来确认主要活性是归因于所观测到的峰而非在所选波长下未观测到的任何物质。60％级分中的两者，也就是60％EtOHF8和60％EtOHF9，需要进一步色谱法(参看下文的SephadexLH20色谱法)。对90％EtOH级分也进行色谱法。然而，对于这种级分的色谱法修改所用溶剂和梯度型态。此处所采用的溶剂是80％MeOH水溶液(含有0.1％TFA)和EtOAc/MeOH(4:1vol/vol)。初始洗脱剂组成由80％甲醇水溶液组成。使溶剂组成在初始条件下保持5分钟，随后使EtOAc/MeOH溶剂浓度经35分钟线性增加至100％。通过制备型HPLC对90％EtOH级分的分析显示这种级分的主要组分是完全非极性的，在色谱图中很晚洗脱，并且在用于对其它蜂胶级分进行分析的波长，即268和327nm下显示出最小UV吸收。然而，蒸发光散射检测(ELSD)揭示了组分的复杂混合。归因于ELSD制备型HPLC的破坏性质，手动收集级分，并且在210nm下进行在线检测。因为色谱法并不产生明显分离的峰而是基线的宽泛上升和下降，所以在运作期间收集四个级分并且全部准备用于生物试验。

SephadexLH20色谱法

来源于如上文所指出的制备型HPLC工作的级分60％EtOHF8和F9的分析型HPLC分析显示这些级分含有几种紧密洗脱的化合物。如下对这些级分进行进一步色谱法。

将这些级分中的每一者施加至含有先前已经用70％MeOH水溶液(含有0.1％TFAvol/vol)平衡的SephadexLH20固定相(3×42cm)的玻璃柱的顶部。以时间为基础使用级分收集器来收集级分，其中个别的级分体积为约7mL。通过分析型HPLC检查级分，并且将含有单一化合物或高度纯化化合物的那些组合并且准备用于生物试验。将来自每个系列的剩余级分组合并且作为‘非峰’级分准备用于生物试验。

用于DLD-1结肠癌抗增殖试验的材料和方法

如通过MTT试验所评估，评估下表4中所示的测试样品调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照(阴性对照)之外还包括阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。如实施例1中所描述进行DLD-1抗增殖试验。

表4.测试样品

将样品作为工作溶液以2mg/mL溶解于含15％EtOH的HBSS中，而样品#1除外，其以1mg/mL溶解于15％ETOH/HBSS中。在试验中，样品的最终浓度为200μg/mL并且最终EtOH浓度为1.5％，而样品#1除外，其为100μg/mL并且最终EtOH浓度为1.5％。

结果和讨论

汇总

·所测试的大多数样品是DLD-1结肠癌细胞增殖的抑制剂。

·无一样品具有刺激作用。

·在蜂胶级分当中，最强抑制剂是(抑制水平在括号中)：

ο#320％F8(95.2％)

ο#830％F8(96.1％)

ο#1460％F8(27-30)(95.0％)

ο#1760％F8(44-50)(90.4％)

ο#1860％F8(52-53)(90.4％)

·几个样品对结肠癌的生长没有影响或具有可忽略的影响。这些包括

ο#120％F1(0.4％抑制)

ο#930％F10(3.2％刺激)

ο#1030％F11(7.5％抑制)

ο#38松属素7-甲基醚(2.7％抑制)

在24小时孵育之后阳性对照和测试样品对细胞增殖的影响的汇总呈现于下表5中。

表5.测试样品对DLD-1细胞增殖的影响

化合物鉴别

进一步分析作为结肠癌细胞增殖的最强抑制剂的级分以鉴别存在于这些级分中的化合物。在活性级分中所鉴别的化合物呈现于表6中。下文详述用于鉴别每种化合物的方法。

5-苯基戊-2,4-二烯酸

HPLC在线UV-可见吸收光谱和低解析度LCMSm/z数据与5-苯基戊-2,4-二烯酸的结构一致，先前已经报导5-苯基戊-2,4-二烯酸存在于源自新西兰的蜂胶中(Markham等,1996.新西兰蜂胶中的主要有机成分的HPLC和GC-MS鉴别(HPLCandGC-MSidentificationofthemajororganicconstituentsinNewZealandpropolis).Phytochemistry,42(1):205-211)。这个结构是通过在HPLC上与确证的标准进行联合色谱法来确认。

3-甲基-3-丁烯基咖啡酸

HPLC在线UV-可见吸收光谱和低解析度LCMSm/z数据与3-甲基-3-丁烯基咖啡酸的结构一致，先前已经报导3-甲基-3-丁烯基咖啡酸存在于源自新西兰的蜂胶中(Markham等,1996)。另外，HRMS、'H-和^l3CNMR数据与3-甲基-3-丁烯基咖啡酸的已发布数据一致。

1,1-二甲基烯丙基咖啡酸

HPLC在线UV-可见吸收光谱和低解析度LCMSm/z数据与1,1-二甲基烯丙基咖啡酸的结构一致，先前已经报导1,1-二甲基烯丙基咖啡酸存在于源自新西兰的蜂胶中(Markham等,1996)。这个结构是通过在HPLC上与确证的标准进行联合色谱法来确认。另外，HRMS、'H-和^l3CNMR数据与1,1-二甲基烯丙基咖啡酸的已发布数据一致。

短叶松素-3-乙酸酯

HPLC在线UV-可见吸收光谱和低解析度LCMSm/z数据与短叶松素-3-乙酸酯的结构一致，先前已经报导短叶松素-3-乙酸酯存在于源自新西兰的蜂胶中(Markham等,1996)。实验室参考样品也可用于比较。

球松素查尔酮

球松素查尔酮从粗蜂胶中分离出。分离涉及几个色谱步骤：在硅胶上的两个步骤和使用SephadexLH-20的最终净化步骤。收集来自这个最终步骤的主要黄色化合物并且通过比较NMR和UV-可见光谱数据与文献值来显示是纯球松素查尔酮(Malek,S.N.A.；Phang,C.W.；Ibrahim,H.；AbdulWahab,N.；Sim,K.S.马来良姜根茎的植物化学和细胞毒性调查(PhytochemicalandCytotoxicInvestigationsofAlpiniamuticaRhizomes).Molecules2011,16,583-589)。

杨芽黄素

HPLC在线UV-可见吸收光谱和低解析度LCMSm/z数据与杨芽黄素的结构一致，先前已经报导杨芽黄素存在于源自新西兰的蜂胶中(Markham等,1996)。

阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯

存在于S#2360％F9级分中的酯被鉴别为阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯的混合物。鉴别是以级分的小规模水解为基础，其得到苯甲醇以及阿魏酸和异阿魏酸的混合物。从HPLC数据(保留时间和在线UV-VIS光谱)与来自参考化合物的数据的比较来鉴别水解产物。

表6.在活性级分中所鉴别的化合物

讨论

这些数据支持了本发明的组合物抑制结肠直肠细胞增殖的功效。

从这个实施例精选的最具生物活性的化合物经过纯化，合成，或在以下实施例中用作真正纯的标准。还测试了松属素和对香豆酸，以其强和弱活性为基础分别作为额外的阳性和阴性对照。

实施例3

这个实施例描述了从作为级分S#1460％F7的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物5-苯基戊-2,4-二烯酸的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

下文示出了用于实施例3至13的一般方法。

用于胃肠癌抗增殖试验的材料和方法

如通过MTT试验所评估，评估5-苯基戊-2,4-二烯酸调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)、人类结肠癌细胞系(HCT-116)、人类胃癌细胞系(NCI-N87)以及人类食管鳞状细胞癌细胞系(KYSE-30)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照作为阴性对照之外，还包括三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-苯基戊-2,4-二烯酸是具有通过NMR和MS确认的化学结构的真正的标准。

测试材料和测试方法

使四种人类胃肠癌细胞系从冷冻储存中复活并且在测试和参考样品存在下培养。然后对培养物进行MTT试验以确定样品对细胞生存力和增殖的影响。

方法是基于以下参考文献中所报导的程序：

Smolka,AJ,Goldenring,JR,Gupta,S以及CharlesEHammond,CE.由吡咯里嗪衍生物ML3000抑制胃H,K-ATPase活性和胃上皮细胞IL-8分泌(InhibitionofgastricH,K-ATPaseactivityandgastricepithelialcellIL-8secretionbythepyrrolizinederivativeML3000).BMCGastroenterology.2004年2月10日公布。

Trainer,D.L.等(1988).人类结肠直肠癌细胞系中的生物表征和癌基因表达(Biologicalcharacterizationandoncogeneexpressioninhumancolorectalcarcinomacellslines).InternationalJournalofCancer41:287-296。

细胞的培养条件是由细胞供应者(ATCC和ECACC)所提供的那些。

样品制备

将测试样品5-苯基戊-2,4-二烯酸和实施例4至12中的所有其它测试样品(杨芽黄素除外)初始溶解于纯乙醇中达到约13.35mg/ml的浓度。将杨芽黄素初始溶解于三乙二醇单甲基醚中达到相同浓度。然后从储备溶液通过稀释至15％乙醇/汉克斯平衡盐溶液(ETOH)/HBSS中达到2mg/mL固含量的浓度来制备工作溶液。在试验中，样品的最终浓度为200μg/ml并且最终EtOH浓度为1.5％。如上文所制备的测试化合物和蜂胶的最终浓度如实施例3中所指出。

实验程序

测试系统的表征

1.人类结肠直肠腺癌细胞(ATCCCCl-221,DLD-1)(ATCC,Bethesda,MD,USA)

2.人类胃癌细胞(ATCCCRL-5822,NCI-N87)(ATCC,Bethesda,MD,USA)

3.人类食管鳞状细胞癌(ECACC,KYSE-30)(SigmaAldrich,Auckland,NZ)

4.人类结肠癌细胞(ECACCHCT-116)(SigmaAldrich,Auckland,NZ)

5.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、10mg/ml链霉素的0.9％NaCl(Sigma目录号P-0781)。储存于-20℃下。

6.对于DLD-1细胞：DMEM培养基(Invitrogen目录号12100-046)。储存于4℃下。

7.对于NCI-N87细胞：经过修改以含有2mML-谷氨酰胺、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、4500mg/L葡萄糖以及1500mg/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养基(SigmaR6504)。储存于4℃下。

8.对于KYSE-410细胞：经过修改以含有2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(SigmaR6504)。储存于4℃下。

9.对于HCT-116细胞：经过修改以含有2mML-谷氨酰胺的麦考伊氏5A培养基(McCoy's5Amedium)(SigmaM48792)。储存于4℃下。

10.胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25％胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号15400054(×10，于储备液中)。

11.磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由TBL制备)。

12.汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO目录号14185-052)。储存于4℃下。

13.胎牛血清(GIBCO目录号10091-148)。储存于-20℃下。

14.MTT试剂：100mg/小瓶(SIGMA目录号M-2128)，以10mg/mL溶解于PBS中并且储存于-20℃下。将在PBS中制备5mg/mlMTT溶液并且储存于4℃下作为工作溶液。

15.MTT裂解缓冲液：10％十二烷基硫酸钠(SDS)/45％二甲基甲酰胺(将20gSDS溶解于100mL双蒸馏水(DDW)中，并且将90mL二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中)。用冰醋酸将pH调整至4.7，并且添加DDW直至200mL的最终体积。

16.5-氟尿嘧啶(5-FU)(Sigma目录号F-6627)。将以19.5μg/ml、6.5μg/ml以及1.95μg/ml制备三种工作溶液，溶解于15％乙醇/HBSS中。最终浓度将为1.95μg/ml(15μM)、0.65μg/ml(5μM)以及0.195μg/ml(1.5μM)。

培养基制备

上文给出了用于繁殖细胞系中的每一者的培养基。每种培养基是遵循ATCC/ECACC说明书来制备并且补充有青霉素-链霉素溶液(10毫升/升)。在即将使用之前添加FBS(以10％)。

细胞培养

1.使获自美国菌种保藏中心或欧洲细胞培养中心(EuropeanCollectionofCellCultures)的细胞系中的每一者从冷冻储存中复活。

2.在使用上文所描述的培养基(参看测试系统的表征和培养基制备)进行初始繁殖之后，使用胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的相关培养基来中和胰蛋白酶，并且在4℃下使悬浮液以300g(1200rpm)离心5分钟。

3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于含有FBS(10％)、青霉素(100单位/毫升)、链霉素(100μg/ml)的相关培养基中。

5.弃去上清液，并且如上文3中所描述以1.0×10⁴个细胞/毫升使细胞再悬浮于相关培养基和补充物中。需要约54ml总体积的每种细胞悬浮液。

6.根据预定的板布局，向六个96孔板的每个孔中添加180μl细胞(1,800个细胞/孔)或培养基。将板在5％CO₂/95％空气中于37℃下孵育约48小时以允许细胞附着。

7.如板布局所指示，向每个孔中添加20μl测试化合物或5-FU中的每一者。对于标记为‘培养基’或‘仅细胞’的阴性对照孔，添加20μl15％ETOH/HBSS。以3或6个重复测定来评估每个样品或对照。

8.每个孔中的总体积为200μl。

9.将板在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育24小时。

细胞增殖试验

1.在孵育完成时，将20μlMTT工作溶液(5mg/mL)添加至所有孔中，并且在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育3-4小时。每隔30-60分钟监测板并且如果极少细胞显示晶体的存在，那么如下文步骤2中添加裂解缓冲液。

2.然后添加100μlMTT裂解缓冲液，并且将板在37℃下于5％CO₂/95％空气中孵育过夜。使板以1200rpm离心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200μl从每个孔转移至新的96孔板中。然后在550nm下用VersaMax微板读取器读取板。

3.从所有孔扣除作为背景读数的空白读数。结果表示为与仅细胞对照相比在样品存在下培养的细胞的增殖百分比。

4.使用VersaMax96孔板读取器以比色法(在550nm下)评估细胞的增殖。

5.评估平均值的标准误差百分比并且如果SEM％>15，那么将去除极端界外值。将用独立的司徒登t检验(Studentt-test)在α≤0.05下(存在和不存在界外值下)评估初步统计显著性。

关于测试方法的观测

在各种测试制剂和5-FU存在下进行几种癌细胞的培养持续48小时，届时在24小时后DLD-1和NCI-N87的阴性对照的细胞密度的目视观测表明生长并不如预期一样快。为了一致，将其它培养物的时间设定为相同的。

研究计划要求如果平均值的标准误差(SEM)百分比大于15％，那么从计算中删除重复测定当中的界外值。当样品是强拮抗剂时，吸光度值很小。因此，在这些当中的小变化意指当与较小抑制性样品相比较时，用百分比表示的从平均值的变异相对较大。这使得发生几乎完全抑制的一些界外值从分析中去除。

结果

5-苯基戊-2,4-二烯酸的细胞增殖试验的结果示于表7中，连同三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)，和阴性对照(仅细胞与培养基并且没有测试化合物或阳性对照)的结果一起。在表中，OD是在570nm下测量的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标准误差；p是测量经由司徒登t检验是统计上显著的概率值，此处被视为<0.05；刺激％是与阴性对照(测试化合物无活性)相比增殖的刺激百分比；抑制％是与阴性对照相比增殖的减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。

表7.5-苯基戊-2,4-二烯酸对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

5-苯基戊-2,4-二烯酸对所有四种癌细胞系具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制43.5％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制36.4％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制42.56％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制37.6％。抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)所达成的抑制程度，并且对于NCI-N87细胞确实是优良的。

实施例4

这个实施例描述了从级分S#1460％F8(27-30)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物1,1-二甲基烯丙基咖啡酸的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

试验中所用的200μg/ml浓度的1,1-二甲基烯丙基咖啡酸是真正的标准。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例4。

结果

1,1-二甲基烯丙基咖啡酸的细胞增殖试验的结果示于表8中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表8中。

表8.1,1-二甲基烯丙基咖啡酸对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

1,1-二甲基烯丙基咖啡酸对所有四种癌细胞系极具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制93.2％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制86.7％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制86.7％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制97.8％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度-当也包括界外值结果时除NCI-N87以外的所有细胞系几乎完全被杀死。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中主要含有1,1-二甲基烯丙基咖啡酸的级分S#1460％F8(27-30)显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例5

这个实施例描述了从级分S#1560％F8(35-40)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

以化学方式合成试验中所用的200μg/ml浓度的3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯并且通过NMR和MS确认身份。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例5。

结果

3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯的细胞增殖试验的结果示于表9中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表9中。

表9.3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯对所有四种癌细胞系极具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制91.6％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制96.0％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制84.5％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制96.3％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度-观测到HCT-116和KYSE-30细胞几乎完全被杀死。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#1560％F8(35-40)中不纯的3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例6

这个实施例描述了从级分S#2460％F9(54-57)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物球松素查尔酮的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

从粗蜂胶中分离出试验中所用的200μg/ml浓度的球松素查尔酮并且进行大量纯化。通过NMR和MS确认其身份。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例6。

结果

球松素查尔酮的抗增殖试验的结果示于表10中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表10中。

表10.球松素查尔酮对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

球松素查尔酮对四种癌细胞系中的三种具高度至中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制83.3％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制51.2％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制45.0％。

然而，球松素查尔酮对人类胃癌细胞系NCI-N87不具活性。令人惊讶地，其对这种细胞系的增殖稍有刺激性但不是统计上显著的。对其它三种细胞系的抑制程度类似于或实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#2460％F9(54-57)中不纯的球松素查尔酮显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例7

这个实施例描述了从级分S#1660％F8(41-43)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物短叶松素3-O-乙酸酯的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

试验中所用的200μg/ml浓度的短叶松素3-O-乙酸酯是纯的实验室标准，其身份通过NMR和MS确认。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例7。

结果

短叶松素3-O-乙酸酯的抗增殖试验的结果示于表11中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表11中。

表11.短叶松素3-O-乙酸酯对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

短叶松素3-O-乙酸酯对所有四种癌细胞系具极高至中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制75.4％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制90.6％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制48.2％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制68.0％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#1660％F8(41-43)中不纯的3短叶松素3-O-乙酸酯显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例8

这个实施例描述了从级分S#1860％F8(52-53)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离和用作标准S#37的化合物松属素的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

试验中所用的200μg/ml浓度的松属素是真正的标准。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例8。

结果

松属素的抗增殖试验的结果示于表12中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表12中。

表12.松属素对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

松属素对所有四种癌细胞系极具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制91.7％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制99.1％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制72.5％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制96.3％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度，并且对于KYSE-30和HCT-116，几乎所有细胞都被杀死。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#1860％F8(52-53)中不纯的松属素和松属素标准S#37显示几乎完全抑制DLD-1的增殖。

实施例9

这个实施例描述了从级分S#2360％F9(49-51)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物阿魏酸苯甲酯的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

以化学方式合成试验中所用的200μg/ml浓度的阿魏酸苯甲酯，并且如下确认其身份：通过NMR、MS，以及通过从NZ蜂胶中分离的酯水解成母体酸和醇，然后与真正的标准化合物比较来鉴别。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例9。

结果

阿魏酸苯甲酯的抗增殖试验的结果示于表13中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表13中。

表13.阿魏酸苯甲酯对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

阿魏酸苯甲酯对所有四种癌细胞系极具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制86.0％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制95.9％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制87.0％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制98.6％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度，并且对于KYSE-30和HCT-116，几乎所有细胞都被杀死。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#2360％F9(49-51)中阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯的不纯混合物显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例10

这个实施例描述了从级分S#2360％F9(49-51)的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离的化合物异阿魏酸苯甲酯的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

以化学方式合成试验中所用的200μg/ml浓度的异阿魏酸苯甲酯，并且如下确认其身份：通过NMR、MS，以及通过从NZ蜂胶中分离的酯水解成母体酸和醇，然后与真正的标准化合物比较来鉴别。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例10。

结果

异阿魏酸苯甲酯的抗增殖试验的结果示于表14中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表14中。

表14.异阿魏酸苯甲酯对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

异阿魏酸苯甲酯对所有四种癌细胞系极具活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制90.8％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制94.8％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制80.0％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制95.8％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度，并且与结构异构体阿魏酸苯甲酯所达成的抑制程度几乎相同-对于KYSE-30和HCT-116，几乎所有细胞都被杀死。这个结果也再次确认了实施例2的发现，其中级分S#2360％F9(49-51)中阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯的不纯混合物显示实质上抑制DLD-1的增殖。

实施例11

这个实施例描述了从级分S#2760％F10的NZ来源的欧洲型蜂胶中分离和用作比较标准S#35的化合物杨芽黄素，也称为白杨素-7-甲基醚的抗胃肠癌活性的评估(表6，实施例2)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

试验中所用的200μg/ml浓度的杨芽黄素是真正的标准。在实施例3中详细给出的相同测试程序也用于实施例11，但例外为将杨芽黄素溶解于三乙二醇单甲基醚中，因为其作为实施例2中的样品S#35并不适当地溶解。

结果

杨芽黄素的抗增殖试验的结果示于表15中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表15中。

表15.短叶松素3-O-乙酸酯对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

杨芽黄素对所有四种癌细胞系具极高至中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制92.8％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制90.1％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制54.0％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制87.6％。

抑制程度实质上优于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶所达成的抑制程度。这个结果也再次确认了实施例2中对于S#2760％F10的发现，其中不纯的杨芽黄素显示实质上抑制DLD-1的增殖，但不同于实施例2的S#35，因为此时这个样品完全溶解于测试培养基中。

实施例12

这个实施例描述了与欧洲型蜂胶广泛相关并且显示当从NZ蜂胶中分离时对DLD-1无活性的化合物对位香豆酸，也称为对香豆酸的抗胃肠癌活性的评估(数据在实施例2中未示出)。使用人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验进行这项研究。

试验中所用的200μg/ml浓度的对香豆酸是真正的标准。

结果

对香豆酸的抗增殖试验的结果示于表16中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例3相同并且因此不包括于表16中。

表16.对香豆酸对4种胃肠细胞系的抗增殖活性

讨论

对香豆酸对人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30具中等活性，使得抑制46.1％。然而，其对人类结肠腺癌细胞系DLD-1具较小活性，使增殖抑制14.3％，并且对人类胃癌细胞系NCI-N87具较小活性，使增殖抑制17.3％，不过这不是统计上显著的。对香豆酸对人类结肠癌细胞系HCT-116无活性，稍微刺激增殖(2.6％)但不是统计上显著的。

这种化合物因此可以被视为对鳞状细胞癌细胞系KYSE-30具活性。

松属素和对香豆酸以其强和弱活性为基础分别被选作阳性和阴性对照。

实施例13

这个实施例提供了NZ和波兰杨树型蜂胶以及如实施例4、5、8以及9中测试和展示的从蜂胶中分离的200μg/ml浓度的最具生物活性的化合物的抗食管癌活性的详细评估。使用人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验，使用实施例3中所概述的一般方法进行这项研究。所测试的化合物是100μg/ml松属素；100μg/ml二甲基烯丙基咖啡酸；10μg/ml3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯；以及50μg/ml阿魏酸苯甲酯。两个蜂胶样品是富含松属素和短叶松素3-o-乙酸酯的NZ蜂胶酊剂；以及富含对香豆酸的波兰蜂胶酊剂。在溶解于测试溶液中达到50μg/ml的最终浓度之前，两个样品都蒸发至干燥。在蒸发至干燥之后两个蜂胶酊剂样品的组成(毫克化合物/克干固体)在表17和18中给出：

表17.蒸发至干燥的蜂胶酊剂的类黄酮组成(毫克/克干固体)

P-3-o-A＝短叶松素3-o-乙酸酯；pino-7-me＝松属素-7-甲基醚

表18.蒸发至干燥的蜂胶酊剂的酚酸和酯组成(毫克/克干固体)

CAPE＝咖啡酸苯乙酯；Benzylf&iso-f＝阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯；3M3Bcaffeate＝3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯；DMAcaffeate＝咖啡酸二甲基烯丙酯

NZ蜂胶相比波兰蜂胶具有实质上更高水平的类黄酮松属素和短叶松素3-o-乙酸酯。二甲基烯丙基咖啡酸和3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯的含量也实质上更高，一起定量的阿魏酸苯甲酯和异阿魏酸苯甲酯的总水平同样如此。波兰蜂胶具有实质上更高水平的对香豆酸，和适度更高水平的CAPE。

对于所测试的化合物和蜂胶酊剂样品的KYSE-30细胞增殖试验的结果示于表19中，连同三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)，和阴性对照(仅细胞与培养基并且没有测试化合物或阳性对照)的结果一起。在表中，n是重复测定的数目(n<6指示一些重复测定得到增殖的100％抑制)；OD是在570nm下测量的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标准误差；p是测量经由司徒登t检验是统计上显著的概率值，此处被视为<0.05(NS＝不显著)；抑制％是与阴性对照相比增殖的减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。

表19.测试化合物对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的抗增殖活性

讨论

这个实施例显示从蜂胶中分离的化合物在抑制KYSE-30的增殖方面比蜂胶更有效，并且因此是用于医药制剂的适合候选分子。这个实施例还提供了对松属素、二甲基烯丙基咖啡酸、阿魏酸苯甲酯以及3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯的剂量反应的指示。二甲基烯丙基咖啡酸与阿魏酸苯甲酯甚至分别在实施例4和9中所用的一半和四分之一的浓度下都展示极高活性。对于二甲基烯丙基咖啡酸，6个重复测定中仅3个得到增殖的小于100％抑制；并且对于阿魏酸苯甲酯，6个重复测定中仅5个得到KYSE-30增殖的小于100％抑制。3-甲基-3-丁烯咖啡酸酯也是增殖的极强抑制剂，因为其在10μg/ml下仍然具中等活性(39.3％抑制)，10μg/ml仅为实施例5中所用浓度的5％。松属素在100μg/ml下仍然具高度活性(50.3％抑制)。50.3％抑制增殖的NZ蜂胶比29.6％抑制的波兰蜂胶更有效，这反映了具有高水平的高度活性的二氢类黄酮松属素和短叶松素-3-o-乙酸酯以及低水平的中等活性的对香豆酸的效益。

工业适用性

含有来源于蜂胶或其级分的化合物的本发明的抗胃肠癌组合物可以用于包括食品和饮料、医疗装置、医疗用品、功能食品以及医药品的消费品中。使用这类组合物，例如治疗胃肠癌和其症状的方法在医学领域中具有应用。

Claims

1.一种医药组合物，其包含治疗有效量的式(I)或(II)化合物：

其中：

Z为O或羟基；

X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_1-6烷基；

______当Z为O时为单键或当Z为羟基时不存在；

为单键或双键；并且

R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是R¹和R²中的至少一者为羟基；并且

条件是当X为H并且为双键时R¹和R²不都为羟基；

其中：

R^a为氢、C_2-6烯基、芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基；

m为1或2；并且

R¹⁰和R²⁰各自独立地为氢、羟基或C_1-6烷氧基；并且

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)化合物是式(IA)化合物：

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_2-5烷基。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中X为氢或C_1-6烷基C(O)O。

5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述C_1-6烷基C(O)O为MeC(O)O。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中R¹为羟基并且R²为C_1-6烷氧基，R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基，或R¹和R²各自为羟基。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述C_1-6烷氧基为OMe。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中Z为O；______为单键；为单键；X为C_1-6烷基C(O)O；并且R¹和R²各自为羟基。

10.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中Z为O并且______为单键或Z为羟基并且______不存在；为双键；X为氢；并且R¹为羟基并且R²为C_1-6烷氧基或R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基。

11.如权利要求10所述的组合物，其中R¹为C_1-6烷氧基并且R²为羟基。

12.如权利要求10或11所述的组合物，其中Z为O；并且______为单键。

13.如权利要求10或11所述的组合物，其中Z为羟基；并且______不存在。

14.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(II)化合物是式(IIA)化合物：

15.如权利要求1或14所述的组合物，其中R¹⁰和R²⁰各自为氢，R¹⁰和R²⁰各自为羟基，R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

16.如权利要求1、14以及15中任一项所述的组合物，其中所述C_1-6烷氧基为OMe。

17.如权利要求1和14至16中任一项所述的组合物，其中R^a为氢、C_2-6烯基或芳基C_1-6烷基。

18.如权利要求1和14至17中任一项所述的组合物，其中所述C_2-6烯基为戊二烯基或异戊二烯基。

19.如权利要求1和14至17中任一项所述的组合物，其中所述芳基C_1-6烷基为苯甲基。

20.如权利要求1和14至16中任一项所述的组合物，其中所述芳基C_1-6烯基为肉桂基。

21.如权利要求1和14至20中任一项所述的组合物，其中m为2。

22.如权利要求21所述的组合物，其中Ra为氢并且R¹⁰和R²⁰各自为氢。

23.如权利要求1和14至20中任一项所述的组合物，其中m为1。

24.如权利要求1、14至19以及23中任一项所述的组合物，其中R^a为C_2-6烯基或芳基C_1-6烷基；并且R¹⁰和R²⁰各自为羟基，R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

25.如权利要求1、14至18、23以及24所述的组合物，其中R^a为C_2-6烯基；并且R¹⁰和R²⁰各自为羟基。

26.如权利要求1、14至17、19、23以及24中任一项所述的组合物，其中Ra为芳基C_1-6烷基；R¹⁰为羟基并且R²⁰为C_1-6烷氧基，或R¹⁰为C_1-6烷氧基并且R²⁰为羟基。

27.如权利要求1所述的医药组合物，其包含治疗有效量的选自以下任一者或多者的至少一种化合物

a)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)阿魏酸苯甲酯，

d)异阿魏酸苯甲酯，

e)短叶松素-3-乙酸酯，

f)杨芽黄素，

g)5-苯基戊-2,4-二烯酸，

h)球松素查尔酮。

28.一种治疗或预防受试者中的胃肠癌的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1至27中任一项所述的组合物施用于有需要的受试者。

29.一种在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1至27中任一项所述的组合物独立、同时或依序施用于有需要的受试者。

30.一种诱导受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1至27中任一项所述的组合物施用于有需要的受试者。

31.一种增加受试者对胃肠癌疗法的反应性的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1至27中任一项所述的组合物。

32.一种增加受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1所述的组合物。

33.一种使对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1至27中任一项所述的组合物施用于所述一种或多种胃肠癌细胞。

34.一种至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至27中任一项所述的组合物。

35.一种完全或部分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1至27中任一项所述的组合物的步骤。

36.一种使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1至27中任一项所述的组合物的步骤。

37.如权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

38.一种式(I)或(II)化合物的用途，

其中：

Z为O或羟基；

X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_1-6烷基；

______当Z为O时为单键或当Z为羟基时不存在；

为单键或双键；并且

R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是R¹和R²中的至少一者为羟基；并且

条件是当X为H并且为双键时R¹和R²不都为羟基；

其中：

R^a为氢、C_2-6烯基、芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基；

m为1或2；并且

R¹⁰和R²⁰各自独立地为氢、羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是当R¹⁰和R²⁰都为羟基时R^a不为芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基，

其用于制造供以下使用的组合物：在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。

39.一种式(I)或(II)化合物的用途，

其中：

Z为O或羟基；

X为氢、C_1-6烷基C(O)O或C_1-6烷基；

______当Z为O时为单键或当Z为羟基时不存在；

为单键或双键；并且

R¹和R²各自独立地为羟基或C_1-6烷氧基；并且

条件是R¹和R²中的至少一者为羟基；并且

条件是当X为H并且为双键时R¹和R²不都为羟基；

其中：

R^a为氢、C_2-6烯基、芳基C_1-6烷基或芳基C_2-6烯基；

m为1或2；并且

R¹⁰和R²⁰各自独立地为氢、羟基或C_1-6烷氧基；

其用于制造供以下使用的组合物：在人类受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导人类受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加人类受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加人类受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使人类受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的人类受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷胃肠癌的人类患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的人类患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。

40.如权利要求38或39所述的用途，其中所述化合物是如权利要求2至27中任一项所述的化合物。

41.一种选自由以下组成的群组中的任一者或多者的至少一种化合物的用途，

a)1,1-二甲基烯丙基咖啡酸，

b)3-甲基-3-丁烯基咖啡酸，

c)阿魏酸苯甲酯，

d)异阿魏酸苯甲酯，

e)短叶松素-3-乙酸酯，

f)杨芽黄素，

g)5-苯基戊-2,4-二烯酸，以及

h)球松素查尔酮，

任选地与至少一种额外治疗剂一起，其用于制造供以下使用的组合物：在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。

42.如权利要求1至27中任一项所述的组合物，其用于在人类受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导人类受试者中的一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加人类受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加人类受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使人类受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的人类受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷胃肠癌的人类患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的人类患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。

43.如权利要求42所述的组合物，其用于治疗或预防胃肠癌。